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UUUNNNIIIVVVEEERRRSSSIIIDDDAAADDD AAAUUUTTTOOONNNOOOMMMAAA MMMEEETTTRRROOOPPPOOOLLLIIITTTAAANNNAAA UNIDAD: IZTAPALAPA. DIVISIÓN: CBS. GRADO: LICENCIATURA EN HIDROBIOLOGÍA. TITULO DEL PROYECTO DE INVESTIGACION: ESTUDIO DE LA FACTIBILIDAD DEL TRATAMIENTO DE AGUA Y SEDIMENTO D E LA PRESA JOSE ANTONIO ALZATE Y SUELOS AGRICOLAS QUE LA RODEAN. TITULO DEL TRABAJO DEL S.S: ESTABLECIMIENTO DE UN PROTOCOLO PARA LA EVALUACION DE BIOACUMULACION DE METALES PESADOS CON DAPHNIA PULEX DE LA PRESA JOSE ANTONIO ALZATE. NOMBRE DEL PARTICIPANTE: GUERRERO ROMERO LUIS RAMON MATRICULA: 97334124 TELEFONO: 56331548-56336560 NOMBRE Y FIRMA DEL ASESOR: PATRICIA RAMIREZ ROMERO LUGAR Y FECHA DE REALIZACIÓN: LABORATORIO DE ECOTOXICOLOGIA DEPARTAMENTO DE HIDROBIOLOGÍA DIVISIÓN DE CIENCIAS BIOLÓGICAS Y DE LA SALUD DEL 5 DE SEPTIEMBRE DEL 2004 AL 26 DE MAYO DEL 2005. CLAVE DE REGISTRO:H.016.04

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INDICE CARTA OFICIAL MEMBRETADA…………………………………………….. 3 RESUMEN…………………………………………………………………………. 4 INTRODUCCION…………………………………………………………………. 5,6 Área de estudio………………………………………………… 6,7 Daphnia Pulex………………………………………………..... 8 Metales…………………………………………………… … 9,10 OBJETIVOS………………………………………………………………………... 11 METODO……………………………………………………………………… …… 11 Medio EPA……………………………………………………… 12 Sistemas de cultivo del cladócero Daphnia Pulex………….…. 12

a) Preparación del agua………………………………………….. 12

b) Siembra del cultivo de Daphnia…………………………....... 12

c) Cuidado y alimentación………………………………………. 13 d) La cosecha…………………………………………………..... 13 BIOENSAYOS………………………………………………………………………. 13 a) Bioensayo Preliminar……………………………………...... 13 Fase de acumulación o intoxicación Fase de desintoxicación b) Bioensayo Definitivo…………………………………......14, 14 Fase de acumulación o intoxicación Fase de desintoxicación: d)Digestión de Organismos………………………………… ACTIVIDADESREALIZADAS……………………………................... ..........14,15,16

OBJETIVOS Y METAS ALCANZADAS…………………………………………. 16

RESULTADOS Y CONCLUCIONES:…………………………………………….. 17 CRITERIOS DE EVALUACION:…………………………………………………. 17 BIBLIOGRAFIA:………… ………………………………………………………….18,19,20 ANEXO 1, MAPAS…………………………………………………….…………21-24

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CARTA OFICIAL MEMBRETADA Carta oficial membretada, firmada por el asesor interno dirigida al Director de la División de Ciencias Biológicas y de la salud indicando:

A) Luis Ramón Guerrero Romero, matricula 97334124, licenciatura en hidrobiología.

B) Datos del trabajo (titulo, fechas de inicio y terminación) TITULO DEL TRABAJO DEL S.S: ESTABLECIMIENTO DE UN PROTOCOLO PARA LA EVALUACION DE BIOACUMULACION DE METALES PESADOS CON DAPHNIA PULEX DE LA PRESA JOSE ANTONIO ALZATE.

LUGAR Y FECHA DE REALIZACIÓN: LABORATORIO DE ECOTOXICOLOGIA DEPARTAMENTO DE HIDROBIOLOGÍA DIVISIÓN DE CIENCIAS BIOLÓGICAS Y DE LA SALUD DEL 5 DE SEPTIEMBRE DEL 2004 AL 26 DE MAYO DEL 2005

C) Datos del asesor (Grado académico, cargo y adscripción)

________________________________ NOMBRE Y FIRMA DEL ASESOR:

PATRICIA RAMIREZ ROMERO

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RESUMEN DEL SERVICIO SOCIAL Nombre: Luis Ramón Guerrero Romero Matrícula: 97334124 Licenciatura: Hidrobiología TITULO DEL TRABAJO DEL SERVICIO SOCIAL: ESTABLECIMIENTO DE UN PROTOCOLO PARA LA EVALUACION DE BIOACUMULACION DE METALES PESADOS CON DAPHNIA PULEX DE LA PRESA JOSE ANTONIO ALZATE. Nombre del asesor interno: PATRICIA RAMIREZ ROMERO Clave de registro: H.016.04 Resumen: El Servicio Social se hizo con la finalidad de diseñar un protocolo para la evaluación de la bioacumulaciòn y biodepueraciòn de los metales Cr, Cu, Zn en la especie D. pulex obtenida en la presa José Antonio Alzate la cual se ubica en la cuenca del alto Lerma. Las actividades del Servicio Social fueron desarrolladas en la UAM-I, en donde se busco información de hábitos alimenticios de las especies D. pulex como de la Chorella sp, así como de los factores fisicoquímicos necesarios para lograr el mantenimiento del cultivo de la D. pulex. Se tuvo la asesorìa del laboratorio de zoología acuática en la Facultad de Estudios Superiores en Iztacala (FES IZTACALA), en manejo del cultivo de D. pulex, así como el cultivo de la Chorella sp en medio EPA y con el fertilizante Triple 17. Se ocuparon las instalaciones del laboratorio de especiación de metales pesados y electroquímica de la UAM-A, para la familiarización con el equipo de microondas, espectro de absorción atómica y horno de grafito. Como resultado se logro la producción del cultivo de la Chorella sp, el cultivo de la D. pulex sp, así como el protocolo para la evaluación de la bioacumulación y biodepuración de cada metal en D. pulex.

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INTRODUCCION: El deterioro del río Lerma y por ende de la presa J.A. Alzate ha ocasionado la reducción de su potencial zooplanctonico, tal es el caso de la D. pulex que en años anteriores registraba una explotación y exportación en toneladas, siendo esta una fuente económica. El acelerado desarrollo tecnológico, industrial y demográfico así como el uso de nuevos productos en la agricultura, han contribuido al aumento del número de sustancias químicas, sintéticas y naturales, cuyos efectos en los ecosistemas acuáticos repercuten en los sistemas biológicos, sobrepasando su capacidad para transformar, asimilar o eliminar estas sustancias contaminantes, alterando el equilibrio ambiental. El destino de cualquier sustancia química en el ambiente acuático, depende y está influenciado por numerosos procesos químicos, físicos y biológicos. Sus efectos tóxicos dependen de su biodisponibilidad y persistencia, de la capacidad de organismos para acumularlos o excretarlos y de la interferencia de tales compuestos con procesos fisiológicos o ecológicos específicos.(INEGI, 1994) Existen contaminantes que al ser vertidos dentro de los cuerpos de agua, decrecen en su concentración inicial debido a su posterior dispersión, dilución y degradación. Otros sin embargo, permanecen en el ambiente por mucho tiempo ocasionando lesiones ecológicas, biológicas y troficas, hasta llegar a manifestarse daños en el hombre. La caracterización química de estos contaminantes es insuficiente para evaluar su impacto biológico y para establecer medidas de protección al ambiente, por lo que es necesario reforzar estos análisis con la evaluación toxicológica. Actualmente existe la tendencia, sobre todo en países industrializados de completar los análisis físicos y químicos con pruebas biológicas o bioensayos. La principal razón para estudiar la influencia de los agentes xenobióticos y contaminantes en los sistemas acuáticos es la posibilidad de que se incorporen a las cadenas alimenticias y se concentren en peces y otros organismos de importancia comercial. Existen varias fuentes de contaminación en los sistemas acuáticos como son las emisiones atmosféricas industriales, los escurrimientos de agua, sin embargo la fuente más importante de contaminación son las aguas residuales que son vertidas sin un tratamiento adecuado a los cuerpos de agua. (Secretaría de Recursos Hidráulicos, 2000). Un grupo importante de contaminantes son los metales, los cuales usualmente no son eliminados de los ecosistemas acuáticos por procesos naturales como ocurre con muchos contaminantes orgánicos. Metales tóxicos como el Hg, Cd, Pb, Cr, Cu y As entre otros, tienden a acumularse en los sedimentos donde pueden experimentar procesos de sedimentación y suspensión. Y así logran moverse hacia las cadenas alimenticias y ocasionar intoxicaciones crónicas y/o agudas en humanos, como es el caso ocurrido durante 1947 en Japón donde se presento la enfermedad "itai itai" (ouch, ouch) caracterizada por producir deformaciones óseas, la causa fue por intoxicación por

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Cd proveniente de las aguas residuales no tratadas de una mina de Zn y vertidas al río Jintsu. Fue imposible cuantificar el número de casos, pero se registraron más de 100 muertes hasta 1965 (Forstner y Wittmann, 1979; Friberg y Piscator, 1944; Hagino y Yoshioka, 1974; Kobayashi, 1971). El principio de los bioensayos se basa en la característica de los organismos para reaccionar a las condiciones ambientales. Dentro de la gran variedad de organismos utilizados en bioensayos, los micro crustáceos son de los más empleados. Los micro crustáceos desempeñan un importante papel en la cadena alimenticia ya que sirven de alimento para consumidores secundarios como peces y otros vertebrados. Una alteración en la población de estos organismos puede afectar a otros niveles troficos del ecosistema acuático. Daphnia pertenece a la clase Crustácea, orden Cladócero, familia Daphnidae. Los cladóceros o pulgas de agua son un grupo pequeño que pertenece a uno de los 4 órdenes de los crustáceos en su mayoría dulceacuícolas (Barnes, 1989). El cladócero dulceacuícola D. magna ha sido utilizado ampliamente como organismo de prueba en bioensayos de toxicidad aguda internacionalmente, con el fin de evaluar los efectos tóxicos de los contaminantes que ingresan a los ecosistemas acuáticos. El micro crustáceo que se encuentra en la presa José Antonio Alzate del Río Lerma es D. pulex, este cladócero fue utilizado para tener mejores referencias del grado de contaminación de la presa. La mayoría de los cladóceros son animales muy pequeños, los adultos miden entre 0.2 y 3 mm de longitud, son transparentes y generalmente nadan en forma espasmódica, de ahí su nombre común de "pulga de agua". Presentan hábitos semibentónicos, ya que se desplazan con movimientos cortos e irregulares subiendo y bajando a diferentes profundidades durante el día, al anochecer suelen hundirse gradualmente para subir nuevamente al amanecer. Aceptan una salinidad de hasta 4g/Kg., generalmente sobreviven en aguas pobres en oxígeno; el pH y la temperatura óptima para su desarrollo oscila de 6 a 9 y de 18 a 22°C, respectivamente. En contraste a las bajas concentraciones de oxígeno, los Dafnidos son sensibles a la variación de minerales en su ambiente, siendo extremadamente sensible a metales como cobre y zinc. Son de color pardo o transparente, aunque a veces adquieren un color rojo debido a la presencia de hemoglobina en el interior de su cuerpo. En algunas especies se ha observado una coloración oscura, ya que tienen depósitos de melanina sobre su exoesqueleto. La melanina se localiza sobre la superficie que habitualmente le da el sol, lo cual es una protección contra la foto demanda (Luecke y O'Brien, 1983). Poseen un ojo compuesto central y un caparazón que sirve como cámara de incubación. En la mayoría de las especies el caparazón envuelve todo el cuerpo excepto la cabeza y termina en una espina apical llamada quilla. La cabeza, con forma de pico corto asoma ventralmente y algo hacia atrás de modo que el animal tiene la apariencia de pájaro regordete.

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Presentan 6 pares de apéndices de estructura plana que les sirven para efectuar el intercambio gaseoso, alimentación y locomoción. Su alimentación es por filtración de partículas, la cual consiste principalmente en algas unicelulares, protozoarios, levaduras, bacterias y detritus (Brooks, 1959; Pennak, 1978). Área de estudio: La cuenca del río Lerma-Santiago comprende la región hidrológica denominada Cuenca del alto Lerma que abarca desde el nacimiento del río Lerma en Almoloya del Río hasta la presa Solís cerca de Acámbaro, Gto., en este tramo los afluentes más importantes son los ríos Capulhuac, San Luis, Ameyalco, Mayorazgo, Otzolotepec, Sila, Santo Domingo, Chiquito, Ocotillo, Santiaguito, Verdiguel, Tejalpa, Almoloya de Juárez, Rosario, Gavia y Jaltepec (Secretaría de Ecología, 1994). Los principales aprovechamientos superficiales son las presas José Antonio Alzate, Ignacio Ramírez, Tepetitlán, El Mortero, Cuendo y Jordana. En cuanto al aprovechamiento de aguas subterráneas existen aproximadamente 900 pozos y 30 manantiales (INEGI, 1994; Secretaría de Recursos Hidráulicos, 1990). La cuenca de rió Lerma Santiago tiene una superficie total de 129,632km2 la cual para 1989 recibía un volumen de descarga de aguas residuales de 536 millones de metros cúbicos de los cuales el 33% corresponde a descargas urbanas y el 67% a descargas industriales (Secretaría de Recursos Hidráulicos, 1990). (Fig. 1) Son numerosas las industrias que descargan sus aguas residuales en el río Lerma, las cuales tienen diferentes giros como el alimentario, tabacalero, textil, maderero, papelero y sus derivados, químico, cementero, automotriz, hule y plásticos, polímeros, tenerías, minerales no metálicos, del acero, maquinaria y equipo, entre otras (INEGI, 1994; Secretaría de Recursos Hidráulicos, 2000). Es importante mencionar que parte de las aguas residuales de estas industrias son tratadas por la planta tratadora de aguas negras RECICLAGUA, la cual elimina una gran parte de materia orgánica, sin embargo no elimina totalmente compuestos altamente peligrosos como son los metales pesados (Hg, Pb, As, Cd, Cr, etc.), hidrocarburos aromáticos y alifáticos, fenoles, detergentes, plaguicidas entre otros, los cuales continúan su trayecto a través del río Lerma llegando a la presa J.A. Alzate, cuerpo de agua que actúa como una laguna de oxidación facultativa y de estabilización de las descargas provenientes del río Lerma (Avila, 1995, Barceló, 2000). El hecho de que el río Lerma se haya convertido en el cuerpo receptor de aguas residuales industriales y domésticas aunadas a la sobreexplotación del acuífero y la reducción de los volúmenes de escurrimiento, ha provocado la pérdida de la capacidad de auto depuración, ocasionando un cambio en el ciclo hidrológico y un desequilibrio en el ambiente (Montes de Oca, 1991). El río Lerma en su recorrido atraviesa la presa José Antonio Alzate, la cual junto con el río mismo representan los cuerpos de agua más contaminados del Estado de México. La presa Alzate está situada a 22 km al noreste de la ciudad de Toluca, entre las latitudes geográficas 19° 24' 59" y 19° 27 55" de latitud norte y los 99° 37' 50" y 99° 24' 15" de longitud oeste a una altitud de 2670 m sobre el nivel del mar, forma parte de los municipios de Toluca y Temoaya. (Fig. 1). Es el mayor de los 37 cuerpos de agua del municipio de Toluca y el quinto en el Estado de México (Secretaría de Recursos Hidráulicos, 2000); tiene una longitud de 10.2 km y un ancho promedio de 0.9 km en sus ejes rectos excluyendo sus brazos, con una superficie de aproximadamente 10 km2, una capacidad de almacenamiento de 39 millones de metros cúbicos y una profundidad

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máxima de 19 m. Su caudal, junto con la presa Ignacio Ramírez, riega alrededor de 7800 hectáreas en los valles de Temascalcingo e Ixtlahuaca (Secretaría de Recursos Hidráulicos, 1979 y 1990). La presa José Antonio Alzate fue construida en una zona lacustre durante los años 1960 a 1962 por la compañía Omega S.A., embalsando al río Lerma por medio de una cortina de 19 metros a 30 Km aguas abajo del puente sobre la carretera México - Toluca, con el objeto de controlar las avenidas. Evitando inundaciones en poblaciones y zonas agrícolas ribereñas, retener los acarreos del río para evitar la sedimentación aguas abajo, el desarrollo de fauna acuática con fines recreativos que constituiría una fuente de ingreso para los habitantes de la región (Barceló, 2000; CNA, 1993; Arámburu y Calderón, 1979). Actualmente esta presa funciona como reserva de agua para irrigación durante los meses de noviembre a abril y como depósito vacío para el control de inundaciones durante los meses de mayo a octubre. Normalmente la presa se encuentra en niveles cercanos al mínimo de operación, 8 millones de metros cúbicos, durante los meses de mayo a agosto y en los niveles cercanos a al nivel de aguas máximas, 35.5 millones de metros cúbicos, durante los meses de noviembre a febrero (CNA, 1993; Barcelo, 2000). Debido a las condiciones de eutrofizacón y contaminación, la presa hasta 1995, se veía cubierta por lirio acuático (Eichhornia crassipes) principalmente en primavera, verano y otoño (Avila. 1995; Vázquez, 1991). El lirio acuático se considera una plaga, ya que provoca grandes daños como la pérdida de grandes volúmenes de agua, altera la calidad fisicoquímica del agua, impide el paso de la luz por lo que los procesos fotosintéticos se ven afectados reduciéndose drásticamente la concentración de oxígeno disuelto y provocando un desequilibrio en las cadenas tróficas por extinción de especies. Este cuerpo de agua era rico en especies ícticas, las cuales fueron eliminadas por el alto grado de contaminación, ocurriendo lo mismo con el micro crustáceo Daphnia y otros organismos planctónicos que son la base de las cadenas tróficas acuáticas (Vázquez et al. 1986a). Daphnia sp: Los dáfnidos se caracterizan por tener un tiempo de vida corto, entre 10 y 40 días (Margalef, 1983). En general las poblaciones consisten casi exclusivamente de hembras partenogénicas, las cuales se reproducen asexualmente dando origen sólo a hembras. Ocasionalmente aparecen machos propiciando la reproducción sexual, los huevos son producidos en condiciones ambientales desfavorables, como la sobrepoblación (con la consecuente acumulación de productos de excreción y escasez de alimento, temperaturas bajas y fotoperiodos extremos). Desarrollan estructuras de resistencia por lo que son llamados efipios o huevos de resistencia los cuales siempre dan origen a hembras partenogénicas. A este periodo se le conoce como diapausa (Brooks, 1959; Pennak, 1978; Zaffagnini, 1987; Hoff y Snell, 1989). Se pueden encontrar en una gran variedad de cuerpos de agua, desde pequeñas charcas y estanques temporales, hasta en presas y grandes lagos. En México, según Vázquez (1986), los cuerpos de agua en donde la producción de este crustáceo era de importancia comercial hasta los años setentas y principio de los ochentas, son el Lago de Yuriria, la Laguna de Valle de Santiago en el Estado de Guanajuato, el vaso de Texcoco y la Presa José Antonio Alzate en el Estado de México.

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A partir de los años setentas la Daphnia pulex se convirtió en una fuente importante de ingresos para los habitantes de Tlachaloya (Vázquez et al., 1986a), pero a partir de los años ochentas las condiciones de eutrofización y contaminación existentes en la presa ocasionaron la aparición del lirio acuático (Eichhornia crassipes), el cual cubría prácticamente toda la presa principalmente en primavera, verano y otoño ocasionando grandes daños como la pérdida de grandes volúmenes de agua por evapotranspiración, impidiendo el paso de la luz afectando así los procesos fotosintéticos y reduciendo drásticamente la concentración de oxígeno disuelto. Debido a que además es hospedero del mosquito Culex sp, el cual causaba grandes molestias a la población, en 1995 el gobierno del Estado de México determinó la eliminación del lirio acuático de la presa reapareciendo nuevamente dáfnidos a finales de 1996. Trabajos realizados en la década de los ochentas por Vázquez et al. (1986a) y Elías (1982) muestran que la población de Daphnia, también conocida como "chipiril", que se desarrolla en la presa J.A. Alzate estaba zonificada, siendo el oxígeno disuelto y los sólidos suspendidos totales los dos factores fisicoquímicos del agua que más influencia tienen sobre su ocurrencia, además la población es intermitente debido a cambios climáticos limitantes para la población, caracterizada por una rápida proliferación que genera una gran población, la cual pasadas algunas semanas, incluso meses, sufre grandes mortandades. Su valor nutricional varía con la edad, pero el contenido promedio es: humedad 23.42%, materia seca 76.58%, proteína el 41.02%, grasa cruda el 14.83%, carbohidratos el 13.34% y cenizas minerales el 7.39% (Davis y Ozbum, 1979; Torrentera y Tacon, 1989; Dodson y Frey, 1984; Barnes, 1989; Neill, 1978; Soriano y Hernández; 1997). Metales: Los metales son elementos químicos que presentan ciertas propiedades comunes, a saber: conductividad eléctrica y térmica, maleabilidad, ductibilidad y brillo. Se encuentran en forma aislada, aunque la mayoría se encuentra combinados, formando minerales o bien disueltos en forma iónica en el agua. Los metales pesados llamados así por tener una densidad mayor a 5 g/cm3, pueden ser emitidos como contaminantes de manera natural a partir de actividades volcánicas, procesos de erosión, o bien por actividades antropogénicas (García, 1993). Algunos metales como el Cu, Fe, Zn y Co, entre otros, son necesarios en bajas concentraciones para el buen funcionamiento de los organismos vivos, a éstos se les llama metales esenciales ya que cumplen funciones esenciales en muchos procesos metabólicos: sin embargo si la concentración de estos en la fuente de abastecimiento ya sea en el agua o en el alimento es mucho mayor a la capacidad de regulación homeostática del organismo, este cesa su función y los metales antes esenciales pueden volverse tóxicos (Forstner y Wittman, 1979). Los metales pesados pueden ser altamente peligrosos para los seres vivos, se sabe que elementos como el Pb, Hg, Cd y Cr, entre otros pueden ocasionar alteraciones celulares como son la inhibición en la síntesis del DNA, la formación de compuestos carcinogénicos como los epoxialdehídos, la

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inhibición de la RNA polimerasa, deteniendo el proceso mitótico, provocando rupturas cromosómicas, interferencia en la síntesis de la hemoglobina, causando daños estructurales en los cromosomas y alteración de linfocitos (Avila, 1995; Albert y Molina, 1985). Los metales son considerados entre los contaminantes más problemáticos en el medio acuático, ya que usualmente no son eliminados por los microorganismos del medio (García, 1993), pudiendo ingresar a las cadenas alimenticias a través de procesos como bioacumulación, bioconcentración y biomagnificación (Avila y Zarazúa, 1993; Florence, 1981). La toxicidad de los metales pesados en un cuerpo de agua depende en gran medida de su biodisponibilidad. (Luoma y Bryan, 1978; Bryan y Hummerstone, 1978; Bryan y Uysal, 1978; Walton et al., 1982). Estudios sobre la toxicología de los metales en los organismos acuáticos se han limitado a los peces, sin embargo se ha demostrado que las especies zooplanctónicas son más delicadas que los peces. El zooplancton es un buen indicador para conocer el grado de incorporación de metales del agua. (García, 1993; Badouin y Scoppa, 1994). Hay muchos ejemplos de cómo los metales pesados pueden incorporarse del medio acuático a los organismos, por ejemplo Gillespie y Scout (1971), observaron la incorporación de Hg en guppies a partir de sedimentos contaminados encontrando una relación entre la concentración de Hg en sedimento y la cantidad de mental acumulado en los organismos. Knauer y Martín, (1973) realizaron un estudio en zooplancton durante dos estaciones del año encontrando una gran variación de la concentración de Hg entre las muestras de una estación y otra. Esta variación se atribuyó a la variedad de especies y población zooplanctónica. Skei et al. (1976), evaluaron la contaminación por Hg empleando fito y zooplancton como indicadores. Los resultados en zooplancton presentaron una menor concentración de Hg que el fitoplancton. Windom et al. (1973), encontraron concentraciones de Hg entre 0.06 a 5.3µg/Kg en muestras de zooplancton de las bahías del este de los Estados Unidos. Cocoros et al. (1973), realizaron estudios similares encontrando concentraciones de 0.11 a 0.19 µg/Kg de Hg. Existen diversos estudios sobre el efecto toxicológico de algunos metales pesados en organismos como la Daphnia, estas observaciones son a bajas concentraciones, en pruebas de intoxicación crónica. La tabla 1 muestra algunos de los efectos tóxicos provocados por metales en dáfnidos.

Metal Efecto Autor Cu Afecta el desarrollo embrionario y disminuye el

tiempo de vida, retraza el tiempo de maduración, la reproducción y produce inhibición enzimática.

Kenneth. 1972, Ingesoll y Winner. 1982; Biensiger. 1986, Bodar. 1989, Kubitz. 1995, Suedel. 1996.

Zn Altera la reproducción, el desarrollo y el metabolismo, afecta el desarrollo de los huevos, la fecundidad , causa hipoxia y daño citológico

Kenneth. 1972, Attar y Maly 1982, Biesinger 1986.

Cr Tiene efectos genotóxicos en neonatos disminuye la fecundidad y el crecimiento

Kenneth. 1972, Gorby y Corradi, 1993.

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OBJETIVO: Establecer un protocolo para la evaluación de la bioacumulacion y depuración de los metales en: Cr, Cu y Zn con la Daphnia pulex de la presa José Antonio Alzate. METODO:

1.- Se hizo una revisión bibliográfica exhaustiva sobre la Daphnia pulex, en donde se conoció su taxonomía, ciclo de vida, alimentación, mantenimiento y antecedentes de bioensayos de eco toxicidad. 2.- Se preparo en el laboratorio de ecotoxicología de la UAM-I el cultivo de la (Chlorella sp) con el método del fertilizante Triple17 y con el método de medio Bold y agua mineral (Peñafiel). Medio Bold

REACTIVOS Formula concentración 1.-Nitrato de Sodio 20g/800ml 2.-Fosfato de Potasio diabatico

6g/800ml

3.-Sulfato de Magnesio 6g/800ml 4.-Cloruro Fèrrico 2g/800ml 5.-Fosfato de Potasio monobásico

14g/800ml

En el método de medio Bold:

• Con una pipeta se tomaron 10ml de c/u de los cinco reactivos, se colocaron en un matraz de 1000ml y se aforaron con agua destilada. A siendo ahora la solución Stock.

• Se coloco en dos matraces de 1000ml un poco de la cepa de Chlorella sp. • Con la solución stock obtenida anteriormente se le agrego 500ml a cada

matraz. • Se aforaron los matraces a 1000ml con agua destilada.

En el método Triple17:

• Para preparar la solución (A). Se pesaron 50g de 3ple17 y se virtieron en 500ml de agua

• Para preparar la solución (B).Se pesaron 50g de urea y se virtieron en 500ml de agua.

• Se tomo 1ml de la solución (A, B) y se le agrego a 2L de agua, con un poco de la cepa de Chlorella sp.

• Se verifico durante la primera semana de manera diaria que el pH fuera de 7, en el caso de que el pH fuera mayor a 7 se le agrego Ac. Sulfúrico y en el caso de que el pH fuera menor a 7 se le agrego una muy pequeña cantidad de NaHCO3

• Los envases con los 2L del cultivo, se pusieron a aerear durante 2 semanas

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3.- Se preparo en el laboratorio de ecotoxicología de la UAM-I el agua dulce artificial o agua sintética conocida como “MEDIO EPA” para el mantenimiento de la Daphnia pulex en cultivo. Esta fue preparada con agua destilada y sales para lograr tener un agua con dureza moderada. (EPA. 2000).

MEDIO EPA:

Bicarbonato de Sodio: (NaHCO3) 1.9g/20L

Sulfato de Calcio (CaSO4) 1.2g/20L

Sulfato de Magnesio (MgSO4) 1.2g/20L

Cloruro de Potasio (KCl) 0.04g/20L

SISTEMAS DE CULTIVO DEL CLADOCERO Daphnia Pulex Los cultivos fueron estáticos y estuvieron limitados a las fluctuaciones en la concentración de alimentos, ya que en cultivos estáticos y masivos el medio se vuelve eutrófico y por ende se contaminan los organismos por la reingestión de heces, por lo que parte del agua del medio tuvo recambios cada tercer día.

El vidrio se uso para prevenir la contaminación del medio de cultivo del contenedor que estuvo cubierto. En estos cultivos estáticos el diámetro del contenedor fue el de los vasos de precipitado de 250ml. La reproducción y crecimiento dependieron de la calidad y la cantidad de alimento, por lo que en esta etapa se alimentaron sin tener el control de cantidad de alimento suministrado; esta variable fue necesaria en el momento de empezar el experimento toxicológico. Para cladóceros la concentración de alimento fue menor a 500 µg en volumen de 50-100ml/ ind. La frecuencia de limpieza del material, contenedores y utensilios fue una actividad básica para asegurar un nivel óptimo de desarrollo del cultivo. a) Preparación del agua.

Se prepararon los contenedores con agua con medio EPA antes de cultivar la pulga; permitiendo que los cultivos de Chlorella alcanzaran una coloración verde esmeralda. Fue necesario tener cultivos dobles ya que era posible que uno de ellos no se mantuviera. Se tuvo un control en el cultivo con dos semanas de anticipación con una temperatura de 25°C ±1°C para comenzar a repartir a la Daphnia entre los envases en disposición, agregándola lentamente. El contenedor fue aireado para mantener la concentración de O2 por encima de 3.5mg/L, niveles por debajo de 1mg/L son letales. b) Siembra del cultivo de Daphnia

En el cultivo se utilizaron envases de 250ml para tener un mejor control en los recambios que se realizaran 3 veces por semana. Teniendo como principio el concepto

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de tener 1 Daphnia/ 2ml. Se tuvo un control de 100 Daphnias en los vasos de precipitado de 250 ml. Estos fueron expuestos a luz tenue. Una vez que se tuvo bastante agua preparada con medio EPA y el alimento de Chorella, se transfirió una cierta cantidad de agua preparada a los envases que contuvieron a la Daphnia.

Se observo diariamente que los cultivos tuvieran suficiente Chorella y la mortalidad fuera menor al 10 %

c) Cuidado y alimentación.

Las poblaciones de Daphnia presentaron una gran mortalidad en el sistema por lo que mucho dependió de los recambios de agua durante la semana, del oxígeno disponible, la dureza, y del alimento disponible, así como su control poblacional en los recipientes de 250ml. Dejar la luz a toda hora ayudó a promover algas y bacterias en el cultivo. Se retiro un 10% de agua del cultivo y un poco de alimento al envase por que se observo que el cultivo estaba decayendo por la presencia de Daphnias muertas. También se cosecho algo de Daphnia para comenzar un nuevo cultivo. (Anexo 1.) d) La cosecha. Una vez que se logro tener una población constante y controlada de la Daphnia pulex se pudo cosechar a los organismos necesarios para empezar con la parte del experimento con los bioensayos. BIOENSAYOS: a) Bioensayo Preliminar En la primera parte del experimento se colocaron 250 D. pulex en vasos de precipitado de 250ml. Los procesos fueron estudiados en 2 fases: bioacumulacion y biodepuraciòn del metal. La fase de bioacumulación o intoxicación: En esta fase se hizo una prueba estática de 7 días con recambios, donde se le agrego el metal con la concentración conocida del lugar, siendo el caso del Cr 82.75 µg/L, del Cu 102 µg/L, y de 17 µg/L de Zn. Se realizaron recambios los días 3, 5 y 7 del 50% del agua ya preparada con la concentración del metal establecido. Después de 7 días se tomó la mitad de la población expuesta para medir la acumulación del tóxico en D. pulex y la otra parte pasó a la fase de desintoxicación. La fase de biodepuraciòn o desintoxicación: En esta fase se colocaron las D. pulex en medio EPA libre del metal por 7 días con recambios del 50% con agua libre de toxico para evaluar la eliminación del metal cada tercer día, se tomaron muestras para conocer el tiempo en que se desintoxicaron los organismos.

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Para el proceso de las muestras se tomo una cantidad mayor a 100 organismos con una pipeta Pasteur y se colocaron en una caja petri, donde fueron secadas en el horno a una temperatura constante de 90ºC con la finalidad de evaporar el agua. Después de un día se sacaron del horno y se raspo el fondo de la caja petri, para extraer de esta los organismos, las cuales fueron guardadas y etiquetadas en pequeñas bolsas de plástico. b) Bioensayo Definitivo Para el bioensayo definitivo, en la fase de bioacumulación el procedimiento fue el mismo que en el bioensayo preliminar, a diferencia que se tomaron nueve muestras para la fase de bioacumulación y 9 muestras con el mismo horario para la fase de biodepuración del metal como se muestra en la tabla 2. TABLA 2: muestra la hora en que fueron tomadas las muestras en la fase de intoxicación y en la fase de depuración.

FASE DE INTOXICACION

HORA FASE DE DEPURACION

HORA

MUESTRA MUESTRA 1 6 1 6 2 12 2 12 3 24 3 24 4 36 4 36 5 72 5 72 6 96 6 96 7 120 7 120 8 144 8 144 9 166 9 166

d) Digestión de Organismos: La etapa de digestión consistió en agregarles 5ml de acido nítrico a cada una de las muestras previamente deshidratadas, posteriormente se llevaron en vasos de teflón al microondas donde se sometieron a un programa establecido el cual consta de calentar la muestra durante 25 minutos a una temperatura ascendente hasta 210º C y una presión ascendente hasta 150 PSI, una vez alcanzadas estas condiciones se mantuvo por 10 minutos mas, una vez frías las muestras se guardaron en vasos de teflón sellados y en refrigeración. ACTIVIDADES REALIZADAS

OCTUBRE 2004:

• Búsqueda y consulta de bibliografía relacionada al cultivo y mantenimiento de la Daphnia, así como sus hábitos alimenticios.

• Familiarización en el cultivo de la micro alga (Chlorella) para alimentar a la D. pulex. En la facultad de estudios superiores. (FES. IZTACALA).

15

NOVIEMBRE 2004: • Se continúo con la búsqueda y consulta de bibliografía relacionada al cultivo y

mantenimiento de la Daphnia. • Se preparo el material para salida a campo, se prepararon los materiales

necesarios e instalaron los recipientes para los organismos. • 1ª salida a campo, a la presa José Antonio Alzate del rió Lerma, para la colecta

de organismos (D. pulex), para el bioensayo preliminar. • Cultivo de la micro alga (Chlorella) para alimentar a la D. pulex. En (FES.

IZTACALA). • Familiarización con el equipo “Espectro de Absorción Atómica”, “Horno de

Grafito”, y “Horno de Microondas” en las instalaciones de la UAM-A

DICIEMBRE 2004: • Búsqueda y consulta de bibliografía relacionada al cultivo y mantenimiento de

la Daphnia, ecotoxicología, ingestión de metales en organismos, estudios con D. pulex.

• Se preparo el material para salida a campo, se prepararon los materiales necesarios e instalaron los recipientes para los organismos.

• 2ª salida a campo, a la Presa José Antonio Alzate del rió Lerma, para la colecta de organismos (D. pulex). Para continuar los Bioensayos preliminares con Zn.

• Mantenimiento de organismos en el laboratorio de la UAM-I • Cultivo de la micro alga (Chlorella) para alimentar a la D. pulex. En. (FES.

IZTACALA). • Practicas con el “Espectro de Absorción Atómica”, “Horno de Grafito”, y

“Horno de Microondas” en las instalaciones de la UAM-A; así como el principio del proceso del la Digestión de organismos en medio ácido.

ENERO 2005:

• Búsqueda y consulta de bibliografía relacionada a Daphnia, D. pulex,

ecotoxicología, ingestión de metales en organismos. • Se preparo el material para salida a campo, se prepararon los materiales

necesarios e instalaron los recipientes para los organismos. • 3ª salida a campo, a la presa José Antonio Alzate del rió Lerma, para la colecta

de organismos (D. pulex). • Mantenimiento de organismos en el laboratorio de la UAM-I • Cultivo de la micro alga (Chlorella) para alimentar a la D. pulex, así como el

cultivo de el organismo. En (FES. IZTACALA). • Secado y etiquetado de organismos del Bioensayo Preliminar. • Se hizo el seguimiento en la metodología para la digestión de muestras en el

horno de microondas en la UAM-A, así como la lectura de muestras piloto en el Espectro de Absorción Atómica.

FEBRERO 2005:

• Consulta y búsqueda de bibliografía relacionada al cultivo y mantenimiento de la Daphnia, ecotoxicología, ingestión de metales en organismos, estudios con D. pulex.

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• Mantenimiento de organismos en el laboratorio de la UAM-I • Cultivo de la micro alga (Chlorella) para alimentar a la D. pulex, así como el

cultivo de el organismo, En la UAM-I en los laboratorios de “Pexpa”, con el método de cultivo por medio del fertilizante “Tripe 17”

• Digestión de organismos en la UAM-A

ABRIL-MAYO2005: • Consulta de bibliografía relacionada a Daphnia, D. pulex, ecotoxicología,

ingestión de metales en organismos. • Se Inicio el cultivo de (Chlorella) para la previa alimentación de la D. pulex del

Bioensayo definitivo. • Se preparo el material para salida a campo, se preparo el medio EPA y los

materiales necesarios junto con la instalación de los recipientes en el laboratorio para los organismos.

• 4ª salida a campo, a la presa José Antonio Alzate, del al río Lerma, para la colecta de organismos (D. pulex), para las muestras de Cr y Cu.

• Alimentación y mantenimiento de la D. pulex, con la micro alga (Chlorella) para el Bioensayo Definitivo, en el laboratorio de la UAM-I

• Se hizo la fase de intoxicación y la fase de depuración del bioensayo definitivo con los metales “Cr y Cu”.

• Secado y etiquetado de organismos del Bioensayo Definitivo. • 5ª,6ª salida a campo, a la presa José Antonio Alzate del río Lerma, para la

colecta de organismos (D. pulex). Que no fue posible realizar, por condiciones climáticas y blooms de diferentes especies zooplanctonicas.

• 7ª salida a campo, a la presa José Antonio Alzate del rió Lerma, para la colecta

de organismos (D. pulex), para el cultivo con el metal Zn. • Alimentación y mantenimiento de la D. pulex, con la micro alga (Chlorella) para

el Bioensayo Definitivo con “Zn”, en el laboratorio de la UAM-I • Se hizo la Fase de intoxicación y la Fase de depuración del Bioensayo Definitivo

con el metal “Zn”. • Se secaron y etiquetaron los organismos con “Zn” del bioensayo preliminar.

JUNIO-JULIO 2005: • Elaboración de informe final.

OBJETIVOS Y METAS ALCANZADAS

Se logro establecer un método para el cultivo de Chorella sp, que era necesario para el mantenimiento de las D pulex. Se realizo una metodología para el cultivo de la D. pulex, necesaria para los Bioensayos de Bioacumulación y biodepuraciòn de los metales “Cr”, “Cu”, “Zn”. Se hizo un protocolo para la evaluación de bioacumulacion de metales pesados, con cantidades conocidas de “Cr”,” Cu” y “Zn” que acumula y depura la pulga de agua, (Daphnia pulex) de la presa José Antonio Alzate. Se logro establecer un programa para la digestión en un horno de microondas para la digestión de la D. pulex. Se logro establecer que 0.5mg de D. pulex “o” 15 organismos era el peso en seco mínimo necesario para la lectura en el espectro de absorción atómica.

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RESULTADOS Y CONCLUSIONES: La realización de este protocolo fue llevada a cabo exitosamente. Para lograr esto fue necesario la búsqueda de información bibliográfica, así como la orientación proporcionada en la UAM-I y Fes Iztacala, para el cultivo de la Chorella sp, alimento adecuado para el cultivo y mantenimiento de la D. pulex. Se realizaron 7 salidas a campo a la presa José Antonio Alzate del río Lerma para realizar las colectas de la D. pulex. Fue necesario conocer los hábitos alimenticios de la D. pulex, así como las características fisicoquímicas óptimas para lograr un manejo del organismo. Sin embargo, trabajar con organismos vivos en un proyecto de laboratorio fue una actividad laboriosa en el manejo del cultivo y mantenimiento de la Daphnia, ya que son muchas las variables y factores que hay que controlar, siendo estas adversas a un control ya establecido. Las D. pulex de la presa José Antonio Alzate del rió Lerma, presentaron muchas facetas para el análisis de resultados, ya que el control poblacional del cultivo de no fue siempre el mismo, debido a que el cuerpo de agua, unas veces se encontraba mas contaminado que otras, lo que dependía de si las compuertas de la presa habían sido o no abiertas. Hubo veces que al ponerlas en medio EPA, estas no se aclimataban y morían al poco tiempo, otras veces se morían por que los organismos ya eran demasiado viejos y en otras ocasiones eran demasiado jóvenes y no se podía lograr el numero de organismos necesarios para las lecturas de un “Espectro de Absorción Atómica”. También se observo que nunca pudieron alcanzar la talla que tenían en su lugar de origen. Sin embargo las pruebas o experimentos toxicológicos realizados con organismos vivos con fines de conocer la ecotoxicología del medio o del organismo, son muy necesarios hoy en día para lograr la recuperación ecológica o parar la contaminación de la flora y fauna del lugar. Ya que nuestros cuerpos de agua cada vez están más contaminados por la desinformación, negligencia y una pérdida de aprecio a la naturaleza, debido a las necesidades que la metrópoli requiere. Por lo que es necesario continuar con la investigación en estudios de incremento poblacional y su impacto ambiental, planes de educación ambiental, estudios ecotoxicológicos en D. pulex. Para una mejor biorremediación del Sistema acuático del lugar. Así logrando bajar los niveles de contaminación, poder cultivar nuevamente la especie D. pulex CRITERIOS DE EVALUACION: Puntualidad Asistencia. Iniciativa. Avance programático semanal. Calidad del informe final

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FIRMA DEL PROFESOR FIRMA DEL ALUMO PATRICIA RAMIREZ ROMERO LUIS RAMON GUERRERO ROMERO

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Anexo 1:

SUMARIO DE RECOMENDACIONES PARA EL CULTIVO DE LA DAPHNIA PULEX, COMO CONDICIONES PARA SU ESTUDIO TOXICOLOGICO.

TIPO DE CULTIVO ESTATICO CON RECAMBIOS TEMPERATURA 25 + -1°C INTENSIDAD DE LUZ 10-20 µE/m2/s (50-100 ft-c) (niveles de

ambiente de laboratorio) FOTOPERIODO 16 hrs. luz, 8 hrs. de oscuridad. TAMAÑO DE EMBASES PARA EL CULTIVO.

250ml

RENOVACION DE CONCENTRACION DEL TOXICO

Cada 3 días

No. DE REPLICAS POR CONCENTRACION

2

No. DE ORGANISMOS POR EMBASE 125 ALIMENTACION 5 ml Chorella, diariamente. (100 a 150

cels/ml) LIMPIEZA DEL EMBASE Cada 3 días AEREACION 100 burbujas/min. AGUA Preparada con medio EPA pH Entre 7 y 8

22

.

FIG 1. Localización del curso del río Lerma en la República Mexicana.

23

Fig. 2. Trayectoria del río Lerma por las cordilleras del valle de México, con dimensiones de 54 300 km2.

24

FIG 3. LOCALIZACION DE LA PREZA JOSE ANTONIO ALZATE EN EL TRANSCURSO DEL RIO LERMA.

25

FIG 4. Ubicación de la presa José Antonio Alzate ubicada entre las coordenadas geográficas 19º 24’ 50’’ y 19º 27’ 55’’ de latitud norte y los 99º 37’ 50’’ y 97º 42’ 15’’ de longitud oeste , así como las estaciones de muestreo indicadas con los puntos A,B,C,D Y F.