UNIVERSIDAD TÉCNICA PARTICULAR DE LOJA La...

UNIVERSIDAD TÉCNICA PARTICULAR DE LOJA La Universidad Católica de Loja

ÁREA BIOLÓGICA Y BIOMÉDICA

TÍTULO DE BIOQUÍMICO FARMACÉUTICO

Caracterización morfo-molecular de hongos anamorfos del cepario UTPL y

evaluación de su potencial antibacteriano.

TRABAJO DE TITULACIÓN

AUTORA: Ramírez Ulloa, Carolina Maribel

DIRECTOR: Cruz Sarmiento, Darío Javier, Ph. D.

LOJA – ECUADOR

2016

Esta versión digital, ha sido acreditada bajo la licencia Creative Commons 4.0, CC BY-NY-SA: Reconocimiento-No comercial-Compartir igual; la cual permite copiar, distribuir y comunicar públicamente la obra, mientras se reconozca la autoría original, no se utilice con fines comerciales y se permiten obras derivadas, siempre que mantenga la misma licencia al ser divulgada. http://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/4.0/deed.es

2016

http://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/4.0/deed.es

ii

APROBACIÓN DEL DIRECTOR DEL TRABAJO DE TITULACIÓN

Ph.D. Darío Javier Cruz Sarmiento.

DOCENTE DE LA TITULACIÓN

De mi consideración:

El presente trabajo de titulación, “Caracterización morfo-molecular de hongos anamorfos del

cepario UTPL y evaluación de su potencial antibacteriano” realizado por Ramírez Ulloa Carolina

Maribel, ha sido orientado y revisado durante su ejecución, por cuanto se aprueba la presentación

del mismo.

Loja, septiembre de 2016

f) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

iii

DECLARACIÓN DE AUTORÍA Y CESIÓN DE DERECHOS

Yo, Ramírez Ulloa Carolina Maribel: declaro ser autor del presente trabajo de titulación:

Caracterización morfo-molecular de hongos anamorfos del cepario UTPL y evaluación de su

potencial antibacteriano, de la Titulación de Bioquímica y Farmacia, siendo Darío Javier Cruz

Sarmiento director del presente trabajo; y eximo expresamente a la Universidad Técnica

Particular de Loja y a sus representantes legales de posibles reclamos o acciones legales.

Además certifico que las ideas, conceptos, procedimientos y resultados vertidos en el presente

trabajo investigativo, son de mi exclusiva responsabilidad.

Adicionalmente declaro conocer y aceptar la disposición del Art. 88 del Estatuto Orgánico de la

Universidad Técnica Particular de Loja que en su parte pertinente textualmente dice: “Forman

parte del patrimonio de la Universidad la propiedad intelectual de investigaciones, trabajos

científicos o técnicos y tesis de grado o trabajos de titulación que se realicen con el apoyo

financiero, académico o institucional (operativo) de la Universidad”

f. …………………………………….

Autor: Ramírez Ulloa Carolina Maribel

Cédula: 110431619-3

iv

DEDICATORIA

A Dios, él que nunca me falla.

A mi padre, Wuilman, ejemplo de perseverancia y sacrificio.

A mi madre, Rosa, su coraje y amor, me da la fuerza que necesito.

A mi hermana, Mariuxi, la alegría de mi vida.

A mis sobrinas, Evelyn y Mireya por ser mi inocencia y ternura.

Carolina Maribel

v

AGRADECIMIENTO

A Dios, por regalarme vida y bendecirme día a día.

A mis padres, Wuilman y Rosa, por su amor y apoyo incondicional, la vida no me

alcanzara para agradecerles lo que han hecho por mí. Este logro también es suyo.

A mi hermana, Mariuxi, por sus consejos y motivación, has sido mi inspiración.

A mis compañeros del Fungario, en especial a Sebastián Eguiguren, por su apoyo y

amistad.

Agradezco de manera especial al Ph. D. Darío Cruz y M.Sc. Luis Cartuche por guiarme

en cada paso de esta investigación y brindarme su apoyo.

A la Universidad Técnica Particular de Loja, a sus docentes quienes me orientaron en

mi formación profesional.

¡GRACIAS!

Carolina Maribel Ramírez Ulloa

vi

ÍNDICE DE CONTENIDOS

DEDICATORIA ........................................................................................................................... iv

AGRADECIMIENTO .................................................................................................................... v

ÍNDICE DE CONTENIDOS ......................................................................................................... vi

ÍNDICE DE TABLAS ................................................................................................................. viii

ÍNDICE DE FIGURAS ................................................................................................................. ix

RESUMEN .................................................................................................................................. 1

ABSTRACT ................................................................................................................................ 2

INTRODUCCIÓN ........................................................................................................................ 3

CAPÍTULO I ................................................................................................................................ 4

MARCO TEÓRICO ..................................................................................................................... 4

1.1. Reino Fungi .................................................................................................................. 5

1.2. Características generales de los hongos ...................................................................... 5

1.3. Diversidad en el mundo y distribución en el Ecuador. ................................................... 5

1.4. Importancia de los hongos ............................................................................................ 6

1.5. Clasificación morfológica y molecular de los hongos .................................................... 6

1.6. Ciclo de vida y reproducción de los hongos .................................................................. 7

1.7. Metabolismo de los hongos .......................................................................................... 7

1.8. Actividad antibacteriana ................................................................................................ 8

1.8.1 Concentración mínima inhibitoria .......................................................................................... 8

CAPÍTULO II ............................................................................................................................... 9

MATERIALES Y MÉTODOS ....................................................................................................... 9

2.1. Especímenes o cepas ................................................................................................ 10

2.2. Identificación morfológica ........................................................................................... 10

2.3. Identificación molecular .............................................................................................. 11

2.4. Comparación en BLAST ............................................................................................. 11

2.5. Pruebas antagónicas bacterianas en medio sólido ..................................................... 11

2.6. Obtención de extractos fúngicos ................................................................................. 14

2.7. Concentración mínima inhibitoria ................................................................................ 14

CAPÍTULO III ............................................................................................................................ 16

RESULTADOS Y DISCUSIÓN ................................................................................................. 16

vii

3.1. Morfología .................................................................................................................. 17

3.2. Comparación de similitud genética ............................................................................. 20

3.3. Pruebas antagónicas en medio sólido ........................................................................ 24

3.4. Extractos y rendimiento de extractos positivos ........................................................... 27

3.5. CMI según los extractos para diferentes bacterias...................................................... 28

CONCLUSIONES ..................................................................................................................... 30

BIBLIOGRAFÍA ......................................................................................................................... 31

ANEXOS ................................................................................................................................... 38

ANEXO 1. Fotografías de las cepas estudiadas .................................................................... 39

ANEXO 2. Secuencias ITS-5.8S, obtenidas para las diferentes cepas estudiadas. ............... 40

ANEXO 3. Fórmulas para preparación del medio líquido YNPD usado en el estudio ............ 45

viii

ÍNDICE DE TABLAS

Tabla 1. Cepas de hongos incluidas en este estudio. ............................................................... 10

Tabla 2. Bacterias patógenas de interés clínico y sus respectivos medios de cultivo específicos

utilizados en el estudio. ............................................................................................................. 13

Tabla 3. Comparación y búsqueda de BLAST para las secuencias ITS-5.8S obtenidas desde los

cultivos en el presente estudio. ................................................................................................. 20

Tabla 4. Resultados de pruebas antagónicas mostrando el diámetro de halo de inhibición. ..... 24

Tabla 5. Diferencia de coloración según medio cultivo sólido (PDA) o medio líquido YNPD. Para

los diferentes extractos positivos. ............................................................................................. 28

Tabla 6: Pesos de la biomasa de los extractos y su correspondencia con el rendimiento. ........ 28

Tabla 7. CMI de los diferentes extractos frente a las diferentes bacterias de interés clínico. .... 28

ix

ÍNDICE DE FIGURAS

Figura 1: Esquema secuencial de Pruebas Antagónicas ......................................................... 13

Figura 2: Cepa de Clonostachys sp. ......................................................................................... 18

Figura 3: Cepa de Pycnoporus sanguineus ............................................................................. 19

Figura 4: Cepa de Pyrenochaetopsis microspora ...................................................................... 20

Figura 5: Antagonismo positivo con halos de inhibición generados por Chonostachys sp. y

Pyrenochaetopsis microspora. .................................................................................................. 26

Figura 6: Antagonismo positivo con halos de inhibición generados por Pycnoporus sanguineus

................................................................................................................................................. 27

1

RESUMEN

Los metabolitos secundarios aislados desde los hongos presentan una promisoria actividad

antibacteriana que podría solucionar problemas de interés clínico. No obstante, muy pocos

estudios de búsqueda o caracterización de hongos se han llevado a cabo hasta la actualidad.

Este estudio pretende la caracterización morfológica (características microscópicas) y molecular

(ADN ITS-5.8S) de hongos anamorfos, así como la obtención de extractos para valorar su

capacidad de inhibir a siete bacterias patógenas de interés clínico, a través de la medición de la

Concentración Mínima Inhibitoria. Morfológica y molecularmente se obtuvieron 18 hongos que

corresponden a Basidiomycetes, Ascomycetes y Zygomycetes. En las pruebas de antagonismo,

Pycnoporus sanguineus fue activo contra Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Proteus

vulgaris y Salmonella typhimurium, mientras que Clonostachys sp. y Pyrenochaeptosis

microspora fueron activos frente a Staphylococcus aureus. Al evaluar los extractos obtenidos de

los hongos que resultaron positivos en las pruebas de antagonismo, se determinó que la

capacidad inhibitoria fue negativa a la dosis más alta probada (CMI>1000 ug/mL). Estos

resultados indican que algunos hongos presentan actividad antibacteriana a concentraciones

elevadas difíciles de usar como antibióticos de uso terapéutico.

Palabras clave: Basidiomycetes, Ascomycetes, ITS-5.8S, bacterias, antagonismo.CMI.

2

ABSTRACT

Secondary metabolites isolated from fungi, show promising antibacterial activity that could solve

problems of clinical interest. However, very few studies have focused on the search or

characterization of fungi out to date. This study attempts morphological (microscopic features) and

molecular (nrDNA ITS-5.8S) characterization of anamorphic fungi, as well as obtaining extracts to

assess their ability to inhibit seven pathogenic bacteria of clinical interest, by measuring the

Minimum inhibitory concentration. We found that our 18 fungal cultures belong to the phyla

Basidiomycota, Ascomycota, and Zygomycota. In the antagonism tests Pycnoporus sanguineus

was active against Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Proteus vulgaris and Salmonella

typhimurium, while Clonostachys sp. Pyrenochaeptosis microspore and were active against

Staphylococcus aureus. When assessing the extracts obtained from fungi found to be positive in

the antagonism tests, it was determined that the inhibitory capacity was negative to the highest

dose tested (MIC>1000 ug/mL). These results indicate that some fungi have antibacterial activity

at high concentrations which are difficult to use as antibiotics for therapeutic use.

Key words: Basidiomycota, Ascomycota, ITS-5.8S, bacterias, antagonism, MIC.

3

INTRODUCCIÓN

Los hongos fueron considerados como parte del reino vegetal, pero posteriormente fueron

clasificados por Whittaker (1969), en un quinto reino denominado “Reino Fungi” (Cepero,

Restrepo, Franco, Cárdenas, & Vargas, 2012). Actualmente se divide en seis grupos o filos:

Ascomycota, Basidiomycota, Chytridiomycota, Zygomycota, Blastocladiomycota y

Glomeromycota, siendo los más conocidos los Ascomycetes y los Basidiomycetes (Piepenbring,

2015). Este Reino es muy diverso y su riqueza se estima en más de cinco millones de especies

a nivel mundial y hay casi 75000 especies de hongos filamentosos conocidos (Blackwell, 2011).

Según el Centro de Conservación del Medio Ambiente (2016), Ecuador se encuentra en el sexto

puesto del grupo de 17 países megadiversos del planeta. No obstante, la diversidad de hongos

en el Ecuador es poco conocida ya que se conocen aproximadamente 3776 taxones lo que

significa que es solo el 4% de los hongos de nuestro territorio (Læssøe & Petersen, 2008).

La importancia de su estudio radica en que estos organismos son muy diversos, no solamente

en morfología y ecología, sino también en los compuestos que sintetizan derivados del

metabolismo secundario, como antibióticos, enzimas y colorantes con gran valor biotecnológico

(Calvo, Wilson, Bok, & Keller, 2002; Villanueva et al., 2013). Estas sustancias activas pueden ser

de mucha utilidad para el ser humano, por lo que se investigan con fines de bioprospección

(Sánchez et al., 2013)

Por esta razón, en esta investigación se buscó la caracterización tanto morfológica y molecular

de una pequeña parte de la diversidad de hongos colectados en las provincias de Loja y Zamora

Chinchipe y que se encuentran depositados en el herbario HUTPL. Así mismo evaluaremos el

potencial antibacteriano de estos hongos. Científicamente existe evidencia que el consumo

regular de hongos o de sus componentes biológicos activos se puede lograr un tratamiento

benéfico para muchas enfermedades que padece la población humana (María, López, Quintero

Díaz, & Garcés, 2011).

4

CAPÍTULO I

MARCO TEÓRICO

5

1.1. Reino Fungi

El Reino Fungi o de los Hongos inicialmente fue considerado como parte del reino vegetal, hasta

su posterior separación realizada por Whittaker (1969). Este grupo representa uno de los más

grandes acervos de biodiversidad con actividades ecológicas cruciales en todos los ecosistemas

(Herrera & Ulloa, 1990). Sistemáticamente los hongos se consideran como un grupo heterogéneo,

polifilético, formado por organismos pertenecientes por lo menos a tres líneas evolutivas

independientes (Ulloa & Hanlin 2012), pero mucho más cercanos evolutivamente al Reino animal

(Baldauf & Palmer, 1993).

Los hongos son muy diversos incluyendo mohos, levaduras y las setas (macrohongos en general)

que pueden cumplir diversos roles y se pueden subclasificar coloquialmente como saprotróficos,

liquenizados, micorrizícos y parásitos (Levetin, Horner, & Scott, 2016).

1.2. Características generales de los hongos

Los hongos son organismos tan diversos en funcionalidad, ecología y morfología, pero calzan

adecuadamente como organismos eucariontes donde pueden ser divididos como uni o

pluricelulares que se desarrollan en sitios húmedos con poca luz (Herrera & Ulloa, 1990). Dentro

del núcleo se encuentran uno o dos nucléolos pequeños y varios cromosomas (Deacon, 2006).

Son organismos no móviles, pues no poseen flagelos a excepción de las zoosporas y los

planogametos de los hongos acuáticos. También son aclorófilos y poseen una membrana nuclear

y otros organelos rodeados de membrana así como las demás características que definen a los

eucariontes (Deacon, 2006).

Dentro de la clasificación de los hongos, se incluyen dos divisiones, los hongos verdaderos

(Fungi) que incluyen los Basiodiomycota, los Ascomycota, los Glomeromycota, los Zygomycota,

los Blastocladiomycota, los Chytridiomycota y otros grupos (Hibbett et al., 2007). Estos

organismos, en su mayoría, son aerobios estrictos porque necesitan oxígeno libre para su

crecimiento (Cepero et al., 2012), son filamentosos con crecimiento apical (hifas y micelio),

heterótrofos por absorción, con reproducción asexual y sexual por medio de esporas y sus

membranas se caracterizan por la presencia de ergosterol y quitina (Piepenbring, 2015; Webster

& Weber, 2007). Por otra parte los hongos no verdaderos (pseudohongos), que son los mohos

mucilaginosos, mohos acuáticos y otros grupos muchos de ellos con pared de la célula rica en

celulosa (Webster & Weber, 2007).

1.3. Diversidad en el mundo y distribución en el Ecuador.

Recientemente se estima que a nivel mundial existen más de cinco millones de especies de

hongos, donde alrededor de 75000 especies han sido descritas hasta el momento (Blackwell,

6

2011). Esta aproximación es mucho mayor a clasificaciones anteriores como por ejemplo la

realizada por Hawksworth (2001) donde estima 1.5 millones de especies de hongos basada en

una relación de 6:1 (seis hongos por cada planta vascular). Ecuador es conocido como

megadiverso; si hacemos esta relación de 6:1 tendríamos una estimación de 96000 especies de

hongos ya que el país aproximadamente contiene unas 16500 plantas vasculares (Læssøe &

Petersen, 2008). Esta diversidad fúngica es poco conocida y según bases de datos y estudios

recientes en nuestro territorio se reportan apenas 3776 taxones conocidos, lo que significa que

es solo 4% de los hongos de nuestro país (Læssøe & Petersen, 2008).

1.4. Importancia de los hongos

Los hongos tienen gran importancia en múltiples campos como por ejemplo en la medicina, la

agricultura e inclusive como alimento (Guerra et al., 2007; Pitt & Hocking, 2009). En la medicina

uno de los mayores descubrimientos fue el antibiótico Penicilina, el cual fue obtenido desde el

hongo anamorfo Ascomycete Penicillium notatum (Curtis, Barnes, Schnek, & Massarini, 2008).

Naturalmente o en la agricultura los hongos cumplen variados roles ecológicos donde varios

estudios demuestran que aproximadamente el 80% de las plantas vasculares por medio de sus

raíces están asociadas a hongos, denominando a la asociación micorrizas, en donde hay una

colaboración mutua que permite la resistencia de las plantas a cambios bruscos del ambiente

como sequia o falta de nutrientes en el suelo, así como la resistencia frente a ataques de bacterias

o insectos (Hawksworth, 1991). Los hongos también son importantes a nivel industrial, por

ejemplo, en la creación de materiales para la construcción, industria cervecera o la denominada

mico-remediación (Ramírez, Fernandez, Rodolfi, & Solveig, 2006).

1.5. Clasificación morfológica y molecular de los hongos

La clasificación de los hongos mantiene categorías, niveles o jerarquías, las cuales agrupan a

los especímenes que comparten características muy generales y aquellos que comparten

características muy específicas (visto el 01 de Junio de 2016 en

http://www.inbio.ac.cr/papers/hongos/taxonomia.htm). La nomenclatura que se utiliza para

clasificar a los hongos taxonómicamente establece una serie de categorías (Haro & Melic, 2002),

de las cuales las más importantes son: reino, división, clase, familia, género y especie, contenidas

en el Código Internacional de Nomenclatura Botánica (Hibbett et al., 2007).

La clasificación de los hongos se ha basado principalmente en criterios morfológicos y en las

características de las estructuras de reproducción (Montes, Restrepo, & MacEwen, 2003). En la

actualidad se han comenzado a aplicar técnicas moleculares para crear una clasificación más

http://www.inbio.ac.cr/papers/hongos/taxonomia.htm

7

natural y lograr establecer, relaciones filogenéticas más precisas entre estos organismos (Iwen,

Hinrichs, & Rupp, 2002).

Para clasificar los hongos morfológicamente, se establece una clasificación básica donde se

diferencian las características de los hongos micro y macroscópicos como el tamaño de sus

fructificaciones y la morfología de sus estructuras como hifas, micelios y esporas (Avilés & Granja,

2012). Dentro del grupo de hongos microscópicos, los más conocidos son las levaduras y mohos,

algunos de ellos conocidos coloquialmente como dermatofitos. Respecto a los hongos

macroscópicos su descripción se basa principalmente en determinar los principales caracteres

externos que presenta el cuerpo fructífero o carpóforo (Pfenning & Abreu, 2000).

De acuerdo a estas características y a la revolución molecular en la taxonomía de hongos con la

amplificación por Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) del ADN ribosomal nuclear con

su Espaciador Interno Transcrito (ADNrn ITS-5.8S) y la utilización de bases de datos para definir

las especies, se logró una clasificación filogenética de hongos que soporta varios grupos

morfológicos (Hibbett et al., 2007). Según esta nueva clasificación el Reino Fungi se divide en

seis grupos o filos: Ascomycota, Basidiomycota, Chytridiomycota, Zygomycota,

Blastocladiomycota y Glomeromycota, siendo los más conocidos los Ascomycetes y los

Basidiomycetes (Piepenbring, 2015).

1.6. Ciclo de vida y reproducción de los hongos

Los hongos en su mayoría son haplontes, lo que significa que los núcleos haploides se multiplican

por mitosis, sin embargo también hay algunos hongos que son diplohaplontes (Webster & Weber,

2007). Los ciclos de vida de Basidiomycota y Ascomycota incluyen una fase dicariótica que no

existen en las demás divisiones de los hongos. Se inicia cuando las dos células con núcleos

haploides se unen por plasmogamia y ambos núcleos haploides compatibles se asocian en un

dicario unidos por microtúbulos, no se fusionan, se multiplican por mitosis y la hifa dicariótica

crece y se tabica (fíbula). En algún momento del ciclo de vida, los dos núcleos se encuentran en

una célula madre de un meiosporangio, en la cual se fusionan. En los basidiomicetes, el

meiosporangio se denomina basidio y en los ascomicetes asco. El núcleo diploide resultante no

se multiplica por mitosis sino que se divide por meiosis y los cuatro núcleos haploides finales se

llaman en meiosporas y al ser liberadas dispersarán los resultados de la recombinación genética

(Piepenbring, 2015).

1.7. Metabolismo de los hongos

Los hongos son muy diversos, no solamente en morfología y ecología sino también en

compuestos químicos que sintetizan, como carbohidratos, aminoácidos, proteínas y compuestos

8

cíclicos, compuestos que tienden a ser específicos de género o especie (Cepero et al., 2012;

Piepenbring, 2015). Su metabolismo se puede dividir en dos grandes categorías: primario y

secundario, según la función que tengan generados por estos metabolismos en el ciclo de vida

del hongo (Jennings, 1995).

Los metabolitos primarios son esenciales para el crecimiento de los hongos, participan en la

regulación del metabolismo, de intermediarios biosintéticos y en el metabolismo energético. Los

metabolitos secundarios, en cambio se originan como derivados del metabolismo primario y

tienen en común que se producen al final de la fase de crecimiento o cuando el crecimiento es

limitado por el sustrato. Estos compuestos químicos son características útiles para distinguir y

clasificar los hongos (Bushell, 1995). Estas sustancias pueden ser compuestos bioactivos que

presentan actividad antibacteriana, antifúngica, insecticida, nematicida y protozoicida cuando

crecen junto con otros organismos (Deacon, 2006).

1.8. Actividad antibacteriana

La actividad antibacteriana se define como un antagonismo de sustancias naturales (metabolitos

secundarios) o sintéticas contra bacterias en concentraciones pequeñas pero de alta sensibilidad

(Bauer, Kirby, Sherris, & Turck, 1966) como se explica seguidamente.

1.8.1 Concentración mínima inhibitoria

La concentración mínima inhibitoria (CMI) se considera un estándar para la determinación de la

sensibilidad de los microorganismos a los antibióticos, por lo tanto, se usa para juzgar el

desempeño de todos los demás métodos de pruebas de sensibilidad. Este método se utiliza en

laboratorios de diagnóstico para confirmar la resistencia inusual y dar una respuesta definitiva a

la que se obtiene mediante otros métodos de prueba, además determina la actividad in vitro de

nuevos antimicrobianos (Gillard, Al-Dahir, & Brakta, 2016). La CMI se define como la

concentración más baja de un fármaco que inhibe el crecimiento visible de un organismo después

de la incubación, este período se extiende según los organismos a estudiar, como los anaerobios

que requieren incubación prolongada para el crecimiento (Andrews, 2001).

La técnica de microdilución en caldo ha sido ampliamente difundida y se la emplea para

determinar la CMI en un gran número de muestras. Su ventaja se establece en el aumento de la

sensibilidad para cantidades pequeñas, lo cual es conveniente cuando se trabaja con productos

naturales, además permite diferenciar entre un efecto bacteriostático de un bactericida (Langfield

et al., 2004).

9

CAPÍTULO II

MATERIALES Y MÉTODOS

10

2.1. Especímenes o cepas

Se trabajó con 20 cepas de hongos puros (Tabla 1), aislados desde hongos que fueron

recolectados por el equipo de la sección fungario del herbario HUTPL. Estos especímenes

pertenecen a la colección cepario dentro del fungario y se encuentran almacenados en medio

agar papa dextrosa (PDA). Estas cepas fueron seleccionadas principalmente por ser

tentativamente Basidiomycetes y otras características destacadas como su morfología,

pigmentación y rápido crecimiento.

Tabla 1. Cepas de hongos incluidas en este estudio.

N/D = No determinado.

Fuente: Autora

2.2. Identificación morfológica

Para la identificación morfológica de los hongos efectuamos una descripción macroscópica de la

cepa cultivada en medio PDA (crecimiento, coloración de micelio). Microscópicamente se

evaluaron las diferentes estructuras de los hongos como hifas, esporas (conidias), fíbulas, entre

otras. Las características microscópicas fueron registradas en ilustraciones principalmente para

las cepas positivas en pruebas antagónicas. Todas las cepas se registraron fotográficamente.

N. Código de colecta* Código herbario Localidad Lugar de recolección

1 Daniels-3294 H1121C Loja Vilcabamba




5 EM-115 H968C Loja Parque Nacional Podocarpus

6 EM-169 H1086C Zamora Chinchipe El Tambo


8 EM-191 H1126C Zamora Chinchipe Bombuscaro

9 EM-219 H1152C Zamora Chinchipe Nangaritza



12 EM-280 H1217C Loja Zapotillo



15 EM-373 H1310C Loja Puyango

16 EM-397 H1334C Loja Puyango


18 OF001 N/D Loja Cajanuma

19 OF004 N/D Loja N/D

20 OF005 N/D Loja Cajanuma

* Los códigos de colecta serán referenciados en todo el trabajo.

11

Las estructuras y mediciones se anotaron en descripciones que fueron comparadas con guías

específicas o claves taxonómicas para clasificarlos a diversos niveles como género y especie.

2.3. Identificación molecular

Se utilizó el Kit Extract-N-AmpTM PCR Ready Mix de PCR directa usando fragmentos de micelio

del cultivo del hongo según las indicaciones del fabricante. Se amplificó la región ITS-5.8S y LSU

parcial (D1/D2) de ADNrn a través de primers universales: ITS1 (5′-

TCCGTAGGTGAACCTGCGG -3’; White et al., 1990) y NL4 (5′- GGTCCGTGTTTCAAGACGG -

3′; O’Donnell, 1993).

Las condiciones de corrida de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) fueron las siguientes:

desnaturalización a 98ºC por 5 minutos, seguido por 40 ciclos: desnaturalización a 98ºC por 10

segundos, 55ºC por 20 segundos para el anillamiento de los primers, extensión a 72ºC durante

30 segundos y una extensión final a 72ºC por 10 minutos. Se empleó la polimerasa PhireTM Hot

Start II ADN polimerasa. El volumen final de reacción de la PCR fue de 20 µl.

Los resultados fueron evaluados por electroforesis en gel de UltraPureTM Agarosa (Invitrogen) al

1% [agar en solución 1X de Gel Red (Biotium), según norma de manufactura]. Se tomó 2 μl de

producto de PCR más 2 μl de azul de bromofenol y fueron comparados contra un marcador de

peso molecular 1Kb Plus DNA Ladder (Invitrogen) en buffer de corrida SB 1X (Borato de Sodio).

Las condiciones de corrida de electroforesis fueron: 128 V, 300 mA durante 20 minutos y el gel

se reveló bajo luz UV a 260 nm.

Los productos de PCR fueron purificados con el kit QIAquick PCR Purification Kit Protocol

(Qiagen) y posteriormente enviados a secuenciar a la empresa Macrogen (Seoul - Korea).

2.4. Comparación en BLAST

Mediante la utilización de la base de Datos GenBank, NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) y su

opción BLAST, (Basic Local Alignment Search Tool) se comparó las secuencias obtenidas de los

hongos. Las tres secuencias más similares desde la base de datos fueron tomadas como

referenciales para determinar los diferentes niveles taxonómicos como orden, familia, género y

especie.

2.5. Pruebas antagónicas bacterianas en medio sólido

Las pruebas antagónicas bacterianas de todas las cepas de hongos se efectuaron en paralelo a

la caracterización morfológica y molecular.

12

Para la evaluación de la capacidad antagónica in vitro de los hongos, se realizó el ensayo con

bacterias patógenas Gram + y Gram -. Estas cepas bacterianas (Tabla 2) fueron proporcionadas

por la sección de Bioensayos perteneciente al departamento de Química Aplicada de la UTPL.

Para la elaboración del ensayo, se partió de reservas mantenidas a -82ºC y se cultivaron en

medios nutritivos adecuados (Tabla 2) a 37°C por 14 horas. A partir de estos cultivos se realizó

un inóculo en NaCl 0,9%, equivalente a 0,5 McFarland, el cual se distribuyó homogéneamente

sobre placas de Agar Muller Hinton (DIFCO). Se realizó este procedimiento por cada bacteria que

se evaluó y por triplicado. Posterior a ello, se realizaron pocillos de 10 mm de diámetro sobre el

agar inoculado de preferencia siguiendo una estructura similar a un triángulo. Sobre los pocillos

realizados se transfirió el material fúngico, el cual fue obtenido como discos de 10 mm de diámetro

a partir de cultivos frescos mantenidos en PDA. Se requiere que la caja Petri este totalmente llena

de micelio y así haya homogeneidad y suficiente material para obtener los discos.

La transferencia de los discos de micelio se lo hizo en medio ambiente y material estéril (pinzas

y cabinas de flujo laminar), seguido de incubación por 24 horas a 37°C.

Al final de este tiempo se verificó el efecto antibiótico del hongo mediante observación y medición

del diámetro del halo de inhibición (Figura 1).

13

Figura 1: Esquema secuencial de la prueba de antagonismo

Fuente: Autora

Tabla 2. Bacterias patógenas de interés clínico y sus respectivos medios de cultivo específicos utilizados

en el estudio.

Fuente: Autora

Bacterias patógenas Medio de cultivo

Gram positivas

Enterococcus faecalis Infusión cerebro-corazón (BHI)

Staphylococcus aureus Soya tripticasa (TSC)

Gram negativas

Soya tripticasa (TSC) Escherichia coli

Klebsiella pneumoniae

Proteus vulgaris Muller Hinton

Pseudomona aeruginosa

Salmonella typhimurium Oxoid

14

2.6. Obtención de extractos fúngicos

Los hongos con probable efecto antibiótico se sembraron inicialmente en 50 mL de medio líquido

YNPD. Se incubaron a temperatura ambiente en agitación hasta que el micelio colonice el medio,

luego se transfirió a 150 mL de YNPD y en iguales condiciones anteriores se incubó hasta que el

crecimiento sature el medio. Así sucesivamente se transfirió el cultivo a cantidades más elevadas

de medio líquido por ejemplo 2000 mL de YNPD.

El micelio desarrollado se separó del medio de cultivo por filtración al vacío. El micelio obtenido

se secó a 30ºC por 12 horas. Se determinó todo el peso seco de la biomasa, esta biomasa fue

colocada en un recipiente, y se añadió 200 mL de acetato de etilo y se mantuvo en el shaker a

200 rpm durante 12 horas con el fin de que el solvente capture los metabolitos presentes en el

micelio. Al finalizar el tiempo se filtró el macerado.

Al filtrado se adicionó resina de absorción Amberlite® XAD7HP, y se agitó por 30 min, seguido

de un nuevo filtrado. Nuevamente se añadió acetato de etilo al filtrado en proporción (1:1) para

extraer los metabolitos remanentes. Se separó las fases sólidas de las líquidas y se efectuó

mediante en embudo de decantación.

La resina resultante se colocó en un frasco con 200 mL con acetato de etilo más agitación a 100

rpm por dos horas seguido de filtrado al vacío. Este proceso se repitió hasta que la resina se

tornó clara.

Tanto el acetato de etilo obtenido desde el macerado y del medio de cultivo se concentró mediante

rotaevaporador a 35ºC. El concentrado final se recuperó con metanol y se colocó en un vial de

vidrio y fue secado al vacío. Al final del secado se obtuvo el peso seco del extracto.

Se calculó el rendimiento de los extractos empleando la siguiente fórmula:

𝑅 =𝑃𝑒𝑠𝑜 𝑑𝑒 𝑙𝑎 𝑏𝑖𝑜𝑚𝑎𝑠𝑎 𝑠𝑒𝑐𝑎

𝑃𝑒𝑠𝑜 𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙 𝑑𝑒𝑙 𝑒𝑥𝑡𝑟𝑎𝑐𝑡𝑜 × 100%

Los extractos se almacenaron en refrigeración hasta la realización de los posteriores ensayos.

2.7. Concentración mínima inhibitoria

La determinación de CMI, de los diferentes extractos obtenidos se realiza por la técnica de

Microdilución en Caldo contra las siete bacterias patógenas. Únicamente se evaluaron los

extractos de aquellos hongos que presentaron halos de inhibición en las pruebas antagónicas.

Para ello los extractos de los hongos se evaluaron a concentraciones de 20 mg/mL como

concentración máxima o a concentraciones menores de acuerdo al rendimiento obtenido. Como

control positivo se empleó Tetraciclina a una concentración de 5 mg/mL y como control negativo

el vehículo empleado para disolver el extracto, el cual fue DMSO (Dimetilsulfóxido).

15

La prueba se realizó en placas esterilizadas de 96 pocillos, mediante diluciones dobles seriadas.

Del medio Mueller Hinton se transfirieron 180 µL a cada pocillo de la primera fila de la placa, en

los pocillos restantes se colocaron 100 µL del mismo caldo. A continuación se colocaron 20 µL

del material fúngico diluidos en Dimetilsulfóxido solo a los pocillos de la primera fila de la placa;

excepto a los tres últimos pocillos los cuales van a contener: el primero, 200 µL de caldo Mueller

Hinton como control de esterilidad, el segundo, un control negativo con 180 µL de caldo Muller

Hinton + 20 µL de DMSO y el último un control positivo, que es una mezcla de 180 µL de caldo

Muller Hinton + 20 µL de Tetraciclina de 5 mg/mL para todas las bacterias. Las placas se

incubaron a una temperatura de 37ºC durante 24 horas.

16

CAPÍTULO III

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

17

3.1. Morfología

Se registraron fotográficamente 18 cepas de hongos (Anexo 1). Las dos cepas restantes no se

registraron por presentar contaminación. De las 18 cepas algunas de ellas mostraron

características distintivas de su anamorfo permitiendo su identificación a nivel de género como el

caso de Ganoderma sp., donde se evidencia la presencia de fíbulas (Anexo 1, Figura 1, I).

Otras cepas no presentaron estructuras asexuales definitorias lo que solamente se registró su

estado estéril (Anexo1, Figura1, C). Es bien descrito en diversos estudios que muchos hongos

en cultivo in vitro producen micelio estéril y otros producen solamente el anamorfo (Cepero et al.,

2012) pobremente algunos podrían generar sus estados teleomorficos o sexuales en condiciones

especiales (Deacon, 2006).

Se hicieron ilustraciones detalladas únicamente para los hongos positivos en las pruebas

antagónicas debido al interés que estos nos generan a nivel de biotecnología. No obstante se

efectuarán a futuro las descripciones detalladas para los hongos restantes. Los tres hongos

positivos fueron Clonostachys sp., Pycnoporus sanguineus y Pyrenochaetopsis microspora.

Clonostachys sp. pertenece a los ascomycetes de la familia Bionectriaceae y se caracteriza por

presentar colonias algodonosas con superficie polvorienta y de coloración naranja clara tanto en

su teleomorfo como en su cultivo anamorfo, esta coloración se debe a la producción de

esporodoquios, masas de color amarillo claro (Schroers, Samuels, Seifert, & Gams, 1999),

además genera conidiódoros dimórficos primarios y secundarios. Los conidióforos primarios

pueden ser similares a Verticillium sp. y los secundarios pueden contener conidias hialinas que

se separan una de otra (Figura 2), como se ha descrito en Alvindia & Hirooka (2011). Esta especie

de hongo es saprotrófo el cual ha sido reportado como micoparásito de hongos y nematodos

(Toledo, Virla, Humber, Paradell, & Lastra, 2006).

18

Figura 2: A. Cepa Daniels-3300 = Clonostachys sp. en medio sólido en PDA. Microscopía. B. Conidióforos sencillos verticilados. C, D. Células hinchadas de conidióforos verticilados. E, F Ilustraciones. Las barras representan 10 µm

Fuente: Autora

Pycnoporus sanguineus, perteneciente a los basidiomycetes de la familia Polyporaceae se

caracteriza por ser rojizo en su teleomorfo y anamorfo en cultivo. Microscópicamente genera

fíbulas (Figura 3) como lo ha demostrado Sigoillot et al. (1999). P. Sanguineus es un hongo

considerado filamentoso, saprotrófo, que causa pudrición blanca en maderas muertas (Nobles &

Frew, 1976).

19

Figura 3: A. Cepa EM-281 = Pycnoporus sanguineus en medió sólido de PDA. B. Microscopía, presencia

de fíbulas. C. Ilustración con determinación clara de sus fíbulas. Las barras representan 10 µm

Fuente: Autora

Phoma leveillei var. microspora, actualmente reconocido como Pyrenochaetopsis microspora, se

ha descrito como micoparásito de hongos y de plantas como las gramíneas (de Gruyter et al.,

2010). Esté hongo pertenece a los ascomycetes de la familia Cucurbitariaceae (de Gruyter et al.,

2010). En el cultivo anamorfo presentó colonias de margen irregular marrón oscuro,

oscureciéndose hacia el centro generando micelio aéreo de color gris como en su teleomorfo

descrito en Chen, Jiang, Zhang, Cai, & Crous, (2015). Este hongo no mostró estructuras

asexuales definitorias (Figura 4), pero según bibliografía este hongo presenta, conidióforos,

conidias cilíndricas o elipsoidal a alantoides e hifas septadas, además tiene gran similitud con

Pyrenochaetopsis leptospora diferenciándose solamente por la longitud de las conidias (Crous,

Quaedvlieg, & Groenewald, 2014; de Gruyter et al., 2010).

20

Figura 4: A. Cepa Daniels-3294 = Pyrenochaetopsis microspora en medio sólido de PDA. B. Microscopía, Células monilioides (flecha blanca), células estériles sin fluidos y pigmentadas (flecha negra). La barra representa 10 µm

Fuente: Autora

3.2. Comparación de similitud genética

Se obtuvo secuencias amplificadas para la región ITS-5.8S desde 18 cultivos, los cuales

presentan altos porcentajes de cobertura y similitud al realizar la búsqueda del BLAST (Tabla 3).

Estas secuencias nos permitieron clasificar a nuestras cepas a diferentes niveles como ordenes,

familias, géneros y especies. Esto sugiere a este marcador muy útil en los estudios de hongos,

ratificando la región ITS como marcador universal de hongos (Schoch et al., 2012). Tres

secuencias no permitieron observar una buena similitud con secuencias de la base de datos, sin

embargo, no podemos descartar que estas secuencias puedan pertenecer a especies no

registradas o pueden ser secuencias erróneas (Nilsson et al., 2006).

Tabla 3. Comparación y búsqueda de BLAST para las secuencias ITS-5.8S obtenidas desde los cultivos en el presente estudio.

ITS-5.8S Similitud en

pares de bases

Cobertura en

alineamiento

E value *

Ascomycetes

1 (Daniels-3294)

Pyrenochaetopsis microspora, KM355992.1* 100% 96% 6e-176

Leptosphaeria sp. HE584912.1* 100% 96% 6e-176

Perisporiopsis sp. HM031458.1* 100% 96% 6e-176

21

ITS-5.8S Similitud Cobertura E value

Basidiomycetes

2 (Daniels-3296)

Polyporus submelanopus, JQ964424.1* 89% 100% 1e-98

Trametes mimetes, JN645074.1* 89% 100% 1e-97

Hexagonia tenius, KP715549.1* 89% 100% 3e-94


Ascomycetes

3 (Daniels-3300)

Clonostachys sp. KC007312.1* 99% 99% 0.0

Bionectria sp. “Clonostachys sp.” KC007301.1* 99% 99% 0.0

Clonostachys sp. HQ130701.1* 99% 99% 0.0


Basidiomycetes

4 (Daniels-3308)

Lepiota sp. JN224828.1* 98% 99% 4e-91

Lepiota sp. JN224825.1* 97% 99% 2e-89

Lepiota pilodes, EF080865.1* 97% 99% 2e-89


Ascomycetes

5 (EM-115)

Bisporella sp. AY89326.1* 94% 98% 3e-98

Calycina citrina, KC412005.1* 93% 98% 1e-96

Bisporella citrina, GQ411507.1* 93% 98% 1e-96


Basidiomycetes

6 (EM-191)

Amauroderma intermedium, KR816524.1* 96% 98% 0.0

Amauroderma calcigenum, JX982565.1* 93% 96% 2e-176

Amauroderma aurantiacum, JX310840.1* 92% 98% 4e-174


Ascomycetes

7 (EM-219)

Trichoderma longibrachiatum, KM103342.1* 99% 99% 0.0

22

Thichoderma gamsii, KX009499.1* 99% 97% 0.0

Thichoderma koningiopsis, KR995115.1* 99% 97% 0.0


Basidiomycetes

8 (EM-280)

Gloeophyllum striatum, KC345720.1* 97% 96% 0.0

Gloeophyllum trabeum, JN182912.1* 93% 97% 0.0

Gloeophyllum sepiarium, JQ673112.1* 93% 95% 0.0


Basidiomycetes

9 (EM-281)

“Trametes sanguínea”, Pycnoporus sanguineus,

KF850157.1*

99% 100% 1e-152


KF850156.1*

99% 100% 1e-152


KF850155.1*

99% 100% 1e-152


Basidiomycetes

10 (EM-322)

Ganoderma coffeatum, KU315204.1* 96% 97% 1e-153

Ganoderma subresinosum, KJ654467.1* 93% 99% 2e-140

Ganoderma pseudoferrum, FJ392279.1* 93% 99% 2e-140


Basidiomycetes

11 (EM-397)

Eutypella scoparia, EU702434.1* 98% 100% 2e-171

Eutypella sp. EU821493.1* 97% 100% 1e-162

Eutypella sp. EU821475.1* 97% 97% 1e-162


Zygomycetes

12 (EM-541)

Mortierella alpina, AB516323.2* 96% 95% 0.0

Aspergillus fumigatus, KU350719.1* 95% 95% 0.0

Mortierella sp. JF439487.1* 95% 95% 0.0

Basidiomycetes


23

13 (OF001)

Pleurotus djamor KP026246.1* 99% 100% 2e-180

Pleurotus sp. KR155119.1* 99% 100% 2e-180

Pleurotus djamor, KF280325.1* 99% 100% 2e-180


Basidiomycetes

14 (OF004)

Stereum qausapatum, KT876601.1* 94% 98% 0.0

Stereum hirsutum, KR909200.1* 94% 98% 0.0

Stereum rugosum, AJ006685.1* 94% 98% 0.0


Basidiomycetes

15 (OF005)

Ganoderma australe, KF605664.1* 88% 99% 3e-125

Ganoderma annulare, JQ520160.1* 88% 99% 3e-125

Ganoderma adspersum, AJ006685.1* 88% 99% 3e-125

* Números de accesión para las tres secuencias con porcentaje de similitud más elevado.

* E value (logaritmo estadístico de significancia)

Nota: Los nombres de sinónimos se muestran entre comillas

Fuente: Autora

Para las cepas Daniel-3296, EM-191, EM-280, EM-281, EM-322, OF001, OF005 (Tabla 3) su

identificación molecular coincide con la determinación morfológica clasificándolos dentro de los

Basidiomycetes, principalmente por la presencia de fíbulas características distintivas de este

grupo (Horton, Bakkeren, Klosterman, Garcia, & Gold, 2005). Entre las especies identificadas se

encuentran Amauroderma intermedium, Ganoderma australe, Ganoderma coffeatum,

Gloeophyllum striatum, Polyporus submelanopu, Pleurotus djamor, Pycnoporus sanguineus

(=Trametes sanguínea).

Algunas de estas especies tienen esencial importancia en la naturaleza e industria por producir

sustancias bioactivas. Por ejemplo, Pycnoporus sanguineus produce enzimas capaces de

degradar la lignina (Agrios, 2005), y también genera sustancias antibióticas (Acosta et al., 2010).

Pleurotus sp. es una especie comestible que tiene un alto potencial nutritivo y es producido y

consumido a nivel mundial (Andrade, 2012). Ganoderma sp. ha sido estudiado ampliamente como

fuente de metabolitos bioactivos donde se ha encontrado compuestos activos con actividad

24

antiviral, antitumoral, hematólógica, antioxidante, antinflamatoria y antidiabetes (Arboleda &

Mejia, 2010; Trigos & Suárez, 2011).

La cepa Daniels-3300 después de la determinación morfológica coincidió con las características

de la especie Clonostachys sp. perteneciente al grupo de Ascomycetes. Este hongo no

corresponde a la fructificación de Basidiomycete del cual fue aislada. En muchos trabajos como

el de Pfenning & Abreu (2000), se sugiere que muestras ambientales pueden contener elevada

contaminación por otros microorganismos. No obstante esté hongo es importante ya que muchos

estudios lo muestran como potencial agente de control biológico para hongos patógenos de

plantas (Moraga, Opazo, Zaldúa, González, & Sanfuentes, 2011).

Las siete cepas restantes no presentaron estructuras morfológicas definitorias por lo que no se

pudo confirmar con los datos obtenidos en el análisis molecular. Por el alto porcentaje de

resultados claros y concisos nosotros sugerimos a los datos moleculares como correctos para las

diferentes cepas sin morfología. Es conocido que varios estudios únicamente hacen referencia a

sus secuencias de ADN obtenidas, ya que muchos hongos en cultivo in vitro sólo producen

micelio estéril o estructuras anamorfas que no permiten una correcta identificación morfológica

(Cepero et al., 2012).

3.3. Pruebas antagónicas en medio sólido

Se evaluó el potencial antibacteriano para los 20 cultivos (Tabla 1), frente a siete bacterias

patógenas de interés clínico (Tabla 2). De todas las muestras, tres cepas, Clonostachys sp.,

Pycnoporus sanguineus y Pyrenochaetopsis microspora (Figura 2, 3 y 4) fueron positivos para

actividad biológica Tabla 4.

Tabla 4. Resultados de pruebas antagónicas mostrando el diámetro de halo de inhibición.

Bacterias Patógenas

Cultivos

Gram Positivas Gram Negativas

Enterococcus

faecalis

Staphylococcus

aureus

Escherichia

coli

Klebsiella

pneumoniae

Proteus

vulgaris

Pseudomona

aeruginosa

Salmonella

typhimurium

Clonostachys sp. (Daniels-3300)

NA Activo Ø 30mm

NA NA NA NA NA

Pyrenochaeptosis

microspora (Daniels-3294)

NA

Activo Ø 18mm

NA

NA

NA

NA

NA

Pycnoporus

sanguineus (EM-281)

NA

Activo Ø 30mm

Activo Ø 15mm

NA

Activo Ø 26mm

NA

Activo Ø 16mm

25

NA: No activo

Ø: Diámetro de inhibición

Fuente: Autora

El cultivo Daniels-3300, identificado como Clonostachys sp., es utilizado generalmente como

agente de control biológico para hongos patógenos de plantas (Nordström, 2014). También se ha

demostrado que tiene actividad antibacteriana frente a Bacillus megaterium, Bacillus subtilis,

Clostridium perfringens, Escherichia coli, Micrococcus tetragenus y Staphylococcus aureus. Las

sustancias activas encontradas en este género son principalmente los Bisorbicillinoides (Zhai et

al., 2016). En este ensayo, Clonostachys sp. mostró actividad para Staphylococcus aureus,

(Figura 5), mientras que no presentó actividad para el resto de bacterias analizadas.

Probablemente los resultados negativos para las otras bacterias se puede deber a que no

seguimos las mismas condiciones de crecimiento señaladas en el estudio de referencia, donde

especifica que los metabolitos secundarios de este hongo se producen sólo bajo condiciones

fisiológicas específicas (Anupama, Narayana, & Vijayalakshmi, 2007).

Pyrenochaetopsis microspora es de gran interés ya que estudios relacionados han descrito que

puede tener actividad antibacteriana y compuestos activos como los Phomalevone A, B, y C

(Shim, Baltrusaitis, Gloer, & Wicklow, 2011). Estudios han demostrado que P. microspora

presenta sensibilidad para bacterias como Bacillus subtilis, Escherichia coli, y Staphylococcus

aureus (Shim et al., 2011). Sin embargo, en dicho estudio no se especifica las condiciones de

mantenimiento del cultivo. Esta variable es importante y puede modificar la generación de

metabolitos y por ende la actividad antibacteriana que presenta la especie, así esta razón puede

explicar porque en este ensayo solo mostró sensibilidad a S. aureus (Figura 5) y no para las

otras bacterias que han sido evaluadas.

26

Figura 5: Antagonismo positivo con halos de inhibición generados por Chonostachys sp. (A) y Pyrenochaetopsis microspora (B) frente a Staphylococcus aureus.

Fuente: Autora

Pycnoporus sanguineus, es un hongo de gran interés biotecnológico debido a sus compuestos

activos, entre ellos el Poliporin aún en estudio y la Cinabarina que es un pigmento naranja. Estos

compuestos son los responsables de la actividad antibacteriana como lo ha descrito Munoz et al.

(2015). Este pigmento se reporta con actividad contra Bacillus cereus, Enterococcus faecalis, E.

faecium, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Listeria mesenteroides, Lactobacillus

plantarum, Pseudomona aeruginosa, Salmonella sp., S. typhi, Staphylococcus aureus y

Streptococcus spp., pero tiene mayor actividad antibiótica contra bacterias Gram + que frente a

Gram - (A. Smânia et al., 1995; E. Smânia, Smânia, Loguercio, & Gil, 1997). En nuestro ensayo

P. sanguineus mostró actividad contra Escherichia coli, Proteus vulgaris, Salmonella typhimurium

y Staphylococcus aureus (Tabla 4 y Figura 6). De igual forma se evidencio una mayor sensibilidad

para bacterias Gram + (S. aureus) ya que generó una mayor zona de inhibición (30 mm). Con

respecto del resto de bacterias patógenas no presento actividad inhibitoria, lo que se puede deber

a diferentes mecanismos de defensa que poseen las bacterias para resistir la acción de los

antibióticos (Fernández, López, Ponce, & Machado, 2003).

27

Figura 6: Antagonismo positivo con halos de inhibición generados por Pycnoporus sanguineus frente a A. Escherichia coli, B. Proteus vulgaris, C. Salmonella typhimurium, D. Staphylococcus aureus.

Fuente: Autora

3.4. Extractos y rendimiento de extractos positivos

Los extractos fúngicos se obtuvieron de los cultivos con actividad antibacteriana y presentaron

diferentes características tanto para la coloración como para la consistencia (Tabla 5). Estás

características varían entre los cultivos ya que los extractos son mezclas complejas de cientos

de compuestos, entre ellos los antibacterianos que les otorgan características distintivas entre

géneros (Lynd et al., 2010).

En las características presentes, se determinó que hubo un cambio de coloración respecto al

cultivo en caja Petri en comparación al que presentó en el extracto (Tabla 5), esta variación se

dio principalmente en los cultivos de Pycnoporus sanguineus y Pyrenochaetopsis microspora.

Nosotros sugerimos que el cambio de la coloración según el medio (sólido o líquido) de cultivo

influye altamente sobre la actividad biológica, ya que los hongos en cultivos sólidos presentaron

diferente coloración y mayor actividad en pruebas antagónicas que al emplear el extracto en CMI

(Tabla 5). Varios hongos se han reportado con buena actividad antibiótica gracias a los pigmentos

28

que producen desde sus cultivos puros en medio sólido como por ejemplo Fusarium javanicum

(Arnstein & Cook, 1947). Los pigmentos activos pueden ser muy variables y su producción es

altamente relaciona a las condiciones de crecimiento como: temperatura, pH, oxígeno disuelto,

entre otros (Brakhage, 2004).

Tabla 5. Diferencia de coloración según medio cultivo sólido (PDA) o medio líquido YNPD. Para los diferentes extractos positivos.

Cepas Coloración de cultivo en placa Coloración del cultivo en medio líquido


Amarillo Claro Amarillo Claro

Pyrenochaeptosis microspora (Daniels-3294)

Gris Café Oscuro

Pycnoporus sanguineus (EM-281)

Anaranjado Amarillo Oscura

Fuente: Autora

El rendimiento de los extractos fue muy variable de los tres hongos con actividad positiva según

su peso (Tabla 6).

El cultivo de Clonostachys sp. tuvo el mayor rendimiento pese a su pequeña producción de

biomasa. Esto indica que el rendimiento de los extractos no es directamente proporcional a la

cantidad de biomasa y esta puede variar dependiendo de la naturaleza química de los metabolitos

y la polaridad del disolvente (León et al., 2011).

Tabla 6: Pesos de la biomasa de los extractos y su correspondencia con el rendimiento.

Cultivos Peso seco (g) Peso extracto (g) Rendimiento peso seco/ peso

extracto


2,5154

0,8020

31.89 p/p

Pyrenochaeptosis microspora (Daniels-3294)

14.0501

1.4057

10.00 p/p

Pycnoporus sanguineus (EM-281)

16.5678

1.2321

7.47 p/p

Fuente: Autora

3.5. CMI según los extractos para diferentes bacterias

Las cepas de Clonostachys sp. y Pyrecnochaeptosis microspora mostraron un CMI para ciertas

bacterias (Tabla 7). No obstante Pycnoporus sanguineus no tuvo actividad de CMI a pesar de ser

activo en las pruebas antagónicas (Tabla 7, Figura 6).

Tabla 7. CMI de los diferentes extractos frente a las diferentes bacterias de interés clínico.

29

NA: No activo

Fuente: Autora

El cultivo de Pycnoporus sanguineus, no presentó actividad antibiótica frente a ninguna cepa

bacteriana, no obstante en estudios similares muestran esta especie con valores de CMI de 1,7-

5,9 mg/ml, frente a la muchas bacterias inclusive las utilizadas en esta investigación (Acosta et

al., 2010). El resultado negativo para esta cepa puede deberse a la variación de condiciones de

cultivo como mencionado anteriormente, lo cual disminuye la producción de metabolitos por parte

del organismo (E. Smânia et al., 1997).

El extracto de Clonostachys sp. mostró actividad para bacterias Gram +, Enterococcus faecalis,

Staphylococcus aureus, ambos en una concentración de 1000 µg/ml. Por otra parte el extracto

de Pyrenochaetopsis microspora presentó actividad contra las mismas bacterias pero en

concentración de 1000 µg/ml y 4000µg/ml respectivamente, además fue activo para una bacteria

Gram -, Klebsiella pneumoniae, en una concentración de 4000 µg/ml.

Según Holetz et al.(2002) quién clasifica la actividad antibacteriana y establece valores > 1000

µl/mL como inactiva, 500 a 1000 µl/mL como débil, 100 a 500 µl/mL como moderada, y < 100

µl/mL para buena, nos permite sugerir a nuestros compuestos como inactivos debido a su elevado

valor de CMI. Esta inactividad se define como la necesidad de demasiada concentración de

extracto para poder controlar el desarrollo y actividad antibacteriana. Como consecuencia

descartamos estos extractos para el tratamiento de enfermedades producidas por bacterias en el

ser humano. No obstante estos hongos podrían poseer un buen potencial para fines de

bioprospección, ya que existe un amplio campo de aplicaciones de los hongos y sus compuestos

ecológicamente en micorremediación o en la industria por ejemplo para el biocontrol de plagas

como lo es el caso de Clonostachys sp. (Moraga et al., 2011).

CONCENTRACIÓN MÍNIMA INHIBITORIA

EXTRACTOS

Bacterias Patógenas

Gram Positivas Gram Negativas

Enterococcus

faecalis

Staphylococcu

s aureus

Escherichia

coli

Klebsiella

pneumoniae

Proteus

vulgaris

Pseudomona

aeruginosa

Salmonella

typhimurium


1000 µg/ml

1000µg/ml

NA

NA

NA

NA

NA

Pyrenochaeptosis.

microspora (Daniels-3294)

1000 µg/ml

4000µg/ml

NA

4000µg/ml

NA

NA

NA

Pycnoporus.

sanguineus (EM-281)

NA

NA

NA

NA

NA

NA

NA

30

CONCLUSIONES

Se logró la identificación a nivel de género y especie de ocho especímenes con una elevada

coincidencia entre los resultados morfológicos y moleculares.

Las especies Clonostachys sp., Pycnoporus sanguineus, y Pyrenochaetopsis microspora

resultaron positivos en la prueba de actividad antagónica, frente a Escherichia coli, Proteus

vulgaris, Salmonella typhimurium y Staphylococcus aureus, con halos de inhibición desde 18 a

30 mm.

Las características de cultivo (sólido o líquido) pueden afectar la generación de metabolitos

secundarios en los hongos y por ende afectar la actividad antibacteriana.

31

BIBLIOGRAFÍA

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38

ANEXOS

39

ANEXO 1. Fotografías de las cepas estudiadas

Microscopía de las cepas sin actividad antibacteriana con tinción floxine al 0.1 % A. Daniels-3296 Fíbulas, B. Daniels-3308 Conidiosporas pigmentadas, C. EM-115 Clamidosporas , D. EM-188 Conidiosporas pigmentadas, E. EM-191 Fíbulas, F. EM-219 Clamidosporas, G. EM-253 Fíbulas, H. EM-280 Fíbulas, I. EM-322 Fíbulas, J. EM-373 Ovillo de hifas, K. EM-397 Células con fluidos celulares ( flecha negra), células estériles sin fluidos celulares (flecha blanca), L. EM-541 Células con fluidos celulares, M. OF001 Fíbulas, N. OF004 Células con fluidos celulares ( flecha negra), células estériles sin fluidos celulares (flecha blanca) , O.OF005 Fíbulas. Barras representan 10 µm

40

ANEXO 2. Secuencias ITS-5.8S, obtenidas para las diferentes cepas estudiadas.

EM-115

TCCCCAACGTTGCTTTGGCGGGCCGCCCCGGGGCCGCCGGCTGCGGCCGG

CGCGTGCCCGCCAACAGACCCCCTCAAACCCTGAATGTATGTGTCGTCCG

AGTACGATGTAATGATGAAAACTTTCGACAACGGATCTCTTGGTTCTGGC

ATCGATGAATAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGATTTGCATAATT

CAGTGAATCATCCAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCCTTGGTATTCGGG

EM-191

GGGATCTGGAGATTGACTGGGTTGTAGCTGGCCTTCCGAGGCATGTGCAC

GCCCTACTCATCCACTCTACACCTGTGCACTTACTGTGGGCTTCAGATTG

TGAAACGGGCCTGTTCGCATGGCCTCGGGAAACGTCTGCGGCCTACGTTT

ACCACAAACTCTATAAAAGTATCAGAATGTGTATTGCGACGTAACGCATC

TATATACAACTTTCAGCAACGGATCTCTTGGCTCTCGCATCGATGAAGAA

CGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATC

GAATCTTTGAACGCACCTTGCGCTCCTTGGTATTCCGAGGAGCATGCCTG

TTTGAGTGTCATGAAATCTTCAACCTACAAGCTTGTTACCGGGCATGTAG

GCTTGGACTTGGAGGTTTGTCGGCCTTGCGGACGGCTCCTCTTACACGCA

EM-219

GTGGCATTGAGATTAACTCCCAACCCAATGTGACCATACCAAACTGTTGC

CTCGGCGGGGTCACGCCCCGGGTGCGTCGCAGCCCCGGAACCAGGCGCCC

GCCGGAGGGACCAACCAAACTCTTTCTGTAGTCCCCTCGCGGACGTTATT

TCTTACAGCTCTGAGCAAAAATTCAAAATGAATCAAAACTTTCAACAACG

GATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTA

ATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGC

GCCCGCCAGTATTCTGGCGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTTCAACCCT

CGAACCCCTCCGGGGGGTCGGCGTTGGGGATCGGGAACCCCTAAGACGGG

ATCCCGGCCCCGAAATACAGTGGCGGTCTCGCCGCAGCCTCTCCTGCGCA

GTAGTTTGCACAACTCGCACCGGGAGCGCGGCGCGTCCACGTCCGAAAAA

CACCCAACTTCTGAAATGTTGACCTCGGATCAGGTAGGAATACCCGCTGA

EM-280

TGGCATTAGGGTACACGGAGTTGTAGCTGGCCGCAAGGCATGTGCACGCT

CTCTACTCAATCACAACCTTACACCTGTGCATCTATTGTAGGTCGGGTGG

41

CTTGGCTTCTGTCAAGCTACTCTTCCTATGTTCTACACATACACTGTAGT

CTTAGAATGTCATCTGCGTATAACGCATCTATAAACAACTTTCAACAACG

GATCTCTTGGCTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTA

ATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACCTTGC

GCTCATTGGTATTCCGAGGATCATGCCTGTTTGAGTGTCATGAATATCTC

AACTTACCCAGTTTTTGTGACTGTGGTGAGCTTGGACTTGGAGGTATGCT

GGCTGACTATTCCGCTCCTCTCTAAATGCATTAGCTGGACCCGTTACGGA

TCACTACTCGGTGAGATAATTGTCCACACCATGTCTGTGAAGTGCCTTAA

EM-281

ACACCCTGCTCATCCACTCTACACCTGTGCACTTACTGTAGGTTTGGCGT

GGGCTTCGGGGCCTCCGGGCTCTGAGGCATTCTGCCGGCCTATGTATCAC

TACAAACACATAAAGTAACAGAATGTATTCGCGTCTAACGCATTTAAATA

CAACTTTCAGCAACGGATCTCTTGGCTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGC

GAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCT

TTGAACGCACCTTGCGCTCCTTGGTATTCCGAGGAGCATGCCTGGTTGAG

EM-322

GTTCATACCGAGTCTGACTGGGTTGTAGCTGGCCTTACGAGGCATGTGCA

CGCCCTGTTAATCCACTCTACACCTGTGCACTTACTGTGGGTTTCAGATC

GTGAATTGGGCCTACGGGCTCGTGAAGCGCATCTGTGCCTGCGTTTATTA

CAAACACTATAAAGTATCAGAATGTGTGGGTTGCGACGTAACGCATCTAT

ATACAACTTTCAGCAACGGATCTCTTGGCTCTCGCATCGATGAAGAACGC

AGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAA

TCTTTGAACGCACCTTGCGCTCCTTGGTATTCCTAGGATCATGCCTGTTT

EM-397

GTGGCCTCGGAGCTTCTACTCCAACCCTTGAGACATACCTTTGTTGCCTC

GGCGGAAGCGTCTTACCCTGGGATGGCCTACCCTGTAGCGCCCTACCCTA

GGCGGCGCCCCCCGCCGGTGGTCTTCTAAACTCTGTTTTATTGTGTCACT

TCTGAGGATTATTATAAAATCAGTTAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTG

GTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATT

GCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCATTAG

TATTCTAGTGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTCAACCCCATCAAGCTT

TATTTTTGCTTGGCGTTGGGAGAACGCGGGGCCGTGGACCCCCGCGCCTC

CGCTCATCCCTCCGCGGACGCCCAGCTACCCGGACGTAGTAATGTTTTCT

EM-541

42

TGCCAGGGTCAGCTGTTTTTATGGCACTTTCAAAATCCATATCCACCTTG

TGTGCAATGTCATCTCACTGGGGGCCACCGGCTGTCAAAAGCCGTCTGGT

CACCTTTGGGATTTATATCTACTCAGAACTTTAGTGATTTTGTCTGAAAC

ATATTATGAATACTTAATTCAAAATACAACTTTCAACAACGGATCTCTTG

GCTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATACGTAATGTGAATT

GCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCATATTGCGCTCTCTGG

TATTCCGGAGAGCATGCTTGTTTGAGTATCAGTAAACACCTCAACTTCCA

TATCTTTTTTGAAATGGGAGTTGGACTTGAGTGAGCCCAACGCTTTTCCT

CACCGAAAAGTGGCGGGTTACTTGAAATGCATGTGCAGCTGGACTTTTCT

CTGAGCTATTAGCATATCAATAAATTCTGCCTACATTTTGAATTATTATC

TTTGCTGCATCTAATCTATGGGAAATTATCTCTTGTGATCACGGACGGAG

Daniels-3294

GAGGCATCGACGCGGACTTCGGTCCTTGCTGCACCCTTGTCTTTTGCGTA

CCGTATGTTTCCTCGGCGGGCTTGCCTGCCGGTTGGACATTATCAAACCT

TTTTGTAGTTGCAATCAGCGTCAGAAAACAAACAATAATTACAACTTTCA

ACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGA

AAAGTAGTGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCA

CATTGCGCCCCTTGGTATTCCATGGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTT

GTACCCTCAAGCACTGCTTGGTGTTGGGCGTTTGTCCTGCAAAGGACTCG

Daniels-3296

ACTTTCAGCAACGGATCTCTTGGCTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGA

AATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTT

GAACGCACCTTGCGCTCCTTGGCATTCCGAGGAGCACGCCTGTTTGAGTG

TCGTGTAATTCTCAACCTACAACTCCTGGCGGTCGTTGTTAGGATTGGAC

TTTGGAGGATTCTTTGTGTCGGGCCCACACACATTTCTGTGGGTCGGCTC

CTCTCAAATGCATTAGCTTGGTTCCTTGCGGATCGGGCCCCCGGTGTGAT

Daniels-3300

GTGTCTGCGTTAACTCCAACCCATGTGACATACCTACTGTTGCTTTACGG

CGGGATTGCCCCGGGCGCCTCGTGCGCCCCGGACCAGGCGCCCGCCTAGG

AAACTTAACTCTTGTTTTATTTTGGAATCTTCTGAGTAGTTTTTACAAAT

AAATAAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAA

CGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATC

GAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGTATTCTGGCGGGCATGCCTG

TCTGAGCGTCATTTCAACCCTCATGCCCCTAGGGCGTGGTGTTGGGGATC

43

GGCCAAAGCCCGCGAGGGACGGCCGGCCCCTAAATCTAGTGGCGGACCCG

TCGTGGCCTCCTCTGCGAAGTAGTAATATTCCGCATCGGACAGCGACGAG

CCCCTGCCGTTAAACCCCCAACTTTCTAAGGTTGACCTCAGATCATGTAG

GAGTACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGCGGACGAAAAGAAACCAA

CAGGGATTGCCCTAATAACGGCGAGTGAAGCGGCAACAGCTCAAATTTGA

AATCTGGCGCAAGCCCGAGTTGTAATTTGAAGAGGATGTTTCTGGCGATG

Daniels-3308

TTGACTATGTCTTTCATATACCATGTAGTATGTTGCAGAATGTATCAATG

GGACTTTGTGCCTATAAACTCAATACAACTTTCAGCAACGGATCTCTTGG

CTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTG

CAGAATTCAGTGAATCATCTAATCTTTGAACGCACCTTGCGCTCCTTGGT

OF001

TGCACGCTTCATTAGTTTCCACTTCATACCCCTGTGCACCTTTGATAGAT

TTCGGTTTGGGTTATCCTTTGGTTTTTTTTCTTAATTGAAAGGCCTTTGG

TTTCCTTAAAACGACTTCTATACTATACCACACACCAAATGTATGTTTTA

TAATGAATGGTTTATAATGACAAGGCCATGAGCCTTATAAACTTAATACA

ACTTTCAACAACGGATCTCTTGGCTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGA

AATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTT

GAACGCACCTTGCGCCCTTTGGTATTCCGAAGGGCATGCCTGATTGAGTG

OF004

TTTATGTAGCATTATGACTGGGGTTGTAGCTGGCCTATAAAACGGCATGT

GCACGCCCCTTTCACAATCCACACACACCTGTGCACCTTCGCGGGGGTCT

CTTTTCGAATTTACTTTTGATAGAGGCTCGCGTCCCACTACACACCCTTT

TGTATGTCTTAAGAATGTCTACTCGATGTAATAAAACGCATCTAATACAA

CTTTCAACAACGGATCTCTTGGCTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAA

ATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTG

AACGCACCTTGCGCCCTTTGGTATTCCGAAGGGCACACCTGTTTGAGTGT

CGTGAAATTCTCAACCCTCTACATTTTTTTGTTGAGGGATTGGACTTGGA

GGCTTTGCCGGTGCTACTCCGCTCGGCTCCTCTCAAATGCATTACTGCGT

CTTGTTGCGACGTGCGCCTCGGTGTGATAATTATCTACGCTGTGGTGCGC

OF005

TTCATGCCGAGTTCGACTGGGTTGTAGCTGGCCTTCCGAGGCACGTGCAC

GCCCTGCTCATCCACTCTACACCTGTGCACTTACTGTGGGTTTACCGGTC

GCGAAACGGGCTCGTTTATTCGGGCTTGTGGAGCGCACTTGTTGCCTGCG

44

TTTATCACAAACTCCATAAAGTATTAAAATGGGGATTGGGAAGGAACGCC

TCTATTTACCACTTTCCGCCACGGATCTCTTGGCTCCCCCCTCCATGAAA

AACGCCGCGAAATGGCATAAGTAATGGGGATTGGCAAATTTCCTGGATCC

TCCAATCTTTGAACGCCCCTTGCGCCCCTTGGTATTCCCAAGAACAAGCC

45

ANEXO 3. Fórmulas para preparación del medio líquido YNPD usado en el estudio

Preparación para 1000mL

Glucosa 10 g

Extracto de malta 10 g

Peptona 2 g

Extracto de levadura 2 g

KH2PO4 2 g

MgSO4.7H2O 1 g

Vitamina 10 mL

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