UNlVERSiDAD AUTONOMA METROPOLITANA DIVISION DE CIENCIAS BIOLOGICAS Y DE LA SALUD M. EN C. ARTURO PRECIADO LOPEZ SECRETARIO ACADEMIC0

A QUIEN CORRESPONDA

Por medio de la presente se hace constar que el (la)

del Departamento de: Biotecnología de la División de Ciencias Biológicas y de la Salud, asesoró el siguiente Servicio Social:

TITUL0:”Optimización de métodos analíticos para análisis de medicamentos”.

Q.F.I. YOLANDA VARGAS ALVARADO

ALUMNO: ALEJANDRA PEREZ NAVARRETE

MATRICULA: 91234910

LICENCIATURA: Ingenieria Bioquímica Industrial

PERIODO: 7 de abril de 1997 - 19 de noviembre de 1997.

Se extiende la presente para los fines que al interesado convengan, en la Ciudad de México, D.F. a cuatro de diciembre de mil novecientos noventa y siete.

A t e n t a m e n t e ‘CASA ABiERTP AL TIEMPO”

UNIDAD GTAPALAPA Av Michoadn y La Purísima. Coi. Vicantina, D.F. C.P. 09340,Tel: (5) 724-48-79, Fax (5) 812-8043

c -

UNIVERSIDAD ALTONÓ%lA hlETROPOLITANA

/PQRIBRE : PÉREZ NAVARREE ALEJANDRA TELÉFONO : S 56 60 22 MATRÍCULA : 91234910

JLICEXCLATURA : INGENIER~A B IOQU~ ICA INDUSTRIAL UNIDAD QTAPALAPA DIVISIÓN DE C.B.S J

TRCIIESTRE LECTIVO : 97-1 HOR4S A LA SEMANA : 21 HRS.

ANÁLISIS DE MZDICAh'ENTOS POR 1 T í T U L O DEL TRAL3AJO : CROMATOG~AF~A DE ALTA RESOLUCI~N (CLAY)

J' ASESOR ES: Q F.1. YOLANDA VARGAS ALVARADO PXOFESOR TITULAR TIEMPO COMPLETO DPTO. EIOTECNOLOGÍA. PARCIAL, DPTO. BIOTECNOLOGiA

Q.F. L. FERNAhVQ POOT LÓPEZ PROFESOR TITULAR TEMPO

LUGAR DE REALIZACIÓN : EDIFICIO S CVBÍCULO 150 DE LA WiERSiDAD AUTONÓMA METROPOLITANA UNIDAD IZTAPALAPA

.ECHA DE INICIO : FECHA DE TERMih'hCIÓN : 19 - Novie,nbre - 1997 1 CLAVE : LBI 017.97 NOMBRE DEL PROYECTO : OPTIMIZACIÓN DE MÉTODOS ANALiTICOS PW-ÁLISIS DE

7 - AbnI - 1997 2 --

MEDICAMENTOS . ! 'I

Q.F.I.. Yolanda Vagas Alvarado , Profesor tiempo completo Dpto. Biotecnologia.

A L W A : Perez Navanete Alejandra

UNIVERSIDAD A U T O N ~ M A METROPOLITANA

NOMBRE : PÉREZ NAVARRETE ALEJANDRA TELÉFONO : 8 56 60 22 MATRÍCULA : 91234910 LICENCIATURA : INGENIER~A BIOQUIMICA INDUSTRIAL

UNDAD IZTAPALAPA DIVISIÓN DE c B s

TRIMESTRE LECTIVO : 97-1

TíTULO DEL TRABAJO :

ASESOR E S Q F I YOLANDA VARGAS A L V A R O 0 PROFESOR T I T C U R TiEhlPO COMT'LETO DPTO BIOTECNOLOGIA PARCIAL, DPTO BIOTECNOLOGiA

noms A LA SEMANA : 2 1 HRS ANALISIS DE MEDICAMENTOS POR CROMATOGIWIA DE ALTA RESOLUCION (CLAR)

Q F L FERNiwW POOT LOPEZ PROFESOR TITüLAR TIEMPO

LUGAR DE REALIZACIÓN : EDIFICIO S CUBBICULO 150 DE LA UNIVERSIDAD AUTONOMA METROPOLITANA UNiDAü IZTAPALAPA

FECHA DE INICIO : 7 - Abnl - 1997 FECHA DE TERMliiACIÓN : 19 - Noviembre - 1997 CLAVE : U31 017 97 NOMBRE DEL PROYECTO : OPTIiLI1ZACION DE METODOS AYALITICOS P A M ANALLISIS DI:

A MEDICAW3"OS

, /,

Dpto. Biotecnología. Dpto. Biotecnologia.

ALUMNA : Pérez Navmete Alejandra

Noviembm 19.1997.

Dr. José Luis Arredondo Figueroa Director de la División de Ciencias Biológicas y de la Salud Universidad Autónoma Metropolitana Unidad Iztapalapa. P R E S E N T E :

Por medio de la presente liaceirios constar que la alumna Pérez Navarrete Alejandra con niatricula 91234910

de la Licenciatura en Ingenieria Bioquitiiica Industrial, realir6 satisfactoriamente su Servicio Social en el

departamento de Biotecnologia durante el periodo, comprendido del 7 de Abril al 18 de Noviembre del aiio en

curso, desarrollaiido el proyecto titulado “Optiniizacióii de Métodos Aualíticos para Análisis de

medicamentos”

Sin más por el inoniento

A t e n t a m e n t e “Casa atbiena al tiempo”

Dpto. Biotecnología Profesor titular tiempo parcial Dpto. Biotecnologia

Noviembre 19,1997

Dr. José Luis Arredondo Figueroa Director de la División de Ciencias Biológicas y de la Salud Universidad Autónoma Metropolitana Unidad Iaapalapa. P R E S E N T E :

Por iiiedio de la presente solicitanios a usted considere este trabajo como el reporte final de Servicio Social de

la alumna Ptrez Navarrete Alejandra con iiiatricula 91234910 de la licenciatura en Ingenieria Bioquíiinca

Industrial quien no presentó su reporte final en el tiempo establecido de entrega (Octubre 7, 1997), debido a

que, dentro del proyecto '40ptimizacióii de M'étodos Analíticos para Aiiálisis de Medicanientos" se

efectuó un estudio de estabilidad, que como nunimo deberia realizarse en 6 meses para obtener resultados

sigiuficativos sobre la estaldidad del Principio Activo propuesto; POT ello fue necesario prolongar su estancia

eti este departamento para la terminación de la parte experimental hasta la 1" semana de Noviembre.

Agradeciendo de anteniano la ateiicióii prestada

A t e n t a m e n t e "Casa abierta al tiempo"

,/

Q F.d- landa d r g a d v a r a d o Profesor titular tiempo completo Dpto. Biotecnologia

Profesor titular tiempo parcial Dpto. Biotecnologia.

s ERI'ICIO SOCf.4L

. -~ -1 USIVERSIDAD AUTONOMA METROPOLITAEI'A

: \ :

.- . - 1559 =:

.: I > NOMBRE : PEREZ NAVARRETE ALEJANDRA

TELEFONO : 3l.ATRfCUL.A : 91233910 . 7 , I

LICENCLATURA :

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! .- . ,I . 8 56 60 22 :. . ,, '. " ..: * , - * .:. I. INGENIEd.4 BlOQL'iMICA INDUSTRIA>:.' .:. ~ .. ,,

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TRI3IESTRE LECTIVO : 97-1 tlOR.AS A LA SEMANA : TITULO DEL TRABAJO :

ASESORES: Q.i...i. YOI..ANDA VARGAS ALVARADO

I X ~ . BIOTECNOLOG~A. PARCIAL. DPTO. BIOTECh'OLOGiA

LUGAR DE REALIZACION : EDIFICIO S CUBiCLJLO 150 DE LA IíNIi'ERCIDAD

21 HRS. ANÁLISIS LIE MEDICAMEXTOS POR CROMATOC;R4FiA DE ALT.4 RESOLUCIÓN (CL.-lRj

Q.F. FERh'ANDO POOT LOPEZ I'I<OI'ES@R TITGLAR TIEMPO COMI'LETO PROFESOR TITULAR TIE41PO

AUTONOMA. METROPOLIT.4NA L N D A D IZT.qPALAP.4

FECHA DE INICIO : FECHA DE TERMINACION : 29 de Acosro 1997 C L A v E : NOMBRE DEL PROYECTO : OPTIMIZACIÓN DE !&TODOS ANALÍTICOS PAR4

7 de Marzo 1997

. ..\S.iLISIC DE \1EDIC.4.\lENT@S . . .~

I: /-

. < I

Dpto. Bioiecnolo@a. profesor tiempo pirciai Dpto. Bioiecnologia.

NOMBRE : Perez Navarrete Alejandra rnTRICULA : 91234910 LICENCWTURA : Ingenieria Bioquimica Industrial

NOMBRE DEL PROYECTO : OPTIMIZACIClN DE &TODOS ANALITICOS PARA ANÁLISIS DE MEDICAMENTOS

CLAVE : IB1.017.97 FECHA DE TERMINACION : 19 ~ Noviembre ~ 1997

ASESOR ES: Q.F.1. Y olanda Vargas Alvarado Profesor titular .tiempo completo Dpto. BIO'iECNOLOGh

Q.F. Luis Fernando Poot López Profesor titular tiempo parcial , Dpto. BIOTECNOLOGIA

RESUMEN : Obietivo : Implementar la tecnica de cromatografia de alta resolución CLAq en análisis de medicamento! como método para la valaración de los principios ;activos, asi como la cuanrificación de sustancias relacionada! y disolución in vitro.

Resultados : Utilizando la fase móvil, Soluci¿>n reguladora : AcN en proporción (2 : I ) se obtiener cromatogramas de la degradación ácida, básica y oxidativa, de la muestra, es posible observar que no existe inkrfereztcia de los productos de depdacióii coi1 el pico pñlicipal conxsyoridietile al Otriepmol. Comparando la retención del Oiiiepfazol eii la fase iiióv¡l, Solución reguladora : AcN (2 : I ) y (3 : 1). es en est? ultima donde la retención es mayor debido a que el carácter polar de la fase móvil es mayor, lo que provoca UI aumento en la interacción con la fase estacionaria, esto pernute una mejor resolución de los picos secundario! que la obtenida wn la fase móvil (2 : I ) . Por lo que se considera a la fase móvil (3 : I ) como optima para Ir determinación de sustancias relacionadas. Sin embargo para la valoración, la fase movil (3 : I ) , presenta un¿ desventaja, como la retención es alta, el tiempo de corrida es grande (45 m¡n) lo que significa mayor consumc de solventes y costos de anasis, por lo cual la fase móvil ( 2 : I ) es adecuada para la valoración (7 min), a: existir menor retención del Omepnzol. Con respecto al estudio de estabilidad del producto terminado, se observa que los resultados de la Valoración. Sustancias relacionadas y Disolución, están dentro de las especificaciones, aún bajo las condiciones extremas B las que fue sometido. No existe una diferencia significativa en la disolución por lo que cualquiera de los métodos pueden set

utilizados para esta prueba, para la cuantificacióri del Omeprml en la disolución se usó la fase móvil (2 : I ; debido a que era el pico de interés.

fonclusiones : Por las pruebas efectuadas se puede concluir : U La tecnica por CZAR óptima para la cuantifiuición del Omeprazol en pruebas de valoración y disolución e:

B Para la determinación de sustancias relacionadas, la Fase móvil Ó p k es en la proporción (3 :i) donde se la Fase móvil, ,Solución reguladora : AcN (2 : i ) , por la dismjnución de tiempo y menor costo.

ohtiene la mejor resolución de los picos secundanos.

INDICE

1.- Introducción 1.1 .- Cromatograíia Líquida 1.2 .- Portes que conforman un cromatograio de líquidos 1.3 .- Parametros cromatográficos 1.4 .- Generalidades

2.- Objetivos generales y especifieos

3.- Metodología utilizada 3.1.- Protocolo de estabilidad 3.2.- Material, Equipo y reactivos

4.- Actividades realizadas 4.1.- Caracterización del Principio Activo 4.2.- Selección del tipo de CL.4R. 4.3.- Selección de la fase móvil. 4.4.- Definir el sistema 4.5.- Factores cromatográñcos específicos para el .P..4. 4.6.- Aplicación del metodo.

5.- Objetivos y metas alcanzados

6,- Resultados y conclusiones 6.1.- Optimización del sistema 6.2.- Comparación del método 6.3.- Caracterización del principio activo 6.4.- Resultados del Estudio de estabilidad. 6.5.- Conclusiones.

1.- Recomendaciones

8.- Bibliografia

Anexo A

Anexo B

Anexo C

Pal?. 1 i 3 8 9

11

12 13 14

15 I S 15 16 16 17 18

30

30 30 31 31 31 31

31

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35

1) INTRODUCCION Y ANTECEDENTES

La cromatogaiia es un proceso de migración diferencial en el cual los componentes de una mezcla son transportados por una fase móvil, gas o liquidos y retenidos selectivamente por una fase estacionaria, que puede ser un líquido o un sólido (ref 1)

1.1 CROMATOGRAFIA LIQUIDA

Aunque Michael Tsweff publicá en 1906 un trabajo completo sobre cromatografia liquida, en el cual explicó claramente la naturaleza del proceso y la apreciación de su potencial, no se adoptó esta técnica ampliamente hasta muchos años después de publicada. En 1941, Martin y Synge, quienes no habian tenido éxito al usar la extracción por contracomente ,para la separación de aminoácidos en muestras de lana, desarrollaron un proceso de cromatogaña líquida. en el cual usaron una columna que contenía gel de silice saturado en agua y una fase móvil de butanol-cloroformo

Perfeccionaron estas técnicas experimentales y explicaron los aspectos teóricos del procedimiento tan profusamente que se otorgó por ello el Premio Nobel de 1952. Desde entonces, la cromatografia líquida se ha convertido en una de las tknicas más versátiles de las que dispone el analista debido a sus sencillez y capacidad para obtener separaciones de alta resolución. Se pueden desarrollar separaciones basadas en características tan diversas como la polaridad de los solutos, y su naturaleza iónica, su peso molecular, su capacidad de partición o su capacidad para.formas complejos de afinidad

El termino cromatogaña liquida se usa hiy en día para referirse a aquellos métodos en los cuales la separación tiene lugar dentro de UM columna empacada. El material de empaque es la fase estacionaria y puede ser un sólido con capacidades adsortivas o un soporte inerte revestido con una fase liquida. Se usa UM fase liquida móvil como eluyente. A q u e la cromatograña en capa delgada y la cromatograña en papel usan la fase móvil que es líquida y una fase estacionaria sólida, difieren en que la separación se verifica sobre una superficie plana y no en una columna

El proceso de la cromatogaña liquida puede ser realizado usando uno de dos métodos. El primero, el procedimiento clásico desarrollado por Tswen, llamado cromatogafia de columna abierta, se deja fluir a la fase móvil en la columna empacada bajo la influencia de la gravedad, o a lo sumo UM baja presión, por ejemplo, 50-100 psi. En el segundo, la fase móvil es forzada a través de la columna empacada aplicando una alta presión. Este método se llama cromaiogrdia líquida de alto rendllniento (HF'LR), debido a las eficiencia extremadamente altas que se obtienen (unos 50,000 platos por metro) o cromatograña liquida de alta presion debido a las ahas presiones que se utikan ( 1.M)O - 3.000 psi). En la HPLC, el diámetro de partícula es tipicamente de 1 0 ~ o meno$ y como resultado de ello las columnas se empacan más compactamente y desarrollan altas retmpresiones que necesitan del bombeo de la fase móvil a traves de la coiumna.

Ya sea que se empleen métodos de HF'1.C o de columna abierta, el modo de separación depende primariamente de la naturaleza de la fase estacionmja Hay cinco modos disponibles: la adsaroán, la partición. el mtercambio iónico, la exclusión de tamrñio y la aiinidad. (ref. 3)

Esta técnica es conocida también como cromatografia líquida modema, el éxito en la aplicación de la CLAR para un compuesto dado depende de la combinación correcta de las condiciones de operación, es decir: el tipo de columna, la fase móvil, la longitud y diámetro de columna, la velocidad de flujo de la fase móvil etc.

La migración diferencial en la CLAR es el resultado del equilibrio de distribución de los componentes de una mezcla entre la fase estacionaria y la fase móvil. Dichos componentes se separan en la columna y al salir de ésta son conducidos por la fase móvil y en el orden en que emigraron, hacia el detector donde se registran sus concentraciones y sus tiempos de retención de la columna . El cromatograma resultante muestra cada compuesto que sale de la columna en forma de picos simétricos con un tiempo de retención característico, por lo que este tiempo puede emplearse para ideniificu el compuesto. Este tiempo de retención tr, se mide desde el momento de ia inyección de la muestra basta el momerrto en que aparece el máximo del pico en el cromaiograma. (ref I)

La cromatograña de liquidos es fundamental en Quimica, porque la mayoria de los compuestos no son suficientemente volátiles o no tienen bastante estabilidad térmica para la cromatograña de gases (ref 2)

Para los medicamentos sucede lo mismo,, si los materides son volátiles y estables en la fase gaseosa, la cromatograña de gaw puede ser la técnica de elección dado que es simple de realizar, rápida y capaz de alta resolución. Si es preciso aislar compuestos eluidos en cantidad, entone3 una elección más ventajosa puede ser la cromatograiia de partición liquida o la cromatograiia en capa delgada. Las columnas de cromatograña gaseosa no pueden manejar grandes cantidades de material y resulta dificil recuperar los ehyentes de los gases calientes que fluyen. Si las sustancias son de alto peso molecular, tal como proteínas, trigücéxidos o polimeros para lograr UM separación es neceSano emplear la cromatogmtia üquida usando el modo de exclusion por tamaño. Para compuestos ionizados en solución -aminoácidos-. el modo de imercambio iónico de la cromatografra de liquidos es p a n i d m e n t e útil. Los compuestos altamente polares o bidmfficos de peso molecular intermedio, tales como los azúcares, pueden ser separados por técnicas de partición que implican la cromatogaña en papel o en columna. Las sustm&as que son no i d l e s , Iiidrofóbicils o no polares, pueden ser separadas mediante métodos de adsorción líqiiida.(ref. 3)

Los Sistemas de Cromatografia de Líquidos de Alta Resolucibn se ban convertido con el paso del tiempo y el desarrollo de la tecnologia, en instrumentos complejos en diseño con funciones y alcances, constituyéndose por si mismos como UM variable importante en ia obtención de información. El buen funcionamiento del instrumento, asi como el adecuado comportamiento de las metodologias, son condiciones necesarias para garantizar la calidad de los resultados generados por el sistema.

El empleo de la técnica cromatográfica como una herramienta analítica de uso diario en el laboratorio, nos ha obligado a reconocer la importancia de las variables que pueden afectar la calidad y consistencia de la información que de ellos se obtiene Para toda persona que se ha involucrado con la técnica, resultará evidente que la cantidad de factores que pueden definir el <!xito de un análisis cromatográñco es tai, que puede ser dificil enumerarlos en su totalidad, de los cuales podemos considerar:

Preparación de la muestra Calidad de los disolventes Volumen de inyección Selección de la columna

Desempeño del instrumento etc

Los iiwarios de la técnica reu>nocen que tras la ejecución re- de UM Metodologia es posible experimentar variaciones en algunos parámetros cromatográñcos wm, pueden ser el tiempo de retención, área o altura, etc. sin embargo se sabe que estas variaciones deben de mantenerse dentro de algunos inm-valos de comportamiento. Cuando estas vanaciones se ;dejan de los intenialos considerados, es entonces que se tiene la necesidad de identificar la b t e de variación y de ser posible, solucionar el problema.(ref. 11)

1.2 PARTES QUE CONFORMAN UN CROMATOGRAFO DE LiQUlDOS

El notorio avance que la cromatograña líquida moderna ha experimentado en los últimos aiios, en especial en lo referente al desarrollo de nuevas fases estacionzinas, ha permitido al analista acceder a un nivel instnimental de alta precisión, compuesto por bombas que pemiiten entregar (en un solo instrumento) caudales muy estables que varían entre el microlitro y varios mililitros, detectores con celdas intercambiables en las cuales el volumen puede escogerse, generalmente entre 1 y 12 PI, válvulas accionadas por microprocesadores que penniten dirwionar la fase móvil para automatizar procesos, integradores versátiles, aislados o conectados a una computadora que puede permitir no sólo el control global de uno o más equipos cromatográficos sino la libre manipulación y almacenamiento de datos, generación de reportes e incluso el desarrollo automático de métodos, etc.

Básicamente, los equipos de HF’LC pueden clasifi,irrse en integrados y modulares. En los primeros, cada una de sus partes (reservono de solventes, bomba, inyector y detector) están reunidas en un gabinete y su intercambio o conexión con otros componentes de la misma o diferente marca es dificil. Permiten en cambio un mejor aprovechamiento del espacio, menos cables, tuberias y conexiones expuestas y quizás menores riesgos frente a operadores ocasionales o poco experimentados. En los segundos, los módulos son instrumentos individuales que permiten no solo armar el equipo ;según la necesidad del anaiista sino aumentar su complejidad según esa necesidad varie. La visuaiizición de cada componente permite no solo el mejor conocimiento y control visual del equipo, sino el mejor aislamiento y resolución de problemas cuando estos se producen

Fig. 1 Esquema de un cromatógrafo líquido básico modular.

7

Reservono de la fase móvil El reservono es el recipiente que contiene la fase móvil. Puede ubicarse “ dentro” de un equipo integrado o ezternamente en un equipo modular, y en general algunos centímetros sobre en nivel de la bomba para que la tüerza. de gravedad dirija el solvente hacia ésta, manteniendo Uenas las conexiones

Tubenas La fase móvil empleada en HPLC debe circular por tuberías que conectan el recervorio de solvente con la bomba, la bomba wn el inyector, éste con uno o más detectores conectados en serie, y eventualmente wn un colector de fracciones o váivulas de distribución. Es evidenle que estas tubenas deben ser inertes, y de acuerdo a su ubicación en el sistema cromatográñw, resistentes a altas presiones. Las tuberias de acero se utilizan para conectar los componentes sometidos a alta presión (entre bomba e inyector, inyector y columna. columna y detector y entre detectores conectados en serie) y los materiales poüméricos para conectar los componentes donde la presión es amosfénca o ligeramente superior (reservorio de solvente a bomba, úitimo detector a frasco de desechos).

UNones Las uniones permiten conectar las tubenas, y con ellas, conectar los distintos wmponentes del sistema cromatográñw. Una unión consiste en dos piezas de acople perfecto, la unión macho, consistente en una férula que se afirma a la tubería conectara y un tornillo, que se ajusta a la unión hembra, dejando un volumen interno libre al solvente prácticamente nulo (volumen mue:rto cero), al fijar la férula por primera ves en la tuberia y realizar el primer ajuste, ya no se podrá mover. Básicamente, existen dos tipos de uniones, las que hemos descrito, Uamadas convencionales y las universales, en las cuales la fénria esta constituida por un poOmero deformable y el t o d o posee una cabeza algo mayor y fresada, a manera de pennitir el ajuste manual de la. unión, a diferencia de las convencionales que necesitan del empleo de Uaves apropiadas. Las uniones universales resultan mas cómodas que las convencionales, aunque pueden estar limitadas por la menor presión de trabajo que por lo general son menores de 400 psi.

Las uniones deben reunir las siguientes caracteristicas:

Deben ser inertes a fases móviles y muestras. Deben cerrar herméticamente. No deben contribuir en forma notable al ensanchamiento de banda extracolumnar por la presencia de volúmenes muertos.

Bombas Las bombas de HPLC impulsan la fase móvil pronmiente del reservono de solvente hacia el inyector, y desde aiíí hacia la columna. Su caudal de trabajo pude ser muy variable, según la escala de trabajo escogida. Existen bombas capaces de entregar caudales muy pequeños, del orden de los microlitros por minuto para la cromatogaña microbore, pasando a caudales de: unos pocos Mlitros por minuto para la cromaiograña anaiitica convencional hada valores mucho mayores para las preparaciones semipreparativas y preparativas. Básicamente existen dos tipos de bomba: las dc pistón @ombas reciprocantes) y las de desplazamiento continuo (bombas jainga). Las primeras son las de uso mas difuridido; son muy vasátiles y fáciles de adaptar a la rutina de laboratorio.

A

Materiales de construcción Las bombas están construidas de materiales muy resistentes tanto al ataque quimico como al desgaste mecánico. Los componentes en contacto con el solvente son acero inoxidable, &o, rub¡ y teflón. En general el acero inoxidable se utiliza como cuerpo de t0d.a la bomba, para la construcción de tuberias, conectores y cabezales de los pistones. Cuando el acero inoxidable resulta incompatible con el tipo de muestra (tipicamente las de origen biológico en las cuales se desea conservar la actkidad biológica), debe ser reemplazado por titanio.

Características de las bombas 1.- Caudal: Los equipos convencionales operan con caudales entre 0.1 y 10 mi por minuto y trabajan con presiones de hasta 6000 psi.

2.- Exactitud del caudal: La exactitud en la medición del caudal se refiere a la divergencia entre el caudal de trabajo establecido y el caudal real entregado. Puede determinarse fácilmente midiendo el volumen del líquido entregado en un intervalo de tiempo preestablecido.

3.- Ruido: El mido (short-term) se refiere a las variaciones denominadas pulsaciones que presentan las bombas del tipo reciprocante, y que conducen a variaciones en el caudal de solvente entregado en intervalos cortos de tiempo, válvuias tapadas, burbujas de aire ocluidas en los cabezales o sellos en mal estado intensifican notoriamente su valor.

4.-Deriva: La deriva es un cambio continuo (positivo o negativo) en la entrega del solvente que se produce en intervalos de tiempo muy largos (típicamente durante horas). La deriva en el caudal conduce a diferencias en las ireas de los picos durante operaciones automáticas en periodos de tiempo muy largos. Para minimizar el efecto de la deriva sobre los resultados cuantitati,vos se efectúa una nueva calibración del instrumento con estándares apropiados luego de la inyección de cada serie de 5 a 10 muestras.

5.- Sistema de corte: Es conveniente que la bomba posea sistemas de corte de caudal cuando se supere valores limite de presión tanto superior como inferior. Este sistema de corte evita en el primer caso, que excesos de la presión del sistema cromatogáüco puedan dañar los componentes mas sensibles como columnas y celda de los detectores. En el segundo caso permite detectar las posibles pérdidas de solvente o la incorporación de burbujas de aire al agotarse la fase. móvil.

Sistemas de gradientes. La HPLC isocrática es capaz de separar un número limitado de picos, tipicamente diez o doce. Para sistemas mas complejos, o cuando la polaridad de los componentes a separar es muy diferente, es posible que la modalidad isocrática no sea capaz de resolverlos. 'En estos casos el anaüsta puede optar por dos alternativas: La corrida multidmensional o la utilización de un ;yadiente de solventes El gradiente de soiventes es comparable a la programación de temperaturas en cromatogra3a gaseosa. En GC se varía la temperam en función del tiempo. En HPLC se varía la composición de la fase móvil (contenido porcentual del componente fuerte de la muestra). #comenzando la elución con un solvente débil y aumentando progresivamente la proporción del componente fuerte. Los gradientes de alta presión utibn UM bomba de a h presión para cada solvente individual. Cada bomba es comandada por un programador, y el solvente entregado se m a l a a alta presión en una cámara de bajo volumen y dirigida hacia el sistema.

Invectores El inyector es el dispositivo que permite introducir 1:1 muestra en solución sin interrumpir el caudal de solvente ~. a través del sistema. El inyector debe reunir las siguientes caractensticas:

Debe ser fácil de operar. Debe ser inerte al ataque quúnico y capaz de soportar altas presiones. Debe ser preciso en cuanto a la cantidad de muestra introducida en el sistema.

0 No debe provocar diluciones importantes de la solución inyectada. En casos especiales puede requenrse que opere a altas temperaturas, para lo cual puede ser necesario que alguno de sus componentes sean de titanio o PTI?E.

Detectores El detector es la parte del equipo cromatográfico que permite ver y ubicar en tiempo y espacio la posición de cada componente de UM muestra a la salida de la columna cromatográñca. Los detectores deben reunir las siguientes caractensticas:

Tener un amplio rango dinámico de respuesta. Poseer una respuesta lineal. No contribuir al ensanchamiento de banda extracdumnar. Responder a todos los solutos. Tener la sensibilidad apropiada. No afectarse por cambios de temperatura. Poseer una buena relación señal-ruido. No destruir la muestra. Tener una constante de tiempo baja.

Los detectores pueden clasiñcarse en generales y detectivos. Los detectores generales miden el cambio de alguna propiedad fisica de la fase móvil que contiene el analito en comparación con la misma fase móvil pura. Ejemplos típicos son el detector del índice de refracción y el de conductividad. Los detectores selectivos son aquellos sensibles a alguna propiedad propia del soluto, por ejemplo el detector W, que producirá una señal proporcional a la absorbancia del soluto a una longitud de onda dada y el detector de fluorescencia. Uno de los úitimos adelantos en los detectores u\/ es el denominado de ordenamiento de fotodiodos. En los

dispositivos convencionales. la red de difiaccion se ubica antes de la celda la que recibe luz monocromitica seleccionada por la red. En los detectores de oirdenamiento de fotodiodos se emplea un sistema óptico invertido: la celda se ilumina con luz blanca, es decir. no monocromada y la luz emergente de la celda llega a la red de difracción y alli es dispersada hacia el elemento fotosensible. En lugar de una fotocélula se emplea un conjunto de fotocélulas o fotodiodos montados en chip de silicio. De esta forma se consigue medir no solo la luz transmitida a UM longitud de onda, sino todo el espectro de absorción del eluido en tiempo real. Para poder controlar y procesar toda esta infomción es necesario la presencia de UM computadora con el software adecuado. Éste es el detector ideal para rsalizar el desarrollo de métodos analiticos por HF'LC ya que permite asegurar, dentro de ciertos limites, la integridad de un pico cromatográfico.

SERWCIO Socrar.

Fig. 2 Detector de ordenamiento de fotodiodos, compuesto por: I) lámpara de Deuterio, 2) sistema de lentes, 3) Chopper, 4) celda, 5) red de difracción y 6) ordenamiento de fotodiodos (Hewiett Packard)

Sistema de toma Y !Jrocesami ento de datos El resultado del ensayo cromatográfico es, por un lado, la obtención de 6acciones separadas de los componentes de la muestra, y por el otro, la de un gráñco o cromatograma, de cuya interpretación pueden extraerse conclusiones cualitativas y cuantitativas. Este regstro y la eventual manipulación se obtiene a partir de la seaal proveniente del detector por medio de un sistema de toma y procesamiento di: datos entre los que podemos citar:

Registrador gráfico, que convierte la señal en un gráfico del tipo XY. Integrador, que permite no solo obtener un regstro gráfico (cromatograma) sino también su tratamiento matemático para el cálculo de concentraciones. Computadora. Básicamente, el integrador es una computadora de uso muy especifico. En este punto nos referimos a UM computadora de tipo personal, que permite con el software adecuado tanto el registro gráfico de cromatogama como los cálculos apropiados, la manipulación de los datos, el almacenamiento de ensayos, generación de reportes, e incluso el manejo global de varios cromatografos. Ref (12)

7

1.3 PARÁMETROS CROMATOGRAFICOS

Factor de Capacidad: Es la medida de que tanto son retenidas las moléculas de la muestra por la fase estacionaria en una separación , k debe ser mayor a cero, ya que si k 4 , el pico de interés saldrá a to .siendo el optimo 2 5 k 5 10.

k’=t , IG, - l

Selectividad: Describe la retención relativa de los componentes en una mezcla, indicando la separación de los picos sin considerar el ancho del pico, :;¡endo útil para caracterizar diferentes compuestos. Si los tiempos (ti y ta), son diferentes hay mayor separación cromatográfm

a= ( t r - to) /(ti - to) Numero de Platos teóricos: La fase estacionaria de una columna es caracterizada, además del factor de capacidad y la retención relativa, mediante la eficiencia de la columna o cantidad de platos teóricos. El valor de n es dependiente de la sustancia que está siendo anaiiiada y de las condiciones de operación tales como la velocidad de flujo, la temperatura, la naturaleza del empaque (forma y tamaño) y la uniformidad de éste, Ai igualar la cromatograña con una dest:ilación, se puede definir un plato teórico como un equilibrio en la destilación; a mayor cantidad de platos teóricos hay mayor retención y más agudos son los picos Para CLAR 1000 platos teóricos son suficientes.

n = 16 ( t / w )’

Resolución: Cuando se tienen mezclas de solutos o analitos , nos indica, que tan separados están, en función de los tiempos de retención y los anchos de pico. R = 1.5 nos indica que la separación será del 97%, R = 2 es el caso ideal.

R = 2 (tr -ti) ! ( w, + w2)

Factor de Coleo: Es la simetría que tiene el pico cromatográfico , T = 1, dará una campana de Gauss perfecta y T diferente de 1 indica problemas de retención.

T = wo.05 l2f

Ref (2).

R

1.4 DISOLUCIÓN GENERALIDADES

Esta prueba se basa en la determinación cuantitativa del Prinnpio activo, que se encuentra en soiución, después de un determinado tiempo de agitación de ia forma EarmacRitica en un medio de disohción adecuado.

Recomendaciones Especiales Utilizar d d i s o i m indicado en la monografia del producto. Si el medio de disolución es una solución reguladora, ajustar a 2 0.05 unidades dei pH especificado en la monogrHfia mespondiente. Evitar la presencia de gases disueitos en el medio de disulucibn. Ninguira parte del equipo, incluyendo el medio ambiente cercano a éste, debe contribuir significativamente con movimiento, agitación o vibración ajena a la que produce la rotación del agitador

Procedimiento Colocar el volumen del medio de disolución indicado w a cada producto. en el vaso del awato. calentar Y permitir que la temperatura del medio se equilibre. Colocar la o las unidades de dosis en el aparato, sin provocar burbujas y operar el aparato inmediatamente a la velocidad y tiempo indicados en la monograña del producto correspondiente. Cuando se utiliza el aparato 2, la muestra se deposita en el fondo de vaso antes de iniciar la rotación de la paleta. Cuando transcurra el tiempo establecido, tomar la alicuota necesaria para la determinación en la zona intermedia emre la superficie del medio de disolución y la parte superior de la paleta y a no menos de I O mm de la pared del vaso.

Si dos o más tiempos de muestreo son indicados en la monograña específica del producto, tomar la alicuota solamente en los tiempos establecidos dentro de una tolerancia de & 2 por ciento. Cuando las cápsulas o el recubrimiento de las grageas interfieran en el análisis, remover el contenido de no menos de 6 cápsuias, disolver las cápsulas vacías en el volumen del medio de disolución indicado en la monografia del producto, diluyendo adecuadamente, lo cual seMrá como blanco de corrección. El factor de corrección no debe ser mayor del 25 por ciento del. contenido indicado en el marbete.

Interpretación A menos que la monograña del producto correspondiente indique una especificación especial, realizar la prueba con 6 muestras y ninguno de los resultados individuales deberá ser menor que Q + 5 por ciento. Si esto no se cumple, repetir la prueba con 6 muestras adicionales y el promedio de los 12 resultados debe ser igual o mayor de Q y ninguno de los resultados individuales será menor de Q - 15 por ciento. Si esto no se cumpte, probar 12 muestras más y el promedio de las 24 determinaciones debe ser igual o mayor que Q, no más de dos de las mumas tendrán resultado menor de Q - 15 por ciento y ninguna determinación sera menor de Q - 25 por ciento. En donde Q esla cantidad de mgdiente activo disuelto. mdicado para cada producto en su monografia, expresado en por ciento de la cantidad mdicada en el marbete; 5, 15 y 25 por ciento, son los porcentajm de la ontidad de principio activo indicada en el marbete. Ref (1)

in

2) ORJETNO GElYERAL Imptementar la técnica de cmmatografia de alta molución CLAR en análisis de mediamenios como método para la vaioración de los principios activos así la niantiiicación de sustancias relacionadas

ORJETNOS PARTICiJLARES Determinar la d@a.c¡ón con respecto al tiempo de los principios actiws contenidos en los medicamentos

Cuamificar la absomón in vitro del principio activo (técnica de disotución) para formas de dosicación sólida

Optmiizar el procedimiento de andisis por CLAñ de un medicamento antiulteroso niyo principio activu es ei omq>razol.

11

SERWCIO SKIAL

3) METODOLOGIA UTUiZADA

&TODO

SERVXIO SOCIU

3.1 PROTOCOLO DE ESTABFLIDAD

Para el cumplimiento de los obietiws se reatiz6 un estudio de estabiüdad para el Omeprazol, el cud unnprende las siguientes características:

Condición TA. 30 “C

40°C 75% J3.R

1) Nombre del principio activo:

2) Forma fmacarticd:

O 1 2 1 3 1 4 1 5 6 X I 1 I X

X 1 x 1 X X 1 x 1 I X

3) Envase para el estudio:

4) Número de lote seleccionado:

5) Número de unidades seleccionadas:

6) Tiempos de m e w :

omeprazol

Microesféms con capa entérica equivalente a 2Omg de Omeprazol contenidas en cápsuias de gelatina dura

Cápsulas, F m m s de Vidrio ámbar de I6 mL. Con 7 cápsulas con mimesferas.

6J38

13 frascos con 7 cápsulas cada uno.

7) Pruebas a dim.

0 Valoraciá S u s t a a c i a s ~ o ~ Diwilución.

17

EqWpO

Disoiutm Distek TCS O200 Potenciiimmo Balanza Analitica

o Cromafografo de líquidos HEWLETT PACKPú1D serie 1050 Columna de acero inoxidabte Hyper4 ODS

Maierial

Vasos de precipitado Mmaces aforados 100,SO y 25 mL Pipetas graduadas 10,5 y 2 d. Pipetaspastar Propipetas P d a con agitación Moscasmagnéticas Embudos Espátula Kin de filtración Membranas de filtración 0 . 4 5 ~ Jeringas

Reactiws

Omeprazoi sustancia de referencia

Fosfato monobásico de sodio 9 Fosfato dibásico de sodio

Fosfato m i c o de sodio Aguadedada Ácido dorhidnco Hidróxidodesodio

AceronanlogradoHPLC

l A

4) ACTIVIDADES REALIZADAS

4.1 CARACTERIZACI~N DEL PRMCIPIO A4X"O

OKlEPRAZOL

h

Ci,Hl+V,08 PM 345.42

Descripción: El Omeprazol es un polvo blanco a blanco grisáceo que fimde c m descomposición a 155 "C, es una base débid, fácilmente soluble en etano y metwol, ligeramente soluble en acetom e isopropanol y muy tigeramante soluble en agua, la estabilidad del Cmeprazol esa en función del pH, esto es, se degrada ripidamente en medio ácido, pero tiene una estabilidad aceptable en condiciones aldim.

4.2 SELECCI~N DELTIPO DE CLAR

GUfA PARA LASELECC16N DEL TIPO OE C U R

poiares (hemno a CHCb) a grande I

De acuerdo con la tabla mterior y E las características dei farmam se dende trabajar con fase inversa y columna Cis

4.3 SELECCI~N DE LA FASE MÓM,

control de la ionizacióri

Fase reversa

Fase reversa de apareamiento iónico

Silicagel no modificada

Intercambio iónico

Intercambio iónico

Silicagel no modificada

Columna Ouiral

Guia para la selección de la fase móvü

.. . ( &ido f&fónco hast; pH. 3-35) -

cl8- C S Solución reguladora. 30 mM Vietilamina

alqdsulfonatos pH 3,5 bases

Alternativa Cs ~ CN tetraalquilamonio p H 1.5 ácidos

CN - Mi; Solventes no polares Silica SAX - SCX Solución reguladora. base silica o poliménca

Preferida Cis Agua - MeOH

pH. Controlado fuerza iónica controlada

Acuosos (GFC) Orgánicos (G’C)

Base silica o polimérica

Silica Solventes no polares

Ouiraies Acuosos

iónicos e ionizables

Lipofilicos insolubles er

aminoácidos Péptidos derivados de ácidos nucleicos

Estereoisómeros

Metodos de elección Fase reversa

Fase reversa

‘ Compuestos quiraies I C I , - -__-_ Solucion renulaaora

Fase re\ m a Colunina .Amino I SH: - .. . - _.

--L.

La fase móvil se seleccionó de acuerdo al cuadro ariterior tomando en cuenta el tipo de CLAR (Fase reversa) y la columna C18.

4.4 DEFINIR EL SISTEMA Tipo y caractensticas de la columna, fase móvil, caudal, detector y masa a inyectar

Columna Silicagel químicamente unida a ODS (C,S). FaseMóvil Mezclas Buffer de fosfatos - AcN Caudal 1.4 mi I min. Detección UV Muestra 0.25 pg en 1 mi

La primera inyección se debe efectuar con UM caritidad considerable de muestra para verificar la elución del anaiito y as1 evitar conñindu el pico buscado con otros picos que puedan eluir en el volumen muerto o en el ensayo.

Longitud de onda correspondiente al máximo de absorción 280m

4.5 FACTORES CROMATOGRMCOS ESPEC~ICOS DEL OMEPRAZOL Obtenidos con el estándar (ver cromatograma anexo.)

Factor de Capacidad: k’ = t, / to-1 k’= 11.:195/2 - 1 = 11.395

Numero de Platos teóiicos:

n = 16 ( t / w )* n = 16(1.1.39510.555)2 = 6744.7

Factor de Coleo:

T = w,,.,,~ 12f T = 0.527/2(0.33) = 0.7984

17

. . . .

IAU

. -,. ~.

., ., . . . . . . . . . .

. . . .

22

200

160 lloi

, . ,. . . . . .

ad i

1 1

601

4 4

1 2 oj

020-0401.D: VWD, Wavelength=280 nm

. . . . . . . . . . . . . . . . . . < ,. . . . . . , . . . . -: . . . . . . . . . .

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I . '

. . .

4.6 APLICACI~N DEL MÉTODO PROPUESTO

a) STJST~CIAS RELACIONADAS PAR4 MA TERTA PRIMA

1 ANALISIS PARA OMEPRAZOL MATERIA PRIMA I

j Método propuesto

' Detector UV de

a 280 nrn

Face móvil ' buffer de fosfatos- AcN

(3:l)

i

i

i Veloc;ad

i k': no menor a 6.0 in : no menor a 5000 1 T: no imayor a 1.5

de 1 flujo '1.4 rnllrnin

1x

A) Sustancias Relacionadas (Método interna)

omeprazol, contiene no menos de 98.0 por ciento y no más de 102.0 por ciento de Ci7Hi9N3O3S, calculado en base seca. Envase y almacenamiento. Conservar en contenedores bien cerrados y almacenados en un lugar frío, protegido de la humedad. Estándar de referencia USP: USP Omeprazol RS.

Cromatografía Líquida de Alta Resolución Diluvente: Usar fase móvil.

Buffer de fosfatos. fase iiióvil. solución estabilizadora Y sistema cromatoeráñco: Proceder como se marca en el ensayo.

Solución de Dnieba: Disolver una cantidad exactamente pesada de Omeprazol en el diluyente para obtener una solución que contenga aproximadamente 0.16 mg/r&. (Nota: Preparar la solución en el momento).

Procedimiento: Inyectar volúmenes iguales ( 40 pL) de la solución de prueba y del diluyente al cromatografo, y permita que la solución de prueba eluya por no menos de 2 veces el tiempo de retención del onieprazol Registrar los cromatogramas y medir la respuesta de los picos. Calcular el porcentaje de cada impureza en la porción de omeprazol mediante la fórmula:

100 ( r , / r J

En el cual r , es la respuesta del pico de cada impureza y r ~ es la suma de las respuestas de todos los picos no mas del O 3 por ciento de cualquier impureza #debe encontrarse y la suma de todas las impurezas no debe ser mayar que 1 por ciento.

-seyo

Buffer de fosfatos: Disolver 0.725 g de fosfato monobásico de sodio y 4.472 g de fosfato dibásico de sodio anhidro en 300 mL. de agua, Diluir con agua a 1000 mL . y mezclar. Diluir 250 mL de esta solución con agua a 1000 mL.

Fase móvil: Preparar UM mezcla filtrada y desgasscada de butfer de fosfatos y acetonitdo (3:l). Hacer ajustes si es necesario.

Diluyente: Preparar una mezcla de barato de sodio 0.01 M y acetonitdo (3: 1)

Preparación del estándar Disolver una cantidad exactamente pesada de Omeprazol SR USP en el diluyente, y diluir cuantitativamente para obtener una solución con UM concentración conocida de aproximadamente 0.2 mg/mL

Preparación del ensayo: Transferir 100 mg de Omeprazol pesados exaciamente a un matraz volumétnco de 50 mL. , disolver y atorar con el diluyente, mezcla. Transferir 5 mL. de esta solución a un matraz volumétnco de 50 mL., aforar con el diluyente y mezclar

Sistema de solución estabilizadora: Diluir un volumen de la preparación estándar can el dituyente para obtener una solución que contenga aproximadamente 0. 1 mg de Omeprazol SR USP por mL.

Sistema cromatográfico: El cromatógrafo de líquidos está equipado con un detector de 280 nm, y una columna de 4.6 mm X 15 cm que contiene un empaque L7 de 5 prn. La velocidad de flujo es de 0.8 mL. Condiciones de operación del cromatógrafo: El factor de capacidad k‘, no debe ser menor de 6.0, la eficiencia de la columna no debe de ser menor de 3000 platos teóricos, el factor de coleo no debe de ser mayor de 1.5 y la desviación estándar relativa por inyecciones repetitivas no debe ser mayor que 1.0 por ciento.

Procedimiento: Por separado inyectar volíimenes iguales (2OpL.) de la preparación estándar y de la preparación de ensayo al cromatógrafo, registrar los croniatogramas, y medir l,a respuesta para el pico mayor. Calcular la cantidad en mg de C,,Hi9N303S en la porción de omeprazol tomada mediante la fórmula:

500 C ( r u / rs)

En el cual C es la concentración en mg/mL. de Omeprazol SR USP en la preparación estándar, y r y y r, son las respuestas de los picos obtenidos de la preparación de ensayo y la preparación estándar, respectivamente.

B) Sustancias Relacionadas (Método propuesto)

Cromatograña de líquidos. Solución reguladora, Solución de adecuabiiidad del sistema y Sistema cromatogáfim. Proceder como se indica en la valoración. Fase móvil: Mezclar la solución reguladora - acetonitnlo (3: I). Hacer los ajustes necesarios. Solución de la muestra: Pasar 20 mg de la muestra, a un matraz volumétrico de 25 mL., disolver y Uevar al aforo con la fase móvil, mezclar. Transferir 5.0 mL (de esta solución a un matraz volumetrim de 25 mL diluir y Uevar al aforo con la Fase móvil. ( la solución debe a.er preparada al momento de su uso). Procedimiento: Inyectar volúmenes iguales (40 ILL.) de la solución de la muestra y la fase móvil en el crornatógrafo, y permitir que las soluciones eluyan por no menos de 2 veces el tiempo de retención del omeprazol, registrar los cromatogrmas, y medir los picos respuesta El factor de capacidad k’, es no menor de 6.0, la eficiencia de la columna es no menor de 5000 platos teóricos, y el factor de coleo es no mayor de 1.5. Calcular el porcentaje de cada impureza en la porcicm del omeprazol tomado mediante la fórmula:

IOO(riirs)

en donde r es el pico de respuesta de cada impure:% y r I es la suma de todos los picos respuesta: no más de 0.3 ‘YÓ de cualquier impureza individual y la suma de todas las i m p u r w es no mayor de 0.5 %.

.%Qb?CIO ,%f21,4L

C) Valoración (Método propuesto)

__ _- -- Valoración para materia pnma

método propuesto

Deiector üv con arreglo de diodos

Fase #?stacionaria Hyperisil ODS C18

~ 200X4.6mm

Fase móvil

- ~ Velocidad de

~ k': no mayor a 2.0 ~ n: no menor a 5000 j T: no mayor a 1.0

I

.-

71

SER 1lCiO SOCiiu.

Cromatografia de Liyuidos Solución reguladora: Disolver 0.725 g de fosfato cle sodio monobásico y 4.472 g de fosfato de sodio dibásico en 300 mL de agua, diluir con agua a 1000 mL. y mezclar. Diluir 250 mL de esta solución con agua a 1000 mL .

Fase móvü: Prepara una mezcla filtrada y desgasificada de la solución reguladora - acetonitdo (2:l). Hacer los ajustes necesarios.

Preparación de referencia: Pasar 25 mg de Omeprazol Sref a un matraz volumétrico de 25 mL, disolver y llevar ai aforo con fase móvil, Transferir 5 mL a un matraz volumetnco de 25 mL , mezclar y llevar al aforo con fase movil. Esta solución contiene aproximadamente 0.2 n@mL de Omeprazol.

Preparación de la muestra: Pasar 25 mg de la mu'estra a un matraz volumétrico de 25 nL, disolver y llevar al aforo con fase movil, Transferir 5 mL a un matraz volumétrico de 25 mL , mezclar y llevar al aforo con fase móvil.

Solución de adecuabilidad: Diluir 5 mL de la preparación de referencia con diluyente y llevar a I O mL , para obtener una solución que contenga alredeior de O. 1 mg de Omeprazol Sref por d.

Condiciones del equipo: Columna de 4.6 x 200 n q empacada con microparticulas de silica porosa de 5 pm de diametro recubiertas con octadecilsilano C - 18; detector UV a 280 nm: Flujo 1.4 d min.

Procedimiento: Inyectar al cromatógrafo la solución de adecuabilidad, y registrar los picos respuesta. El factor de capacidad, k', es no menor de 2.0, la eficiencia de la columna es no menor de 5000 platos teóricos, el factor de colea en no mayor de 1.0 %. Una vez cumplidas las condiciones antenores inyectar por separado volúmenes iguales de 5 p i de la preparación de referencia y la preparación de la muestra, obtener sus correspondientes cromatogramas y calcular sus áreas. Calcular la cantidad, en mg, de Omeprazol en la muestra analizada mediante la fórmula:

125C(r,i r, f

en donde C es la concentración, en nig/mL , de Omeprazol SRef en la preparación de referencia, r. y r, son los picos respuesta obtenidos de la preparación de la muesua y la preparación de referencia, respectivamente.

77

b) IMLORAC1d.V P.M.4 PRODUCTO T m I N A D O

Fase estacionaria Hypersil ODS C18

200 x 4.6 nm - i

sometido a condiciones de estabilidad acelerada

- I Detector UV con

arreglo de diodos a 280 nm -

Fase móvil Soluciijn reguladora

' de Fosfatos-acetonitnlo (23)

flujo Velociada 1.4 milmin de I _____I--. , K: no mayor a lo1 ~ n: no menor a 5000

T: no mayor a 1 .O

7 7

A.- Valoración (método propuesto) 95.0 - 105.0% de lo indicado en el marbete ( 19.0 - 21 O mg/ cápsula)

&lliJQ

Cromatógafo de Liquidos equipado con detector dtravioleta a 280 tun, y columna de acero inoxidable Hypersil ODS ( 200 x 4.6) mni, empacada con microparticulas de sil ica porosa de 5 Nm de diámetro, recubienas con octadecilsilano.

Reactivos Omeprazol de pureza conocida Acetonitnlo para cromatografia Fosfaro dibásico de sodio grado reactivo Fosfato monobasico de sodio grado reactivo Agua destdada

Fase móvil. Solución reguladora de fosfatos. Disolver aproximadiunente 0.828 g de fosfato monobásico de sodio y 4.472 g de fosfato dibásico de sodio y llevar a 1000 mL c o n agua destilada. Tomar una alícuota de 250 mL y aforar a 1000 mL con agua destilada. Mezclar dos volúmenes de la solución reguladora y 1 volumen de acetonitdo, filtrar por malla de 0.45 pm y d e s g d c a r

Preoaración de referencia Pesar con exactitud 10 mg de Omeprazol -sustancia de referencia- y transferir a un matraz volumétnco de 50 mL. Disolver y aforar con la Fase móvil. (Esta solución contiene aproximadamente 0.2 mg/mL. de omeprml).

Preoaración de la muestra De una nuestra homogénea del contenido de no mems de 20 cápsulas, pesar aproximadamente el equivalente a 20 mg de omeprazol y transferir a un matraz volunietnco de 100 mL, adicionar aproximadamente 60 mL de Fase móvil y agitar durante 15 minutos, llevar a volumen con la fase móvil y mezclar. Filtrar una porción de la solución a traves de una membrana de 0.45 pm de diámetro de poro (Esta solución contiene aproximadamente 0.2 mg/mL de omeprazol). Nota. Ambas soluciones deben ser preparadas al momento de su uso y evitar el contacto prolongado con la luz.

Procedimiento Ajustar los parámetros de operación de tal forma que con un flujo aproximado a 1.4 mLimin. Proporcione un tiempo de retención de 4.3 min. pars el omepraj:ol, y obtener cromatogramas Inyectar por quintuplicado volúmenes iguales de la preparación de referencia, y calcular el coeficiente de variación relativo, el cual no debe ser mayor al 2.0%. Una vez cumplidas las condiciones anteriores, inyectar por separado la preparación del patrón de referencia y

la preparación de la muestra (20$.), y medir el pic80 respuesta del omeprazol. Forma de cálculo:

% de Omeprazol= SOo(Am/As)Cs donde: Am = área bajo el pico obtenido en el c r o m a t o g w con la preparación de la muestm. As = área bajo el pico obtenido en el cromatograma con la preparación de referencia. Cs = Concentración de omeprazol en la preparacióit de referencia dado en mg/mL.

Cada cápsula debe contener de 19.0 a 21.0 ntg de Omeprazol.

SERWCIO Socú1~

c) DISOLUCIbNPARA PRODUCTO TEF&L"ADO

Andlisis para omiiprazol, producto teminado sometido a condiciones de estabilbad acelerada

~

DISOLUCION I

M6todo propuesto Metodo inierno

ADarato I1 I ! Amrato /I I ~

~

I Paletas,USP I a 37% Paietas,üSP

a 37OC

~ .-I

Medio y volumen de disolucidn

Fase 1500 ml FGS 2 hr

Medio y volumen de disoluci6n

Fase 1:750 ml HCI 0.1 N 2 hr fase 2:250 mi Fosiato tnbdsiw

I -1 -

Mudrear tomar alicuotas

timadas por membrana o 45 mcm

~ ~J Analizar (HPLC) I

1 Muestrear

~ tomara: 1 ,' filtradas por membrana ~ 0.45 mcm

A.- Disolución (Método propuesto)

Condiciones cromatográfcas Columna Hypersil ODS C18 Fase móvil: Solución reguladora: Acetonitdo ( 2 1) Velocidad de flujo I .4 mL/min. Volumen de Inyección 20&. h = 280 nm

Solución redadora Pesar y disolver en agua 0.828 g de fosfato monobásico de sodio (NaH2P04) y 4.472 g de fosfato dibásico de sodio (Na&E”P4), transferir a un matraz de 1000 mL y Uevar ai volumen con agua destilada. Tomar una aiicuota de 250 mL y aforar a 1000 mL con agua.

Condiciones de disolución Método II (Paletas) Velocidad: 100 rpm.

Medio de disolución 1 Acido Clorhídrico (HCI) 0.1 N pH 1.2

Medio de disolución 2 Fosfato ttibásico de sodio (Na3P04) 0.2 M pH 6.8 :? 0.1 Temperatura 37°C 2 0.I”C

Procedimiento 1) En los seis vasos del disolutor. adicionar 750mL de HCI 0.1 N DH 1.2 2) introducir las cápsulas que contienen Omepraz,ol e iniciar la disolución a las condiciones antes descritas

3) Transcurrido el tiempo adicionar 250 mL de Na.,P04 0.2 M pH 6.8 y continuar la disolución durante 45

4) Para cada uno de los vasos, tomar una alicuota de la disolución y filtrarla por membrana 0 . 4 5 ~ 1 5) Inyectar las seis muesiras en el cromatógrafo y inedu el pico de respuesta del Omeprazol.

PreDaración de la Muestra Dentro del vaso de disolución se tiene una cápsula que contiene 20 mg de Omeprazol. disueltos en 750 mL de HCI O. 1 N pH 1.2 y 250 mL de Na3P04 0.2 M pH 6.8, por lo que se tiene un volumen total de 1000 mL. (Esta solución contiene aproximadamente 0.02 mg/mL de omeprazol).

Preparación del Estándar Pesar con exactitud aproximadamente 25 mg de Omeprazol -sustancia de referencia- y transferir a un matraz. voluméttico de 25 mL. disolver y aforar con la Fase móvil, tomar una aücuota de 5 mL y transferir a un matraz volumétrico de 25 mL. y aforar con la Fase móvil, tomar UM alicuota de 5 mL y transferir a un matraz voluméttico de 50 mL. y aforar con la Fase móvil. (Esta solución contiene aproximadamente 0.02 mg/mL de omeprazol). inyectar por quintuplicado la muestra en el cromatcigrafo y medir loa picos de respuesta del Omeprazol..

por un periodo de 2 horas

minutos más.

SERITCIO SOCIAL

B.- Disolución (Método interno)

Condiciones croniatográiicas Columna Hypersil ODS C18 Fase móvil: Solución reguladora: Acetonitdo (2:i) Velocidad de flujo 1.4 mWmin. Volumen de Inyección 20&. h = 280 nm

Solución redadora Pesar y disolver en agua 0.828 g de fosfato monobiisico de sodio (NaKzPO,) y 4.472 g de fosfato dibásico de sodio (NazHP04), transferir a un matraz de 1000 mL y llevar al volumen con agua destilada. Tomar una alicuota de 250 mL y aforar a 1000 mL con agua.

Condiciones de disolución Método I1 (Paletas) Velocidad: 100 rpm. Temperatura 3 7 T 2 0.1'C

Medio de disolución 1 Fluido Gástrico Simulado (FGS) Adicionar 7 mL. de HCI + 2 g de NaCl para 1000 nL de HzO Temperatura 37°C 1. O.l°C

Medio de disolución 2 Fosfato dibásico de sodio (Na2HP04) 0.235 M pH 6.8 t 0.1 Temperatura 37°C 2 O.IoC

Medio de disolución 2 Fosfato dibásico de sodio (Na,HPOJ 0.235 M DH 6.8 + 0.1 - .~ Temperatura 37°C 2 O.IoC

Procedimiento Para cada vaso I ) Adicionar 500 mL de FGS 2) Adicionar las cápsulas que contienen Omeprazc'l e iniciar la disolución a las condiciones antes descritas por

un periodo de 2 horas 3) Transcurrido el tiempo adicionar 400 mL de Na:JiE"P4 0.235 M con temperabra regulada a 37°C y pH 6.8,

continuar la disolución durante 30 minutos más. 4) Para cada uno de los vasos, tomar una alícuota de la disolución y ñitrarla por membrana 0 . 4 5 ~ 5) Inyectar las muestras en el cromatógrafo y mediir el pico de respuesta del Omeprazol.

Preoaración de la Muestra Dentro del vaso de disolución se tiene una cápsula que contiene el equivalente a 20 mg de Omeprazol, disueltos en 500 mL de FGS y 400 mL de NaZHPO4 0.235 M, por lo que se tiene un volumen total de 900 mL. (Esta solución contiene aproximadamente 0.0:!2 m g h L de omeprazol).

Preoaración del Estándar Pesar con exactihid aproximadamente 22 mg de Omeprazol -sustancia de referencia- y transferir a un matraz volumétrico de 100 mL. disolver y aforar con la Fase móvil, tomar una alícuota de 5 mL y transferir a wi matraz volumétrico de 50 mL. y aforar con la Fase móvil. (Esta solución contiene aprohadameute 0.022 mg/mL de omeprazol). Inyectar por quinhiplicado la muestra en el cromatá'grafo y medii los picos de respuesta del Omeprazol..

4 S17STANCIA.Y RELACIONADAS PARA PROLXKTO TERMINADO

1- Método T u e s t o 1 j Fase iestacionaria ; Hypenil ODS C I8

200 x 4.6 mm - Fase móvil

i flujo I .4 mlfmin

SER^ icio SOCIAL

No mas de 0.3% de cualquier impureza individual y la suma de todas las impurezas no es mayor de 1.0% Condiciones cromatográficas: Proceder como se indica en la valoracion

Fase móvil: Mezclar 3 volúmenes de la solución reguladora de fosfatos y 1 volumen de acetonitrilo , filtrar por malla de 0.45pm y desgasificar.

Preparación de la muestra: De una muestra homogeneg pesar el equivalente a 20 mg de omeprazol y transferir a un matraz volumétrico de 25 mL., adicionar 20 mL de la fase móvil y agitar mecanicamente durante 15 minutos hasta disolución completa, aforar con la fase móvil. De la solución anterior tomar una alícuota de 5 mL, transferir a un matraz volumétrico de 25 mL , mezclar y aforar con la fase móvil. Esta solución contiene aproximadamente 0.16 mgimL de Omeprazol.

Procedimiento: Inyectar volúmenes iguales de 40p.L de la preparación de la muestra y de la fase móvil, registrar el cromatograma durante 30 minutos y medir el área bajo los picos, omitiendo la respuesta debida al frente del solvente. Calcular el porcentaje de cada impureza en la porcióri de Omeprazol mediante la fórmula:

100W&)

donde: Ai es el área bajo el pico obtenido en el cromatograma para cada impureza At es la suma de las áreas de todos los picos en el cromatograma.

79

5) OBJETIVOS Y METAS ALCANZADOS

Omeprazol. Los objetivos fueron alcanzados ya que se mejoró el método actual del análisis del principio activo :

6) RESULTADOS Y CONCLUSIONES

6.1 OPTIMUACIÓN DEL SISTEMA Especificidad del sistema.

1 A R t A DF RESPt FSTA DFI FSTAhDAR I DFGRAD4CIOh’BASICA i OXIDACIOK .. 1100% I 93:- NO exste pico g

Se logró degradar la muestra, lo cual indica que no existe interferencia de los productos de degradación para la cuantificacion de Omeprazol (ver cromatogramas del anexo A).

Comparación de condiciones cromatogr(ificas (Realizado al 6nal del estudio)

Retención Relativa: fase móvil Buffer - AcbL&l)

RR= Área xi I Área Total

Con esta fase se cuantifican 8 picos respuesta

Retención Relativa: fase móvil Buffer - A c F W

Con esta fase se niantifican 5 picos respuesta.

(ver cromatogramas del anexo B).

6.2 COMPARACION DE &TOWS

Adecuabilidad del método

(2 1)

[METODO I DETFR\lMACIOMS I RESiJLTADOS 1 ESPECFICACIOYES

(B) n: 7517.71 n: no menor a 3000 T: O 665

k': no menor a 6.0 I n: no menor a 5000 cromatotgáfica k': 11.419 1 n: 6030.12 1 T 0.5938

Interno 1 Pureza cromatogdca I Y: 4.552

(ver cromatogramas del anexo C)

6.3 CARACTERIZACIÓN DEL PRINCIPIO ACTIVO

6.4 RESULTADOS DEL ESTUDIO DE ESTABILIDAD

Tem eratura Ambiei

Valoración 224.271eo 98.48 D i s d u c i ~ terno 98.12 90.0

Disolución Pro ueoto 98.31

6.5 CONCLUSIONES Las sustancias relacionadas no interfieren en la cxantificación del principio activo. La mejor resolución de los picos para la cuantiíicación de las sustancias relacionadas se obtiene con la fase móvil del método propuesto, buffer de fosfatos - AcN (3: I) Los dos métodos de disolución son aptos para dicho análisis. La técnica por CLAR óptima para la cuanti6c;ición del Omeprazol en pruebas de valoración y disolución es la Fase móvil, Solución reguladora : AcN (:2:1) debido a que con esta fase se disminuye el tiempo de corrida y por io tanto, disminuye el costo del anitisis.

7) RECOMENDACIONES

i " R e a l ¡ con más "lotes" cada una de ias actividades realizadas. P Validar el método conforme a la CiPAM pam que pueda ser liberado.

8) BlLlOGKKAFlA

1.- -COMISION PERMANENTE DE LA FARMACOPEA DE LOS ESTADOS L’NIDOS MEXICANOS, “ FAñMACOPEA DE LOS ESTADOS UNIDOS MEXICANOS” Sexta edición , México 1994

2.- HARRIS DANIEL C. , “ANÁLISIS Q W C O CUANTITATIVO Ed. Iberoamerica, México D.F. 1995

3 -REMMGTON, “FARMACIA” 17” Edición, Ed. Panamericana Buenos Aires Argentina.1990

4.- SNYDEK ” INTRODUCTION TO MODERN LIQUID CHROMATOGRAPHY”, Second Edition, Ed. Wilev Interscience.

5 . - UNITED STATES PHARMACOPEIAL CONVENTION. DIC. ‘‘ USP. NF. THE UNITED STATES PHARMACOPEIA THE NATIONAL FORMLTLARY Printed by Rand Mc Nally. NF 18 USP 23

6.-COMISION PERMANENTE DE LA FARMACOPEA DE LOS ESTADOS üNIüOS MEXICANOS ‘‘ FARMACOPEA DE LOS ESTADOS UNIDOS MEXICANOS” Sexta edición Mexico 1995 Suplemento.

7.- ,MARTINDALE “ THE EXTRA PAHAiUvUiCOPEIA” Twenty-ninth Edition, Edited by James E.F. Reynolds, London the Pharmaceutical Press 1989.

8.- CASSIDY, “TECHNIQUE OF ORGANIC CHEMISTRY “ vol. X “ FUNDAMENTALS OF CHROMATOGRAPHY” Ed. Intercience Publisherir, INC., New York 1957.

9.- HETTiMA“ , “CHROMATOGRAPHY Ed. Reinhold. Publishing Corporation., London 1961

10.- BAN= “PHARMACEUTICAL DISSOLUTION TESTING” vol. 49 Ed. Marcel Dekker, INC. U.S.A. 1992.

11 .- WATERS notas para resolución de problemas men HPLC

12.- Quattrochi, 0.A et al. ”INTRODUCCION A :LA HPLC, APLICACIION Y PRÁCTICA” Editorial Artes gráiicas Farro, Argentina 1992.

Anexo (A)

a

~ - ~ _ _ __-_-- AU 007-0401.D: MWD A, Sig=280,4 Ref=450,80

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260,

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Anexo (B)

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005-0501.D: MWI) A, Sig=280,4 Ref=450

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SERVICIO SKIA ,B

Anexo ( C )

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