UNIVERSIDAD TECNOLÓGICA

DE LA MIXTECA

Producción de lacasa a partir de hongos

ligninolíticos utilizando vinazas y bagazo de

origen mezcalero

Avances

Alumna: I.A. Stefi Castillejos-Márquez

Director de tesis: Dr. Vania S. Robles-González

Co- Director: Dra. Ireri V. Robles-González

Asesores:

Dra. Edith Graciela González Mondragón

Dr. Raúl Salas Coronado

Dr. Rogelio Valadez Blanco

Huajuapan de León, Oaxaca. Mayo de 2014

Contenido Introducción

Justificación

Hipótesis

Objetivos

Metodología

Resultados y discusión

Conclusiones

2

Abreviaturas

• AE: Actividad enzimática

• CDS: Caldo dextrosa sabouraud.

• DQO: demanda química de oxígeno

• EM : Extracto de malta

• HL: hongo ligninolítico

• Lac: Lacasa

• Lip: lignino peroxidasa

• MC: medio de cultivo

• MnP: manganeso peroxidasa

• PeAh: Penca de agave Augustifolia haw (Espadín)

• PePz: Penca de agave Potatorum zucc (tóbala)

• PDS: papa dextrosa sabouraud.

• PiPz: Piña de agave Potatorum zucc (tóbala)

3

Introducción

Enzimas

4 Domínguez et al., 2006; Santos et al., 2012

Producción de enzimas

Organismo

• Bacteria

• Hongo

• Planta, etc.

Sistema fermentativo

• Sustrato

• Tipos de cultivo

• Condiciones de cultivo.

Recuperación

• Métodos Físicos

• Métodos químicos

5

6

Costos

elevados

Desechos industriales

Shin y Lee, 2000; Si, 1994; Ren et al., 2007; Steele et al., 2005; Kahraman y Yesilada, 2001; Pant y Adholeya, 2007

Comúnmente contienen

compuestos recalcitrantes como

fenoles, lignina, celulosa, etc;

7

Pueden utilizar como

sustrato a los

desechos debido a

enzimas que

producen

Dellamatrice, et al 2005; Archibald, et al., 1997; Takemori et al., 1992

8

Hongos

ligninolíticos (HL) Lacasa

(Lac)

Lignino

peroxidasa

(LiP)

Manganeso

peroxidasa

(MnP)

Pleurotus spp.

Trametes

versicolor. Homolka, et al., 1997, Mijiashvili, et al., 2006; Mendonça et al., 2010; Gedikli, et al., 2010; Archibald, et al., 1997; Osma, et

al., 2010

Aplicaciones de la lacasa

Lacasa

Textil

Papelera

Ambiental

Alimentaria

9

Proceso de elaboración del mezcal

Materia prima Trozamiento Cocimiento

(Hidrólisis)

Mieles de

cocimiento

Molienda Bagazo

15 a 20 kg /L

de mezcal

Rectificación

Fermentación

Destilación

Vinazas

8 a 15L / L de

alcohol

destilado

10 Robles- González et al., 2011

14 millones de

litros de vinazas

19 millones

de kg de

bagazo

11 Duarte et al., 1997; Sangave et al., 2007; García et al., 1997; Jiménez et al., 2003; Coca et al., 2005; Robles- González et

al., 2011; Romahnolo- Herrera, et al., 2011

Vinazas

DQO 70,000–150,000 mgO2/L DBO

35,000–50,000 mgO2/L

pH ácido 3.5 -4.5

Nitrógeno 900 mgNH3-

N/L

Azúcares reductores 962mg/L

Fenoles 478.4 -541.8 mg de ácido

gálico/L

Color oscuro

Características fisicoquímicas de las

vinazas.

Sistemas fermentativos

Enzimas

Fermentación en cultivo sumergido

Fermentación en estado

sólido

12 Aguilar et al., 2008; Toca et al., 2009; Moldes et al., 2003; Vintila et al., 2008

- Ambiente similar al

del hábitat natural

del hongo.

-Bajo requerimiento

energético

-Bajo costo

-Baja producción de

aguas de desecho

-Mayor facilidad para

obtener datos de pH,

acidez.

- Mejor extracción

del sustrato

producido

- Mejor transferencia

de nutrientes.

Métodos de extracción y

purificación

Precipitación, centrifugación y re- suspensión

Cromatografía de intercambio

iónico Identificación por cromatografía en

gel

13

Uso de membranas

Champagne y Ramsay, 2005; Paszczynski, et al., 1994; Shraddha, et al., 2011

Justificación del problema

• El estado de Oaxaca produce el 60% de mezcal a nivel

nacional, en el año 2012 se generaron cerca de 14

millones de litros de vinazas y más de 19 millones de

kilos de bagazo, por lo cual estos residuos pueden ser

aprovechados para la producción de lacasa.

14 COMERCAM, (2010-2011)

Originalidad

• La originalidad del trabajo radica en los siguientes puntos.

i) El uso de residuos de la industria mezcalera (vinazas y bagazo) para la producción de lacasa.

ii) Evaluación de actividad enzimática de lacasa en cepas de Pleurotus spp. (Parentales e híbridos) aisladas en la UTM.

iii) Formación y uso de pellets dobles (HL+bagazo).

15

Hipótesis

• La presencia de azúcares residuales de la fermentación

de agave así como de ácidos fenólicos en las vinazas de

origen mezcalero servirán como medio de cultivo para la

producción enzimática de lacasa empleando Trametes

versicolor y Pleurotus spp.

16

Objetivos

• General

– Producir lacasa a partir de Pleurotus spp. y

Trametes versicolor empleando vinazas y

bagazo de origen mezcalero como sustrato.

17

Objetivos • Específicos

– Efectuar la caracterización fisicoquímica del bagazo y las vinazas mezcaleras.

– Realizar el cultivo, propagación y mantenimiento de Pleurotus spp. y Trametes versicolor en medio sólido y líquido.

– Realizar la formación de pellets dobles (hongo ligninolítico+ bagazo) para utilizarlos como biocatalizadores.

– Evaluar la actividad enzimática de lacasa utilizando pellets dobles (hongo ligninolítico+ bagazo).

– Evaluar la influencia de la concentración de fructosa en vinazas en la producción de la enzima lacasa.

– Realizar la separación, extracción y purificación parcial de la lacasa del medio de cultivo líquido.

18

METODOLOGÍA

19

Plan general de trabajo

20

Caracterizar fisicoquímicamente las

vinazas y el bagazo de origen

mezcalero

Evaluar los medios de cultivo

sólidos y líquidos

Evaluar la actividad enzimática de las cepas de

Pleurotus spp.y de Trametes versicolor.

Mantener y propagar los hongos

ligninolíticos

Fermentación en estado sólido

(bagazo + HL)

Obtener la enzima

Extraer e identificar la enzima lacasa producida

por el hongo ligninolítico que presente la mayor

actividad enzimática

Seleccionar las cepa de Pleurotus spp. con mayor actividad enzimática

Formar el biocatalizador

(bagazo+HL) (cepas con mayor

actividad enzimática)

FASE I: Caracterización fisicoquímica de vinazas

21

Parámetro Método

pH Método estándar 423

Demanda Química de Oxígeno

(mgO2/L)

Método estándar 5220 D

Sólidos suspendidos volátiles, fijos y

totales (mg/mL)

Método estándar 2540

Conductividad (µS/cm) Método estándar 2510 B

Sulfatos (mg SO2- 4/L Método 8051 HACH MR

Fosfatos (mg PO3- 4/L) Método 8048 HACH MR

Nitrógeno total (mg N/L) Método 10071 HACH MR

Fenoles totales (mg ácido gálico/L) Box, 1983

Color (abs 580 nm) Peña et al., 2003

Aromáticos totales (abs 254 nm) Benitez et al., 2003

Minerales: Cu+2, Na+1, K+1, Ca+2, Zn+2,

Fe+3, Mg+2, Ni+2, Cd+2.

Método estándar 3111 B

Azúcares reductores König et al., 2002

22

FASE 1: Caracterización fisicoquímica de

bagazo

Parámetros Método

Fenoles totales (mg ácido

gálico/L)

Box, 1983

Minerales: Cu+2, Na+1, K+1, Ca+2,

Zn+2, Fe+3, Mg+2, Ni+2, Cd+2.

Método estándar 3111 B

• Tratamiento del bagazo para

determinación de fenoles totales (hidrólisis

alcalina).

23

Reducción de

tamaño manual

Polvo de bagazo

(malla de 0.5mm)

4 mL de NaOH

(2N) a 150 rpm/4

horas

Se ajustó el pH a 2

con HCl 10%

Hongos ligninolíticos

Cepas parentales de Pleurotus spp.

UTMR UTMB

Híbrido de

Pleurotus spp.

H1R4B6, H2R2B4, H3R2B1, H2R2B2

Trametes versicolor

24 Paula Cecilia Guadarrama Mendoza, 2011. Tesis doctoral

Diseño factorial simple donde el efecto del medio de cultivo a 7

niveles, sobre 1 variables de respuesta serán analizadas (actividad

enzimática).

• Mantenimiento y propagación de las

cepas de HL.

25

Tomar un pedazo de

0.5cm de diámetro de

cajas petri con medio

agar bacteriológico +

extracto de malta

Inocular en medio caldo

dextrosa sabouraud 2%

a Tv y a las cepas de

Pleurotus spp. en el

medio seleccionado en

la fase II

Incubar a

temperatura

30°C/ 7 a

10 días y se

mantendrá

a 4°C

26

Medio de formación de Pellets + Dextrosa (Medio A)

Medio de formación de pellets

+ E.M (Medio B)

CDS al 2% (Medio C)

CDS 2% + E.M

(Medio D)

Diseño factorial simple donde el efecto del medio de cultivo a 4

niveles, sobre 2 variables de respuesta serán analizadas (crecimiento

y actividad enzimática)

FASE II: Evaluación de medios de cultivo

para el crecimiento de Pleurotus spp.

27

Sustrato Sólido

Polvo PiPz

Polvo PePz

Polvo PeAh

Diseño factorial simple donde el efecto del medio sólido a 4 niveles,

sobre 2 variables de respuesta serán analizadas (crecimiento y

actividad enzimática)

FASE III: Selección de la cepa (s) de Pleurotus

spp que presenten la mayor actividad enzimática

de lacasa y evaluación de actividad enzimática de

Trametes versicolor.

28

Inocular a las

cepas a un

medio líquido

Incubar a

temperatur

a 30°C/ 7 -

10 días

A 4000g /

20

minutos.

Determinación de

actividad

enzimática

Lacasa (1)

1Wolfenden y Wilson, 1982

• Determinación de actividad enzimática de

lacasa

29

300 µL de buffer citrato- fosfatos (0.1 M, pH 3)

100 µL de ABTS 1mM

1 mL de muestra

600 µL de Agua desionizada

ABS=

Wolfenden y Wilson, 1982

FASE IV: Formación del los pellets dobles

(HL+Bagazo)

30

Medio de

cultivo

seleccionado,

por 8-10días

Reducción

de tamaño

Mezcla

30mg de

hongo y 50

mg de

bagazo en

100mL

Agitador

orbital

150rpm

Obtención

de pellets

FASE V: Obtención de lacasa empleando pellets

dobles de HL + bagazo en fermentación en cultivo

sumergido y fermentación en estado sólido.

31

• Bagazo + HL

• Se realizaron experimentos por duplicado, empleando ensayos destructivos

Fermentación en estado

sólido

• Vinazas+ pellets dobles

• Se realizaron experimentos por duplicado

Fermentación en cultivo sumergido

Fermentación en estado sólido

(FES)

32

En cajas petri

adicionar 0.5 g de

bagazo. Esterilizar por 15

minutos a 15 psi.

Adicionar 15 mg

de HL

Muestras destructivas: Consistió en inocular

n muestras e ir tomando una muestra cada

tercer día y evaluar la AE durante 15 días.

33

Enjuagar las cajas

con 5 mL de buffer

Citrato-fosfato 0.1

M, pH 3.

Filtrarlas por filtro

Whatman No. 41,

en filtros gooch

Filtro Econofilter

Agilent 0.45 µm

Realizar la medición

enzimática de lacasa,

cada tercer día.

34

Fermentación en cultivo sumergido

(FCS)

En un matraz con

180 mL de

vinazas diluidas a

674, 917, 1303, y

1918 mg de

fructosa /L añadir

pellets dobles

Agitar a 180 rpm, y

tomar 3 mL cada

tercer día.

Filtrar

empleando

Econofilter

Agilent 0.45

µm, y

determinar la

actividad

enzimática

de lacasa.

Tratamiento control

35

• Medio seleccionado adecuado para el crecimiento del hongo.

• Hongos ligninolíticos

Fermentación en estado

Sólido

• Medio seleccionado adecuado para el crecimiento del hongo.

• Pellets dobles

Fermentación en cultivo sumergido

Diseño experimental

• Cultivo sumergido

– Diseño factorial Na x 4

Donde los factores de origen de la cepa y 4 concentración de fructosa en

las vinazas mezcaleras serán evaluados.

– Realizaran cinéticas por lote cada 15 días

– La variables de respuesta será:

– Actividad enzimática.

Nota: a) N= número de cepas seleccionadas con mayor actividad enzimática

36

Concentración de vinazas

mezcaleras diluidas

mg

fructosa/L mgO2/L

674 5000

917 7000

1303 10000

1918 15000

Diseño experimental

• Cultivo en estado solido

– Diseño factorial de Na x 3, donde el efecto del medio sólido a 3 niveles y

el número de cepas seleccionadas con mayor actividad con N niveles.

– La variable de respuesta será:

– Actividad enzimática.

– Se realizaran cinéticas por lote cada 15 días

Nota: a) N= número de cepas seleccionadas con mayor actividad enzimática.

37

38

FASE VI: Identificación de la enzima

lacasa.

• FCS

Tomar 5 mL del

medio de cultivo

bajo condiciones

estériles. Filtro Econofilter

Agilent 0.45 µm Introducir 500 µL en un centricon

Ultracel 10 Kda, y se centrifugó a

hasta obtener 100 µL de

concentrado.

• Electroforesis SDS-PAGE

39

Se elaboró el

gel SDS-

PAGE 7%

La muestra se

corrió a 120V, por

90 minutos

Se adicionó la

muestra en los

pozos del gel Se

utilizaron

estándares de

pesos moleculares

de Biorad Se realizó la

desnaturalización

térmica de la

muestra con buffer

de carga (1:1)

40

Se sumergió el gel

en la solución

teñidora de azúl

comassie 250G.

El gel se decoloró

con lavados de

agua desionizada

• Electroforesis SDS-PAGE

La tinción (2minutos /1KW) y

la decoloración se realizaron

con calentamiento a

microondas

• Zimograma- Gel nativo

41

Se elaboró el

gel nativo.

(gel

concentrador

al 4% y gel

separador al

7%)

Se colocó el gel

nativo en la cámara

y se adicionó buffer

de corrida

La muestra se

corrió a 120V, por

90 minutos

Se adicionó la

muestra en

los pozos del

gel

Añadir 50 µL de

buffer de carga y

50 µL de muestra.

42

• Zimograma- Gel nativo

Se sumergió el gel

en la solución 1

mM de ABTS

durante 10

minutos.

El gel se enjuago

con buffer citrato

fosfato 0.1 M, pH

3.

RESULTADOS Y

DISCUSIÓN

43

Fase I. Caracterización fisicoquímica de vinazas

44

Parámetro Resultados vinazas DQO (mg O2/L) 62500 ± 7053 Fructosa (mg/L) 5900 ± 100 pH 2.4 ± 0.02 Color (abs 475nm) 2.8 ± 0.09 Fenoles totales (mg ácido gálico /L) 497 ± 109 SST (mg/L) 9400 ± 2690 SSF (mg/L) 1200 ± 290

SSV (mg/L) 8200 ± 2970 Conductividad (µS/cm) 4.5 ± 0.01 Na+1 (ppm) 48.3 ± 5.8 K+1 (ppm) 113 ± 21 Ca+2 (ppm)} 541 ± 51 Mg+2 (ppm) 141 ± 22 Fe+3 (ppm) 4.5 ± 0.3 Cu+2 (ppm) 1.82 ± 0.12 Zn+2 (ppm) 0.4 ± 0.03 Ni+2 (ppm) No detectado Cd+2 (ppm) No detectado Compuestos aromáticos totales (abs 254nm) 84.0 ± 3.6 Nitrógeno total (mg N/mL) 45.5 ± 3.5 N-NO3

- (mg/L) 228.8 ± 5.3 NO2

- (mg/L) 455 ± 21 SO4

2- (mg/L) 425 ± 7 PO4

-3 (mg/L) 105 ± 5

45

Parámetros Bagazo de penca de

agave Potatorum zucc

Bagazo de penca de

agave Angustifolia haw

Fenoles totales (ácido

gálico, mg/g de bagazo)

0.038a ± 0.0019 0.014b ± 0.0005

Cenizas (g/g de bagazo) 0.12a ± 0.007 0.11a ± 0.008

Ca+2 (ppm) 265 239a ± 22 520 202 311a ± 6659

K+1 (ppm) 48 159a ± 3814 16 386b ± 4548

Mg+2 (ppm) 34 075a ± 775 26 969a ± 1816

Na+1 (ppm) 894a ± 98 417b ± 119

Fe+3 (ppm) 1106a ± 208 738a ± 195

Cu+2 (ppm) 482a ± 16 480a ± 1

Zn+2 (ppm) 269a ± 47 546b ± 2

Ni+2 (ppm) No detectable No detectable

Cd+2 (ppm) No detectable No detectable

Fase I. Caracterización fisicoquímica del bagazo

Nota: Superíndice a- a: no hay diferencia significativa, a un nivel de significancia de 0.05; superíndice a-b: existe

diferencia significativa. Desing Expert versión 6.0.10.

Medio líquido

• En el medio A y B no se observó crecimiento en las cepas ensayadas.

• En CDS 2% (Medio C) y CDS 2% + extracto de malta (Medio D) se logró el crecimiento.

Medio sólido

• No se observó crecimiento en la piña de agave Potatorum zucc (tobalá).

• En PeAh y PePz si se observó crecimiento y se procedió con al evaluación de actividad enzimática de lacasa

FASE II: Evaluación de medios de cultivo

para el crecimiento de Pleurotus spp.

46

47

Cepa Actividad enzimática

UTM-B (Medio C) 94±7 U/L

UTM-B (Medio D) 248±0.2 U/L

H1R4B6 (Medio C) 6.9±0.1 U/L

H1R4B6 (Medio D) 81±1 U/L

UTM-R (Medio C) 1.6±0-003 U/L

UTM-R (Medio D) 7.4±0.7 U/L

H2R2B4(Medio C) 6.4±0.017 U/L

H2R2B4(Medio D) 18.3±0.7 U/L

H2R3B4 (Medio C) 3.1±1 U/L

H2R3B4 (Medio D) 2.4±0.3 U/L

H3R2B1 (Medio C) 2.9±0.034 U/L

H3R2B1 (Medio D) 81±1 U/L

Tv (Medio C) 538±58 U/L

Actividad enzimática

obtenidas de las

cepas de Pleurotus

spp. y Trametes

versicolor

evaluadas en el

medio C y D; En

cultivo sumergido

Nota: cds: Caldo dextrosa

sabouraod (Medio C).

Cds+em: caldo dextrosa

sabouraud con extracto de

malta (Medio D). TVC: Trametes versicolor.

FASE III: Selección de la cepa (s) de Pleurotus spp que

presenten la mayor actividad enzimática de lacasa y

evaluación de actividad enzimática de Trametes

versicolor (Tv)

Fase IV. Formación de pellets

dobles. Los pellets dobles formados con BPeAh +PsUTM-B. y BPeAh+Tv presentaron un diámetro promedio de 0.5 ± 0.1 cm.

Pellets dobles formados con BPeAh – Pleurotus spp.(a) o Trametes versicolor (b).

(b) (a)

48

Fase V. Actividad 1. Cinética de AE

evaluadas en FCS.

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

0 5 10 15 20

Act

ivid

ad

en

zim

áti

ca

(U/L

)

Tiempo (días)

Cinética de actividad de lacasa empleando pellets de BPeAh-Tv y vinazas

mezcaleras. ○: VM diluidas a 674 mg de fructosa/L; Δ: VM diluidas a 917 mg

de fructosa/L

49

2402 U/L

997.33 U/L

0

2

4

6

8

10

12

14

16

0 5 10 15 Acti

vid

ad

en

zim

áti

ca (

U/L

)

Tiempo (días)

Cinéticas de actividad enzimática de lacasa empleando pellets de BPeAh - Ps-

UTM-B con vinazas mezcaleras ○: VM diluidas a 674 mg de fructosa/L; Δ: VM

diluidas a 917 mg de fructosa/L.

50

13.9 U/L

1.33 U/L

A concentraciones de 1303 y 1918 mg fructosa/L, no se observó actividad enzimática.

Eggert et al.(1996) reportan que a concentraciones altas de azúcares simples en el medio de cultivo, pueden causar inhibición en la producción de lacasa.

51

52

Hongo ligninolítico (H.L) Descripción Actividad enzimática Ref.

Trametes versicolor (Tv) Se utilizó un cultivo sumergido

empleando vinazas mezcaleras. Se

uso los hongos inmovilizados

formando pellets dobles (Tv+BPeAh)

2402 U/L Nuestros

resultado

s

Trametes versicolor

MZKI G-99

Se utilizó un medio sintético, el cual

se inoculo con pellets del micelio del

hongo.

11.8 U/L 1

Trametes versicolor

ATCC 20869

Se empleo un cultivo sumergido,

utilizando al medio Kirk´s. Se

formaron pellets con el micelio del

hongo para la posterior producción de

lacasa.

1,385 U/L 2

Trametes versicolor

(CBS100.29)

Se empleo un cultivo sumergido

empleando un medio propuesto por

Tien y Kirk, 1988. Se emplearon

pellets formados por el H.L y alginato

de calcio.

4000U/L 3

Actividades enzimáticas mostradas por hongos ligninolíticos.

Notas. 1) Tišma, et al., 2012. 2) Thiruchelvam y Ramsay, 2007. 3) Dominguez, et al., 2007

Resultados de actividad enzimática obtenidos en FCS.

Microorganismo AE de lacasa

(U/L) obtenida

en medio de

cultivo

Medio D

AE de lacasa

(U/L) obtenida

en medio de

cultivo

Medio C

AE de lacasa

(U/L) obtenida en

Medio de cultivo

empleando

concentración de

fructosa de 674

mg/L

AE de lacasa (U/L)

obtenida en medio

de cultivo

empleando

concentración de

fructosa de

917mg/L

Trametes

versicolor

CDBB-h-1051

NE 538 ± 58 NE NE

Pleurotus spp.-

UTM-B

248 ± 0.2 94 ± 7 NE NE

Pellets dobles

formados con

BPeAh-Tv

NE 38a ± 11 881a ± 163 350a ± 77

2402b ± 76

Pellets dobles

formados

BPeAh-Ps-UTM-

B

No presentó

actividad

enzimática

NE 1.3a ± 0.02 13.9a ± 0.5

53

0

50

100

150

200

250

300

350

400

450

0 3 6 9 12 15

Act

ivid

ad e

nzi

mát

ica

(U/L

)

Tiempo (días)

Cinéticas de actividad enzimática de lacasa empleando Tv– Polvo

BPePz (◊) y BPeAh (□).

Fase V. Actividad 2. Cinética de Actividad

enzimática de lacasa en FES.

386.9 U/L

225.6 U/L

0

5

10

15

20

25

30

35

0 3 6 9 12 15

Act

ivid

ad e

nzi

mát

ica

(U/L

)

Tiempo (días)

Cinéticas de actividad enzimática de lacasa empleando Ps- UTM-B – Polvo de

BPeAh (□).Polvo de BPePz (◊).

55

33.1 U/L

23.1 U/L

Fase VI. Separación e identificación de lacasa obtenida

en FCS empleando Trametes versicolor y BPeAh

mediante ultrafiltración, SDS-PAGE y zimogramas.

56

250 kDa

75 kDa

15 kDa

10 kDa

25 kDa

150 kDa

100 kDa

50 kDa

30kDa

(a)

SDS-PAGE de lacasa de Trametes versicolor y BPeAh.

M1 M2

M1/

M2

PM (KDa)

B1 100

B2 50- 75

B3 30- 50

B4 15- 25

57

Organismo Peso molecular (kDa) Ref

HL 60 - 100 Madhavi y Lele, 2006;

Kunamneni et al.

Paraconiothyrium

variabile

84 Forootanfar et al., 2011.

Coriolus hirsutus 55-73 Shin y Lee, 2000; Koroljova-

Skorobogat’ko, et al., 1998.

Monocillium indicum 72 Thakker, et al., 1992.

Trichoderma 71 Assavanig, et al., 1992,

Trametes troji 70 Garzillo, et al., 1998

Ganoderma lucidum 40-68 Ko, et al., 2001; D’souza et

al., 1999

Pleurotus sajor-caju 61 Murugesan et al., 2006.

Pleurotus ostreatus 59 Sannia, et al., 1986

Trametes multicolor 36 Leitner et al., 2002.

Pesos moleculares de lacasa obtenida mediante HL

58

250 kDa

75 kDa

15 kDa

10 kDa

25 kDa

150 kDa

100 kDa

50 kDa

30kDa

M1/

M2

PM (KDa)

B1 100

B2 50- 75

(a) Zimograma y (b) SDS-PAGE de lacasa de Trametes versicolor y BPeAh.

(b)

M1 M2

(a)

M1 M2

59

- Varias isoenzimas de lacasa se han detectado en

muchas especies de hongos. Más de una isoenzima se

produce en la mayoría de los hongos de la pudrición

blanca (Kunamneni et al; Moldes et al., 2004; Pezzella et

al., 2012; Xiao et al., 2003.).

CONCLUSIONES

60

FASE I

• La muestra analizada de vinazas presentó: una fuerte coloración

café obscuro, un bajo pH, alto contenido de materia orgánica

expresado como DQO, alto contenido de fructosa residual de la

fermentación de la obtención del mezcal, alto contenido de cenizas

la cual se vio reflejado en el alto contenido de minerales

principalmente de calcio y magnesio.

61

• El bagazo presentó alto contenido de cenizas (120 mg /g de

bagazo) el cual se reflejó en el alto contenido de minerales

principalmente de Calcio, magnesio, potasio cobre, zinc, hierro,

siendo mayor en el bagazo del agave Potatorum zucc (Tobalá).

• La cantidad de minerales presentes en las muestras de bagazo

estudiadas fue mayor a las encontradas en la muestra de vinazas.

62

• El contenido de fenoles totales expresados como ácido gálico

presente en las muestra de vinazas y bagazo, fue importante (497 ±

109 mg/L y 0.014 ± 0.0005 mg ácido gálico/g de bagazo),

considerando las cantidades que se generan de estos desechos por

la industria mezcalera y además de que se ha reportado a estos

compuestos como inductores de la actividad enzimática.

63

FASE II

• El medio de cultivo sólido de agar

bacteriológico y extracto de malta, resulto

ser un medio apropiado para la propagación

de las cepas de Pleurotus spp.

• El medio líquido adecuado para el

crecimiento de las cepas de Pleurotus spp.

fue el medio CDS 2% con adición de

extracto de malta.

64

FASE III

• La cepa parental UTM-B mostró la mayor actividad enzimática (248

± 0.2 U/L) en la etapa de selección de las cepas de Pleurotus spp.

(Fase III).

65

FASE IV

• Se obtuvieron pellets dobles a partir de polvo de agave Angustifolia

haw (Espadín) con diámetros promedio de 0.5 ± 0.1 cm.

66

FASE V

• Las condiciones óptimas para la producción de lacasa en FCS

fueron utilizando pellets formados con Tv-BPeAh, y vinazas

mezcaleras diluidas a una concentración de 917 mg de fructosa /L,

obteniéndose al noveno día una AELac de 2402 ± 76 U/L

• Las condiciones óptimas para la producción de lacasa en la FES

fueron con la cepa de Tv y bagazo Pz, obteniéndose una actividad

enzimática de lacasa (AELac) de 386.9 ± 27.4 U/L al sexto día de

fermentación.

• De los resultados concluimos que el mejor sistema de fermentación

para la producción de lacasa fue el sistema en cultivo sumergido.

67

• Las vinazas y el bagazo provenientes de los desechos de la

producción de mezcal, sirvieron como medio de cultivo para la

producción de lacasa empleando Trametes versicolor y Pleurotus

spp.

68

FASE VI

• Se logró la separación a temperatura ambiente de la enzima lacasa

producida por los pellets formados por Trametes versicolor y

BPeAh en FCS, mediante el uso de membranas de 0.45 µm y de 10

kDa.

• Se identificaron cuatro bandas intensas mediante SDS-PAGE, dos

de las cuales tuvieron pesos moleculares de 100 kDa y cercano a

los 50 kDa (pesos moleculares reportados para la enzima lacasa).

69

FASE VI

• Mediante el zimograma se constató la presencia de al menos dos

bandas con actividad de lacasa, lo cual apoyó lo observado en los

resultados obtenidos de AELac determinadas en las FCS y FES.

70

Cronograma de actividades

71

Actividad/mes

es

Ene

201

3

Feb

201

3

Mar

201

3

Abr

201

3

May

201

3

Jun

201

3

Jul

201

3

Ago

201

3

Sep

201

3

Oct

201

3

Nov

201

3

Dic

201

3

Ene

201

4

Feb

201

4

Mar

201

4

Abr

201

4

May

201

4

Jun

2014

Jul

2014

Ago,

Sep,

2014

Obtención y

caracterizació

n fisicoquímica

de las vinazas

Y bagazo

Propagación

de los hongos

Evaluación de

cepas, medios

de cultivo

Formación de

pellets

Cinéticas de

FES y FCS.

Separación y

purificación de

la enzima

Redacción de

la tesis

72

UNIVERSIDAD TECNOLÓGICA

DE LA MIXTECA

Producción de lacasa a partir de hongos

ligninolíticos utilizando vinazas y bagazo de

origen mezcalero

Diapositivas de apoyo

Alumna: I.A. Stefi Castillejos Márquez

Director de tesis: Dr. Vania S. Robles González

Co- Director: Dra. Ireri V. Robles González

Huajuapan de León, Oaxaca. Agosto de 2013

Característic

as de las

enzimas

MnP(1.11.1.13)

Mn(II):

H2O2oxidoreductas

a

LiP (1.11.1.14)

diarilpropano O2

H2O2oxidoreductas

a

Lac (1.10.3.2) p-

benzodiol

O2oxidoreductasa

Grupo

proteico Hemo Hemo

Cobre I,II=I Cobre

III=2

PM (KDa) 32.- 62.5 (122) 38 – 47 (42) 60 – 100

Punto

isoeléctrico 2.8 – 7.2 3.2 – 4.7 3- 7

Punto de pH 2.6 – 4.5 2.0 – 5.0 2.0 – 8.5

H2O2 Si Si No

Especificida

d Mn2+

Amplia, aromáticos

incluidos, no

fenólicos

Amplia, fenólicos y

no fenólicos

74

Tabla 2. Características de enzimas ligninolíticas.

Notas: Yadav.M., et al., 2009; Osma, et al., 2010; Madhavi y Lele, 2009.

Marco teórico

75

Suelos

-Asolvar suelos,

menor

permeabilidad.

-Inibición en la

germinación de

semillas

-Remoción de

metales pesados

Vinazas Impacto ambiental

Agua

- Disminución de

oxigeno disuelto.

-Disolución de

metales pesados.

-Inhibición de la

fotosintesis.

-Producción de

malos olores.

Kannabiran y Pragasam, 1993; Díaz et al., 2002; García et al., 1997; Pant y Adholeya,2007

Introducción Hongo ligninolítico Aplicación Ref.

Pleurotus sajor- caju F6

y F2, Pleurotus

ostreatus

Decoloración de efluentes municipales y

lodos.

1

Trametes versicolor Decoloración y producción enzimática en

efluentes de la industria papelera

2

Trametes versicolor Decoloración en efluentes de la industria

textil

3

Trametes versicolor Decoloración de colorante antraquinona 4

76

1) Dellamatrice, et al., (2005); 2) Gómez et al., (2004). 3) Harech y Datta, (2002); 4) Guo et al., (2008)

Medio de inducción

Reactivo Concentración (g/L)

Dextrosa anhidra 10.0

peptona de soya 2.5

K2HPO4 1.0

KH2PO4 1.0

MgSO4.7H2O 0.5

NaCl 0.3

NH4Cl 1.0

CaCl2.2H2O 0.1

Tiamina 0.02

Solución de elementos traza 2mL

77

Elementos traza

Reactivo Concentración (g/L)

FeSO4.7H2O 5.0

MnSO4.H2O

CoCl2.6H2O 1.0

ZnCl2 1.0

(NH4)6Mo7O24.4H2O 0.5

CuSO4.5H2O 0.3

NiCl2.6H2O 1.0

78

Inductores de crecimiento

Enzima Inductor Ref

Lacassa

Sulfato de cobre (1000U/L, 50microM).

(control 820 U/l)

1,2,4

Azul de metileno (1150U/L, 20microM). 2

2,4-dimetoxifenol, Pyrogallol, ácido

veratrico, catecol. (incrementan de 1.6 -2.5

veces)

6

Mg2+, Zn2+, Ca2+, Mn2+ 7, 4

Floureno, Antraceno, Pireno. 7

Manganeso peroxidasa Ácido veratrico , pirogallol (incrementan

1.6-2 veces)

6

Lignino peroxidasa Tween 80. 8

79 1) Gnanamani, A; et.al.1959. 2) Zhiyu, L. 2009. 3) Malhotra, K; et.al. 2004. 4) Li- Quiong, G., et al. 2011. 5)Hess, J.

2002. 6) Elisashvili, V., et.al. 2010. 7) pozdnyakova, N. et.al. 2011. 8) Asgher, M. 2006.

Lacasa

• Lacasa (benzenodiol:oxygeno

oxidoreductasa, EC 1.10.3.2) son

oxidasas multicobres, que catalizan

reacciones de oxidación, y tiene como

sustrato compuestos aromáticos, y al

mismo tiempo ocurre el oxígeno molecular

a agua(b). Su peso molecular es de 60 -

100KDa. Puntos isoeléctricos de 3 a 7 ,

pH óptimo de 3.6. (a).

80 a) Madhavi, V; et.al 2009. b) Lettera, V; et.al. 2010.

Lignino Peroxidasa

• Ligninasa es el nombre genérico para un

grupo de isozimas que catalizan la

despolimerización oxidativa de lignina .

• Ensayo : Ligninasa cataliza la oxidación

del alcohol veratrílico a veratraldehido en

presencia de peróxido de hidrógeno (a).

• La actividad de Lip, fue determinada a T

de entre 25 y 65 C a su pH óptimo (b).

81 a) Tien, M; Kirk, K. 1988. b) Yang, J; et.al. 2005.

Manganeso peroxidasa

• Oxida al Mn(II) a Mn(III) y muestra

actividad oxidasa, produciendo peróxido

de hidrógeno por oxidación del sustrato al

estado reducido como NAD(P)H,

glutationa (GSH), ditiotreitol (DTE) y ácido

dihidroximaleico. La reacción es

catalizada de la siguiente manera (a):

2 Mn2+ + H2O2 2Mn3++H2O

82 a) Pasczynki et al., 1986

Arabiloxilano

• Polisacaridos que se encuentran en el salvado de trigo,

cebada y centeno. Las unidades de arabinosa que lo

componen producen compuestos viscosos con el agua

que afectan la consistencia de la masa, retención de

burbujas de la fermentación en las películas de gluten y

almidón y la textura final del pan..

83

Columna de cromatografía. • DEAE Sephacel ™ es un intercambiador de

aniones débiles a base de celulosa moldeada.

• El ion intercambio grupo es dietilaminoetilo, conserva su carga y mantiene consistentemente alta capacidad en toda la gama de trabajo, pH 2-9.

• DEAE Sephacel es macroporosa y tiene un límite de exclusión de aproximadamente 1000 000 daltons de las proteínas globulares.

84

Norma

• NORMA OFICIAL MEXICANA NOM-052-

SEMARNAT-2005, QUE ESTABLECE

LAS CARACTERÍSTICAS, EL

PROCEDIMIENTO DE IDENTIFICACIÓN,

CLASIFICACIÓN Y LOS LISTADOS DE

LOS RESIDUOS PELIGROSOS.

85

Ciclo de vida de los hongos

86

87

88

Actividades enzimáticas obtenidas de la cinética en cultivo

sumergido empleando pellets dobles con diferentes soportes.

Origen del polvo de bagazo Actividad enzimática (U/L)

PiAT + Tv –A 1362.4

PiAT + Tv- B 2668.0

PeAT+Tv-A 1476.2

PeAT+Tv-B 5634.8

PeAE+Tv-A 4304.1

PeAE+Tv-A 1432.3

Aserrín + Tv-A 49.0

Aserrín + Tv-B 1308.0

89

Actividad enzimática

• Una unidad de actividad enzimática (símbolo U) es la

cantidad de enzima que en una reacción

enzimática cataliza la conversión de

1 µmol de sustrato por minuto. Se utiliza también en

combinación con otras unidades (U/mg de proteína o

U/mL) para señalar, respectivamente, la actividad

enzimática específica o la concentración de actividad

enzimática.

90

91

Enzima Métodos para

determinar actividad

enzimática

Estructura Referencia

Lacasa

ABTS

Karp et al., 2012;

Dwivedi et al., 2011;

Babiĉ y Pavko,

2012; Iandolo et al.,

2011; Schückel et

al., 2011; Zhi-Xin et

al., 2010.

Siringaldazina

Mikiashvili et al.,

2006; Schückel et

al., 2011; Zhi-Xin et

al., 2010.

2,6 dimetoxifenol

Tlecuitl-Beristain et

al., 2008; Schückel

et al., 2011; Zhi-Xin

et al., 2010.

Guayacol Schückel et al.,

2011; Zhi-Xin et al.,

2010.

2,4-diclorofenol / 4-

aminoantipirina

Schückel et al.,

2011;

92

93

Enzima y hongo Método de extracción Método de purificación Ref.

Lacasa; Pleurotus

ostreatus.

Lacasa, Coniothyrium

variabile.

Homogeneización de los cuerpos

fructíferos del hongo, seguido por

centrifugación a 13000g/30 minutos y

filtración del sobrenadante.

Sulfato de amonio al 80% de

saturación, centrifugación a 10000g/40

minutos, re-suspensión del precipitado.

Se realizó una diálisis y cromatografía

de intercambio iónico (columna aniónica

con sepharosa), se recolectaron las

fracciones de la enzima, y se filtraron

con una membrana PM-10. Se sometió

a una columna de intercambio aniónico

Q.

Lettera

et al.,

2010;

Foroot

anfar et

al.,

2011;

Salony

et al.,

2006

Lacasa, Cyathus bulleri.

Sedimentación por centrifugación,

filtración, ultrafiltración,

Precipitación de proteínas con sulfato

de amonio, centrifugación,

cromatografía en gel.

Autore

et al.,

2009

Lacasa, Polyporus sp.

Homogeneización y centrifugación a

5000g/15min

Concentración del sobrenadante por

ultrafiltración (viva flow 200 system,

200cm2), seguido por el análisis con

cromatografía de intercambio iónico

(anionico, DEAE, sepharosa flujo

rápido). Se comprobó la presencia de

lacasa por el ensayo de actividad. Las

fracciones positivas se sometieron a

ultrafiltración, finalmente se sometió a

una columna sephadexG100.

Lo-

Qion et

al., 2011.

Métodos para la purificación de lacasa.

Enzima Referencia

Hongos se la pudrición

blanca

Lacasa Pointing, 2001; Silverio

et al., 2013;

Lignino peroxidasa Pointing, 2001; Pant y

Adholeya, 2007.

Manganeso peroxidasa Pointing, 2001;

Champagne y Ramsay,

2005.

Glioxal oxidasa Kersten, 1990; Pointing,

2001.

Superoxido dismutasa Pointing, 2001.

Glucosa oxidasa Wong et al., 2008;

Pointing, 2001.

Aril alcohol oxidasa Goswami et al., 2013;

Pointing, 2001,.

Celobiosa: quinona

oxidoreductasa

Pointing, 2001.

Celobiosa

deshidrogenasa

Pointing, 2001.

Versatil peroxidasa Pointing, 2001. 94

Sustratos de la Lacasa

• Laccases are nonspecific with regard to reducing substrates. They catalyze oxidation of various organic substances, including O and p-diphenols, aminophenols, polyphenols, polyamines, methoxy phenols, lignins, aryl diamines, and some inorganic ions with simultaneous direct reduction of dioxygen to water without intermediate production of hydrogen peroxide (Yaropolov et al., 1994; Solomon et al., 1996; Reinhammar, 1984; Gianfreda et al., 1999; Morozova et al., 2007)

95

Marco teórico

96

Producen

Bacterias

Hongos

Más

utilizadas

Debido a :

- Cantidad

- Tipo y Variedad

Domínguez et al., 2006; Santos et al., 2012; Wang et al., 2013; Vhardwaj et al., 2013; Ramesh y Venugopalan, 1987

Aplicaciones de lacasa en la industria textil, papelera y

biorremediación

Enzima Aplicaciones Ref

.

Lacasa

Despolimerización de lignina

1,2 Deslignificación de pastas de madera

Blanqueo de pastas kraft

Degradación de blanqueo de colorantes textiles 3,4

,5

Biodegradación de hidrocarburos xenobióticos

aromáticos policiclicos. 6,7

Ref: 1)Bourbonnais et al, 1997; .2) Lund y Ragauskas, 2001; 3) Mc Kay, 1979; 4) Cripps et al. 1990; 5)Cooper, 1993; 6) Pointing, 2001; 7) Bamforth y Singleton,

2005.

97

Enzima Aplicaciones Ref.

Lacasa

Estabilidad de vinos (reducción de compuestos

polifenólicos) 1,2

Estabilización de cerveza (reducción de compuestos

polifenólicos) 2,3

Clarificante en el procesamiento de jugos de fruta

(reducción de compuestos polifenólicos) 4,5

En panadería, aumentando la fuerza, estabilidad,

maleabilidad de la masa. (ruptura de los enlaces

entrecruzados de ácido ferúlico y arabinoxilano) 6,7

Mejoramiento de los parámetros sensoriales de los

alimentos (eliminando compuestos indeseables, controla

olor y mejora sabor.

8,9,

10

Participa en gelificación de la pectina de remolacha. 10

. Ref: 1) Conradet al., 2002 ; 2)Minussiet al., 2002. 3) Giovanelli, 1989. 4)Minussiet al., 2007; 5)Siebert, 1999. 6) Labatet al., 2000; 7)Si , 1994. 8)

Bouwens et al., 1997; 9) Takemoriet al., 1992. 10) Montereali et al., 2010

98

Aplicaciones de lacasa en la industria alimentaria

Marco teórico

• Las vinazas se definen como los residuos líquidos

remanentes en la etapa de la destilación de los azucares

fermentados de diferentes sustratos (melazas, caña de

azúcar, jugos de uva, agave previamente hidrolizado,

etc.)

99

Definición de vinazas

Robles- González et al., 2011

Marco teórico

• Definición de bagazo

– El bagazo es el residuo de los azucares extraídos

para producir el mezcal, es decir, azúcar, lignina,

celulosa y hemicelulosa

100 Rodríguez-Macías et al., 2010

101

Condiciones de cultivo

Temperatura (24- 30°C)

Relación C/N (0.7g/g)

pH (4 – 6)

Sales: CaCl2, CuSO4, MgSO4

Champagne y Ramsay, 2005; Songulashvili et al., 2006; Khalili et al., 2010; Miskiashvili et al., 2006.

102

103

104

105

106

107

108

109

110

Histidina

111

112

Estructuras tridimensionales de las lacasas de los

basidiomicetos

T. versicolor (A, PDB 1gyc, Piontek et al., 2002)

Función de la lacasa en HL

• Algunas de las funciones que cumple la

lacasa se relacionan con la morfogénesis,

la pigmentación de los conidios, la

formación de rizoformos, el desarrollo de

cuerpos fructificantes y la protección

frente a compuestos fenólicos tóxicos

liberados durante la degradación de la

lignina.

113

• The chemical analysis of winery

wastewater has indicated that sugars

make up a large portion of the chemical

oxygen demand, whereas organic acids

play a more prominent role in the acidity of

the wastewater (Malandra et al., 2003).

114

• The composition of South African distillery wastewater

• during the 1999 harvest season displayed the following

• properties: pH ranging from 3.7 to 4.8, COD from 7.4

• to 28.5 g/L, conductivity from 140 to 400 mS/m, total

• dissolved solids from 1000 to 2800 mg/L, nitratesfrom

• 35 to 132 mg/L, chlorides from 20 to 425 mg/L, phosphates

• from 98 to 251 mg/L, ammonia from 68 to

• 378 mg/L, potassium from 330 to 490 mg/L, sodium

• from 18 to 170 mg/L, magnesium from 14 to 86 mg/L,

• and calcium from 21 to 90 mg/L (Malandra et al.,

• 2004).

115

116

UTM-B (Medio D) 248 U/L Nuestros

resultados

Pleurotus ostreatus 13,000 U/L Tellez-

Tellez, et al.,

2008

Pleurotus ostreatus 98 82 U/L Mikiasshvili,

et al., 2006 Pleurotus ostreatus 108. 284 U/L

Pleurotus ostreatus (ATCC

32783)

12,200 U/L Tlecuitl-

Beristain, et

al., 2008

Pleurotus ostreatus CP50 600U/L Tinoco, et

al., 2011

Pleurotus sajor- caju 80,000 U/L Patrick, et

al., 2011

Pleurotus sajor- caju PS- 2001

Pleurotus ostreatus

13,000 U/L

147 U/L

Bettin, et al.,

2008

Freixo, et

al., 2011.

Hongo ligninolítico (H.L) Actividad enzimática Ref.

Actividades enzimáticas de lacasa obtenidas por hongos ligninolíticos

empleando diversos sustratos sólidos.

117

Microorganismo Sistema de cultivo Observaciones Resultados Ref

Trametes

versicolor y

Funalia Trogii

FES; sustrato:

salvado de trigo.

Humidificación del

medio sólido (HMS):

vinazas, residuos de

la elaboración de

aceite de oliva y

suero lácteo, a

concentraciones de

25, 50 y 100%, y

melasas al 1 y 5%.

Actividad enzimática máxima

(AE máx)se obtuvo al decimo

día empleando a Trametes

versicolor y vinazas al 50%,

con una actividad de lacasa

de 8510 ± 5170 U/L

Boran y

Yesilad

a, 2011

Trametes hirsuta

(BT 2566)

FES ; sustrato:

salvado de cebada

o semilla de uva

HMS: medio de

cultivo mineral.

AE máx se obtuvo empleando

como sustrato semillas de uva

23000 U/L

Moldes

et al.,

2003

Pleurotus

ostreatus(ATCC

32783)

FES; Inmovilizada

en: esponja de

poliuretano de baja

densidad.

HMS: medio mineral,

sustrato para HL

AE máx obtenida fue de 2430

U/L

Téllez-

Téllez

et al.,

2008

Pleurotus

ostreatus

FES ; sustrato:

salvado.

HMS: vinazas

estériles en una

relación 1:1.

AE máx promedio obtenida

fue de 20 000 U/L a los 22

días de fermentación.

Ramíre

z et al.,

2003.