Validación de titulación volumétrica como método para la ...³n_Aluminio_Vacunas... ·...

Instituto de Salud Pública de Chile

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Facultad de Farmacia Química y Farmacia

Valerie Francesca Gómez Ahumada

2014

Internado para optar al Título de Químico Farmacéutico

Validación de titulación volumétrica como método para la determinación de aluminio en vacunas, mediante el equipo titulador automático T70

Profesor Guía: Q.F. Marco Carmona Báez

Sección Fisicoquímico

Laboratorio Nacional de Control


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Contribuye al cuidado y mejoramiento de la salud

Control de los productos farmacéuticos, cosméticos y dispositivos médicos

Se divide en Subdeptos Laboratorio Nacional de Control

Realizar el control de calidad Programa Control de Serie

ISP

ISP-ANAMED

ANAMED

Introducción Objetivos Métodos Resultados y

Discusión Conclusiones


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Analiza previa distribución y comercialización los medicamentos biológicos, con el fin de autorizar su liberación de lote

Control de serie

Sueros de origen humano y animal

Hemoderivados

Biotecnológicos

Hormonas

Antibióticos

Vacunas




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Se encuentra en forma de hidróxido, fosfato o sulfato potásico de aluminio

Se utiliza para aumentar la intensidad de la respuesta inmune

Aluminio en vacunas

Adyuvante

Reducen toxicidad

Adsorbente

Permiten que se use una menor cantidad de antígeno en las vacunas




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El efecto inmunoestimulante del aluminio se atribuye a varios mecanismos:

Aluminio como adyuvante

Exposición prolongada del antígeno al sistema

inmune

Activación del complemento

Activación de linfocitos Th2

Producción de inmunoglobulinas IgE e

IgG

Adyuvante




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Es aceptado en vacunas humanas y veterinarias

Los límites para uso humano oscilan entre 0,85 (FDA) y 1,25 mg de aluminio por dosis (OMS)

Para uso veterinario no hay límites establecidos

Contenido de aluminio en vacunas




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Tétanos Difteria Tos ferina Poliomielitis

Hepatitis A y B Hib Papiloma humano

Pneumococo

Vacunas que contienen aluminio




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El método farmacopeico oficial es la titulación complejométrica por retroceso en exceso de EDTA

El EDTA no quelado se titula con una solución estandarizada de concentración conocida

Debido a las ventajas que presentan los equipos automáticos el laboratorio decide utilizar un titulador automático

Método de ensayo Agregar app. 1 mg de Al

Agregar 1 mL de ácido sulfúrico y 6 gotas de ácido nítrico

Calentar hasta eliminar humos blancos y hasta contenido incoloro

Enfriar y agregar 10 mL de H2O

Agregar 1 gota de anaranjado de metilo 0,1%

Agregar NaOH 50% hasta punto de viraje

Agregar 10 mL de H2O, 10 mL de EDTA 0,02M y 4 mL de Buffer Acetato pH 4,4

Agregar perlas de ebullición, calentar y hervir por 3 minutos

Agregar 1 mL de PAN 0,1% y titular con sulfato de cobre 0,02M


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• Métodos automatizados pueden ser más eficaces y precisos que los métodos manuales

• Eliminan errores humanos, reducen el tiempo de análisis e incrementan la productividad

• Permiten la determinación de una o más sustancias mediante la adición de módulos y accesorios

Automatización de métodos




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Titulador Automático

•Equipo versátil

•Resultados de forma rápida y sencilla

•Menor tiempo de análisis y mayor productividad

•Análisis seguros y confiables

•Se adapta a las necesidades de los usuarios



Automatización de métodos


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Implementar y validar una metodología analítica para la determinación cuantitativa de aluminio, mediante el uso de un titulador automático

Objetivos

Describir el procedimiento para realizar la determinación cuantitativa de aluminio

Comprobar que el titulador automático es adecuado para su uso, mediante la verificación del equipo

Determinar los parámetros de desempeño analítico de la validación de métodos para demostrar que el procedimiento es adecuado

Determinar si la titulación automatizada se puede utilizar como alternativa al método farmacopeico, mediante comparación de métodos




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• Documentación de calidad

• Instalación de la metodología analítica

• Estabilidad de las soluciones

• Verificación del equipo

• Validación de la metodología analítica

• Comparación de métodos

Métodos




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• Mantenciones, reparaciones, calibraciones, verificaciones, incidentes y otros eventos Ficha de vida

• instrucciones de uso, funcionamiento, creación de métodos, partes del equipo, entre otras características

Instructivo de uso

• Registro de la utilización del equipo Bitácora de uso

Documentación de calidad




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Se realizó en el titulador automático Titration Excellence, modelo T70

IT- Determinación del contenido de aluminio en vacunas por titulación automática

Instalación de la metodología analítica

Método 1 Estandarización tiosulfato de sodio (Na2S2O3)

Método 2 Estandarización sulfato de

cobre penta-hidratado (CuSO4·5H2O)

Método 3 Determinación de aluminio




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Pruebas realizadas: inspección visual, medición del pH, densidad y determinación del título

Se realizaron aproximadamente durante un mes

Estabilidad de las soluciones

Buffer Acetato pH 4,4

Dicromato de potasio

EDTA 0,02M PAN 0,1%

Hidróxido de sodio 50%

Anaranjado de metilo 0,1%

Sulfato de cobre 0,02M

Tiosulfato de sodio 0,02M




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“Procedimiento de garantizar que un instrumento es adecuado para el uso al que está destinado” (USP 35/NF 30)

Esencial para generar datos confiables y repetibles

Dentro de la calificación se realiza la verificación del equipo

Se realizó en el método de estandarización de tiosulfato de sodio

Calificación de equipos



Tabla 1: Parámetro, Métodos y Criterio de aceptación para la verificación del equipo

Linealidad

- Preparar 6 soluciones estándar

- Realizar 3 determinaciones del título por nivel

- Realizar curva de regresión y determinar r2

r2 ≥0,9990

Precisión



- Determinar el CV del gasto del valorante y del título

CV ≤0,2% por nivel

Exactitud

-Preparar 3 soluciones estándar


- Calcular el %Error utilizando el gasto de valorante

%Error ≤0,5% por nivel


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“Proceso que establece mediante estudios de laboratorio, que las características de desempeño del procedimiento cumplen los requisitos para las aplicaciones analíticas previstas” (USP 35/NF30)

Demostrar estadísticamente que el método es adecuado para un uso determinado

Se realiza determinando las características de desempeño analítico

Validación de la metodología analítica




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Tabla 2: Parámetros, Métodos y Criterio aceptación para la validación

Especificidad

- Revisión de los excipientes de c/formulación

- Titulación de c/excipiente

- Calcular %Diferencia

Valor obtenido debe ser

simular al blanco

Linealidad


- Realizar 3 titulaciones por nivel

- Calcular el CV del gasto de valorante

- Determinar el FR y el CV de los FR

- Realizar curva de regresión y determinar el r2

- Determinar el I.C. del intercepto

-CV ≤ 2% por nivel

-CV de los FR ≤ 5%

-r2 ≥ 0,995

-El I.C. debe incluir el cero

Precisión

-Repetibilidad

-Precisión intermedia







- Realizar el Test de comparación de medias



-t exp ≤ t tab

Exactitud

- Preparar solución estándar madre, de ella se preparan 3 niveles

- Realizar 3 titulaciones de cada nivel

- Calcular el %Recuperación de cada nivel

- Comparar vol. valorante gastado y vol. Teórico y determinar el

r2 y la m

- Realizar test 100±4S

-%R: 96-104% por nivel

-r2 ≥ 0,995 y m ≥ 0,95

-Prom. del %R debe estar en

el 100±4S

LD y LC

- Preparar 3 soluciones estándar cercanas al nivel más bajo de la

linealidad


- Calcular DS de la respuesta

- Graficar Cant. Al v/s consumo valorante y cant. Al v/s DS de la

respuesta

≤ 0,5 mg de aluminio


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Se realizaron titulaciones de solución blanco, estándar y muestras por ambos métodos simultáneamente

Comparación de métodos



Tabla 3: Método, Procedimiento y Equipo utilizado

Manual -Titulación de 3 bcos, 4 sol. Estándar y 4

sol. muestra Bureta certificada 25 mL

Automatizado -Titulación de 3 bcos, 4 sol. Estándar y 4

sol. muestra Titulador automático T70

Tabla 4: Resultados, Método y Criterio de aceptación comparación métodos

Gasto valorante

(mL)

-Calcular CV

-Realizar Test de comparación de medias

CV ≤ 2%

t exp ≤ t tab


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Resultados y Discusión


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INSTITUTO DE SALUD PÚBLICA DE CHILE SUBDEPTO: LABORATORIO NACIONAL DE CONTROL

ANAMED SECCIÓN: Físico químico

Nº Pagina FICHA TÉCNICA EQUIPO

C. interno

001 EQ-EU-027




ANAMED

INSTRUCTIVO DE USO DE EQUIPO TITULADOR

AUTOMÁTICO TITRATION EXCELLENCE T70

METTLER TOLEDO.

Emisión:12/03/2013

VERSIÓN: 0

Actualización: 12/03/2013

S. Fisicoquímica

Subdepto LNC

IT-MA 422.00-XXX Pág. 1 de 26

BITÁCORA DE USO DE EQUIPO TITULADOR TITRATION EXCELLENCE.

Marca : METTLER TOLEDO Sección/Unidad : Fisicoquímico Nº Folio :

Modelo : T70 Ubicación : Sala N° 11

Código interno : EQ-EU-027 Responsable

inventario : xxx

N° Inventario : 32881; 32880; 32878;

32879. Encargado equipo : xxx


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Procedimiento autorizado Suministra instrucciones para efectuar

operaciones generales y específicas




ANAMED

INSTRUCTIVO

DETERMINACIÓN DEL CONTENIDO DE

ALUMINIO EN VACUNAS POR TITULACIÓN

AUTOMÁTICA

Emisión: xx/xx/xxxx

VERSIÓN: 0

Actualización: xx/xx/xxxx

S.Físicoquímica

Subdepto LNC

IT 4X0.00-0XX Página 1 de 12


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Estabilidad de las soluciones




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El aspecto se mantuvo constante en comparación con las características observadas el primer día

Inspección visual



Tabla 5: Soluciones, Aspecto y Días analizadas

Solución Características N° días

Anaranjado de metilo Transparente, color rojo, s/partículas extrañas 31

Buffer acetato Transparente, incolora, s/partículas extrañas 37

Dicromato de potasio Transparente, color anaranjado, s/partículas extrañas 31

EDTA Transparente, incolora, s/partículas extrañas 31

Hidróxido de sodio Transparente, incolora, s/partículas extrañas 30

PAN Transparente, color anaranjado, s/partículas extrañas 37

Sulfato de cobre Transparente, color celeste, s/partículas extrañas 31

Tiosulfato de sodio Transparente, incolora, s/partículas extrañas 31


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Tabla 6: Densidad de las soluciones

Sln. A. Metilo B. acetato D. potasio EDTA H. sodio PAN S. cobre T. sodio

Prom (g/cm3) 0,9993 1,0841 1,0006 1,0026 1,3740 0,7913 1,0023 1,0014

DS 0,0005 0,0008 0,0003 0,0004 0,0009 0,0014 0,0002 0,0008

CV (%) 0,0457 0,0694 0,0257 0,0440 0,0619 0,1725 0,0180 0,0788

Determinación de la densidad

Figura 1: Variación de la densidad de las soluciones volumétricas. A: Hidróxido de sodio, B: Buffer acetato, C: Sulfato de cobre, D: Anaranjado de metilo, E: Dicromato de potasio, F: EDTA, G: Tiosulfato de sodio y H: PAN.

En todas la soluciones el CV se mantiene con valores aceptables (≤2%)




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Tabla 7: pH de las soluciones

Solución A. Metilo Buffer acetato D. de potasio EDTA S. de cobre T. de sodio

Prom. (pH) 6,1026 4,5067 4,4162 4,5377 4,8366 9,5074

DS 0,1972 0,0531 0,0855 0,1284 0,0980 0,3829

CV (%) 3,2286 1,1788 1,9352 2,8305 2,0261 4,0747

Determinación del pH

Figura 2: Variación del pH de las soluciones volumétricas. A: Tiosulfato de sodio, B: Anaranjado de metilo, C: EDTA, D: Sulfato de cobre, E: Dicromato de potasio y F: Buffer acetato.

La variación del pH no afecta la valoración de las soluciones titulantes ni las muestras

Evaluar el pH es importante ya que evita la interferencia de otros metales en la determinación de aluminio




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Tabla 8: Título de las soluciones

Solución S. de cobre T. de sodio

Promedio (M) 0,0201 0,0201

DS 0,0004 0,0002

CV (%) 1,7940 1,2419

Determinación del título

Figura 3: Variación del título de las soluciones de tiosulfato de sodio y sulfato de cobre.

El título de ambas soluciones varía en menos del 2%

Conocer el contenido de las soluciones valorantes es fundamental para conocer la cantidad de analito en las muestras



0,000

0,005

0,010

0,015

0,020

0,025

0 10 20 30 40

Títu

lo (

M)

Dias

Variación del título

T. de sodio

S. de cobre


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Conclusiones

Todas las soluciones analizadas se mantuvieron estables a temperatura ambiente durante aproximadamente un mes


Discusión


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Verificación del equipo




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Respuesta del equipo es proporcional a las concentraciones de analito

La respuesta es lineal

Linealidad

y = 20,24x + 0,048 R² = 0,999

0,00

5,00

10,00

15,00

20,00

25,00

0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2

Na 2

S 2O

3 (m

L)

K2Cr2O7 (mg/mL)

Verificación equipo: linealidad

Figura 4: Verificación del equipo, linealidad método Na2S2O3.



Tabla 9: Resultados Linealidad

Nivel K2Cr2O7 (mg/mL) Na2S2O3 (mL)

N1 0,5006 10,2216

N2 0,5678 11,5299

N3 0,7435 15,0920

N4 0,9068 18,3531

N5 0,9808 19,9041

N6 1,1223 22,8138

Tabla 10: Criterios aceptación verificación equipo

Linealidad r2 ≥0,9990 Cumple


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El CV en todos los niveles fue menor al valor establecido

Las determinaciones son precisas

Precisión



Tabla 11: Resultados CV (%) por nivel para la precisión

Nivel Volumen Na2S2O3 Título Na2S2O3

N1 0,0650 0,0650

N2 0,0421 0,0421

N3 0,1260 0,1259

Tabla 12: Criterios aceptación verificación equipo

Precisión CV ≤ 0,2% por nivel Cumple


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Las determinaciones realizadas por el equipo son exactas

Exactitud

Tabla 13: Resultados Exactitud

Nivel

K2Cr2O7 (mg/mL)

% Error Valor teórico Valor experimental

N1 0,5678 0,5671 0,1245

N2 0,7435 0,7430 0,0641

N3 0,9808 0,9807 0,0109

Tabla 14: Criterios de aceptación exactitud

Exactitud Error ≤ 0,5% por nivel Cumple




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El equipo está verificado, cumple con las especificaciones y funciona adecuadamente

Verificación del equipo, finalmente

Linealidad

Precisión

Exactitud




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Validación de la metodología analítica




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Tabla 15: % Diferencia de cada excipiente

Glicina 1,1254

Cloruro de potasio 0,7204

Fosfato de sodio dibásico 0,9904

Fosfato de sodio dihidrato 1,2133

Bórax 0,2766

Timerosal 0,3537

Formaldehído 0,9600

Tween 20 1,2007

Cloruro de sodio 0,5817

Fosfato de potasio monobásico 0,8165

El método es capaz de cuantificar aluminio en presencia de otros compuestos existentes en la formulación

Especificidad



Tabla 16: Criterios de aceptación especificidad

Especificidad Valor obtenido debe

ser similar al blanco Cumple


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El método de determinación de aluminio por titulación volumétrica es lineal

Linealidad

y = 1,828x - 0,005 R² = 0,999

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

0 0,5 1 1,5 2

Co

ns.

Al (

mL

Cu

SO4)

Al (mg)

Linealidad del método

Figura 5: Linealidad método determinación de aluminio.



Tabla 17: Resultados linealidad

Nivel Al (mg) Consumo Al (mL) CV (%) FR

N1 0,5027 0,9081 0,1057 1,8062

N2 0,6028 1,0915 0,2189 1,8107

N3 0,8020 1,4674 0,3792 1,8296

N4 1,0014 1,8264 0,0954 1,8239

N5 1,2046 2,2008 0,3470 1,8269

N6 1,4038 2,5823 0,3792 1,8395

N7 1,4817 2,6763 0,9804 1,8062

CV (%) 0,7092

Tabla 18: Intervalo Confianza del intercepto a ± t (n-2)*S a

Máx 0,0420

Mín -0,0520

Tabla 19: Criterios de aceptación linealidad

Linealidad

r2 > 0,995 Cumple

CV de c/nivel ≤ 2,0 % Cumple

CV del factor de respuesta ≤ 5 % Cumple

Intervalo confianza incluye el cero Cumple


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Tabla 20: CV Gasto CuSO4·5H2O (%)

Nivel Precisión int. Repetib.

N1 0,3023 0,4994

N2 0,1841 0,4432

N3 0,1653 0,3058

Precisión

Existe concordancia entre los resultados

No existe diferencia estadísticamente significativa entre ellos

El método es preciso



Tabla 22: Criterios de aceptación precisión

Repetibilidad CV de cada nivel ≤ 2,0 % Cumple

Precisión

Intermedia

CV de cada nivel ≤ 2,0 % Cumple

Comparación de Medias:

estadístico t de student

(0,95;(n1+n2-2)). Cumple si

texp.<tcrit a dos colas

<tcrit (2,7765)

Cumple

Tabla 21: Resultados precisión intermedia

Nivel N1 N2 N3

Prec. Int. Repetib. Prec. Int. Repetib. Prec. Int. Repetib.

Promedio (mL) 0,9996 1,0206 1,9184 1,9281 2,7950 2,8196

Varianza 0,0007 0,0012 0,0002 0,0012 0,0001 0,0013

F 2,7150 5,7808 9,5867

S2 0,0013 0,0007 0,0007

t' 4,3027 4,3027 4,3027

t exp 0,7053 0,4396 1,1238


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El método de determinación de aluminio es exacto

Exactitud

y = 1,0855x - 0,4446 R² = 0,9993

0

2

4

6

8

10

7 7,2 7,4 7,6 7,8 8 8,2 8,4 8,6 8,8

Vo

l. T

eó

rico

(m

L)

Vol. Gastado (mL)

Comparación volúmenes para determinar la exactitud

Figura 6: Comparación volumen gastado vs. volumen teórico.



Tabla 23: Resultados exactitud

Nivel Vol. Gastado

(mL)

Vol. Teórico

(mL) Recuperación (%)

N1 8,6074 8,9001 96,7118

N2 7,9193 8,1490 97,1812

N3 7,2245 7,3979 97,6559

Promedio (%) 97,1830

Tabla 24: intervalo 100±4S

Mín 88,40

Máx 111,60

Tabla 25: Criterios de aceptación exactitud

Exactitud

(Recuperación)

C/lectura entre el rango 96-104% Cumple

r2> 0,995 Cumple

m> 0,95 Cumple

100±4S (X3= 97,1830%; S= 2,9009) Cumple


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LD y LC

y = 1,8377x + 0,1305 R² = 0,9862

0,000

0,200

0,400

0,600

0,800

1,000

1,200

0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6

mL

con

sum

o A

l

Cantidad de Al (mg)

Señal del blanco (Yb)

y = -0,0077x + 0,0239 R² = 0,0258

0,000

0,005

0,010

0,015

0,020

0,025

0,030

0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6

De

svia

ció

n e

stán

dar

Cantidad de Al (mg)

Desviación estándar del blanco (Sb) Figura 7: Gráfico cantidad de analito vs. Respuesta para determinar la señal del blanco.

Figura 8: Gráfico cantidad de analito v/s desviación estándar de la respuesta para determinar la desviación estándar del blanco.



Tabla 26: Resultados LD y LC

Nivel Cantidad Al (mg) Respuesta (mL) DS

N1 0,3007

0,6724

0,0189 0,7026

0,6677

N2 0,4010

0,8497

0,0263 0,8655

0,9010

N3 0,4991

1,0398

0,0174 1,0316

1,0649

Tabla 27: Valores LD y LC

Límites Al (mg) Gasto CuSO4 (mL)

LD 0,1139 9,7268

LC 0,2013 9,5624


DEPARTAM

EN

TO

AG

EN

CIA

NACIO

NAL D

E M

ED

ICAM

EN

TO

S

Dentro de este rango se puede determinar aluminio con precisión, exactitud y linealidad

Intervalo



Tabla 28: Intervalo de validación

Parámetro Rango cantidad de Al (mg)

Mín. Máx.

Linealidad 0,5027 1,4817

P. intermedia 0,5054 1,4838

Repetibilidad 0,5081 1,4844

Exactitud 0,9980 1,4528

Intervalo 0,9980 1,4528


DEPARTAM

EN

TO

AG

EN

CIA

NACIO

NAL D

E M

ED

ICAM

EN

TO

S

• Se cumplen los criterios de aceptación de c/parámetro

• Método validado

• Apto para la determinación de aluminio

• Resultados confiables

Validación: finalmente




DEPARTAM

EN

TO

AG

EN

CIA

NACIO

NAL D

E M

ED

ICAM

EN

TO

S





DEPARTAM

EN

TO

AG

EN

CIA

NACIO

NAL D

E M

ED

ICAM

EN

TO

S

Los resultados obtenidos son equivalentes

Método automático se puede adoptar como alternativa al método manual


Tabla 30: Criterios aceptación comparación de métodos

CV (%) CV ≤2% Cumple

t exp

texp ≤ tcrit

tcrit= 2,7765 (blanco)

tcrit= 2,4469 (estándar y muestra)

Cumple



Tabla 29: Resultados comparación de métodos

Parámetro Blanco Estándar Muestra

Equipo Manual Equipo Manual Equipo Manual

Promedio (mL) 9,8740 9,8667 8,3964 8,4500 8,5504 8,4250

CV (%) 0,1726 0,5852 0,2382 0,6833 1,4945 1,4935

texp 0,2120 1,8207 1,3987


DEPARTAM

EN

TO

AG

EN

CIA

NACIO

NAL D

E M

ED

ICAM

EN

TO

S

Conclusiones


DEPARTAM

EN

TO

AG

EN

CIA

NACIO

NAL D

E M

ED

ICAM

EN

TO

S

Conclusiones



Procedimiento

Permite a cualquier analista realizar la determinación de

aluminio

Verificación y Validación

Tanto el procedimiento como

el equipo utilizado son adecuados para la determinación de

Al

Resultados confiables y reproducibles

Comparación Métodos

Titulador automático se puede utilizar como alternativa


DEPARTAM

EN

TO

AG

EN

CIA

NACIO

NAL D

E M

ED

ICAM

EN

TO

S

Determinación cuantitativa de aluminio utilizando el titulador automático entrega resultados

confiables, esto permite asegurar la calidad de los productos farmacéuticos analizados

Descripción procedimiento

Verificación Validación


Conclusiones




DEPARTAM

EN

TO

AG

EN

CIA

NACIO

NAL D

E M

ED

ICAM

EN

TO

S

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