UNIVERSIDAD TECNOLÓGICA...

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UNIVERSIDAD TECNOLÓGICA EQUINOCCIAL FACULTAD DE CIENCIAS DE LA INGENIERÍA CARRERA DE INGENIERÍA DE ALIMENTOS IDENTIFICACIÓN DE INDICADORES ENTÉRICOS EN CILANTRO (Coriandrum sativum) Y PEREJIL (Petroselinum sativum) QUE SE EXPENDEN EN MERCADOS POPULARES DEL NORTE DE LA CIUDAD DE QUITO TRABAJO PREVIO A LA OBTENCIÓN DEL TÍTULO DE INGENIERA DE ALIMENTOS DAYANA KAROLINA CERÓN SALGADO DIRECTORA: ING. NUBIA GRIJALVA V. Quito, Septiembre, 2014

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UNIVERSIDAD TECNOLÓGICA EQUINOCCIAL

FACULTAD DE CIENCIAS DE LA INGENIERÍA

CARRERA DE INGENIERÍA DE ALIMENTOS

IDENTIFICACIÓN DE INDICADORES ENTÉRICOS EN

CILANTRO (Coriandrum sativum) Y PEREJIL (Petroselinum

sativum) QUE SE EXPENDEN EN MERCADOS POPULARES

DEL NORTE DE LA CIUDAD DE QUITO

TRABAJO PREVIO A LA OBTENCIÓN DEL TÍTULO

DE INGENIERA DE ALIMENTOS

DAYANA KAROLINA CERÓN SALGADO

DIRECTORA: ING. NUBIA GRIJALVA V.

Quito, Septiembre, 2014

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© Universidad Tecnológica Equinoccial. 2014

Reservados todos los derechos de reproducción

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DECLARACIÓN

Yo Dayana Karolina Cerón Salgado, declaro que el trabajo aquí descrito es

de mi autoría; que no ha sido previamente presentado para ningún grado o

calificación profesional; y, que he consultado las referencias bibliográficas

que se incluyen en este documento.

La Universidad Tecnológica Equinoccial puede hacer uso de los derechos

correspondientes a este trabajo, según lo establecido por la Ley de

Propiedad Intelectual, por su Reglamento y por la normativa institucional

vigente.

_________________________

Dayana Karolina Cerón Salgado

C.I. 171686309-5

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CERTIFICACIÓN

Certifico que el presente trabajo que lleva por título “IDENTIFICACIÓN DE

INDICADORES ENTÉRICOS EN CILANTRO (Coriandrum sativum L.) Y

PEREJIL (Petroselinum sativum) QUE SE EXPENDEN EN MERCADOS

POPULARES DEL NORTE DE LA CIUDAD DE QUITO”, que, para aspirar

al título de Ingeniera de Alimentos, fue desarrollado por Dayana Karolina

Cerón Salgado, bajo mi dirección y supervisión, en la Facultad de Ciencias

de la Ingeniería; y cumple con las condiciones requeridas por el reglamento

de Trabajos de Titulación artículos 18 y 25.

______________________________

Ing. Nubia Grijalva V.

DIRECTORA DELTRABAJO

C.I. 171766568-9

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DEDICATORIA

Todo el esfuerzo aquí plasmado está dedicado a mi padre, un hombre

espectacular que ha sido un ejemplo permanente para mi vida por ser una

persona trabajadora, luchadora, llena de valores y sobre todo de amor

incondicional. Este trabajo es en agradecimiento por sus continuas

enseñanzas, por todos esos días de extenuante trabajo, por su paciencia y

sobre todo porque jamás se ha dado por vencido para sacarme adelante y

hacer de mí, la persona que ahora soy.

Este trabajo también es dedicado para esas dos personas sin las cuales no

hubiera sido posible la perseverancia gracias a su apoyo incondicional, mis

amados hermanos, Belén y Luis, tal vez su aporte no fue con conocimientos

pero si con consejos y amor para que no me diera por vencida en ningún

paso que daba, siempre mis logros serán para ustedes porque mi vida no

estaría completa si faltara alguno de los dos.

Y finalmente a mi madre, que es el ángel que guía mi vida, gracias a ti por

darme la vida porque de otra forma hoy no hubiera podido lograr esto; sé

que desde allá arriba estarás orgullosa de mí. Te Amo.

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AGRADECIMIENTO

En primer lugar y ante todo doy gracias a Dios por cada día regalarme una

nueva oportunidad para levantarme y luchar por cumplir mis sueños como

ahora lo estoy haciendo.

A mi padre Enrique por darme los estudios y siempre estar conmigo, a mis

hermanos Belén y Luis que hacen que cada día de mi vida sea una dicha a

su lado y porque sé que mis logros les hacen felices también a ellos.

Agradezco inmensamente y de corazón a la Ing. Nubia Grijalva, que más

que una directora de tesis ha sido una gran amiga, confidente y de quien

siempre he recibido los mejores consejos profesionales y personales,

gracias por brindarme su amistad, cariño y confianza, sin su apoyo este

trabajo no hubiera podido llegar a feliz término.

Y finalmente pero no menos importantes agradezco a esas personas

quienes me han regalado los momentos más lindos de esta etapa

universitaria, MIS AMIGOS! Siempre incondicionales para mí: Estefy, Tañis,

Dayta Mo, gracias por quererme y estar a mi lado; a Jess por haber

demostrado que no fueron necesarios largos años de conocer a alguien

para brindarme su ayuda, apoyo, paciencia, en fin una verdadera y sincera

amistad; pero especialmente agradezco a Naty Q., mi consejera, soporte,

ayuda, cómplice, casi hermana en fin, su presencia ha sido muy importante

estos años universitarios, simplemente eres mi mejor amiga.

¡Les quiero de corazón amigos y futuros colegas!

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i

ÍNDICE DE CONTENIDOS

PÁGINA

RESUMEN vii

ABSTRACT viii

1. INTRODUCCIÓN 1

2. MARCO TEÓRICO 5

2.1. INOCUIDAD ALIMENTARIA 5

2.2. ENFERMEDADES TRANSMITIDAS POR ALIMENTOS 7

2.2.1. TIPOS DE ENFERMEDADES MICROBIANAS DE

ORIGEN ALIMENTARIO 8

2.2.1.1. Intoxicaciones alimentarias 9

2.2.1.2 Infecciones transmitidas por alimentos 10

2.2.1.3. Toxicoinfecciones alimentarias 11

2.2.2. CAUSAS DE LAS ENFERMEDADES TRANSMITIDAS

POR ALIMENTOS11

2.3. INDICADORES ENTÉRICOS 13

2.3.1. ENTEROBACTERIAS 14

2.3.2. COLIFORMES 16

2.3.2.1. Coliformes fecales 17

2.3.2.2. Escherichia coli 18

2.3.2.2.1. Generalidades 18

2.3.2.2.2. Enfermedades 20

2.3.2.2.3. Alimentos implicados 22

2.3.2.2.4. Prevención 23

2.3.2.3. Análisis y detección de coliformes 23

2.4. VEGETALES TIPO HOJA 25

2.4.1. CILANTRO 26

2.4.1.1. Generalidades de la planta 26

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ii

PÁGINA

2.4.1.2. Clasificación taxonómica 28

2.4.1.3. Composición y valor nutricional 28

2.4.1.4. Variedades 29

2.4.1.5. Cultivo en Ecuador 30

2.4.2. PEREJIL 31

2.4.2.1. Generalidades de la planta 31

2.4.2.2. Clasificación taxonómica 32

2.4.2.3. Composición y valor nutricional 33

2.4.2.4. Variedades 34

2.4.2.5. Cultivo en Ecuador 35

2.5. INTOXICACIONES CAUSADAS POR LA INGESTA DE

VEGETALES TIPO HOJA 36

2.6. USO DE INDICADORES ENTÉRICOS PARA DETERMINAR

LA CALIDAD MICROBIOLÓGICA DE VEGETALES TIPO

HOJA 38

3. METODOLOGÍA 41

3.1 DESCRIPCIÓN Y TOMA DE MUESTRA 41

3.2 ANÁLISIS MICROBIOLÓGICOS 42

3.2.1 DILUCIONES SUCESIVAS 42

3.2.2 RECUENTO, AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE

COLIFORMES FECALES Y Escherichia coli. 43

3.2.2.1 Colimetría presuntiva 43

3.2.2.2 Colimetría confirmatoria 44

3.2.2.3 Colimetría complementaria 46

3.2.2.3.1 Prueba para indol (I): 46

3.2.2.3.2 Prueba de rojo de metilo (RM): 47

3.2.2.3.3 Prueba de Voges-Proskauer (VP) 47

3.2.2.3.4 Prueba para la utilización de citrato 48

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iii

PÁGINA

3.2.3 DETERMINACIÓN DE COLIFORMES TOTALES

PORLA TÉCNICA DE RECUENTO EN PLACA 49

3.3. ANÁLISIS ESTADÍSTICOS 50

4. ANÁLISIS DE RESULTADOS 51

4.1 RECUENTO, AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE

COLIFORMES TOTALES, COLIFORMES FECALES Y

Escherichia coli 51

4.1.1 COLIFORMES TOTALES 52

4.1.2 COLIFORMES FECALES 56

4.1.3 Escherichia coli 58

5. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES 62

5.1 CONCLUSIONES 62

5.2 RECOMENDACIONES 64

BIBLIOGRAFÍA 65

ANEXOS 72

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iv

ÍNDICE DE TABLAS

PÁGINA

Tabla 2.1. Alimentos involucrados en los brotes de ETAs 8

Tabla 2.2. Enterobacterias más importantes:punto de vista clínico 16

Tabla 2.3. Condiciones de crecimiento de E.coli 19

Tabla 2.4. Alimentos contaminados con E.coli 22

Tabla 2.5. Clasificación taxonómica del cilantro 28

Tabla 2.6. Composición nutricional del cilantro 29

Tabla 2.7. Variedades de cilantro 30

Tabla 2.8. Clasificación taxonómica del perejil 33

Tabla 2.9. Composición nutricional del perejil 34

Tabla 2.10. Calidad microbiológica en vegetales frescos 39

Tabla 3.1 Identificación de coliformes por IMViC 49

Tabla 4.1. Resultados de coliformes totales por mercado 53

Tabla 4.2 Resultados de coliformes totales de cilantro por puesto de expendio 54 Tabla 4.3 Resultados de coliformes totales de perejil por puesto de expendio 55 Tabla 4.4 NMP de coliformes fecales 57

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v

ÍNDICE DE FIGURAS

PÁGINA

Figura 2.1. Factores que ocasionan ETAs 13

Figura 2.2. Estructura del género Enterobacteriaceae 15

Figura 2.3. Estructura de Escherichia coli 19

Figura 2.4. Características de cepas de E.coli causantes de diarrea 21

Figura 2.5. Análisis microbiológico de E.coli 25

Figura 2.6. Estructuras morfológicas del cilantro 27

Figura 2.7 Variedades de perejil 35

Figura 3.1. Mercados del norte de la ciudad de Quito 41

Figura 3.2. Tubos BGBL 43

Figura 3.3. Tubos BGBL y TSB 44

Figura 3.4. Siembra en estría 45

Figura 3.5. Cultivos purificados 46

Figura 3.6. Coliformes en agar VRB 50

Figura 4.1. Recuento de coliformes totales 52

Figura 4.2. Pruebas de identificación bioquímicas para E.coli. 58

Figura 4.3. Presencia de E.coli en vegetales tipo hoja analizado 59

Figura 4.4. Distribución de muestras de cilantro y perejil según la presencia de E.coli por mercado y puesto de expendio 60

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vi

ÍNDICE DE ANEXOS

PÁGINA

ANEXO I

TABLA DEL NÚMERO MÁS PROBABLE (NMP) POR g/mL DE

ALIMENTO 72

ANEXO II

RECOLECCIÓN DE MUESTRAS MERCADO LA OFELIA 73

ANEXO III

RECOLECCIÓN DE MUESTRAS MERCADO IÑAQUITO 74

ANEXO IV

RECOLECCIÓN DE MUESTRAS MERCADO SANTA CLARA 75

ANEXO V

PROCEDIMIENTO DE RECUENTO, AISLAMIENTO E IDENTIFICA-

CIÓN DE E. coli 76

ANEXO VI

TÉCNICA RECUENTO EN PLACA AGAR VRB 79

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vii

RESUMEN

El cilantro y el perejil son vegetales tipo hoja de consumo habitual que

generalmente se ingieren crudos. Por su naturaleza, tipo de cultivo y

manipulación previa a la comercialización pueden ser portadores de agentes

infecciosos capaces de causar enfermedades transmitidas por alimentos

(ETAs). En esta investigación se analizaron 108 muestras (54 de cilantro y

54 de perejil) obtenidas de manera aleatoria en tres puestos de expendio de

tres mercados del norte de la ciudad de Quito seleccionados para este

estudio. Se realizó la determinación de Coliformes Totales (CT), Coliformes

Fecales (CF) y Escherichia coli (EC) según la metodología establecida por la

NTE INEN 1529-8 en medios selectivos para este tipo de microorganismos;

la identificación de E.coli se realizó empleando pruebas bioquímicas. La

población de CT para cilantro fue de 5.09 log UFC/g y 6.39 log UFC/g para

perejil. Se obtuvieron valores de CF de 607.0 NMP/g en el mercado uno,

596.7 log NMP/g en el mercado dos y 474.2 NMP/g para el mercado tres.

El 23.1% de las muestras de perejil presentaron recuentos positivos para

Escherichia coli mientras que para cilantro el 14.8% de las muestras fueron

positivas. La presencia de indicadores entéricos (CT, CF y EC) en cilantro y

perejil fue independiente del mercado y puesto de expendio lo cual indica un

alto nivel de contaminación y demuestra la necesidad de un control

microbiológico en el sistema de riego, cosecha, transporte y condiciones

higiénicas de los manipuladores para asegurar la calidad de vegetales tipo

hoja evitando posibles brotes de enfermedades transmitidas por este tipo de

alimento. Cabe recalcar que en el Ecuador hasta el momento no se han

registrado datos de análisis microbiológicos realizados en cilantro y perejil, y

además no se cuenta con normativa que controle este tipo de productos.

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viii

ABSTRACT

Coriander and Parsley are leaf vegetables of regular consumption. They are

generally ingested uncooked. Due to their nature, cultivation methods and

handling process prior to commercialization, these products can carry

infectious agents that are capable of causing foodborne diseases. In this

research 108 samples were analyzed (54 of coriander and 54 of parsley).

These samples were obtained under a random method in three distribution

spots on each of the markets around the north of the city of Quito. Total

coliforms (TC), fecal coliforms (FC) and Escherichia coli (EC) were detected

applying the NTE INEN 1529-8 methodology on selective media for this type

of microorganism. The identification of E.coli was performed using

biochemical tests. The average TC value for the coriander was 5.09 log

UFC/g and 6.39 log UFC/g for the parsley. Values of 607.0 NMP/g for CF for

the market #1, 597.7NMP/g for the market # 2, and 474.2 NMP/g for the

market # 3 were found. The 23.1% of the parsley samples presented positive

recounts for Escherichia coli while for the coriander the 14.8% of the samples

were positive for this bacterium. The presence of enteric indicators (TC, FC,

and EC) in coriander and parsley was independent from the market and the

distribution point which indicates a high contamination level and

demonstrates the necessity of a microbiologic control on the irrigation

system, farming, transport and hygienic conditions of the handlers in order to

assure the quality of the leafy vegetables avoiding possible breakouts of

diseases caused by these products. In Ecuador there are not data about

microbiological analyzes in these vegetables, neither legislation to control

this type of product.

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1. INTRODUCCIÓN

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1

1. INTRODUCCIÓN

Las hortalizas son un grupo de alimentos que se cultivan en huertos o

sembríos, su consumo principalmente está enfocado a la alimentación por

poseer innumerables propiedades nutricionales (Rivera, Rodríguez, & López,

2009).

El valor nutricional de las hortalizas se basa especialmente en

micronutrientes como potasio, calcio, hierro; las cantidades de

macronutrientes no son significativas ni presentan un alto valor calórico. Las

hortalizas o vegetales tipo hoja como cilantro, perejil, apio, lechuga, acelga y

espinaca son empleadas en platos tradicionales o comúnmente preparados

en los hogares, tal es el caso de sopas, ensaladas, comidas rápidas (Verdú

& Carazo, 2005).

El cilantro es una planta herbácea, sus hojas presentan un aspecto muy fino

con sabor y aroma característicos, es una fuente importante de vitamina K

que interviene en factores de coagulación sanguínea. Se lo considera

originario del norte de África y sur de Europa. Fue una de las primeras

especies que se introdujo en América para la conservación de carnes y

como hierba medicinal: sus frutos maduros se usan para condimentar. En

países de Latinoamérica como México, Venezuela, Colombia y Ecuador se

usan las hojas frescas enteras o picadas. Además del uso culinario, en

muchas culturas (India, Grecia, China y Japón) se usa el cilantro como

remedio casero. En estudios realizados en la década de los noventa se le

atribuyó propiedades quelantes para atrapar metales en sangre que

producen envenenamiento (Ramos, 2008).

El perejil, planta herbácea, se consume de forma cruda. Es originario del

Mediterráneo oriental. Los griegos y romanos lo veneraban como una planta

sagrada que acompañaba las grandes festividades (Japon, 2011).

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2

Posee vitaminas como la A, B1, B2 y C aunque no son una fuente

significativa, además de minerales como hierro y fósforo; su olor

característico está dado por un aceite volátil llamado apiol (Galeazzi, 2004).

El cilantro y el perejil son vegetales de consumo habitual que se ingieren

crudos. Por su naturaleza pueden ser portadores de agentes infecciosos

causantes de enfermedades transmitidas por alimentos (ETAs). Por el tipo

de cultivo y la manipulación previa a la comercialización pueden presentar

un alto número de enterobacterias que son la causa más importante de

enfermedades gastrointestinales. La detección e identificación de este tipo

de microorganismos, permite tener una idea de la calidad microbiológica que

presenta el producto (Galeazzi, 2004).

Las ETA´s representan un gran peligro para la salud de los seres humanos.

Son producidas por la ingesta de alimentos y bebidas contaminados con

microorganismos y sus toxinas, muchas personas enferman y mueren

alrededor del mundo por consumir alimentos insalubres (Ramírez Merida,

Alfieri, Gamboa, & Morón de Salim, 2009).

Pese a que no se notifica un elevado porcentaje de ETA’s, estas son solo

una pequeña fracción de lo que ocurre en la realidad, razón por la cual no

se tienen datos de la incidencia anual de las mismas, por ejemplo, se estima

que en los países industrializados se informa <10% de la cifra real, mientras

que en los países en vías de desarrollo se informa solo el 1% de las cifras

reales (Fuentes & Cepedillo, 2012).

Se han descrito más de 250 ETA’s, ocasionadas por distintas bacterias, virus

y parásitos. Entre las bacterias comúnmente reconocidas como causantes

de ETA se encuentran especies de los géneros Campylobacter y

Salmonella, así como la cepa O157:H7 de la enterobacteria Escherichia coli

(Flores & Rojas, 2005).

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3

El Sistema de Información Regional para la Vigilancia Epidemiológica de las

Enfermedades Transmitidas por Alimentos (SIRVETA) de la OPS/OMS

manifestó que los brotes relacionados con legumbres y hortalizas

representan el 2,39% de las enfermedades de América Latina y el Caribe

(Hualpa & Castillo, 2009).

La inocuidad de los alimentos engloba acciones encaminadas a garantizar la

máxima seguridad posible de los mismos; es necesaria la vigilancia continua

de los alimentos a lo largo de toda su cadena de suministro: en el transporte,

manipulación, limpieza y comercialización. Las políticas y actividades que

persiguen dicho fin deben trabajar en dimensiones sociales, económicas,

culturales y políticas. (Camelo A. , 2003).

Se debe trabajar en el control sanitario de todos los alimentos,

especialmente de aquellos que presentan una alta frecuencia de consumo y

no se someten a procesos de cocción, es decir se consumen casi o

totalmente crudos como cilantro y perejil.

En estudios similares realizados en vegetales frescos en Venezuela, Perú y

Costa Rica se detectó la presencia de microorganismos como Salmonella,

Escherichia coli, Staphylococcus aureus, mohos y levaduras que fueron

hallados principalmente en lechuga, tomates, cilantro, perejil y cebollas

(Rivera, Rodríguez, & López, 2009) (Ramírez Merida, Alfieri, Gamboa, &

Morón de Salim, 2009) (Ginestre, Rincón, Romero, Castellano, & Ávila,

2010).

La población ecuatoriana mantiene la costumbre de adquirir alimentos como

verduras, hortalizas y frutas en los mercados por su costo y presentación.

Las condiciones de manipulación de los alimentos en los mercados no son

óptimas, pues no siempre cumplen con normas que aseguren inocuidad. Por

ello este estudio aportará a determinar la calidad microbiológica de los

vegetales frescos consumidos con alta frecuencia, como son cilantro y perejil

en los principales mercados del norte de Quito.

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4

OBJETIVO GENERAL

Identificar los principales indicadores entéricos en cilantro

(Coriandrum sativum) y perejil (Petroselinum sativum) que se

expenden en tres mercados populares del Norte de la ciudad de

Quito.

OBJETIVOS ESPECÍFICOS

1. Realizar recuentos de coliformes totales en muestras de cilantro y

perejil de tres mercados populares del norte de Quito: Mercado Santa

Clara, Mercado Iñaquito y Mercado La Ofelia.

2. Realizar recuentos de coliformes fecales y E.coli en muestras de

cilantro y perejil de tres mercados populares del norte de Quito:

Mercado de Santa Clara, Mercado Iñaquito y Mercado La Ofelia.

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2. MARCO TEÓRICO

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2. MARCO TEÓRICO

2.1. INOCUIDAD ALIMENTARIA

Inocuidad es la garantía de que los alimentos no van a causar daño cuando

se preparen y/o consuman de acuerdo con el uso al que se le destine. Un

alimento inocuo es aquel que está libre de peligros físicos (huesos, piedras,

fragmentos de metal o cualquier materia extraña), peligros químicos

(medicamentos veterinarios, pesticidas, toxinas de microorganismos,

agentes de limpieza y desinfección) y peligros biológicos (microorganismos

patógenos) (Codex Alimentarius, 2003).

La inocuidad de los alimentos se asegura controlándola desde el inicio de la

cadena de suministros, con la ayuda de la aplicación de buenas prácticas

de agricultura y manufactura, en la producción, procesamiento (incluyendo el

etiquetado), manipulación, distribución, almacenamiento, venta, preparación

y uso final de los alimentos, junto con la aplicación del Sistema de HACCP

(Análisis de Riesgos y Puntos de Control) (FAO, 1996).

El término inocuidad no se debe confundir con las palabras Calidad y

Seguridad. La calidad de los alimentos es una característica compleja que

determina su valor o aceptabilidad para el consumidor. Abarca atributos

negativos como el estado de descomposición, contaminación con suciedad,

decoloración y olores desagradables, y atributos positivos, como origen,

color, aroma, textura y métodos de elaboración de los alimentos (OMS,

2007).

La seguridad alimentaria “existe cuando todas las personas tienen en todo

momento acceso físico y económico a suficientes alimentos inocuos y

nutritivos para satisfacer sus necesidades alimenticias y sus preferencias en

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6

cuanto a los alimentos con el fin de llevar una vida activa y sana” (FAO,

1996).

La seguridad alimentaria está dada en función de cuatro componentes o

pilares fundamentales que son: disponibilidad de los alimentos, estabilidad,

acceso a los alimentos, consumo y utilización biológica (Jácome, 2012)

La actual Constitución del Ecuador, en el Capítulo Segundo, Art.- 13,

expresa que las personas y colectividades tienen derecho al acceso seguro

y permanente a alimentos sanos, suficientes y nutritivos (Constitución del

Ecuador, 2008).

La ley Orgánica del Régimen de la Soberanía Alimentaria del Ecuador,

establece en el capítulo IV “Sanidad e inocuidad alimentaria”; que la

finalidad de la inocuidad alimentaria es promover una adecuada nutrición y

proteger la salud de las personas previniendo, eliminando o reduciendo la

ocurrencia de enfermedades causadas y que puedan agravarse por el

consumo de alimentos que estén contaminados (LORSA, 2010).

La producción de alimentos libres de contaminantes depende de los

procesos de elaboración, así como de las personas que tienen contacto con

los mismos. La contaminación bacteriana de los alimentos causa problemas

de salud; entre los más importantes se encuentra la salmonelosis y

enfermedades causadas por estafilococos y clostridios (Rivera J. F., 2012).

El mantenimiento de la higiene en la infraestructura donde se procesan o

elaboran alimentos es una condición esencial para asegurar la inocuidad de

los productos. En cada etapa de la cadena alimentaria, desde la producción

primaria hasta el consumo, son necesarias prácticas higiénicas eficaces. La

implementación de procedimientos operativos de saneamiento (POES) que

describen tareas de saneamiento antes, durante y después de las

operaciones de elaboración, ayudarán a asegurar la calidad de los alimentos

(Mercado, 2007).

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2.2. ENFERMEDADES TRANSMITIDAS POR ALIMENTOS

Las Enfermedades Transmitidas por Alimentos (ETAs) son consideradas

como la causa principal de trastornos que se producen en el tracto intestinal,

manifestándose con varios síntomas entre los que se destacan: dolores

abdominales, diarreas y vómito. Son causadas por ingerir alimentos que

contienen cantidades de microorganismos patógenos (bacterias, virus,

hongos, parásitos) mayores a la DMI (Dosis Mínima Infectiva), o productos

tóxicos, que resultan nocivos para el organismo (Bravo, 2004).

La DMI es la cantidad más pequeña de material infeccioso que suele

producir enfermedad; varía entre las personas dependiendo de su estado

general de salud y de la forma como se ingieren las bacterias (en ciertas

condiciones las DMI pueden ser muy baja por lo que es muy necesaria la

higiene) (Fuentes & Cepedillo, 2012).

Se han descrito más de 250 ETAs. La mayoría de enfermedades

transmitidas por alimentos son infecciones ocasionadas principalmente por

bacterias, entre las más comunes como causantes de ETAs se encuentran

especies de los géneros Campylobacter y Salmonella, así como la cepa

O157:H7 de la enterobacteria Escherichia coli (González & Rojas, 2005).

Según las cifras de la Organización de las Naciones Unidas para la

Agricultura y la Alimentación (FAO) y la Organización Mundial de la Salud

(OMS), la región latinoamericana experimentó al menos 6.000 brotes de

diversos tipos de enfermedades de origen alimentario, entre 1993 y 2002

( Instituto Nacional de Salud de Colombia, 2011).

El Sistema de Información Regional para la Vigilancia Epidemiológica de las

Enfermedades Transmitidas por Alimentos de la OPS/OMS manifiesta que

los brotes relacionados con legumbres y hortalizas representan el 2,39% de

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las enfermedades de América Latina y el Caribe como lo muestran los datos

presentados en la Tabla 2.1 (SIRVETA, 2002).

En Ecuador el mayor índice de mortalidad infantil está dado por

enfermedades gastrointestinales, siendo la segunda causa de morbilidad

según las estadísticas del INEC. Los microorganismos patógenos (bacterias,

virus o parásitos) en el agua y alimentos pueden provocar: cólera, fiebre

tifoidea, poliomielitis, meningitis y hepatitis A y E y una gran variedad de

intoxicaciones alimentarias (Clavijo, 2011).

Los microorganismos están presentes en el medio ambiente natural (aire,

agua o suelo); es decir, pueden ser propios de los alimentos antes de su

obtención, o presentarse cuando colonizan el alimento durante la cadena de

suministro ya sea en su obtención, transporte, industrialización y/o

conservación, pues contienen asociaciones microbianas que cuando llegan a

los alimentos son capaces de sobrevivir, proliferar e interaccionar con sus

componentes (Larrañaga et al., 2000;Mossel & Moreno, 1991).

Tabla 2.1. Alimentos Involucrados en los brotes de ETAs

(Panalimentos OPS/OMS, 2002)

Alimento involucrado % Brotes

Pescado 21.52

Agua 19.51

Carnes rojas 14.20

Lácteos 7.88

Huevo-Mayonesa 5.85

Carnes de aves 5.08

Hortalizas-Legumbres 2.39

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2.2.1. TIPOS DE ENFERMEDADES MICROBIANAS DE ORIGEN

ALIMENTARIO

Con base a las características de la enfermedad, se pueden dividir en tres

tipos de enfermedades microbianas de origen alimentario:

2.2.1.1. Intoxicaciones alimentarias

Se originan como consecuencia de la ingesta de alimentos en los que

existen sustancias tóxicas que pueden ser originarias de restos de

pesticidas, moluscos contaminados por metales, metabolitos propios del

alimento, o toxinas producidas por microorganismos presentes en alimentos

(Larrañaga, Carballo, Rodríguez, & Fernandez, 2000).

Son de carácter gastroentérico agudo, pues su sintomatología aparece de

forma violenta poco tiempo después de haber ingerido el alimento

contaminado. Los microorganismos que producen con mayor frecuencia

intoxicaciones son Staphyloccocus aureus y Clostridium botulinum

(Caballero, 2008).

Según Ray & Bhunia (2010), las principales caraterísticas de una

intoxicación alimentaria son:

1. La toxina se produce a medida que el patógeno crece en el alimento.

2. Una toxina es estable o inestable al calor.

3. Para que se dé la intoxicación, se requiere ingerir un alimento con una

toxina activa, y células microbianas no viables. La dosis mínima

infectiva depende del tipo de microorganismo.

4. Los síntomas son instantáneos, generalmente aparecen 30 min

después de la ingestión.

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5. Los síntomas dependen del tipo de toxina: enterotoxinas (síntomas

gástricos) por patógenos como Staphylococcus aureus y neurotoxinas

(síntomas neurológicos) por patógenos como Clostridium botulinum.

6. No se presenta fiebre.

2.2.1.2 Infecciones transmitidas por alimentos

Se originan por la presencia de microorganismos que colonizan, se

multiplican e invaden el alimento, sin que se evidencie la producción de

ningún tipo de toxina por parte del microorganismo; la dosis mínima infectiva

depende del tipo de microorganismo. (Larrañaga et al., 2000).

Se produce por la ingestión de alimentos y/o agua contaminados con

agentes infecciosos específicos como bacterias, virus, hongos y parásitos,

que en el tracto intestinal puedan multiplicarse, e invadir otros aparatos o

sistemas. Su período de incubación es mucho más prolongado, por ejemplo,

una de las infecciones más comunes es la salmonelosis, donde el periodo de

incubación de la Salmonella es de 24 a 36 horas, en relación una

intoxicación alimentaria, donde generalmente los síntomas se presentan en

un lapso de 2 a 4 horas después de ingerir el alimento (Caballero., 2008).

Según Ray & Bhunia (2010), las principales características de infección por

alimentos son:

1. Las células vivas de patógenos (bacterias y virus) se consumen por

medio de los alimentos.

2. Las células patógenas se albergan en las células epiteliales del

estómago donde se multiplican y producen la toxina.

3. Los niveles de carga que se requieren para que se produzca la

infección varían según el tipo de microorganismo patógeno.

4. Los síntomas se presentan después de 24h.

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5. Los síntomas entéricos que se presentan incluyen dolor abdominal,

diarrea, náuseas, vómito y fiebre. Ejemplo de estos patógenos son:

Salmonella, Shigella, E.coli enteropatogénica, Vibrio

parahaemolyticus, Campylobacter jejuni.

6. Los síntomas no entéricos se presentan cuando los patógenos o

toxinas invaden otros órganos; los síntomas dependen del tipo de

órgano afectado, pero van acompañados por fiebre. Ejemplo de

estos patógenos son: Listeria monocytogenes, E.coli

enterohemorrágica, Vibrio vulnificus, virus de hepatitis A.

2.2.1.3. Toxicoinfecciones alimentarias

Se originan por la ingesta de alimentos que contienen microorganismos

patógenos, que además de multiplicarse e invadir el organismo, producen

toxinas (Larrañaga et al., 2000).

Según Ray & Bhunia (2010), las principales características de una

toxicoinfección por alimentos son:

1. Generalmente son microorganismos formadores de esporas o bacilos

Gram negativos.

2. Las células formadoras de esporas no se multiplican en el tracto

digestivo.

3. Las células Gram negativas se multiplican con rapidez en el tracto

digestivo.

4. Muchas células mueren pero al hacerlo sus toxinas son liberadas.

5. Las toxinas de ambos grupos de microorganismos producen síntomas

de gastroenteritis.

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2.2.2. CAUSAS DE LAS ENFERMEDADES TRANSMITIDAS POR

ALIMENTOS

Las ETAs son producidas por la ingesta de alimentos y bebidas

contaminadas, la Organización Mundial de la Salud (OMS), ha calculado que

cada año mueren 1,8 millones de personas como consecuencia de

enfermedades diarreicas siendo la población más vulnerable niños, ancianos

y mujeres embarazadas, a causa de esto, en el año 2001, la OMS difundió

las “5 claves para la inocuidad de los alimentos” cuyo fin fue garantizar la

preparación higiénica de los alimentos y prevenir la mayoría de las ETA’s,

estando orientadas a productores, comerciantes y consumidor final(Ramírez,

Alfieri, Gamboa, & Morón de Salim, 2009; OMS, 2007).

Existen varias causas que producen ETAs entre las que Caballero et al.

(2008) destaca como primordiales a las siguientes:

Sustancias tóxicas presentes en el tejido de animales y plantas

(ejemplo: ciguatera).

Adición de aditivos (ejemplo: nitrito).

Metales tóxicos (ejemplo: mercurio, arsénico, hierro, plomo).

Agentes químicos (ejemplo: plaguicidas, residuos de materiales de

empaque).

Origen Biológico, siendo esta, una de las causas prioritarias debido a

la gran cantidad de agentes biológicos existentes.

En la Figura 2.1se presentan otro tipo de factores que pueden ocasionar el

desarrollo de ETAs, dividiéndose en tres categorías: abuso del tiempo de

exposición - temperaturas inadecuadas de cocción o manejo, mala

manipulación de alimentos - equipo mal lavado y contaminación cruzada

que es la transmisión de microorganismos de un alimento contaminado, en

la mayoría de los casos crudo, a otro que ya está cocinado (Bravo, 2004).

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Figura 2.1. Factores que ocasionan ETAs

(Bravo, 2004)

Los cambios en los hábitos alimentarios de la sociedad, como el consumo de

alimentos envasados, comidas fuera del hogar, expendio de comidas

preparadas y comidas rápidas, son factores que contribuyen al incremento

de las ETAs. Estos cambios en los estilos de vida presentan riesgos, con

mayor probabilidad de ocurrencia en países del primer mundo (Olea, Díaz,

Fuentes, Vaquero, & García, 2012).

2.3. INDICADORES ENTÉRICOS

La determinación de microorganismos patógenos en alimentos es una

práctica analítica básica por dos razones: la primera, son parte de un

procedimiento para detectar microorganismos indicadores de calidad, y la

segunda, porque se convierten en agentes importantes para determinar

ETAs (Larrañaga et al., 2000).

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Los indicadores entéricos ponen en evidencia deficiencias en la calidad

microbiológica de un determinado alimento, al exceder un valor de referencia

experimentalmente establecido por organismos oficiales (Benavides, 2006).

Para determinar, en base a un indicador, si se acepta o rechaza el consumo

de un alimento, se debe primero comprobar si la cantidad elevada de

microorganismos son resultado de un nivel de contaminación inicial o de su

posible crecimiento de contaminación a lo largo de la cadena de suministro

(Ray & Bhunia, 2010).

2.3.1. ENTEROBACTERIAS

La familia Enterobacteriaceae no incluye solo coliformes sino muchos

géneros y especies que son patógenos entéricos, por lo que el recuento del

grupo completo puede ser un mejor indicador de higiene y posible

contaminación fecal (Ray & Bhunia, 2010).

Las enterobacterias están constituidas por un grupo heterogéneo de

bacterias Gram negativas. Reciben este nombre debido a su ubicación

habitual como saprofitos en el tubo digestivo; de igual manera se encuentran

en el suelo, agua y la vegetación. Son microorganismos con forma de bastón

de 1-3 µm de largo y 0,5 µm de diámetro, su envoltura se caracteriza por

tener una estructura multilaminar, la membrana interna contiene una doble

capa de fosfolípidos y la externa está formada por un peptidoglicano delgado

que contiene una elevada concentración de proteínas (Puerta- García &

Mateos-Rodríguez, 2010). En la Figura 2.2 se puede observar la estructura

de las enterobacterias.

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Figura 2.2. Estructura del género Enterobacteriaceae

(Merino & Lôsch, 2012)

Según las características microbiológicas, las enterobacterias son bacterias

no esporuladas con crecimiento en aerobiosis y anaerobiosis, es decir, son

anaerobios facultativos; fermentan la glucosa con o sin formación de gas,

muestran negatividad a la prueba de la oxidasa; no aumenta su crecimiento

en un medio hipertónico y pueden ser móviles, dependiendo de la presencia

o no de flagelos (Galí, 2010).

Dentro de la familia Enterobacteriaceae se reconocen más de 30 géneros

diferentes. En la Tabla 2.2 se detallan los géneros y especies que se aíslan

con mayor frecuencia y son de importancia clínica.

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Tabla 2.2. Enterobacterias más importantes desde el punto de vista clínico

Géneros Especies

Escherichia E. coli

Shigella S. flexneri, S. sonnei, S.dysenteriae

Salmonella S. enteric, S. bongori

Klebsiella K. pneumonia, K. oxytoca

Enterobacter E. cloacae, E. aerogenes, E. agglomerans

Serratia S. cloacae, S. odorífera, S. fonticola

Citrobacter C. freundii, C. kooseri

Proteus P. vulgaris, P. mirabilis

Providencia P. rettgeri, P. stuartii

Yersinia Y. enterocolítica, Y. pestis

(Merino & Lôsch, 2012)

Uno de los factores de virulencia en las enterobacterias es su capacidad de

producir toxinas, existiendo una amplia variedad de citotoxinas y

enterotoxinas causantes de los diferentes síndromes diarreicos. Las

enterobacterias tienen la capacidad de adquirir rápidamente resistencia a los

antibióticos debido a que poseen plásmidos, que son unidades de ADN

extracromosómico (Galí, 2010).

2.3.2. COLIFORMES

El grupo coliforme es considerado como el principal indicador de patógenos

entéricos y comprende: coliformes, coliformes fecales y E.coli. El término

coliforme representa un grupo de especies de diversos géneros como:

Escherichia, Enterobacter, Klebsiella, Citrobacter. Se los agrupa juntos por

compartir características comunes: son bacilos Gram negativos, no

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formadores de esporas, facultativos anaeróbicos; son sensibles al

tratamiento con calor bajo, por ello mueren con la pasteurización (Ray &

Bhunia, 2010).

Debido a que los coliformes se encuentran comúnmente en el tracto

intestinal, su presencia puede indicar una contaminación fecal, por ello se los

considera como microorganismos indicadores; sin embargo se debe

considerar que los coliformes presentes en los alimentos pueden tener o no

un origen fecal (Yousef & Carlstrom, 2006).

A pesar de la presencia de coliformes, los alimentos se pueden consumir sin

peligro, siempre y cuando se cumpla con los niveles de tolerancia (un

coliforme por cada 100ml agua); si hay cantidades superiores, el alimento no

debe consumirse (Gómez, 2002).

2.3.2.1. Coliformes fecales

Los coliformes fecales constituyen un grupo de bacterias cuya especificidad

como contaminante fecal es mucho más alta; los grupos que se encuentran

con mayor frecuencia en las heces fecales son E.coli, Klebsiella y

Enterobacter (Ray & Bhunia, 2010).

Una de las características que diferencia a los coliformes fecales es que son

termotolerantes, pues su temperatura de incubación oscila entre 44 y 45°C

es decir que soportan temperaturas elevadas lo que permite diferenciarlos

de los coliformes totales, fermentan la lactosa produciendo ácido y gas; en el

recuento de coliformes fecales se determina el número de los mismos por

gramo o cm3 de alimento (INEN, 1990 ;CYTED, 2011).

Los coliformes fecales, incluyendo E.coli, son fáciles de destruir, aplicando

una temperatura de 55ºC se logra su destrucción, sin embargo es

recomendable asegurarse temperaturas por encima de 63ºC así como

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también pueden morir durante el almacenamiento en congelación. Los

coliformes pueden estar presentes en equipos y utensilios que al emplearlos

contaminarán los alimentos procesados (Montville et al., 2012).

2.3.2.2. Escherichia coli

Escherichia coli fue descubierta por primera vez en 1885 por el bacteriólogo

alemán Theodore von Escherich, quién la llamó Bacterium coli;

posteriormente esta bacteria recibirá el nombre con la que actualmente se la

conoce, en honor a su descubridor (Pesantez, 2010).

Schardinger, en 1982, fue el primero que utilizó E.coli como indicador de

organismos patógenos transmitidos por el consumo de agua; Teobaldo

Smith, un año más tarde manifiesta que al ser E. coli un organismo que se

encuentra de forma constante en el tracto intestinal, su presencia en agua o

alimentos se debe a que ha existido contaminación con materia fecal del

hombre o animales de sangre caliente (Jay, 2000).

2.3.2.2.1. Generalidades

E. coli pertenece al grupo de coliformes, es una bacteria Gram negativa,

anaerobia facultativa, no esporulada, con forma de bastón como se observa

en la Figura 2.3; su nicho natural es el tracto intestinal de los seres

humanos, animales de sangre caliente y aves (Ray & Bhunia, 2010).

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Figura 2.3. Estructura de Escherichia coli

(Puerta- García & Mateos-Rodríguez, 2010)

Se multiplica a temperaturas entre 6 y 50º C, con una temperatura óptima

alrededor de 37º C. También, pueden crecer en presencia de un 6% de

NaCl, ya que es más resistente a estos compuestos en comparación a otras

bacterias, como por ejemplo, Salmonella (Guadalupe, 2002).

En la Tabla 2.3 se indican los principales parámetros que inciden en el

crecimiento de E.coli.

Tabla 2.3. Condiciones de crecimiento de E.coli

Condiciones Mínimo Óptimo Máximo

Temperatura 7-8 35-40 46

pH 4.4 6-7 10

aw 0.95 0.99 ----

(Do Santos, 2007)

Investigaciones realizadas indican que existe más de un tipo de cepas

patógenas de E.coli; se han dividido en seis grupos en base a la capacidad

para producir toxinas, adherirse e invadir las células epiteliales del intestino.

Los grupos son: E.coli enterotoxigénica (ETEC), E.coli enteropatogénica

(EPEC), E.coli enteroinvasiva (EIEC), E.coli difusamente adherida (DAEC),

E.coli enteroagregativa (EAEC) y E.coli enterohemorrágica (EHEC)

(Montville et al., 2012).

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2.3.2.2.2. Enfermedades

E. coli coloniza el intestino del hombre pocas horas después de que ha

ingresado al organismo; se le considera un microorganismo de flora normal,

pero hay cepas que pueden ser patógenas y causar daño produciendo

diferentes cuadros clínicos, entre ellos diarrea (Guadalupe, 2002).

Es considerado un microorganismo marcador que actúa como indicador e

índice ya que la presencia genérica de este microorganismo en una muestra

revela una posible contaminación fecal y la posible presencia simultánea en

el alimento de otros microorganismos patógenos ecológicamente

relacionados (Montville et al., 2012).

La forma de infección de E. coli en la mucosa intestinal es: adhesión,

colonización de la mucosa para absorber nutrientes de la flora del intestino,

evasión de las defensas del huésped, multiplicación y daño al huésped

(García, 2004).

Según el tipo de cepa, se genera sintomatología diferente causada por el

tipo de toxina o mecanismo presente. En la Figura 2.4se presenta la

patología desarrollada por diferentes cepas de E.coli.

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Figura 2.4. Características de cepas de E.coli causantes de diarrea

(García, 2004)

La cepa enterohemorrágica de E.coli (EHEC), fue reconocida en 1982 como

un patógeno que afecta al hombre pudiendo causar diarrea o colitis

hemorrágica en seres humanos. El principal reservorio de EHEC O157: H7

en particular es el ganado vacuno y ovino, quienes no presentan síntomas

de la infección, eliminando de su organismo heces contaminadas. Los seres

humanos adquieren EHEC O157: H7 por contacto directo con los animales,

sus excrementos, tierra/ agua contaminada, o por medio de la ingestión de

carne de vacuno y otros productos animales como la leche, así también por

la ingesta de verduras y frutas contaminadas. La dosis infecciosa de este

serotipo de E. coli es baja, se requieren de 100 a 200 bacterias para producir

la enfermedad y el período de excreción del organismo varía de 2 días a 5

meses, lo que aumenta el riesgo de enfermedad (OIE, 2009).

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2.3.2.2.3. Alimentos implicados

La presencia de E.coli en las materias primas alimenticias indica

contaminación fecal, directa o indirecta. La contaminación directa ocurre en

el procesamiento de materias primas de origen animal por la falta de higiene

de las personas que manipulan el producto, la contaminación indirecta se da

por aguas servidas o sucias (Ray & Bhunia, 2010). Algunos ejemplos de

alimentos contaminados se lista en la Tabla 2.4.

Tabla 2.4. Alimentos Contaminados con E.coli

Alimento Tipo de Contaminación

Carne picada cruda o poco cocida Directa

Semillas germinadas crudas Indirecta

Leche cruda Indirecta

Hamburguesas poco cocidas Directa

Salami curado Directa

Yogur Directa

Queso elaborado con leche cruda Directa

Frutas Indirecta

Verduras:

Col

Espinacas

Lechuga

Ensaladas

Indirecta

(OMS, 2011)

Otras cepas de E.coli, especialmente la EHEC, son capaces de sobrevivir

durante meses en el estiércol contaminando, afectando directamente las

aguas superficiales que se utilizan para bebida y riego, contaminando así las

verduras, frutas y productos que se encuentran en la superficie de las tierras

de cultivo (Guadalupe, 2002).

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En 1982, se detectó por primera vez una infección masiva de E.coli O157:H7

relacionada con el consumo de productos cárnicos; recientes casos de

enfermedades con este serotipo han sido relacionadas con frutas y

vegetales contaminados cuya causa principal se debe al agua de riego

(Montville et al., 2012).

2.3.2.2.4. Prevención

Las fuentes de transmisión de E.coli se pueden prevenir aplicando medidas

de control en todas las etapas de la cadena alimentaria, desde la producción

agropecuaria en la granja hasta la elaboración, fabricación y preparación de

los alimentos, tanto en establecimientos comerciales como en los hogares.

Las medidas de prevención frente a E.coli se centran en cocción adecuada

de los alimentos, uso de agua potable, lavado de frutas y vegetales antes de

consumirlos, y sobre todo una correcta higiene tanto del manipulador como

del consumidor de alimentos (OMS, 2011; DoSantos, 2007).

2.3.2.3. Análisis y detección de coliformes

Según Rivera (2012), para detectar E.coli se deben realizar tres pruebas

consecutivas: presuntiva, confirmativa y complementaria.

Prueba presuntiva: Se emplea la determinación del Número Más Probable

(NMP) que es la estimación del número de bacterias existentes en una

muestra de alimento. Se realizan diluciones sucesivas con el medio líquido

Caldo Verde Brillante Bilis Lactosa y campanas de Durham; el fin de realizar

esta prueba es buscar tubos con presencia de gas lo que es indicativo de

una prueba positiva procedente del CO2 que causa la fermentación de la

lactosa. Se calcula el número más probable de E.coli por mililitro o gramo de

alimento utilizando las tablas del número más probable (INEN, 1990).

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Prueba confirmatoria: Con cada uno de los tubos positivos de la prueba

presuntiva, se realiza la técnica de recuento en placa mediante siembra por

estría en placas Petri con medio selectivo líquido, como es el Agar Eosina

Azul de Metileno (EMB); de las colonias sospechosas se realizará tinción

Gram, con ello se comprobará la presencia de bacilos Gram negativos no

esporulados (INEN, 1990).

Prueba complementaria: Para identificar las diferentes bacterias

pertenecientes a la familia Enterobacteriaceae, se emplea un conjunto de

pruebas bioquímicas conocidas como IMViC, con las que se verifica la

producción de indol a partir del triptófano (I), se comprueba el descenso de

pH del caldo glucosa a través de la reacción de rojo de metilo (M), la

comprobación de la producción de acetona a partir de glucosa través de la

reacción de Voges- Proskauer (V), y la utilización del citrato como fuente de

carbono (C) (Rivera J. F., 2012).

En la Figura 2.5 se muestra un esquema de los análisis microbiológicos que

se realizan para la detección de E.coli.

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Figura 2.5 Análisis Microbiológico de E.coli

(Cano, 2006)

2.4. VEGETALES TIPO HOJA

“Los productos frescos son probablemente los alimentos más difíciles para

establecer criterios y controles microbiológicos” (Montville et al., 2012).

Los alimentos son de gran importancia en la salud y la vida de las personas,

la frecuencia de consumo de vegetales ha aumentado por su calidad

nutricional, por lo que se debe salvaguardar la calidad higiénica y sanitaria

de los mismos, desde el campo hasta la mesa del consumidor (Gombas,

2012).

Por lo general los alimentos que se consumen frescos como vegetales y

frutas tienen una microbiota natural compleja que viene dada desde el

campo. Evidencias epidemiológicas indican que la contaminación en

productos frescos no presenta peligro para la salud, sin embargo los criterios

microbiológicos para vegetales frescos se han aplicado desde que se han

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presentado brotes epidemiológicos resultantes de vegetales frescos

contaminados con patógenos entéricos (Montville et al., 2012).

Los productos frescos no eran considerados como vehículo de

enfermedades alimentarias hasta antes de los años 90’s cuando se produjo

una epidemia de cólera en Latinoamérica que redujo notablemente el

consumo de hortalizas en muchos países de la región por casi un año

(Camelo, 2003).

Los vegetales tipo hoja son consumidos en fresco, por lo tanto todo

organismo patógeno para el ser humano que pueda transportarse sobre su

superficie constituye un peligro potencial. Bacterias como Shigella spp.,

Salmonella spp., Aeromonas spp., Escherichia coli, Listeria monocytogenes

así como las toxinas producidas por Clostridium botulinum y otros

microorganismos han sido identificadas como responsables de

enfermedades alimentarias transmitidas por la ingestión de frutas y

hortalizas (Camelo, 2003).

Se requiere un manejo cuidadoso de los vegetales tipo hoja durante la

cosecha y empaque ya que por su naturaleza y fácil contacto con aire, agua

y suelo, pueden facilitar la entrada de los microorganismos y provocar

alteraciones o daños físicos en el alimento (Do Santos, 2007).

2.4.1. CILANTRO

2.4.1.1. Generalidades de la planta

El cilantro (Coriandrum sativum), perteneciente a la familia Apiaceae

(Umbelliferae), es un cultivo que se originó en el sur de Europa, continente

asiático, centro y norte de la India, centro y sur de Rusia y regiones

orientales de Afganistán y Pakistán (Vallejo & Estrada, 2004).

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Su uso por primera vez como planta medicinal y de condimento aparece en

registros históricos egipcios de 1550 A.C; los españoles y portugueses en

sus viajes de conquista y colonización trajeron el cilantro y otras especias al

Caribe, Centro y Sur América (Morales J. P., 1995).

Alcanza 40 a 80 cm de alto, sus hojas presentan un color verde claro u

oscuro, con bordes dentados; sus hojas son alternadas, finamente divididas

con un pecíolo en la base; las flores son actinomorfas y hermafroditas y

están dispuestas en umbelas formadas generalmente por un pequeño cáliz

de 5 sépalos, una corola de 5 pétalos, 5 estambres alternados con pétalos.

Las semillas tienen de 3 a 5mm de diámetro, son redondas de color verde y

cambiando a marrón al madurar, tienden a desprenderse de la planta

cuando están maduras (Vallejo & Estrada, 2004; Morales, 1995).

En las Figuras a y b se muestran las diferentes estructuras morfológicas que

puede tener el cilantro, formadas generalmente por un tallo que se ramifica

presentando hojas finas y delgadas (Vallejo et al., 2004).

Figura 2.6. Estructuras Morfológicas del Cilantro: a) Planta de cilantro

florecida, b) Posición de hojas en tallo.

(Morales J. P., 1995)

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2.4.1.2. Clasificación taxonómica

La clasificación taxonómica del cilantro que propone (Oleas & Taco, 2011)

se presenta en la Tabla 2.5.

Tabla 2.5. Clasificación Taxonómica del Cilantro

Nombre

Científico

Coriandrum sativum

Nombre común Cilantro

Reino Plantae

Clase Angiospermas

Subclase Dicotiledónea

Familia Umbelliferae Juss

Subfamilia Apidaceae Drude

Tribu Coriandreae W. Koch

Géneros Coriandrum

Bifora, Hofman

Sclerotiaria Korovin

(Oleas & Taco, 2011)

2.4.1.3. Composición y valor nutricional

La composición del cilantro en 100 gramos de porción comestible se detalla

en la Tabla 2.6.

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Tabla 2.6. Composición nutricional del cilantro

(INIAP, 2000)

La parte comestible del cilantro es principalmente su follaje, las hojas frescas

del cilantro son ricas en caroteno, calcio y vitaminas A, B2 y C (Morales J.

P., 1995).

Las hojas poseen propiedades diuréticas, estimulantes, antisépticas,

antiespasmódicas y purificadoras de la sangre, se usa para cicatrizar

heridas, úlceras y ayuda a la maduración de inflamaciones (Corporación

Colombiana Internacional, 2006).

Sus propiedades medicinales y aromáticas están relacionadas con su

contenido de aceites esenciales que forman parte de la composición

química del cilantro como son: decanal, dodecanal, decano, huleno,

cerofileno, linanol, taninos, ácido málico (Ramos, 2008).

2.4.1.4. Variedades

En general las variedades del cilantro se clasifican como de floración lenta o

rápida, y según el color de sus flores blanco, rosa o morado.

Como se indica en la Tabla 2.7, actualmente en el mercado también existen

cultivares híbridos que han sido aprobados por los agricultores a pesar de su

alto costo (Vallejo & Estrada, 2004).

Composición Química de la parte comestible (100g)

Agua 83.00

Proteína 4.20

Grasas 0.46

Carbohidratos 8.00

Fibra 2.20

Cenizas 2.20

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Tabla 2.7. Variedades de Cilantro

Nombre del

Cultivar

Característica Tipo

Cilantro Criollo

Florece a los 40-50 días, del mismo

se han desarrollado diferentes

variedades

Variedad

MS Susceptible a la cenicilla causada por

el hongo Erysiphe Variedad

Long Stanlin Alcanza 75cm de alto al madurar las

semillas Híbrido

Shepherd’s

Floración rápida, semillas inmaduras

de olor y sabor muy fuertes, cuando

maduran la fragancia cambia a olor

parecido al cítrico.

Híbrido

Slow Bolt

Floración lenta, de hoja ancha de

excelente productividad para

consumo en fresco.

Híbrido

Mágnum Color verde intenso, buen

comportamiento poscosecha Variedad

(Vallejo & Estrada, 2004)

2.4.1.5. Cultivo en el Ecuador

El cilantro en el Ecuador tiene una producción amplia y con alta frecuencia,

debido a las características geográficas y climáticas del país, que favorecen

su desarrollo y crecimiento. Se lo cultiva especialmente en la Sierra, en las

provincias de Imbabura, Pichincha, Chimborazo, Carchi, Tungurahua y

Bolívar; tiene un ciclo vegetativo corto, que entre la siembra y la cosecha,

oscila alrededor de 40 a 45 días ( Revista El Agro, 2013).

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Los requerimientos climáticos de este cultivo son de preferencia entre los

1000 y 1300 metros sobre el nivel del mar, en suelos francos y franco

arcilloso, bien drenado, rico en materia orgánica, pH entre 5 y 7,5. (Morales,

Brunner, Flores, & Martínez, 2011).

Las enfermedades más comunes en el cilantro están causadas por

patógenos que afectan las hojas, por ejemplo hongos como: Erysipe,

Cercospora y Alternaria, y la bacteria Pseudomonas syringae o los que

afectan las raíces como Rhizoctonia y Fusarium. Las plagas más reportadas

incluyen orugas como: Spodoptera exigua, Spodoptera frugiderpay

Trichoplusia nii, ácaros y trípidos(Morales et al., 2011).

Un estudio realizado por expertos de la Universidad de California (USA) y de

la Universidad Autónoma de Guadalajara (México) confirma que el cilantro

es eficaz para combatir bacterias presentes en los alimentos como la

Salmonella, resultando ser más efectivo que la gentamicina, antibiótico

utilizado normalmente para combatir esta bacteria (Wong & Kitts, 2006).

2.4.2. PEREJIL

2.4.2.1. Generalidades de la planta

El perejil (Petroselinum sativum) pertenece a la familia Apiaceae. Es una

planta herbácea bianual aromática, muy ramificada, de tallo cilíndrico, de

alrededor de 60cm de altura y con raíz carnosa. Las hojas son compuestas,

con limbo triangular y con foliolos dentados, rizados, siendo el principal

órgano de consumo; tienen una longitud de 10 a 20cm, con segmentos

ovalados o cuneiformes, algunos son lisos y otros crespos de color verde

oscuro. Las flores se presentan en forma de sombrilla aplanadas por arriba,

de color verde-amarillento y producen un fruto redondeado, que una vez

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maduro se divide en dos medios frutos arqueados (Japon, 2011;Marsh &

Gardener, 2008).

Es originario de la región del Mediterráneo, de la isla de Cerdeña en Italia.

Se cultivó en España e Inglaterra antes del siglo XVI, extendiéndose desde

ahí a América, África y Asia. Petroselinum proviene del nombre común

griego petroselino dado a una especie de perejil que crecía sobre las rocas

(Morales J. P., 1995).

El perejil es utilizado ampliamente como condimento; sus hojas rizadas son

utilizadas como aderezo y como saborizante de carnes, salchichas,

alimentos enlatados, sopas, salsas y como sazonador; también es apreciado

como aromatizante de quesos (Marsh & Gardener, 2008).

El perejil ha demostrado tener gran cantidad de componentes químicos

como la apiína y los flavonoides, que le confieren propiedades diuréticas,

antioxidantes, emenagogas (estimula la menstruación), carminativas y

diuréticas. Debido a los apioles que contiene se lo debe usar con cuidado

pues en dosis inadecuadas puede producir convulsiones, espasmos y

parálisis; en ciertos casos presenta también propiedades abortivas o

contraceptivas (INIAP, 2000; Vallejo et al., 2004).

2.4.2.2. Clasificación taxonómica

La clasificación taxonómica del perejil que propone (Oleas & Taco, 2011) se

presenta en la Tabla 2.8.

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Tabla 2.8. Clasificación Taxonómica del Perejil

Nombre

Científico

Petroselinum sativum

Nombre común Perejil

Reino Plantae

Clase Angiospermas

Subclase Dicotiledónea

Familia Umbelliferae

Subfamilia Apidaceae Drude

Géneros Petroselinum

(INIAP, 2000)

2.4.2.3. Composición y valor nutricional

El perejil es una hortaliza muy importante debido a su valor nutricional,

caracterizándose por tener un alto contenido de vitamina C, β-caroteno,

tiamina, riboflavina, y vitamina E (García, Cortes, & Rodríguez, 2010).

La composición nutricional del perejil es similar a la de otros vegetales tipo

hoja, que contienen un alto contenido de agua pero bajo valor energético.

En la Tabla 2.9se destacan los principales componentes nutricionales que

tiene el perejil, siendo lo más representativo su alto contenido de provitamina

A y vitamina C (Verdú & Carazo, 2005).

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Tabla 2.9. Composición Nutricional del Perejil

Composición Química de la parte comestible (100g)

Agua 85.00

Proteína 3.40

Grasas 0.60

Carbohidratos 7.10

Fibra 2.10

Cenizas 1.80

Otros componentes (mg)

Calcio 237.00

Fósforo 58.00

Hierro 3.90

Vitamina A 3.200 UI

Tiamina 0.11

Riboflavina 0.20

Niacina 0.80

Ácido ascórbico 38.00

Calorías 44

(INIAP, 2000)

Estudios realizados con aceite esencial del perejil para evaluar su capacidad

antioxidante, mostraron que dos de sus constituyentes, el apiol y la

miristicina, contribuyen a dicha propiedad, y sugieren que el perejil podría

ser una alternativa de consumo de antioxidantes naturales (Reyes, Zabala, &

Alonso, 2012).

2.4.2.4. Variedades

Existen tres tipos principales de perejil que son: de hoja lisa, rizada y

paramount como se observa en las Figuras a-c. El de tipo hoja lisa es menos

vistoso pero tiene sabor más fuerte, el rizado tiene hojas finamente divididas

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y arrugadas y el paramount tiene hojas rizadas más compactas siendo las

mismas encorvadas y encrespadas (García H. D., 2013).

Una de las variedades más sembradas es el “Dark Green Italian” del tipo de

hoja lisa, cosechándose entre 75-80 días, tiene hojas muy dentadas con

mejor sabor que los rizados. El perejil rizado contiene los subtipos: Doble

rizado o Moss Curled, Evergreen y Triple rizado (Morales J. P., 1995).

Figura 2.7 Variedades de Perejil: a) Perejil Liso, b) Perejil Liso y

c) Paramount

(Marsh & Gardener, 2008)

2.4.2.5. Cultivo en el Ecuador

El cultivo de perejil es muy exigente cuanto a la calidad del suelo, pues debe

ser muy rico en humus y muy fértil; es recomendable que antes de la

siembra el suelo sea arado para que las raíces puedan penetrar

profundamente. Para el cultivo comercial se debe repetir la siembra al

menos anualmente para garantizar la obtención continua de la semilla. Bajo

condiciones adecuadas resiste bien todos los climas, de preferencia el frío

(INIAP, 2000).

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Aunque no existen datos reales de la producción de perejil en el Ecuador, se

considera que las principales zonas de cultivo están en las provincias de

Loja, Chimborazo, Bolívar, Imbabura, Cotopaxi y Tungurahua; también

existen algunos cultivos en la costa (García H. D., 2013).

2.5. INTOXICACIONES CAUSADAS POR LA INGESTA DE

VEGETALES TIPO HOJA

Las hortalizas que están expuestas a contaminación generan un riesgo

inminente para la salud humana. Uno de los factores más comunes de

contaminación microbiana para los cultivos es la utilización de aguas

servidas que contienen patógenos, empleadas para el riego, particularmente

para las hortalizas que son ingeridas sin cocerlas como es el caso de:

lechugas, col, zanahoria, rábano, perejil, apio, cebollín y el cilantro (Clavijo,

2011).

Un informe realizado por el Centro para el Control de Enfermedades de

Estados Unidos (CDC, por sus siglas en inglés) a través de información

recopilada desde 1998 al 2008, indicó que las verduras de hojas verdes son

responsables de más enfermedades transmitidas por alimentos que

cualquier otro producto alimentario. La fuente del 22% de las enfermedades

se encontró en verduras de hojas verdes como la col rizada o la espinaca

(Diario El Comercio, 2013;Grajales, 2013).

Se han reportado varios casos de contaminación presente en vegetales tipo

hoja en diferentes lugares del mundo:

En Mayo del 2011, se declaró en Alemania una toxiinfección alimentaria por

verduras (pepinos, tomates y lechuga) contaminadas con Escherichia coli

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O157:H7 teniendo como resultando 1000 afectados y 10 fallecidos (Diario El

Universal, 2011).

Real Mex Foods, en agosto del 2012, emprendió un retiro voluntario del

mercado de 77.688 libras de su marca El Torito, específicamente de la

ensalada lista: “Grilled Chicken Caesar Salad” debido a una posible

contaminación por Salmonella ya que contenía un aderezo hecho con

cilantro que la Administración de Alimentos y Medicina (FDA) había

ordenado retirar del mercado debido a la contaminación con este patógeno.

El retiro fue clasificado como de Clase I, que indica una situación de peligro

que provoca efectos adversos graves o incluso la muerte como

consecuencia del consumo de los productos (Arteaga, 2012).

En el mes de abril del 2013, la Subsecretaría de Defensa del Consumidor de

Argentina inhibió el consumo de verduras de hoja, como espinaca, acelga y

lechuga durante quince días debido a que podían estar contaminadas como

consecuencia de inundaciones que afectaron a la zona del cinturón verde de

La Plata, lugar que abastece de verduras y todo tipo de hortalizas al resto

del país (Diario InfoRegión, 2013).

En agosto del 2013, Buurma Farms Inc., empresa dedicada a la producción

y venta de vegetales frescos, retiró voluntariamente 465 cajas de cilantro lote

No. 02D312A4, debido a una posible contaminación con Listeria

monocytogenes. La empresa se dio cuenta de este problema después de

que el Departamento de Agricultura de Michigan realizara una prueba de

rutina; rápidamente se alertó al resto de minoristas y mayoristas pidiendo

que se retirara el producto de sus estantes (Robledo, 2013).

Según un estudio del Departamento de Agricultura de los Estados Unidos

(FAO), la radiación ionizante es el único método que consigue eliminar por

completo los patógenos causantes de enfermedades que pueden ser

transmitidos en los alimentos frescos. Los investigadores desarrollaron un

método en el cual sumergieron dos vegetales de hoja verde (espinaca y

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lechuga) en una mezcla con E. coli. Las hojas fueron tratadas mediante tres

sistemas: lavado con agua, enjuague con un tratamiento químico (solución

de hipoclorito de sodio) y con irradiación (con una dosis de 1-10 kilo Grays

(kGy). Los resultados finales mostraron que el lavado con agua no fue eficaz

para reducir los niveles del patógenos; el tratamiento químico no redujo de

forma significativa el número de E. coli en las hojas de espinacas y redujo en

menos de un 90% las bacterias en las muestras de lechuga. Finalmente, la

radiación ionizante redujo de forma significativa la población del patógeno

tanto en las hojas de espinaca como de lechuga. El nivel de eliminación fue

independiente de la dosis aplicada, con reducciones del 99.99% en la

lechuga y del 99.90% en espinacas en las dosis más altas (10kGy) (Zamora,

2008).

2.6. USO DE INDICADORES ENTÉRICOS PARA DETERMINAR

LA CALIDAD MICROBIOLÓGICA DE VEGETALES TIPO

HOJA

La microbiota original de los alimentos crudos proviene del entorno donde se

producen, es decir de las granjas o tierras de cultivo. La manipulación de los

alimentos crudos durante su obtención y transporte aumentan una gran

cantidad de contaminantes. La calidad de los alimentos depende de sus

propiedades físicas, químicas, microbiológicas y sensoriales; la calidad

microbiológica puede estimarse en términos generales mediante el análisis

microbiológico de recuento total en placa (RTP) (Yousef & Carlstrom, 2006).

Para determinar la calidad de los vegetales, en diferentes países de América

Latina se han realizado estudios afines con el tema de investigación

empleando distintas muestras de vegetales frescos y obteniendo niveles

significativos de contaminación microbiana; la información recopilada de

estos estudios se puede observar en la Tabla 2.10

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Tabla 2.10. Calidad Microbiológica en Vegetales Frescos

Título Vegetal Microorganismos

encontrados País/Año

Calidad

microbiológica y

bacterias

enteropatógenas

en vegetales

tipo hoja

Lechugas

Cilantros

Perejiles

Coliformes totales

y fecales

Salmonella

Aeromonas

Vibrio

Venezuela

2010

Frecuencia de

Listeria en

muestras de

tomates y

cilantro frescos

en tres

supermercados

Tomates

Cilantro

-Listeria

monocytogenes

-Listeria ivanovii

-Listeria seeligeri

Venezuela

2009

Contaminación

fecal en

hortalizas que

se expenden

en mercados

-Cebolla

-Rabanito

-Culantro

-Lechuga

-Perejil

-Coliformes

fecales

-Escherichia

coli

Perú

2009

Indicadores

entéricos en

vegetales

frescos que se

comercializan

en mercados

populares

Lechugas

Cilantros

Perejiles

-Coliformes

totales y fecales

- Escherichia coli

Venezuela

2009

Calidad

sanitaria de

ensaladas de

verduras

crudas, listas

para su

consumo

-Espinaca

-Lechuga

-Pepino

-Cebolla

-Coliformes

totales, fecales

-Escherichia coli

México

2006

Calidad

microbiológica

y aislamiento

de Shigella en

vegetales

frescos

Lechugas

Tomates

-Shigella sp.

-Salmonella sp.

-Coliformes

totales y fecales

Costa Rica

2001-2002

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40

En el Ecuador se ha realizado un estudio sobre la determinación de

coliformes totales y E. coli en muestras de lechuga expendidas en cuatro

mercados de la ciudad de Cuenca, reportando un grado de contaminación

tolerable de coliformes totales y un nivel aceptable de la presencia de E. coli

en las lechugas (Vélez & Ortega, 2013).

Sin embargo aún no se cuenta con normativa ecuatoriana, razón por la cual

se han empleado valores referenciales de normas internacionales para

determinar el grado de contaminación presente en los vegetales en estudio.

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3. METODOLOGÍA

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3. METODOLOGÍA

3.1 DESCRIPCIÓN Y TOMA DE MUESTRA

La población objeto de estudio estuvo conformada por dos vegetales tipo

hoja: cilantro y perejil. Se seleccionaron al azar tres puestos de expendio de

estos vegetales en cada uno de los mercados populares seleccionados del

Norte de la ciudad de Quito: Mercado La Ofelia, Santa Clara y La Carolina

como se muestran respectivamente en la Figura 3.1.

Figura 3.1. Mercados del Norte de la ciudad de Quito

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Las muestras fueron recolectadas los días sábados en el mercado La Ofelia,

y los días domingos en los mercados Santa Clara y La Carolina, en las

condiciones normales de manipulación y venta al público; tanto el culantro

como perejil fueron colocados en un funda plástica por las mismas

vendedoras (con las manos que manipulan el dinero de la venta), en cada

puesto de venta el peso aproximado que se adquirió fue 80g de cada

vegetal. Las muestras se tomaron de 3 lotes diferentes, durante los meses

de febrero y marzo del 2014; cada muestra en 2 tomas distintas (2 réplicas),

fueron transferidas a una funda sellada estéril etiquetada, conservada en

cadena de frío para su posterior traslado al Laboratorio de Microbiología de

la Universidad Tecnológica Equinoccial para los respectivos análisis.

3.2ANÁLISIS MICROBIOLÓGICOS

3.2.1 DILUCIONES SUCESIVAS

Para realizar los análisis microbiológicos se realizaron diluciones sucesivas

según la norma técnica ecuatoriana INEN1 529-2

Los ensayos se realizaron en una cámara de flujo laminar marca Telstar, con

el fin de mantener condiciones estériles. Se pesó 25g de muestra y se

transfirieron a un frasco con 225 mL de agua peptonada estabilizada el pH;

se homogenizó la muestra (dilución 10-1) y a partir de esta dilución se

preparó diluciones sucesivas (10-2…10-7) en tubos de ensayo que contenían

9 mL de agua peptonada.

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43

3.2.2 RECUENTO, AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE COLIFORMES

FECALES Y Escherichia coli

El recuento de coliformes fecales y Escherichia coli se realizó según la

norma técnica ecuatoriana INEN 1529-8

3.2.2.1 Colimetría presuntiva

Se inoculó 1ml de las diluciones 10-110-2 y 10-3, a una serie de tres tubos

para cada dilución que contenían 9 mL de caldo BGBL (verde brillante bilis

lactosa) con tubos Durham invertidos. Se incubaron a 30°C por 48 horas.

Transcurrido este tiempo se consideró como presuntos positivos en cada

dilución todos aquellos tubos que presentaron crecimiento con producción de

gas que llene el fondo cóncavo de la campana Durham como se observa en

la Figura 3.2. Para la lectura de los resultados se obtuvo una combinación

numérica que fue comparada con la tabla de NMP incluida en el Anexo I.

Figura 3.2. Tubos BGBL

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3.2.2.2 Colimetría confirmatoria

Posteriormente, de cada uno de los tubos presuntamente positivos se

inoculó de dos a tres asadas en 2 tubos: uno con 10 mL de caldo BGBL con

campanas Durham y otro con 3 mL de TSB (caldo triptona de soya) los

cuales fueron incubados por 24 horas a 45.5°C.Transcurrido este tiempo, se

consideró como coliformes fecales positivos los tubos de BGBL que

presentaron producción de gas y aquellos de TSB positivos a la prueba de

producción de indol (al añadir tres gotas del reactivo de Kovac se forma un

anillo rojo en la superficie); la reacción fue negativa cuando se conservaba el

color original del medio (Figura 3.3).

Figura 3.3. Tubos BGBL y TSB

A continuación, de cada tubo de BGBL que resultó positivo para las dos

pruebas mencionadas anteriormente, se inoculó aplicando la técnica de

siembra en estría, con la ayuda de un asa estéril se transfirió una porción de

cultivo a una placa de EMB (agar eosina azul de metileno). En la figura 3.4

se observa el procedimiento de siembra en estría; se incubó las placas

invertidas a 37°C por 24 horas.

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45

Figura 3.4. Siembra en estría

(Cano, 2006)

Se seleccionaron 2-3 colonias bien aisladas y típicas de E. coli, negras

nucleadas con brillo verde metálico, y se sembró para purificar el cultivo por

la técnica de cola de pez en tubos inclinados con PCA (agar de recuento en

placa) incubándolos a 37°C por 24 horas. Con las bacterias que crecieron

se efectuó la tinción por el método Gram con el fin de saber si el cultivo

presentaba un solo tipo de microorganismos, bacilos Gram negativos.

La tinción Gram se realizó según el procedimiento de Rivera(2012) y Yousef

& Carlstrom (2006). Se transfirió una porción de colonia desde el tubo

sembrado por cola de pez de la Figura 3.5 (a), a una gota de agua destilada

mezclándola y difundiéndola con la ayuda de un asa, se secó la extensión y

se fijó con calor pasando el portaobjetos sobre la llama de un mechero. Para

ejecutar la tinción Gram se cubrió la extensión con cristal violeta durante 1

minuto, se lavó con agua destilada con la ayuda de una piseta, se colocó

lugol por 1minuto y se lavó. Posteriormente se añadió una mezcla alcohol

acetona, se lavó y finalmente se añadió safranina por 30 segundos se lavó

nuevamente con agua destilada, se secó y se observó la placa con un

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microscopio marca Olimpus CX31, con el lente 100X colocando una gota de

aceite de inmersión sobre la muestra, comprobando la pureza de los cultivos

como se observa en la Figura 3.5 (b) con los que se realizó las pruebas

bioquímicas IMViC.

Figura 3.5. Cultivos Purificados

3.2.2.3 Colimetría complementaria

3.2.2.3.1 Prueba para indol (I)

A partir del cultivo puro, se sembró por picadura con una aguja de

inoculación en un tubo con medio SIM, que se incubó por 24 horas a 37°C.

Una vez transcurrido el tiempo de incubación, se añadió 2 gotas de reactivo

de Kovac. La aparición de color rojo en la superficie del reactivo determina

que la prueba es positiva, mientras que la prueba es negativa cuando el

reactivo conserva el color original.

Para la prueba de indol en la colimetría presuntiva, NMP positivos, se

sembró por depósito de dos a tres asadas en un tubo con 3mL de caldo

TSB, se incubó por 24 horas a 45,5°C, transcurrido este tiempo se añadió 3

gotas del reactivo de Kovac. La prueba es positiva cuando aparece un anillo

rojo en la superficie del medio después de añadir el reactivo.

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El indol es uno de los productos de degradación metabólica del aminoácido

triptófano; las bacterias que poseen la enzima triptofanasa son capaces de

hidrolizar y desaminar el triptófano con producción de indol, ácido pirúvico y

aminoácido. Se produce un anillo rojo-morado cuando se ha producido indol

a partir del triptófano en el medio (Jimenez, 2009).

3.2.2.3.2 Prueba de rojo de metilo (RM)

Se sembró por depósito una asada de cultivo puro en un tubo con caldo RM-

VP (rojo de metilo-Voges Proskauer) a 37°C por 24 horas. Después del

tiempo transcurrido de incubación se añadió 3 gotas de solución de rojo de

metilo. Si el medio se torna rojo la prueba es positiva y negativa cuando no

cambia el color del medio. Es una prueba que indica por qué vía metabólica

se ha fermentado la glucosa; una coloración roja indica que la glucosa es

metabolizada vía ácidos mixtos; donde estos ácidos (acético, fórmico) son

relativamente fuertes y producen un descenso brusco del pH del medio (este

cambio de pH se detecta añadiendo el indicador rojo de metilo) (Macddafin,

2008).

3.2.2.3.3 Prueba de Voges-Proskauer (VP)

Se sembró por depósito una asada de cultivo puro en un tubo con caldo RM-

VP (rojo de metilo- Voges Proskauer) por 24 horas a 37°C, después de este

tiempo se añadieron 3 gotas de solución alcohólica de α-naftol al 6%, y

finalmente 2 gotas de solución de hidróxido de potasio al 40%, se agitó el

tubo después de añadir cada solución. Al paso de aproximadamente 5

minutos se observó la reacción. La aparición de un color rojo brillante indicó

que el resultado es positivo, mientras que si no hay cambio de color la

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reacción es negativa. Es una prueba que detecta la fermentación

butanodiólica, en la cual se producen menor cantidad de ácidos que en la

fermentación ácido-mixta (prueba rojo de metilo), y una gran cantidad de

butanodiol. Mediante α-naftol y KOH al 40%, se detecta la presencia de

acetoína que en presencia de oxígeno se oxida a diacetilo, este origina una

coloración roja al reaccionar con los restos guanidínicos de algunos

aminoácidos de la peptona del medio (Winn, Janada, & Woods, 2006).

3.2.2.3.4 Prueba para la utilización de citrato

Para realizar esta prueba, se sembró por estría sobre la superficie del pico

de flauta del medio Simmons Citrato, se incubó por 24 horas a 37°C. Pasado

este tiempo se observó la reacción; un cambio de color del medio de verde a

azul determinó que la prueba fue positiva. Esta prueba se fundamenta en

que un microorganismo es capaz de utilizar el citrato como única fuente de

carbono, también utiliza las sales de amonio como fuente de nitrógeno; la

extracción del nitrógeno de las sales amonio producen amoníaco el cual

alcaliniza el medio virando el indicador al alcalino (azul) (Betancourt, 2007).

La presencia de E. coli, se confirma cuando los microorganismos detectados

cumplan con las características que se detallan en la Tabla 3.1.

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49

Tabla 3.1 Clasificación de coliformes por IMViC

(INEN, 1990)

3.2.3 DETERMINACIÓN DE COLIFORMES TOTALES POR LA TÉCNICA

DE RECUENTO EN PLACA

La siembra en placa para el recuento total de coliformes se realizó según la

metodología de Yousef & Carlstrom (2006).

Se depositó 1 mL de las diluciones 10-5, 10-6 y 10-7en placas Petri vacías y

se transfirió 15 mL de agar VRB (agar bilis rojo violeta) fundido (~48°C) a las

placas, se homogenizó la mezcla con la ayuda de un agitador de placas

para asegurar la distribución uniforme del inóculo. Se incubó a 37°C por 24

horas. Se consideran como coliformes a las colonias que presentan un color

rojo-púrpura rodeadas de un halo de ácidos biliares precipitados como se

observa en la Figura 3.6.

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50

Figura 3.6. Coliformes en Agar VRB

3.3. ANÁLISIS ESTADÍSTICOS

Se utilizó un diseño factorial AxB, siendo la variable A los mercados y B los

lotes; los resultados fueron procesados mediante un análisis de varianza

(ANOVA), las medias fueron comparadas con la prueba de Tukey con una

significancia de 0.05 usando el software estadístico INFOSTAT versión

estudiantil.

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4. ANÁLISIS DE RESULTADOS

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4. ANÁLISIS DE RESULTADOS

En el presente capítulo se describen los resultados y discusión del recuento,

aislamiento e identificación de coliformes totales, fecales y E.coli en

muestras de cilantro y perejil expendidos en mercados del norte de la ciudad

de Quito. Los mercados se designaron numéricamente como: 1. Ofelia, 2.

Iñaquito y 3. Santa Clara. Las evidencias fotográficas de la recolección de

muestras en cada mercado se presentan en los Anexos II-IV.

4.1 RECUENTO, AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE

COLIFORMES TOTALES, COLIFORMES FECALES Y

Escherichia coli

Según la norma INEN 1529-8 (1990), el análisis de E. coli comprende tres

fases: colimetría presuntiva (coliformes totales), colimetría confirmativa

(coliformes fecales) y colimetría complementaria (E.coli).

Actualmente en el Ecuador no existen normas que indiquen los valores

máximos permisibles de coliformes totales, fecales y E.coli en vegetales tipo

hoja (cilantro y perejil), tampoco se registran estudios publicados en relación

a la identificación de indicadores entéricos en este tipo de alimentos, por lo

tanto resulta difícil verificar el cumplimiento de criterios microbiológicos que

permiten aceptar o rechazar el producto.

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52

4.1.1 COLIFORMES TOTALES

Para el recuento de coliformes totales se empleó el método de la

determinación del número más probable (48h a 30°C) por la técnica de

dilución en tubos. Según la combinación numérica obtenida con los tubos de

BGBL se detectó en todas las muestras un NMP de coliformes >1100

UFC/g, razón por la cual se procedió a la determinación de coliformes totales

por la técnica de recuento en placa, en un medio selectivo para este tipo de

microorganismos como se observa en la Figura 4.1. Algunas investigaciones

realizadas en hortalizas revelan una importante contaminación fecal; López,

Romero, & Duarte (2003) en Chile reportaron en el 100% de muestras de

apio que los valores de coliformes fueron >1100/g poniendo en manifiesto

una elevada contaminación de este alimento.

Figura 4.1 Recuento de Coliformes Totales a) Técnica NMP

b) Técnica de Recuento en Placa

Los valores reportados en los recuentos en placa para coliformes totales se

muestran en la Tabla 4.1

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Tabla 4.1. Resultados de Coliformes Totales por Mercado

Cilantro Perejil

Mercado Log UFC/g1

1 5.36 ± 0.41a 7.45 ± 0.22a

2 4.33 ± 0.43b 5.52 ± 0.54c

3 5.57 ± 0.24a 6.20 ± 0.54b

1media ± desviación estándar (n=6)

Letras diferentes indican diferencia significativa entre mercado (p<0.05)

En relación a los resultados de los recuentos obtenidos en cilantro, el

promedio de las medias obtenidas fue de 5.09 log UFC/g presentando

diferencias de 1 log entre cada uno de los mercados, el mercado 3 fue el que

presentó mayor población de coliformes totales. Ginestre et al. (2010)

reportaron que el 96% de las muestras presentaron coliformes totales en

muestras de cilantro comercializados en mercados populares de Maracaibo,

los recuentos obtenidos estuvieron en un rango de 4 - 9 log UFC/g,

resultados que fueron similares a los obtenidos en el presente estudio, la

fuente de variación de los recuentos de coliformes totales puede ser por el

sitio de muestreo y el tipo de vegetal analizado.

El valor promedio de los recuentos de coliformes totales en perejil fue 6.39

log UFC/g, siendo la diferencia entre medias superior a 0.6 log UFC/g entre

los mercados. Los mayores recuentos se obtuvieron a partir del mercado

1fueron de estos valores son más altos que los reportados por Emin & Vural

(2008), quienes determinaron la calidad microbiológica de vegetales de hoja

verde en dos sitios de expendio en la ciudad de Diyarbakir-Turquía: en

perejil reportaron recuentos de coliformes totales de 2.20 log UFC/g en

muestras adquiridas en verdulerías y 3.96 log UFC/g en bazares o

mercados.

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Rincón et al. (2010) analizaron la calidad microbiológica de vegetales tipo

hoja en dos supermercados de Maracaibo-Venezuela; reportaron la

presencia de coliformes totales con valores para el cilantro de 4.19 log

UFC/g y para el perejil de 4.03 log UFC/g, según los autores esta elevada

carga microbiana indica que estos vegetales pueden representar una fuente

potencial de microorganismos patógenos.

Los resultados obtenidos en relación al recuento de coliformes totales por

puesto de expendio en cada mercado, para cilantro y perejil, se muestran en

las tablas 4.2 y 4.3 respectivamente; se obtuvieron resultados diferentes en

cada uno de ellos.

Tabla 4.2 Resultados de Coliformes Totales de Cilantro por Puesto de

Expendio

Log UFC/g1

Puesto Mercado 1 Mercado 2 Mercado 3

1 4.88 ± 0.01b 4.84 ± 0.06a 5.83 ± 0.1ª

2 5.72 ± 0.19a 3.89 ± 0.10c 5.42 ± 0.26ª

3 5.48 ± 0.23ab 4.25 ± 0.07b 5.46 ± 0.08ª 1 media ± desviación estándar (n=2)

Letras diferentes indican diferencia significativa entre mercado (p<0.05)

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Tabla 4.3 Resultados de Coliformes Totales de Perejil por Puesto de

Expendio

Log UFC/g1

Puesto Mercado 1 Mercado 2 Mercado 3

1 7.36 ± 0.11a 4.87 ± 0.12a 6.65 ± 0.07ª

2 7.42 ± 0.16a 5.67 ± 0.08a 6.43 ± 0.13ª

3 7.59 ± 0.37a 6.02 ± 0.17b 5.53 ± 0.10b 1 media ± desviación estándar (n=2)

Letras diferentes indican diferencia significativa entre mercado (p<0.05)

Tanto para cilantro como para perejil en el mercado 2 se encontraron los

valores de coliformes totales más bajos en las muestras analizadas. Al

comparar los resultados de los recuentos obtenidos en cada vegetal se pudo

observar de manera evidente que la contaminación microbiana fue más

elevada en las muestras de perejil, esta diferencia podría atribuirse a que el

área superficial que presentan las hojas de este vegetal es mucho mayor a

la del cilantro; tanto el mercado 1 como el 3 presentaron elevada

contaminación de coliformes totales con una diferencia de medias superior a

0.9 log UFC/g. Lo ideal en un puesto de expendio es que además de

presentar recuentos microbiológicos bajos en el alimento analizado, se

asegure el cumplimiento de los requisitos básicos sanitarios como el uso de

agua potable para la limpieza tanto de los alimentos como utensilios

empleados, el uso de recipientes sanitarios para evitar despilfarros de

basura y desperdicios, y sobre todo que el aseo personal de los

expendedores (cabello, uñas, ropa) sea impecable. Se mantiene un alto

riesgo de contaminación en los alimentos que se expenden en este tipo de

lugares debido a malas prácticas de manufactura e higiene; por lo tanto el

manipulador de alimentos es responsable de controlar y evitar que el

producto comercializado esté contaminado.

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56

El análisis de coliformes totales en vegetales tipo hoja cobra importancia ya

que según manifiesta Rivera (2012), los coliformes son útiles como

componentes de criterios microbiológicos para indicar contaminación,

especialmente si la muestra analizada no sufre ningún tratamiento térmico.

En el Ecuador no existen normativas que determinen valores de criterios

microbiológicos para vegetales frescos que se consumen crudos, realidad

que se repite en la mayoría de países de América Latina; sin embargo para

el presente estudio se han tomado como valores de referencia los expuestos

en normativas internacionales (México y Perú) donde se establece que los

niveles de aceptabilidad para coliformes totales en verduras y hortalizas son

de 102- 104. Los valores reportados en la presente investigación sobrepasan

estos límites establecidos.

4.1.2 COLIFORMES FECALES

Los coliformes fecales están más estrechamente relacionados con la

contaminación fecal que los coliformes totales, la presencia de ellos puede

reflejar la ineficiente calidad de los procesos asépticos a los que son

sometidos los vegetales (Emin & Vural, 2008).

En la Tabla 4.4 se muestran los resultados de la cuantificación de coliformes

fecales obtenidos por el método de NMP (45.5°C por 48 horas) referentes a

los tres mercados y al tipo de vegetal analizado. Los valores más altos de

coliformes fecales se encontraron en los mercados 1 y 2, es importante

aclarar que en ambos centros de expendio los puestos de venta se

localizaron en un espacio al aire libre en donde los vendedores arman su

puesto de venta con materiales propios, y son desmontados cuando el

horario de ventas termina razón por la cual los recuentos pudieron verse

afectados al estar directamente expuestos a factores ambientales como aire

y polvo; los puestos de venta del mercado 3 se encontraron dentro de una

infraestructura cerrada diseñada para el expendio y comercialización de

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alimentos, es precisamente este mercado el que presentó menores

recuentos microbiológicos para este indicador.

Tabla 4.4NMP de coliformes fecales

NMP de Coliformes Fecales / g

Mercado 1 Mercado 2 Mercado 3

Cilantro 246.9 350.2 231.2

Perejil 360.1 246.5 243.0

Total 607.0 596.7 474.2

En cilantro el 29.6% de las muestras fue positivo para coliformes fecales;

este porcentaje es menor frente al obtenido por Ginestre et al. (2010),

quienes reportaron porcentajes de coliformes superiores al 80% en muestras

de cilantro. En el estudio realizado por Barrantes et al. (2002) en vegetales

frescos (lechuga y tomate), se encontró que el 27.8% (15/107) de los

vegetales presentó coliformes fecales; este valor es similar al reportado en el

presente estudio lo que podría deberse a las condiciones en las que se

realizaron ambos muestreos.

Para las muestras de perejil y cilantro el recuento de coliformes fecales fue

similar, presentándose en ambos vegetales un 29.6% de estos

microorganismos; estos valores son inferiores a los reportados para perejil

por Ginestre et al. (2010), quienes obtuvieron el 71% de muestras positivas;

mientras que en los resultados reportados por Rivera, Rodríguez, & López

(2009) el porcentaje de coliformes fecales en perejil fue de 36.8%; se

atribuyó esta contaminación al agua de riego procedente de ríos en los que

se vierte agua residual no tratada que es propagada sobre cultivos que son

vendidos en mercados locales y consumidos por la población urbana y rural

de las ciudades.

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Los resultados obtenidos para coliformes fecales en este estudio se

interpretan como no aceptables ya que según la Norma Oficial Mexicana

NOM-093-SSA1 (COFEPRIS, 1994) en su apéndice sobre especificaciones

microbiológicas para verduras o frutas que se consumen crudas, establece

que los límites máximos permisibles para este tipo de alimentos es de 100

NMP/g de coliformes fecales poniendo en manifiesto que estos

microorganismos indicadores revelan deficientes condiciones sanitarias y de

higiene durante el procesamiento, almacenamiento y transporte de

alimentos.

4.1.3 Escherichia coli

La presencia de la bacteria E.coli fue comprobada con los resultados de las

pruebas complementarias (IMViC) cuya interpretación como se observa en la

Figura 4.2 permitió determinar el número muestras positivas para esta

bacteria.

Figura 4.2 Pruebas de Identificación Bioquímicas para E.coli: a) Indol (+),

b) Rojo Metilo (+), c) Voges Proskauer (-), d) Simmons Citrato (-)

De las 108 muestras de vegetales tipo hoja analizadas, 41 (37,9%)

resultaron positivas para determinar E.coli; 25 de estas fueron de perejil y 16

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59

de cilantro. Como se observa en la Figura 4.3, el perejil fue el que presentó

mayor porcentaje de casos positivos de E. coli en relación al otro vegetal

analizado.

Figura 4.3. Presencia de Escherichia coli en vegetales tipo hoja analizados

Monge, Chinchilla, & Reyes (2000) reportaron en su estudio sobre la

estacionalidad de bacterias intestinales en hortalizas que se consumen

crudas, que en el 42% de las muestras de hojas de cilantro, los niveles de

E.coli oscilaron entre 4 log UFC/g y 7 log UFC/g y señalan que es necesario

analizar las prácticas de manejo poscosecha ya que los índices de

contaminación fecal de los productos hortícolas son mayores en las áreas de

mercado que en las de cultivo. Por otro lado, en el estudio de contaminación

fecal en hortalizas que se expenden en mercados de Cajamarca-Perú se

detectó la presencia de E.coli en más del 24% del total de las muestras

analizadas, la mayor frecuencia de esta bacteria se detectó en perejil,

lechuga y rabanito (Rivera, Rodríguez, & López,2009).

En la Figura 4.4 se presenta la distribución de las muestras de cilantro y

perejil según la presencia de E. coli por mercado y puesto de expendio. Se

Muestras Negativas

72%

Cilantro 11%

Perejil 17%

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puede observar que en el cilantro, el mercado que tuvo mayor presencia de

esta bacteria fue el mercado 3, con 33.3% de muestras positivas,

presentándose mayores recuentos microbiológicos en el puesto 3; en el

mercado 1 se detectó esta bacteria en 27.8% de las muestras y una cantidad

igual para el mercado 2. Respecto a las muestras de perejil la mayor

incidencia de E.coli se reportó de igual forma en el mercado 3 con 72.2%

teniendo mayor incidencia de recuentos en el puesto 3, seguido del mercado

1, con 50.0% de muestras positivas y mayores recuentos en el puesto 3,

finalmente en el mercado 2 se puede observar que la incidencia de esta

bacteria se presentó únicamente en el puesto 2 con 16.7%, en los puestos 1

y 3 no se reportaron resultados de muestras positivas para la presencia de

E.coli.

Figura 4.4 Distribución de muestras de cilantro y perejil según la presencia

de E.coli por mercado y puesto de expendio

La Norma sanitaria peruana (DIGESA, 2008) establece que para frutas y

hortalizas frescas (sin previo tratamiento), el rango microbiológico aceptable

para E. coli es de 102 a 103 NMP/g; en la presente investigación se

determinó que trabajando con diluciones hasta 103 se encontró que el 37.9%

0

1

2

3

4

5

6

Mercado1

Mercado2

Mercado3

Mercado1

Mercado2

Mercado3

Culantro Perejil

#Mu

estr

as

con

pre

sen

cia

de

E.co

li

MERCADOS

P1

P2

P3

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de las muestras analizadas fueron positivas, criterio que determina una

calidad microbiológica poco satisfactoria de los vegetales en estudio.

La presencia de la bacteria Escherichia coli en el 37.9% de las muestras

analizadas indica una defectuosa práctica higiénica de las personas que

están involucradas con la poscosecha, distribución, manipulación y

comercialización de estos vegetales. E.coli al ser el mejor indicador de

contaminación fecal y al estar presente en alimentos puede poner en riesgo

la inocuidad alimentaria ya que esto muestra claramente las deficiencias en

la limpieza y desinfección del lugar de expendio y del manejo del producto

por parte de las personas que expenden estos vegetales en los mercados

(Rivera,2012).

La pesencia de E. coli en las muestras analizadas, es un indicador de una

posible presencia de otros patógenos entéricos, por lo que este tipo de

alimentos no debería consumirse crudo sin antes realizar un proceso

adecuado de desinfección.

En el país, la deficiencia en la higiene de los centros de expendio populares

así como la falta de normativas que regulen la inocuidad en el transporte,

almacenamiento y venta de productos que se consumen crudos, como los

vegetales, aumenta el riesgo microbiológico cuyas consecuencias son las

enfermedades de tipo gastrointestinal que tienen una alta frecuencia de

ocurrencia en la población, y especialmente en los niños.

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5. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES

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62

5. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES

5.1 CONCLUSIONES

Si bien los análisis se realizaron únicamente en tres mercados

del norte de la ciudad de Quito, los resultados pueden dar una

idea general del nivel higiénico de los vegetales y otros

productos alimenticios que se expenden en estos lugares y se

consumen con alta frecuencia. Existe la posibilidad que los

resultados encontrados en el presente trabajo, se repita en

otros mercados de la misma ciudad así como en otros de

diferentes ciudades del país.

Los mayores recuentos de coliformes totales fueron de 5.57 log

UFC/g en el mercado Santa Clara para cilantro y 7.45 log

UFC/g en el Mercado La Ofelia para perejil; para ambos

vegetales los menores recuentos microbiológicos se reportaron

en el mercado Iñaquito. Estos resultados indicarían falencias

en la aplicación de buenas prácticas de higiene durante la

manipulación previa y la venta; sin embargo la presencia de

este tipo de microorganismos en los alimentos no se considera

como peligrosa para el consumidor.

El estudio revela que los niveles más altos de contaminación

por coliformes fecales se reportan en las muestras de perejil

adquiridas en el mercado La Ofelia (360.1 NMP/g) y en cilantro

del mercado Iñaquito (350.2 NMP/g) por lo que se asume que

estos resultados pueden depender de las condiciones de

expendio en cada mercado. La presencia de coliformes fecales

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63

indica una deficiencia higiénica de las personas que manipulan

los alimentos así como las condiciones insalubres de los

mercados donde se comercializan vegetales frescos mostrando

así una deficiente calidad e inocuidad de este tipo de alimento.

En esta investigación el 37.9% (41/108) de las muestras fueron

positivas para E. coli, presenciándose esta bacteria en el

14.8% de las muestras de cilantro y en 23.1% de perejil, esta

bacteria indica contaminación de origen fecal poniendo en

manifiesto la deficiencia de higiene en el transporte,

almacenamiento y comercialización de vegetales frescos. La

presencia de E. coli fue independiente del mercado y puesto de

expendio por lo que se evidencia la importancia de un control

microbiológico de los vegetales tipo hoja desde la cosecha

para evitar brotes de enfermedades transmitidas por este tipo

de alimento.

De los resultados microbiológicos obtenidos se determinó que

ninguno de los parámetros analizados cumplieron con las

especificaciones establecidas en las normativas peruana y

mexicana. Las normas ecuatorianas (INEN) no contemplan

criterios microbiológicos para este tipo de alimentos; es preciso

que se desarrolle una normativa ya que actualmente existe una

tendencia hacia el mayor consumo de frutas y hortalizas,

motivada por una creciente preocupación de adoptar un estilo

de vida más saludable.

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64

5.2 RECOMENDACIONES

Debido a que la presencia de coliformes y E.coli pueden ser un factor

para contraer ETAs, los organismos de control deben establecer criterios

microbiológicos que indiquen valores máximos permisibles de estos

microorganismos en vegetales tipo hoja con la finalidad de garantizar la

inocuidad para los consumidores.

Es necesaria la capacitación de los agricultores y comerciantes en lo que

se refiere a Buenas Prácticas Agrícolas (BPA) y Buenas Prácticas de

Manufactura (BPM) durante la recolección, almacenamiento, transporte

y comercialización con la finalidad de asegurar la inocuidad del producto

reduciendo los excesivos niveles de contaminación.

Es recomendable realizar estudios en otro tipo de vegetales donde se

analice la calidad microbiológica ya que estos alimentos son de consumo

masivo e ingeridos crudos o cocinados, por lo que es necesario contar

con rangos establecidos.

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ANEXOS

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ANEXO I

TABLA DEL NÚMERO MÁS PROBABLE (NMP) POR

g/mL DE ALIMENTO

(INEN, 1990)

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73

ANEXO II

RECOLECCIÓN DE MUESTRAS

MERCADO LA OFELIA

Figura A.2. Recolección de la Muestra- La Ofelia: a) Instalaciones, b)

Puesto1,c) Puesto 2 y d) Puesto3

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ANEXO III

RECOLECCIÓN DE MUESTRAS

MERCADO IÑAQUITO

Figura A.3. Recolección de la Muestra- Iñaquito: a) Instalaciones, b)

Puesto1,c) Puesto 2 y d) Puesto3

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75

ANEXO IV

RECOLECCIÓN DE MUESTRAS

MERCADO SANTA CLARA

Figura A.4. Recolección de la Muestra-Sta. Clara: a) Instalaciones, b)

Puesto1,c) Puesto 2 y d) Puesto3

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76

ANEXO V

PROCEDIMIENTO

RECUENTO, AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE E.

COLI

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Figura A.5.Recuento, aislamiento e identificación de E.coli: a) Pesado de la

muestra, b) Homogenizado, c) Diluciones Sucesivas, d) Recuento de

coliformes, e) Estriados en placa, f) Purificación en PCA, g) Tinción Gram, h)

Confirmación bacilos Gram (-) y i) Pruebas IMViC

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ANEXO VI

TÉCNICA RECUENTO EN PLACA

AGAR VRB

Figura A.6. Recuento en Placa (VRB): a) Preparación agar estéril, b)

Inoculación, c) Dispersión en tubos, d) Siembra por vertido y e) Recuento