VALIDACIÓN SECUNDARIA DEL MÉTODO DE FILTRACIÓN POR ...

VALIDACIÓN SECUNDARIA DEL MÉTODO DE FILTRACIÓN POR

MEMBRANA PARA LA DETECCIÓN DE COLIFORMES TOTALES Y

Escherichia coli EN MUESTRAS DE AGUAS PARA CONSUMO HUMANO

ANALIZADAS EN EL LABORATORIO DE SALUD PÚBLICA DEL HUILA

LILIAN JHISEL PAEZ SANABRIA

TRABAJO DE GRADO Presentado como requisito parcial

Para optar al título de

Microbióloga Industrial

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS

CARRERA DE MICROBIOLOGIA INDUSTRIAL BOGOTÁ, D.C.

Noviembre de 2008

NOTA DE ADVERTENCIA Artículo 23 de la Resolución N° 13 de Julio de 1946

“La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus alumnos

en sus trabajos de tesis. Solo velará porque no se publique nada contrario al dogma y

a la moral católica y porque las tesis no contengan ataques personales contra persona

alguna, antes bien se vea en ellas el anhelo de buscar la verdad y la justicia”.






APROBADO

_________________________________ Gloria María Rivera Díaz, Bacterióloga

Directora






APROBADO

_________________________________ Gloria María Rivera Díaz, Bacterióloga

Directora

_____________________________ _______________________________ Rosario del Pilar Ortiz, Bacterióloga Lorena Valencia, Microbióloga Jurado Jurado






APROBADO

_____________________________ _______________________________ Ingrid Schuler , Ph. D Janeth Arias Palacios M.Sc, M.Ed. Decana Académica Directora de carrera

Le doy gracias a Dios por permitirme lograr este triunfo, a mis padres por el

esfuerzo y apoyo que me han brindado, ya que sin su ayuda no lo hubiera podido

lograr, a mis hermanos que de una u otra forma me han brindado su confianza y

apoyo para seguir adelante, al Gordo por brindarme su amor y apoyo

incondicional, a toda mi familia y en especial a mi mamá, que ha sido la persona

que ha estado conmigo en todo este proceso brindándome lo mejor de sí y con

muchas ganas de que yo comience una nueva etapa en mi vida como es la de ser

Profesional.

vii

AGRADECIMIENTOS

Al Laboratorio de salud Publica del Huila, por permitirme llevar a cabo este trabajo

en sus instalaciones, A la Doctora Gloria María Rivera Díaz, por brindarme su apoyo

y recursos necesarios para llevar a cabo este trabajo, al Dr. Gerardo Navas del

Instituto Nacional de Salud, por su valiosa colaboración y al personal del área

ambientes del Laboratorio por su colaboración.

viii

TABLA DE CONTENIDO

RESUMEN ............................................................................................................................. xiii

1. INTRODUCCIÓN .......................................................................................................... 14

2. MARCO TEORICO ........................................................................................................ 16

2.1. GENERALIDADES DE LA VALIDACIÓN ......................................................... 16

2.1.1. Validación ....................................................................................................... 17

2.1.2. Validación primaria......................................................................................... 17

2.1.3. Validación secundaria ..................................................................................... 18

2.1.4. Tipos de validación ......................................................................................... 19

2.1.4.1. Validación prospectiva ............................................................................ 19

2.1.4.2. Validación retrospectiva ......................................................................... 19

2.1.4.3. Validación concurrente ........................................................................... 20

2.1.5. Parámetros analíticos del proceso de validación ............................................. 20

2.1.5.1. Limite de detección ................................................................................. 20

2.1.5.2. Limite de cuantificación .......................................................................... 21

2.1.5.3. Exactitud ................................................................................................. 21

2.1.5.4. Especificidad ........................................................................................... 21

2.1.5.5. Selectividad ............................................................................................. 22

2.1.5.6. Precisión .................................................................................................. 22

2.2. CARTAS DE CONTROL R/ PARA EL CONTROL DE LA CALIDAD ANALITICA INTERNA DEL LABORATORIO .............................................................. 23

2.2.1. Generalidades del grupo Coliforme ................................................................ 23

2.2.1.1. Coliformes Totales .................................................................................. 23

2.2.1.2. Coliformes fecales ................................................................................... 24

2.3. ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO DE AGUAS ..................................................... 25

2.3.1. Plan de muestreo (recolección y recepción de muestras) .............................. 25

2.3.1.1. Toma de muestras en grifos o llaves ...................................................... 27

2.3.1.2. Toma de muestras en pozos carentes de bomba ...................................... 27

2.3.1.3. Toma de muestras en ríos, lagos, quebradas, represas ............................ 28

ix

2.3.1.4. Transporte y almacenamiento de las muestras ........................................ 28

2.4. MÉTODO DE FILTRACIÓN POR MEMBRANA ............................................... 29

2.4.1. Fundamento del método de filtración por membrana ..................................... 29

2.4.2. Características del filtro de membrana ............................................................ 29

2.4.3. Ventajas y desventajas del método de filtración por membrana ..................... 30

2.4.4. Uso del equipo de filtración por membrana ................................................... 30

3. JUSTIFICACIÓN ........................................................................................................... 33

4. OBJETIVOS ................................................................................................................... 35

4.1. OBJETIVO GENERAL .......................................................................................... 35

4.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS .................................................................................. 35

5. MATERIALES Y MÉTODOS ....................................................................................... 36

5.1. DISEÑO DE LA INVESTIGACIÓN ..................................................................... 36

5.2. MATERIALES ....................................................................................................... 36

5.3. PRUEBA DE VIABILIDAD Y PUREZA DE LAS CEPAS ................................. 38

5.4. PREPARACIÓN DEL PATRÓN DE MCFARLAND ........................................... 39

5.5. CONTROL DE CALIDAD DE LOS MEDIOS DE CULTIVO............................. 39

5.5.1. Control de esterilidad ...................................................................................... 39

5.5.2. Prueba de selectividad y eficacia .................................................................... 40

5.6. CONTROL DE AMBIENTES................................................................................ 41

5.7. CONTROL DE EQUIPOS...................................................................................... 41

5.8. VALIDACIÓN DEL METODO DE FILTRACION POR MEMBRANA PARA LA DETECCION DE COLIFORMES TOTALES Y E. coli EN MUESTRAS DE AGUAS PARA EL CONSUMO HUMANO .................................................................................... 42

5.8.1. Estandarización del tubo 0.5 de Mcfarland ..................................................... 42

5.8.2. Ensayo preliminar de repetibilidad ................................................................. 44

5.8.3. Validación del método de filtración por membrana ........................................ 47

5.8.3.1. Descripción de soluciones y muestras ..................................................... 48

5.8.4. Elaboración de cartas R/ para el control de calidad analítica interna del laboratorio ....................................................................................................................... 49

5.8.5. Evaluación de la validación ............................................................................ 49

5.9. INFORME DE RESULTADOS ............................................................................. 50

x

6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS ................................................... 51

6.1. PRUEBA DE VIABILIDAD Y PUREZA DE LAS CEPAS DE REFERENCIA . 51

6.2. CONTROL DE CALIDAD DE LOS MEDIOS DE CULTIVO............................. 53

6.2.1. Control de esterilidad ...................................................................................... 53

6.2.2. Prueba de selectividad y eficacia .................................................................... 54

6.3. CONTROL DE EQUIPOS...................................................................................... 55

6.4. CONTROL DE AMBIENTES................................................................................ 56

6.5. VALIDACIÓN DEL METODO DE FILTRACION POR MEMBRANA ............................... 57

6.5.1. Estandarización del tubo 0.5 de Mcfarland .................................................... 58

6.5.2. Ensayo preliminar de repetibilidad ................................................................. 61

6.5.3. Validación del método de filtración por membrana ....................................... 63

6.5.3.1. Determinación de la precisión ................................................................ 67

6.5.3.2. Determinación de la exactitud ................................................................ 69

6.5.4. Cartas de control “R” ...................................................................................... 74

7. CONCLUSIONES ............................................................................................................... 76

8. RECOMENDACIONES ....................................................................................................... 77

9. BIBLIOGRAFÍA .................................................................................................................. 78

9.1. RECURSOS ELECTRONICOS ...................................................................................... 80

10. ANEXOS ....................................................................................................................... 81

xi

LISTA DE TABLAS

TABLA 1 Recuento de bacterias aerobias mesófilas, hongos y levaduras ............................. 57

TABLA 2 Comparación de absorbancias del tubo 0.5 de Mcfarland y la suspensión de E. coli

................................................................................................................................................ 59

TABLA 3 Lectura de absorbancias de la suspensión de E. coli ............................................. 60

Tabla 4 Calculo de la media, desviación estándar y coeficiente de variación de las

concentraciones de 5, 20 y 70 bacterias/mL ........................................................................... 62

TABLA 5 Recuento de coliformes totales en medio Endo. .................................................... 64

TABLA 6 Recuento coliformes fecales en medio m-FC. ....................................................... 65

TABLA 7 Cálculo para determinar la aceptabilidad de las desviaciones estándares para

coliformes totales .................................................................................................................... 68

Tabla 8 Cálculo para determinar la aceptabilidad de las desviaciones estándares para

coliformes fecales ................................................................................................................... 68

Tabla 9 Recuperación M1 + A1, coliformes totales ............................................................... 70

TABLA 10 Recuperación M1 + A1, coliformes fecales......................................................... 71

TABLA 11 Recuperación M2 + A2, coliformes totales ......................................................... 72

TABLA 12 Recuperación M2 + A2, coliformes fecales......................................................... 73

xii

LISTA DE FIGURAS

FIGURA 1 Esquema de la estandarización del tubo 0.5 de Mcfarland. . ............................... 43

FIGURA 2. Esquema para preparar la concentración de 5 bacterias/ml ................................ 46

FIGURA 3 Crecimiento de E. coli en agar Mc Conkey ......................................................... 51

FIGURA 4 Identificación bioquímica de E. coli .................................................................... 52

FIGURA 5 Crecimiento de S. aureus en agar sangre .............................................................. 52

FIGURA 6 Crecimiento de E.coli en medio Endo y en medio m-FC ..................................... 55

FIGURA 7 Crecimiento de S. aureus en medio Endo y en medio m-FC ............................... 55

FIGURA 8 Recuento de E. coli en medio Endo y m-FC. ..................................................... 61

FIGURA 9 Recuento de los estándares de 5, 20 y 70 bacterias /100 mL de E. coli ............... 63

FIGURA 10 Recuento de E. coli en medio Endo y medio m-FC. .......................................... 67

FIGURA 11 Grafico de control para coliformes totales ......................................................... 74

FIGURA 12 Grafico de control para coliformes fecales ........................................................ 75

RESUMEN

Con el fin de contribuir con los procesos de Mejoramiento de la Calidad del

Laboratorio de Salud Publica del Huila y con el objetivo de iniciar un proceso de

acreditacion, se realizó una validación secundaria de tipo concurrente del método de

filtración por membrana para la detección de coliformes totales y Escherichia coli en

muestras de agua para consumo humano. Al inicio del proceso de validación se reviso

el historial de mantenimiento y calibración de los equipos para garantizar los

procedimientos y resultados obtenidos. Antes de iniciar la etapa de validación se

estandarizo la lectura del tubo 0.5 de Mcfarland, para comprobar que efectivamente

se estaba partiendo de 150 millones de bacterias/mL. Así mismo, se realizo un

ensayo preliminar de repetibilidad con el fin de obtener un dominio del método.

Para la validación se siguió un diseño experimental establecido por el Instituto

Nacional de Salud, en donde la cantidad de soluciones analizadas que conformaron

el diseño experimental fue de 48, distribuidas en seis (6) lotes, de ocho (8) soluciones

cada una, analizando las siguientes soluciones en cada lote: 2 blancos, dos muestras

naturales, dos muestras más adición de 0.4C y 0.7C y dos soluciones estándares. El

estudio se procesó durante seis días, en donde cada lote era un día. La precisión del

método fue evaluada con la aceptabilidad de las desviaciones estándares de cada

solución, las cuales debían de estar en el rango de la meta a alcanzar (W),

correspondiente al 5% de la concentración de la gran media ó a 0.25 veces el valor

mínimo de interés que en este caso fue 8 y la exactitud se evaluó mediante la

recuperación de una concentración conocida de Escherichia coli en las dos muestras

naturales.

Al finalizar el estudio de validación se comprobó que mediante la validación

realizada se cumplieron con los dos parámetros evaluados, la precisión y la exactitud.

14

1. INTRODUCCIÓN

El recurso hídrico para el consumo humano debe ser entregado a las comunidades,

con excelente calidad, la cual inicia desde la misma generación, protección de fuentes

y recorridos hasta las plantas de tratamiento y posteriormente hasta el servicio

domiciliario. A pesar de ello Las enfermedades derivadas de la ingestión de agua son

muy frecuentes en los países en desarrollo y dentro de estos hay zonas de mayor o

menor compromiso epidemiológico.

El acceso de los colombianos al agua potable deja mucho que desear en el país a

pesar de las cifras globales que demuestran que el 56% de la población rural, el 97%

de la urbana, para un total general del 86% tienen agua potable.

Las enfermedades bacterianas, parasitarias, virales y químicas que tienen origen en la

transmisión de estos agentes por el agua adquieren una especial connotación sanitaria

cuando las poblaciones ribereñas con inadecuado suministro del agua potable o

aquellas comunidades que a través de muchos años han carecido del recurso hídrico

necesario para la vida del hombre, deben ser controlados por el estado.

En este sentido, los laboratorios de salud pública tienen la obligación de proteger las

comunidades bajo su cuidado territorial y por ello deben implementar la tecnología y

la metodología que les permita realizar el control de calidad del agua que consumen

los ciudadanos.

Cada laboratorio debe utilizar métodos y procedimientos apropiados para todas las

calibraciones y ensayos considerados en su alcance. Estos incluyen muestreo,

transporte, almacenamiento y preparación de los elementos a ser calibrados o

ensayados.

15

Los laboratorios deben realizar controles internos los cuales garantizan que van

generar resultados altamente confiables, mediante el seguimiento de procedimientos

altamente calificados, los cuales van a depender del programa que se haya

implementado en el laboratorio donde generaran idoneidad y confiablidad de los

resultados emitidos.

Estos programas de control interno incluyen evaluación continua de los principales

materiales y objetos que se utilizan en los diferentes análisis, tales como, control de

los medios de cultivo a utilizar, personal idóneo, equipos, estandarización y

documentación de los procesos, con el fin de garantizar un buen desarrollo del

procedimiento y asegurar que este se está efectuando en forma correcta cada vez que

se ejecute, lo cual se lograra con la realización de la validación de los métodos

utilizados por el laboratorio para sus respectivos análisis.

La validación de una técnica es el proceso por el cual se establece mediante estudios

de requerimientos la aplicación analítica propuesta, siendo su principal objetivo

confirmar y documentar la confiabilidad de los resultados obtenidos. Con ella se

determinan las posibles variaciones que se presentan entre diferentes números de

ensayos y de esta manera disminuir las posibilidades de error dentro del método,

generando un alto grado de confianza en los resultados finales arrojados por el

método validado.

Basada en etas premisas el presente trabajo de grado tiene como finalidad Validar el

Método de Filtración por Membrana para la detección de Coliformes Totales y

Escherichia coli en muestras de aguas para consumo humano, con el fin de asegurar

que el laboratorio va a tener un alto grado de confiabilidad en sus resultados

emitidos.

16

2. MARCO TEORICO

Las enfermedades infecciosas se transmiten principalmente a través de las excretas de

seres humanos y animales, en particular de las heces. El uso de esta agua para beber o

preparar alimentos, el contacto de ella durante el baño o el lavado de ropa, e incluso

la inhalación de vapor o aerosoles, pueden producir la infección. La carga bacteriana

incide directamente en la potabilidad del agua y en las características y las

condiciones que la hacen apta para el consumo humano.

En muchas regiones, esta calidad de agua se consume sin ningún tipo de control de

calidad ni tratamiento. Las enfermedades relacionadas con la insalubridad del agua y

la falta de saneamiento son una de las causas de morbimortalidad. El número total

anual de defunciones producidas por diarreas y enteritis es aproximadamente de

12.000 casos al año y la morbilidad por las mismas causas es de 300.000 casos al año.

La población más afectada en Colombia por estos factores es la población rural y

marginal dispersa de la zona pacifica, la costa atlántica y el suroriente del país, sobre

todo en lugares densamente poblados. (OTALORA, 2005).

Por esta razón se hace necesario llevar a cabo un análisis microbiológico del agua,

que asegure que es apta para el consumo humano y que posee las condiciones de

calidad necesarias para cumplir con la normatividad gubernamental.

2.1. GENERALIDADES DE LA VALIDACIÓN

Para conseguir la idoneidad en un resultado analítico es imprescindible la utilización

de un método confiable. Para asegurar confiabilidad, los métodos analíticos deben

someterse a un procedimiento de validación ya sea de carácter prospectivo,

retrospectivo o de revalidación; para comprobar, si el método es lo suficientemente

confiable, y si los resultados previstos satisfacen los requisitos analíticos prefijados.

17

La validación constituye un requisito imprescindible para las buenas prácticas de

laboratorio, conforme lo establecen diferentes agencias regulatorias y la

determinación de la incertidumbre debe formar parte de este proceso de validación y

es esencial para un control continuo de la calidad. A partir del criterio de que no

existe un modelo único para validación y que los parámetros a evaluar cambian de

acuerdo con los requisitos legales de diferentes organizaciones y de los

requerimientos analíticos particulares; solo es recomendable el seguimiento de una

guía general para la validación de métodos analíticos, en conformidad con pautas

aceptadas internacionalmente. (OTALORA, 2005).

2.1.1. Validación

Consiste en demostrar con un alto grado de confianza, por medio de evidencia

documentada que un proceso especifico producirá de forma consistente y permanente

productos que poseerán las características de calidad predefinidas (WHO technical

Report Series, No. 823, 1992).

Es el proceso por el cual se establecen mediante estudios de laboratorio que las

características de desempeño del método analítico cumplen los requerimientos para la

aplicación analítica propuesta (USP XXVI, 2003), siendo su principal objetivo

confirmar y documentar la confiabilidad de los resultados obtenidos.

La validación de métodos analíticos consiste es la obtención de pruebas

documentadas que demuestran que un método analítico es lo suficientemente

confiable para producir un resultado previsto dentro de intervalos definidos.

(CORTES, 2006).

2.1.2. Validación primaria

La validación primaria es un proceso exploratorio que tiene la meta de establecer los

límites operacionales y las características de desempeño de un método nuevo,

modificado o caracterizado en forma inadecuada. Debe dar origen a especificaciones

18

numéricas y descriptivas para el desempeño e incluir una descripción detallada y

precisa del objeto de interés.

Característicamente, la validación primaria procede mediante el uso de esquemas de

ensayos especialmente diseñados.

Los laboratorios que desarrollan un método “en casa” o una variante de una norma

existente deben realizar los pasos de la validación primaria. (PADILLA, 2007)

2.1.3. Validación secundaria

Demostración por experimento que un método establecido funciona de acuerdo con

las especificaciones en las manos del usuario. Esta validación se denomina

verificación la cual es la confirmación mediante el aporte de pruebas objetivas, de

que se han cumplido los requisitos establecidos. (ISO 9000:2000).

Normalmente la validación secundaria emplea formas seleccionadas y simplificadas

de los mismos procedimientos empleados en la validación primaria, aunque

posiblemente extendidas por un tiempo mayor. Las muestras naturales constituyen el

material de ensayo óptimo y el trabajo solo requiere tratar el procedimiento dentro de

los límites operacionales establecidos por la validación primaria. (GTC 84, 2003).

Para un laboratorio de análisis es importante validar sus técnicas, para así optimizar

sus procesos, lo cual implica reducir gastos, el tiempo de desarrollo de la técnica, y

generar confiabilidad en los resultados que se emiten. De igual forma, sirve para dar

cumplimiento a las normas legales pertinentes o al logro de cumplimiento de normas

que aunque no son de obligatorio cumplimiento contribuyen a la credibilidad del

laboratorio y a obtener altos niveles de confiabilidad que generan confianza dentro de

sus clientes.

19

2.1.4. Tipos de validación

2.1.4.1. Validación prospectiva

Se basa en información obtenida antes de implantar el proceso de validación. Se debe

realizar un análisis de riesgo para determinar si podrían conducir a situaciones

críticas; se investigan posibles causas y se determina la probabilidad de que sucedan.

Posteriormente, se efectúan y se evalúan los ensayos y se hace una valoración

general. Si los resultados son aceptables al final, el proceso es satisfactorio. Los

procesos no satisfactorios se tienen que modificar y mejorar hasta que una nueva

validación demuestre su carácter satisfactorio. Además este tipo de validación busca

prever errores o limitar el riesgo de que estos se presenten durante el proceso.

(CORTES, 2002).

2.1.4.2. Validación retrospectiva

Se lleva a cabo por medio de la revisión y análisis de la información histórica del

proceso. Con esta recopilación de datos históricos se obtiene documentación útil para

la determinación de la reproducibilidad de dicho proceso. Por esto, para la obtención

de información no es necesario aplicar ensayos analíticos, o supervisión del proceso

en forma explícita. (GALEANO, 2007).

Los pasos involucrados en este tipo de validación requieren la preparación de un

protocolo específico, el reporte de los resultados de los datos analizados. Dentro de

este tipo de validación es necesario tener en cuenta el control de la materia prima,

controles ambientales, controles microbiológicos, equipos, procedimientos, métodos

analíticos y especificaciones; es aplicada para productos que se encuentran en el

mercado que conlleven a unas conclusiones y recomendaciones. (PADILLA, 2007).

20

2.1.4.3. Validación concurrente

La información requerida en este tipo de validación se obtiene durante la

implementación del mismo. Se debe tener en cuenta el monitoreo en proceso de las

variables criticas que demuestre que el proceso está bajo control y el registro de datos

sobre la marcha del proceso está en estado productivo. Sin embargo cada

aproximación tiene sus características y limitaciones, y por lo tanto, antes de

desarrollar una validación deberá evaluarse que tipo de validación pueda dar mejor

información sobre la seguridad y la estabilidad del proceso. (GARCIA, 2001).

2.1.5. Parámetros analíticos del proceso de validación

Los parámetro de rendimiento se establecen de acuerdo a la categoría a la que

pertenecen el método y siguiendo los requisitos exigidos por distintos organismos

internacionales que incluyen: intervalo de trabajo, linealidad, sensibilidad, limite de

detección, limite de cuantificación, exactitud, precisión, repetibilidad,

reproducibilidad, robustez, incertidumbre, etc.

Está implícito que los estudios para determinar los parámetros de rendimiento se

llevan a cabo mediante equipos que cumplen con las especificaciones, funcionan

correctamente y están adecuadamente calibrados. Igualmente el operador que realiza

los estudios debe ser competente en el campo de trabajo en estudio y debe contar con

suficientes conocimientos respecto al trabajo, como para poder tomar decisiones

apropiadas a partir de las observaciones realizadas a medida que progrese el estudio.

(OTALORA, 2005).

2.1.5.1. Limite de detección

Es la concentración mínima del analito que puede detectarse en una muestra, pero no

es necesariamente cuantificada, bajo condiciones analíticas especificas.

21

También se conoce como mínima concentración neta detectable o limite de

determinación/limite de decisión y “El mínimo contenido de analito, de existir analito

presente, que se detectara y se podrá identificar”.

El límite de detección es un número, expresado en unidades de concentración (o

cantidad) que describe el más bajo nivel de concentración (o cantidad) de una

sustancia que puede determinarse como estadísticamente diferente del blanco.

(OTALORA, 2005).

2.1.5.2. Limite de cuantificación

Es la concentración mínima del analito que puede ser cuantificada con exactitud y

precisión en una muestra, bajo condiciones analíticas especificas.

2.1.5.3. Exactitud

Indica la capacidad del método analítico para obtener resultados lo más próximo

posible al valor verdadero. A diferencia de la precisión que refleja el error aleatorio,

la exactitud refleja el error sistemático o la tendencia a él. (GALEANO, 2007).

2.1.5.4. Especificidad

Es la capacidad del método para diferenciar precisa y específicamente, el compuesto

de interés, en presencia de los demás componentes, que se esperan estén presentes en

la matriz de la muestra. Estos componentes pueden ser precursores de la síntesis o

subproductos de la misma, impurezas, excipientes o productos de degradación.

(WHO TECHNICAL REPORT, No823, 1992).

22

2.1.5.5. Selectividad

Se define un método selectivo como aquel que produce resultados exactos para todos

los analitos de interés, o cuando diferentes microorganismos pertenecientes al mismo

grupo deben ser detectados por el método.

2.1.5.6. Precisión

Es el grado de concordancia entre los resultados de las pruebas individuales cuando

se aplica el método repetidamente a muestras separadas e idénticas, obtenidas del

mismo lote del material homogéneo. (USP 29, 2006). El parámetro estadístico que

caracteriza a este estudio es la variación estándar o preferiblemente el coeficiente de

variación (variación estándar relativa). Este parámetro permite evaluar la

incertidumbre en la estimación de la media, es decir, el error aleatorio que

corresponde con la dispersión de los datos alrededor de la media. (CASTILLO Y

GONZALEZ, 1996). Puede ser una medida del grado de reproducibilidad o de

repetibilidad del método analítico en condiciones normales de operación (USP 29,

2006).

Reproducibilidad: Es la medida de la precisión de los resultados de ensayos

realizados sobre la misma muestra homogénea, pero analizado en diferentes

laboratorios, por diferentes analista, diferentes días, diferentes instrumentos

(precisión entre laboratorios).

Repetibilidad: Es la medida de la precisión de un método cuando este se realiza por el

mismo analista, el mismo día, los mismos reactivos, los mismos instrumentos

(precisión dentro del ensayo).

23

2.2. CARTAS DE CONTROL R/ PARA EL CONTROL DE LA CALIDAD ANALITICA INTERNA DEL LABORATORIO

La finalidad principal de un laboratorio de agua, es producir información precisa y

confiable que muestre las características cualitativas del cuerpo de agua bajo estudio.

Un elemento esencial para garantizar que los resultados analíticos son precisos y

confiables es el control de la calidad analítica precisa CCA, el cual consiste en la

aplicación rutinaria de los procedimientos necesarios para controlar el proceso de

medición.

El objetivo primordial de un programa de control de calidad interno es el de asegurar

que los resultados que se obtengan en el laboratorio se enmarquen dentro de los

límites aceptables de desviación a partir de los valores verdaderos. Se pueden hacer

duplicados de muestras naturales, de estándares, de muestras adicionadas, o de

blancos y para ello se utilizan las cartas de control.

Las cartas R son cuadros de control, en los cuales el ámbito promedio de las muestras

duplicadas R es la línea central. El límite de control inferior es cero y el límite de

control superior LCS se estima como: LCS = 3.27 x R/

Las cartas R hacen posible el control de los errores aleatorios y el límite de detección

con los blancos. (OTALORA, 2005)

2.2.1. Generalidades del grupo Coliforme

2.2.1.1. Coliformes Totales

Los coliformes totales son un grupo de microorganismos que comprende varios

géneros de la familia enterobacteriaceae. Este grupo de microorganismos se encuentra

ampliamente difundido en la naturaleza, agua y suelo, además, es habitante normal

del tracto intestinal del hombre y animales de sangre caliente.

24

Se caracterizan por ser bacilos Gram. negativos, aerobios o anaerobios facultativos,

son oxidasa negativa, no formadores de esporas y son capaces de fermentar la lactosa

con producción de acido y gas a 35ºC +/- 2°C en un tiempo máximo de 48 horas.

(ORDOÑEZ, 2000).

El grupo de bacterias coliformes es el principal indicador de la adecuación del agua

para usos domésticos, industriales o de otro tipo. La experiencia ha mostrado que la

densidad del grupo de los coliformes es un indicador del grado de contaminación, y

por tanto, de la calidad sanitaria. (AWWA-WPC, 2000).

2.2.1.2. Coliformes fecales

Los coliformes fecales, también denominados coliformes termotolerantes, se

caracterizan por soportar temperaturas hasta 45ºC; comprende un grupo muy

reducido de microorganismos, entre los que se destaca Escherichia coli siendo el más

reconocido representante de contaminación de alimentos por origen fecal, por lo tanto

es el principal indicador de higiene en los alimentos. (ORDOÑEZ, 2000).

Escherichia coli se caracteriza por ser una bacteria Gram. negativa, capaz de

fermentar la lactosa a una temperatura entre 44ºC y 44.5ºC, es indol positivo, y tiene

un origen específicamente fecal, pues está siempre presente en grandes cantidades en

las heces de los seres vivos de sangre caliente y rara vez se encuentra en agua o suelo

que no haya sufrido algún tipo de contaminación fecal.

Desde hace tiempo se reconoce que los organismos del grupo coliforme son un buen

indicador microbiano de la calidad del agua potable, debido principalmente a que son

de fácil detección y se pueden enumerar en el agua. La presencia de Escherichia coli

en muestras de agua potable, indica la existencia de fallas en la eficacia de

tratamiento de aguas, en la integridad del sistema de distribución, y por tanto

evidencia de contaminación de diferentes orígenes: suelo, superficies de agua dulce y

tracto digestivo. (MILLIPORE, 2005).

25

2.3. ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO DE AGUAS

El agua cruda o el agua inadecuadamente tratada, puede contener microorganismos

patógenos, es decir, que pueden causar enfermedades y aun la muerte. Las bacterias

del grupo coniforme, están asociadas con los organismos patogénicos y son un buen

índice del grado de seguridad bacteriológico del agua. Las bacterias coliformes viven

y hacen parte de la flora del intestino humano y de otros animales, y son descargados

en gran cantidad en las heces humanas y las de esos animales. Cuando aparecen

bacterias coliformes en el agua, se asume que otra clase de microorganismos capaces

de causar enfermedades, pueden estar presentes. De igual forma, su ausencia es un

indicativo de que el agua es bacteriológicamente segura para el consumo humano.

En el análisis microbiológico de las aguas crudas no se buscan directamente las

bacterias o virus patógenos, sino algunas bacterias indicadoras de contaminación por

heces fecales y que sin ser patógenas residen en el intestino del hombre y de los

animales, las bacterias coliformes.

Existen diversas técnicas de análisis microbiológico que permiten detectar la

presencia de ciertos microorganismos indicadores de contaminación tales como el

método de filtración por membrana, la técnica del NMP o fermentación en tubos

múltiples, los cuales son utilizados como control de calidad en acueductos o

industrias donde se requiere procesar un gran número de muestras. (ORTIZ, 1999)

2.3.1. Plan de muestreo (recolección y recepción de muestras)

Todo programa que se establezca para el control de calidad del agua tiene como base

fundamental el muestreo, la seriedad y responsabilidad con que se lleve a cabo esta

actividad.

26

Para la recolección de muestras de aguas se deben utilizar frascos de vidrio de fácil

esterilización los cuales son suministrados por el laboratorio que realiza el análisis,

con capacidad de 300 mL. El frasco estéril debe ser llenado hasta las tres cuartas

partes de su capacidad y tapado inmediatamente. Si la muestra es agua tratada con

cloro, el frasco debe contener 0.5 mL de tiosulfato de sodio al 10%. La solución de

tiosulfato de sodio actúa como inhibidor del cloro para evitar la muerte de los

microorganismos presentes en la muestra. (PALMA, 1999)

La muestra debe llevarse lo más rápidamente posible al laboratorio (no demorar más

de 4 horas). Si es necesario demorarla más tiempo se debe refrigerar desde el

momento de la toma (no más de 20 horas).

Condiciones generales para la recolección de muestras:

· Disponer de los recipientes y demás materiales apropiados según el estudio que

se vaya a realizar.

· Cerciorarse que el frasco tenga el aditivo apropiado (Tiosulfato de sodio)

· Asegurarse que la composición de la muestra tomada, refleje fielmente la del

total del suministro o fuente de agua, es decir, que sea representativa del sistema.

· Utilizar técnicas de recolección que no afecten por descuido u omisiones la

calidad del agua recolectada, con respecto a su fuente original.

· Cuando se vaya a tomar muestra para análisis microbiológico no enjuagar el

frasco con la muestra.

· Para análisis físico-químico el frasco no debe tener aditivos y debe enjuagarse

el frasco con la misma muestra.

· Identificar la muestra.

· Consignar inmediatamente después de la toma todos los datos importantes que

permitan identificar correctamente la muestra:

27

* Lugar exacto del muestreo

* Fecha y hora de toma

* Cloro residual (total o libre) encontrado en el momento del muestreo

* Otras condiciones especiales: si la muestra viene directamente de la red de

distribución, de un tanque subterráneo o elevado, pozo, etc.

* Si es agua de río, quebrada, laguna, estanque, etc, o motivo de la solicitud

(Intoxicación, control, etc.)

* Anotar las condiciones en el momento de tomar la muestra (temperatura del

ambiente, temperatura del agua, viento, lluvia, etc.).

2.3.1.1. Toma de muestras en grifos o llaves

Se debe limpiar cuidadosamente el grifo o tubo. La abertura de salida y sus

inmediaciones deben flamearse con llama de alcohol. Se deben escoger grifos que no

tengan escapes por el vastazo, debido a que el agua que sale por allí se contamina e

invalida la muestra. Se deja fluir el agua lo más intensamente posible para quitar las

impurezas adheridas. Posteriormente se debe regular el chorro de agua al espesor de

un lápiz. Se llena rápidamente el frasco hasta la mitad más o menos, si es para

examen microbiológico evitando salpicaduras y totalmente lleno si es para análisis

físico-químico.

En pozos con bomba debe bombearse lenta y uniformemente durante 10 minutos

antes de tomar la muestra.

2.3.1.2. Toma de muestras en pozos carentes de bomba

Preparar el frasco de la siguiente manera:

28

Fijar un alambre al cuello del frasco. Envolver el conjunto en papel de aluminio y

esterilizar. Al tomar la muestra no tocar el exterior del frasco. No tomar de la parte

sobrenadante del pozo.

2.3.1.3. Toma de muestras en ríos, lagos, quebradas, represas

Se debe estudiar la situación de acuerdo con los recursos del laboratorio, objeto del

examen, fuente de contaminación, etc., excepto en casos especiales, no tomar muestra

superficialmente en sitios donde permanezca estancada ni donde se presenten

turbulencias por agitación accidental.

Se realiza el procedimiento de la siguiente manera:

* Colocarse frente a la dirección de las corrientes de agua.

* Sumergir el frasco debajo de la superficie del agua unos 15 a 20 cm, realizando un

semicírculo en la dirección de la corriente. Así se evita contaminar el agua por las

manos del operario. Si no hay corriente de agua, crearla por el movimiento del frasco.

* Evitar recoger material flotante. Este se puede tomar como muestra especial.

* Evitar tomar material del fondo.

2.3.1.4. Transporte y almacenamiento de las muestras

Si las muestras no van a ser analizadas antes de una hora de haber sido tomadas,

deben refrigerarse durante el transporte a 4ºC, y deben estar completa e

inconfundiblemente identificadas.

No debe de transcurrir más de 6 horas entre la toma de muestra y el análisis y

máximo 2 horas en el laboratorio. Si esto no se puede cumplir, las muestras deben ser

conservadas a temperatura inferior a 4ºC sin ser congeladas.

29

2.4. MÉTODO DE FILTRACIÓN POR MEMBRANA

Para la detección de coliformes totales y coliformes fecales (E. coli) es utilizado el

método de filtración por membrana, el cual es un método altamente reproducible,

puede usarse para analizar volúmenes de muestra relativamente grandes y se obtienen

resultados en menor tiempo que con el NMP. Sin embargo, no puede aplicarse a

cualquier tipo de muestra y tiene sus limitaciones. También se encuentra entre los

métodos standards. A los efectos de la filtración por membrana debe replantearse la

definición de coliformes: bastones Gram. (-), aerobios o anaerobios facultativos, que

dan colonias oscuras con brillo metálico en medio Endo, luego de 24 horas de

incubación a 35ºC +/- 2°C. La determinación de coliformes fecales por filtración

puede hacerse a partir de las colonias desarrolladas en Endo o directamente

incubando la membrana en medio m-FC e incubando a 44,5ºC.

2.4.1. Fundamento del método de filtración por membrana

La muestra de agua se hace pasar mediante vacío por un filtro de celulosa de 0.45

micras de tamaño de poro, para que queden retenidas en él, las bacterias de tipo

coniforme y las mesofílicas. El filtro es colocado en un medio de cultivo especifico

para lo que se desea determinar en la muestra (coliformes totales, coliformes fecales y

microorganismos mesofílicos), incubando a 35ºC +/- 2ºC durante 18 a 20 horas.

(PALMA, 1999 ).

2.4.2. Características del filtro de membrana

Se debe utilizar filtro de membrana con un diámetro de poro que permita una

completa retención de las bacterias coliformes. Se debe tener en cuenta que estos

filtros estén libres de químicos susceptibles de inhibir el crecimiento y desarrollo

bacteriano, que posean una velocidad de filtración satisfactoria. (MILLIPORE, 2005).

30

2.4.3. Ventajas y desventajas del método de filtración por membrana

El método de filtración por membrana es un método ágil y poco dispendioso. La

lectura de resultados se da en un menor tiempo (24 horas) a comparación del método

NMP, además se puede utilizar en pruebas de campo, empleando accesorios

adecuados. El análisis se dificulta en muestras de aguas muy turbias o con abundante

carga bacteriana. Este inconveniente es posible remediarlo, haciendo diluciones de la

muestra o haciendo inóculos muy pequeños de acuerdo con el tipo de muestra a

analizar. (PALMA, 1999 ).

2.4.4. Uso del equipo de filtración por membrana

Colocar el portafiltros estéril sobre la base del manifold

Colocar el embudo estéril sobre el receptáculo y fijarlo con las pinzas que trae el equipo

Llenar el embudo con 80 a 100 ml de agua destilada estéril

Dejar filtrar aplicando vacio

Cerrar las llaves del manifold y adicionar 20 – 30 mLde alcohol al 70%

31

Con pinzas estériles colocar un filtro de celulosa en cada portafiltros, con la cuadricula hacia arriba,

sobre la parte porosa del receptáculo

Abrir las llaves del manifold y dejar filtrar

Cerrar las llaves del manifold y retirar el embudo

Pasar el mechero por cada filtro para encender el alcohol, dejar el alcohol encendido durante 3

minutos

Adicionar nuevamente 100 mL de agua destilada estéril y dejar filtrar

32

(Apha, 2005)

Colocar el embudo y adicionar la muestra a analizar

Cuando finalice el filtrado de cada una de las muestras cerrar las llaves del manifold, retirar el

embudo, tomar el filtro con pinzas estériles y colocarlo sobre la superficie del medio Endo y

m-FC

Agua Tratada Agua Cruda

Filtrar 100 mL de cada muestra a analizar

Diluir la muestra 1/10 y filtrar

Incubar las cajas a la temperatura adecuada:

Medio Endo: 37°C +/- 2°C

Medio m-FC: 44.5°C en baño maría

Realizar el recuento de las colonias características:

Medio Endo: colonias rojas

Medio m-FC: colonias azules

33

3. JUSTIFICACIÓN

La acreditación es un proceso que contribuye a la mejora continua de la calidad de los

servicios que prestan los laboratorios. La participación en los procesos de

acreditación es decisión de la dirección de cada laboratorio, y por lo tanto, debe ser

accesible a todos los establecimientos que estén debidamente registrados y

habilitados por las autoridades nacionales del país. El propósito de la acreditación es

formalizar el reconocimiento, por un ente independiente, que los laboratorios han

implementado un sistema que pretende garantizar la calidad de sus servicios.

Para llevar a cabo el proceso de acreditación los laboratorios deben dar cumplimiento

a la norma ISO/IEC 17025 “Requisitos generales para la competencia de laboratorios

de prueba y calibración”, la cual es de vital cumplimiento en el proceso de

acreditación del laboratorio. Esta norma contiene todos los requisitos que los

laboratorios de ensayo y de calibración deben conocer, si desean demostrar que

operan de acuerdo a un sistema de calidad, son técnicamente competentes y son

capaces de generar resultados válidos técnicamente. Según la norma ISO/IEC 17025

los laboratorios deben validar todos los métodos que se utilicen en el laboratorio,

tanto los desarrollados por ellos mismos como aquellos procedentes de fuentes

bibliográficas o desarrollados por otros laboratorios. Además, es necesario que el

laboratorio valide los métodos de referencia; aunque en este caso, no es necesario que

el laboratorio realice una validación completa.

El laboratorio de salud pública del Huila (LSPH) está en busca de la acreditación, la

cual tiene por objeto reconocer la competencia técnica y la idoneidad de organismos

de certificación e inspección, con las normas y los reglamentos que le son de

aplicación, a través de evaluación y auditoría de las mismas, siguiendo criterios

transparentes y públicos.

Debido a esto se hace necesario validar el método de filtración por membrana para la

detección de Coliformes totales y Escherichia coli, en muestras de para consumo

34

humano, el cual es utilizado diariamente en el laboratorio para el análisis

microbiológico aguas para consumo humano.

35

4. OBJETIVOS

4.1. OBJETIVO GENERAL

Realizar la validación secundaria del método de filtración por membrana para la

detección de Coliformes Totales y Escherichia coli en aguas para consumo humano

analizadas en el Laboratorio de Salud Publica del Huila.

4.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS

· Evaluar la calidad de los medios de cultivo Endo y m-FC por medio de

pruebas de esterilidad, selectividad y eficacia.

· Evaluar la precisión del método de filtración por membrana para la detección

de Coliformes Totales y Escherichia coli en muestras de agua para consumo

humano.

· Evaluar la exactitud del método de filtración por membrana para la detección

de Coliformes Totales y Escherichia coli en muestras de agua para consumo humano.

· Realizar el análisis estadístico de los resultados obtenidos durante el estudio.

36

5. MATERIALES Y MÉTODOS

5.1. DISEÑO DE LA INVESTIGACIÓN

Se realizó un estudio experimental basado en la metodología aplicada por el Instituto

Nacional de Salud, donde la validación fue de tipo concurrente, ya que la información

fue obtenida durante el tiempo que duro el estudio, realizando monitoreo de todo el

proceso para garantizar que se estaba trabajando bajo control.

El presente trabajo de grado fue realizado en el Laboratorio de Salud Publica del

Huila.

Para llevar a cabo la validación del método de filtración por membrana, se analizaron

dos muestras de agua, que poseían las características requeridas para las cuales el

método es utilizado rutinariamente, así mismo, se evaluaron los parámetros de

precisión y exactitud del método.

5.2. MATERIALES

Filtros de membrana (poro de 0.45um)

Pinzas

Micro pipeta automática 100-1000 UL

Puntas azules estériles

Cepas microbianas

Cepa de Escherichia coli con número de referencia ATCC 25922

Cepa de Staphylococcus aureus con número de referencia ATCC 25923

37

Material de vidrio

Tubos tapa rosca

Frascos grandes ámbar con alcohol al 70%

Frascos grandes ámbar con agua destilada estéril

Frascos Schott de 250 ml

Material de plástico

Cajas de petri grandes

Medios de cultivo

Cajas de petri plásticas con medio Endo listo para su uso

Cajas de petri plásticas con medio m-FC listo para su uso

Agar plate Count

Agar OGY

Agar Mc Conkey

Agar Sangre

Reactivos

Cloruro de bario

Acido sulfúrico

38

Equipos

Incubadora a 35°C +/- 2°C

Baño de maría a 44.5°C

Espectrofotómetro

Vortex

Equipo de filtración por membrana

5.3. PRUEBA DE VIABILIDAD Y PUREZA DE LAS CEPAS

Se verificó que las cepas de referencia utilizadas para el estudio de validación, ATCC

25922 Escherichia coli y ATCC 25923 Staphylococcus aureus, estuvieran viables y

con una pureza del 100%. El Laboratorio de Salud Publica cuenta con su propio

cepario. Las cepas se encuentran conservadas en leche descremada a -70°C. Se tomo

un vial de cada cepa y se sembró por agotamiento en medio Mc Conkey la cepa de

Escherichia coli y en agar sangre la cepa de Staphylococcus aureus, las cuales fueron

incubadas a 37°C durante 24 horas. Pasado el periodo de incubación se procedió a

realizar coloración de Gram. e identificación bioquímica de cada cepa, utilizando API

20 E para E. coli y realizando prueba de oxidasa, catalasa y coagulasa para la S.

aureus. De igual manera la cepa se identificó en forma automatizada por el equipo de

Microscan, logrando un aceptabilidad de 99.9% con respecto a su identificación..

Determinada la pureza y viabilidad de cada cepa, se realizaron repiques en los

respectivos medios, para el trabajo diario y así mantener las cepas en fase

exponencial.

39

5.4. PREPARACIÓN DEL PATRÓN DE MCFARLAND

Se preparo el tubo 0.5 de la escala de Mcfarland, utilizando 0.05 mL de cloruro de

bario al 1% y 9.95 mL de ácido sulfúrico al 1% el cual contenía una pureza del 96.3%

leyéndose su absorbancia a una longitud de onda de 620nm.

5.5. CONTROL DE CALIDAD DE LOS MEDIOS DE CULTIVO

Para la detección de coliformes Totales y Escherichia coli en muestras de aguas para

consumo humano se utilizaron los medios de cultivo Endo para Coliformes Totales y

el medio m-FC para la detección de Escherichia coli. Estos medios de cultivo son

medios que vienen listos para su uso, por lo tanto se verificó su esterilidad,

selectividad y eficacia para así poder comprobar las especificaciones entregadas por

el fabricante (Palma, 1998). Así mismo se realizo la prueba de esterilidad para los

medios de cultivos preparados, agar Mc Conkey, agar Ogy, agar Plate Count y para el

agar sangre el cual también viene listo para el uso, como también se realizo este

control al agua destilada estéril.

5.5.1. Control de esterilidad

La prueba de esterilidad de los medios de cultivo utilizados para el análisis se realizó

de la siguiente manera:

· Se seleccionó aleatoriamente el 10% de los medios de cultivo que se utilizaron

para la validación. Las cajas fueron hidratadas con agua destilada estéril. Las cajas

con medio Endo se incubaron a 37°C durante 24 horas y las cajas con medio m-FC a

40

44.5°C, con el fin de verificar que estos medios no presentaran crecimiento de ningún

tipo de microorganismo. (SARTORIUS, 2003).

· Se sirvieron en cajas de petri estériles los medios Mc Conkey, Plate Count y

OGY, tomando el 10% de cada medio para su respectivo análisis. Se incubo a 37°C

durante 48 horas. Se verifico que pasado el tiempo de incubación no hubiese

crecimiento de ningún tipo de microorganismo (Allaert, 2002)

· Se comprobó la esterilidad del agua destilada estéril que se utilizó para la

hidratación de los medios de cultivo, para las suspensiones y diluciones bacterianas.

Se tomaron 400 ml de agua la cual fue analizada por el método de filtración por

membrana, tomando 100 ml para cada replica. Se realizaron cuatro replicas de las

cuales 2 fueron incubadas en medio Endo a 37°C y las otras dos fueron incubadas en

medio m-FC a 44.5°C durante 24 horas. Se evaluó el crecimiento solamente de estos

dos microorganismos ya que los medios son selectivos para el microorganismo en

estudio (E. coli) según las especificaciones del fabricante.

5.5.2. Prueba de selectividad y eficacia

Para evaluar la selectividad y eficacia de los medios Endo y m-FC se utilizó una

suspensión de Staphylococcus aureus y una suspensión de Escherichia coli obtenidas

del cepario del Laboratorio de Salud Publica del Huila. Cada suspensión fue realizada

en 10 mL de agua destilada estéril y comparada con la turbidez del tubo 0.5 del

patrón de Mcfarland, las cuales fueron analizadas por el método de filtración por

membrana, evaluando simultáneamente las cajas con medio Endo y las cajas con

medio m-FC incubando a las respectivas temperaturas. Para comprobar la

selectividad y eficacia de cada medio, se verifico visualmente que solo hubiera

crecimiento de Escherichia coli y ausencia de crecimiento de Staphylococcus aureus,

ya que son medios listos para el uso.

41

El medio Endo se utiliza para la identificación de coliformes totales a 37°C durante

24 horas, usando filtros de celulosa con un tamaño de poro de 0.45 micras. Al pasar

la muestra de agua a través de este filtro mediante la aplicación de vacio las bacterias

las cuales son de mayor tamaño quedan retenidas en este. Los coliformes totales que

fermentan la lactosa crecen en este medio formando colonias rojas, brillantes y

convexas, en este medio E. coli crece con brillo verde metálico. (SARTORIUS,

2003).

El medio m-FC se utiliza para la determinación de Escherichia coli y coliformes

fecales, a temperatura de incubación de 44.5°C. Estos microorganismos crecen

formando colonias de color azul intenso brillantes y convexas (SARTORIUS, 2003).

5.6. CONTROL DE AMBIENTES

Se seleccionaron tres puntos de muestreo. Mediante la técnica de sedimentación, en

cada punto se colocó una caja con agar OGY para el recuento de hongos y levaduras

y una caja con agar Plate Count para el recuento de bacterias mesófilas, durante 15

minutos. Las cajas con agar Plate count fueron incubadas a 37°C +/- 2°C durante 24

horas, y las cajas con agar OGY se dejaron a temperatura ambiente durante 5 días.

Finalizado el periodo de incubación, se realizo el recuento de microorganismos. Este

procedimiento fue realizado cada vez que se realizaba el estudio de validación.

5.7. CONTROL DE EQUIPOS

Se reviso la documentación de mantenimiento y calibración de equipos y se llevo el

registro del uso de cada uno de los equipos utilizados en el estudio de validación,

mediante la utilización de formatos de registro que ya tiene establecido el Laboratorio

de Salud Publica del Huila.

42

5.8. VALIDACIÓN DEL METODO DE FILTRACION POR MEMBRANA PARA LA DETECCION DE COLIFORMES TOTALES Y E. coli EN MUESTRAS DE AGUAS PARA EL CONSUMO HUMANO

La metodología para realizar la validación del método de filtración por membrana, se

llevo a cabo de acuerdo al protocolo descrito por el Instituto Nacional de Salud.

(Palma, 1998).

Antes de llevar a cabo el proceso de validación se realizó la estandarización del tubo

0.5 del patrón de Mcfarland y ensayos preliminares de repetibilidad, con el fin de

obtener un dominio del método.

5.8.1. Estandarización del tubo 0.5 de Mcfarland

Se realizo la estandarización de la lectura del tubo 0.5 de Mcfarland para comprobar

que efectivamente se estaba partiendo de 150 millones de bacterias/mL, realizando

varias mediciones para obtener un rango promedio de lectura de absorbancia. (Ver

figura 1).

a. Lectura tubo Mcfarland

Tubo 0.5 de

Mcfarland Leer a 620 nm

43

b. Comparación de la suspensión de E. coli con el tubo de Mcfarland

comparar 15 x 107 UFC/mL

c. Diluciones de la suspension bacteriana

1/100 1/100 1/100

1/10

15 x 107 15 x 105 15 x 103 15x 103 15 Bact/mL

FIGURA 1 Esquema de la estandarización del tubo 0.5 de Mcfarland. a) Lectura tubo 0.5 de Mcfarland. b) Comparación del tubo 0.5 de Mcfarland con la suspensión de E. coli. c) Preparación de las diluciones de la concentración de 5 bacterias/ml.

Tubo 0.5 de

Mcfarland Suspensión E.

coli

Leer a 620 nm

10 mL ADE

44

Obtenida la concentración de 15 bacterias/ml, se realizaron cuatro replicas tomando 4

mL de esta suspensión y adicionando 1 ml a cada frasco que contenía 99 ml de agua

destilada estéril, para completar un volumen final de 100 ml, la totalidad de cada

frasco fue analizada por el método de filtración por membrana. Se realizaron 10

mediciones de cuatro replicas cada una, realizando una medición diaria, de las cuales

dos eran para ser sembradas en medio Endo y dos en medio m-FC y se llevaron a

incubar a las respectivas temperaturas durante 24 horas. Después de 24 horas se

realizo el recuento de las colonias características en cada medio. Este procedimiento

fue realizado cada vez que se hacia una medición. (Ortiz, 2008)

5.8.2. Ensayo preliminar de repetibilidad

Se analizaron tres concentraciones diferentes de Escherichia coli, las cuales se

encontraran dentro del nivel bajo, medio y alto de detección del método. Las

concentraciones analizadas fueron: 5 bacterias/ml, 20 bacterias/ml y 70 bacterias/ml.

En todo el proceso de validación se partió inicialmente de una concentración de 130

millones de bacterias/ml, la cual fue determinada a través de las mediciones que se

realizaron en la estandarización de la lectura del tubo 0.5 de Mcfarland.

Para llegar a la concentración de 5 bacterias/ml se procedió de la siguiente manera:

Se preparó una suspensión de E. coli en 40 ml de agua destilada estéril, se comparó

con el tubo 0.5 de Mcfarland, se leyó en el espectrofotómetro a 620 nm y se

comprobó que estuviera entre el rango de absorbencias establecido anteriormente. A

partir de esta suspensión, para obtener la concentración de 5 bacterias/mL, se utilizo

la fórmula: V1 X C1 = V2 X C2 en donde:

V1= 10 ml

45

C1= 130.000.000 bacterias/mL

V2= ?

C2= 50.000.000 bacterias/mL

Despejando la formula se obtuvo un resultado en volumen que se denominó volumen

final.

V2 = 10 mL X 130.000.000 bac/mL = 26 mL

50.000.000 bac/mL

El volumen final para la concentración de 50 millones de bacterias/mL fue de 26 mL,

como ya se tenían 10 mL del volumen inicial, al volumen final se le restaron estos 10

mL iniciales adicionando la diferencia en agua destilada estéril, para completar el

volumen final de 26 mL. (Ver figura 2).

Suspensión E.coli Adicionar

10 ml

Comparar

Tubo 0.5 de

Mcfarland

40 mL

ADE

46

50 X 106 UFC/ml

1/100 1/100 1/100 1/10

50 x 106 50 x 104 50 x 102 50 UFC/ml 5 UFC/ml

FIGURA 2. Esquema para preparar la concentración de 5 bacterias/ml

Este mismo procedimiento fue realizado para las otras dos concentraciones teniendo

en cuenta la concentración final a la que se quería llegar.

Una vez obtenida cada concentración final 5, 20 y 70 bacterias, se tomo veinte

mililitros de cada una adicionando un mililitro a frascos schott estériles que contenían

99 mL de agua destilada estéril para ser analizadas por el método de filtración por

membrana. Se realizaron veinte replicas de cada concentración sembrando 10

Volumen final

26 mL

16 mL

ADE

47

replicas en medio Endo y 10 replicas en medio m-FC e incubadas en las respectivas

temperaturas.

Con los datos obtenidos se realizo el análisis estadístico, calculando la media,

desviación estándar y coeficiente de variación el cual debe ser menor o igual al 10%.

(Ortiz, 2008)

5.8.3. Validación del método de filtración por membrana

De acuerdo a la metodología adoptada por el INSTITUTO NACIONAL DE SALUD

(INS), la cantidad de soluciones analizadas que conformaron el diseño experimental

fue de 48, distribuidas en seis (6) lotes, de ocho (8) soluciones cada una, analizando

las siguientes soluciones en cada lote: 2 blancos, dos muestras naturales, dos muestras

mas adición de 0.4C y 0.7C y dos soluciones estándares. El estudio se procesó

durante seis días, en donde cada lote era un día.

Cada solución fue preparada como se explico en el ensayo preliminar de

repetibilidad. (Ver figura 2), tomando cuatro mililitros de cada concentración a

evaluar, para ser adicionado un mililitro en frascos schott que contenían 99mL de

agua destilada estéril, para obtener un total de cuatro replicas por concentración de las

cuales dos fueron para analizar coliformes totales y dos para analizar coliformes

fecales (E. coli). Cada solución fue analizada por duplicado, con el fin de realizar las

cartas de control.

No se realizo un control negativo, ya que al momento de hacer la prueba de

selectividad y eficacia de los medios, se comprobó cual era el crecimiento de E. coli y

S. aureus en cada medio.

48

5.8.3.1. Descripción de soluciones y muestras

Blancos: Se utilizo agua destilada estéril, el cual fue sometido al mismo

procedimiento analítico de las demás soluciones.

Soluciones estándares: Cubren el rango de detección del método. Se usaron dos

estándares, los cuales estaban cerca al límite inferior y superior del rango de

detección del método (0.09 C y 0.9 C, donde C es el límite superior de detección del

método), el cual fue de 80 UFC/mL, que ya está establecido por el Instituto Nacional

de Salud, además, es el máximo nivel en el que se puede hacer un recuento

significativo de microorganismos, que para este caso fue E.coli.

Muestras naturales: Deben de poseer las características para las cuales el método es

utilizado rutinariamente. Las muestras naturales analizadas, eran agua en bolsa de dos

marcas diferentes. A estas bolsas de agua se les realizo una evaluación antes del

proceso de validación, con el fin de comprobar que no presentaban crecimiento de

coliformes totales ni fecales. Se analizó el 10% de las bolsas de agua de cada marca,

adicionando 100 ml de cada muestra a frascos Schott estériles de 250 ml que

contenían 0.5 ml de tiosulfato, el cual es un inhibidor del cloro presente en cada

muestra, que permite determinar la concentración de microorganismos indicadores de

contaminación presentes en cada una. Cada muestra fue analizada por el equipo de

filtración por membrana sembrando simultáneamente en medio Endo y en medio m-

FC e incubadas a las respectivas temperaturas durante 24 horas. Finalizado el periodo

de incubación se comprobó que ninguna de las dos marcas de agua presentara

crecimiento característico en cada uno de los medios de cultivo.

Muestras adicionadas: Hace referencia a las muestras naturales, a las cuales se les

adicionó una cantidad conocida del microorganismo en estudio, denominadas 0.4 C

(equivalente a 32 bacterias/ml) y 0.7 C (equivalente a 56 bacterias/mL). Con la

adición de cada concentración conocida se determino la exactitud del método

mediante la evaluación de la recuperación.

49

5.8.4. Elaboración de cartas R/ para el control de calidad analítica interna del laboratorio

Para realizar las cartas de control, los datos fueron obtenidos durante el

procedimiento de validación, en donde cada solución se analizo por duplicado.

Al terminar la validación se calculó el n (número de datos), E (sumatoria), y R/

(promedio) de la columna R.

Se calculo el LCS (límite superior de control) mediante la fórmula:

3.27 x R/

Se calculó el LCI (límite inferior de control) mediante la fórmula:

R x 0

(OTALORA, 2005)

5.8.5. Evaluación de la validación

Se realizo análisis estadístico de los resultados obtenidos mediante un programa

elaborado en Excel (Aplicativo Validar 1.1). (Anexos 4-7). La precisión del método

fue evaluada con la aceptabilidad de las desviaciones estándares de cada solución, las

cuales debían de estar en el rango de la meta a alcanzar (W), correspondiente al 5%

de la concentración de la gran media ó a 0.25 veces el valor mínimo de interés que en

este caso fue 8. Así mismo se evaluó la repetibilidad dentro de lotes, la cual fue

analizada solo para el blanco ya que fue la única solución que se realizo por

duplicado, y reproducibilidad entre los lotes, debido a que el estudio fue realizado en

6 días diferentes. A pesar de que todas las soluciones se realizaron por duplicado, el

valor de las dos mediciones fue tenido en cuenta para la elaboración de las cartas

50

control. Mientras que para el aplicativo se realizo el promedio de las dos replicas,

tomando el resultado como el valor encontrado, puesto que el diseño establece que

solo los blancos se repiten, las demás soluciones no. (Ortiz, 2202).

La exactitud se evaluó mediante la recuperación de una concentración conocida de

E. coli a las dos muestras naturales (0.4C y 0.7C), comprobándose que el promedio

de la recuperación no difiere significativamente del 95 al 105% de la recuperación

esperada.

5.9. INFORME DE RESULTADOS

Mediante la evaluación de los parámetros estadísticos tales como la media,

desviación estándar total dentro de lotes y entre lotes y recuperación, se analizaron

los respectivos datos obtenidos, para determinar la precisión y exactitud del método

de filtración por membrana para la detección de coliformes totales y fecales (E. coli)

en muestras de agua para consumo humano.

51

6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS

6.1. PRUEBA DE VIABILIDAD Y PUREZA DE LAS CEPAS DE REFERENCIA

Macroscópicamente la cepa de Escherichia coli, presentó las siguientes

características: colonias rosadas (lactosa positivas) grandes y redondas. (Figura 3).

FIGURA 3 Crecimiento de E. coli en agar Mc Conkey

En la coloración de Gram. se observo solo la presencia de bacilos Gram negativos y

mediante la utilización del API 20E, se comprobó la identificación del

microorganismo evaluado, encontrándose el código de lectura 5144552, el cual hace

referencia a Escherichia coli. (Figura 4).

52

FIGURA 4 Identificación bioquímica de E. coli

La cepa de Staphylococcus aureus macroscópicamente presentó las siguientes

características: colonias de color amarillo cremoso con presencias de halo de

hemolisis. (Figura 5).

FIGURA 5 Crecimiento de S. aureus en agar sangre

53

Microscopicamente se evidenciaron cocos Gram positivos, y en la identificacion

bioquimica se obtuvieron los siguientes resultados: coagulasa (+), catalasa (+) y

oxidasa (-).

Con estos resultados se comprobo que las cepas utilizadas estaban completamente

puras ya que no se evidencio la presencia de microorganismos contaminantes como

se pudo observar en las coloraciones de Gram, de la misma manera, se comprobo la

viabilidad ya que las dos cepas obtuvieron un buen crecimiento en los respectivos

medios en que se realizaron las siembras.

6.2. CONTROL DE CALIDAD DE LOS MEDIOS DE CULTIVO

El control de calidad en la preparación y evaluación de los medios de cultivo es

considerado como parte esencial de las buenas prácticas de laboratorio, el cual es

necesario para mantener el nivel y la ejecución de cualquier técnica microbiológica,

siendo este un proceso continuo que se extiende desde las materias primas, hasta el

producto final utilizado, el cual es evaluado directamente por el laboratorio que

emplea el medio de cultivo para su análisis. Por esta razón, el control de calidad de

los medios de cultivo está considerado como uno de los puntos críticos de control, del

cual depende la seguridad y confiabilidad de los resultados que emiten los

laboratorios de ensayo. (Soler, 2006)

6.2.1. Control de esterilidad

Por medio del análisis del 10% de los medios de cultivo utilizados en el proceso de

validación, se comprobó la esterilidad de cada uno, ya que no hubo crecimiento de

ningún tipo de microorganismo, permitiendo así la utilización satisfactoria de cada

medio.

54

El agua destilada estéril que se utilizo, para la hidratación de los medios Endo y m-

FC, como para las suspensiones y diluciones bacterianas, estaba completamente

estéril, ya que al ser analizada por el método de filtración por membrana no presento

ningún tipo de crecimiento bacteriano.

6.2.2. Prueba de selectividad y eficacia

La composición química de un medio de cultivo debe proveer los requerimientos

nutricionales básicos para el crecimiento de los microorganismos. Debido a la

variabilidad de pequeños errores en la preparación de los medios de cultivo, es

recomendable realizar una evaluación antes de su utilización, sin embargo, un medio

de cultivo debe cumplir con dos características importantes, la selectividad y la

eficacia. (Padilla, 2002).

Este control fue realizado para comprobar la eficacia y selectividad de los medios

Endo y m-FC, observándose crecimiento de la cepa de Escherichia coli en los dos

medios de cultivo utilizados, y ausencia de crecimiento de Staphylococcus aureus,

comprobándose que los medios de cultivo evaluados son altamente selectivos y

eficaces, ya que permitieron solo el crecimiento de Escherichia coli inhibiendo

completamente el crecimiento de Staphylococcus aureus. (Figura 6 y 7). Comprobada

la ausencia de crecimiento de S. aureus, no se realizaron controles negativos durante

la validación, ya que los medios de cultivo solamente permiten el crecimiento de E.

coli.

55

Medio Endo Medio m-FC

FIGURA 6 Crecimiento de E.coli en medio Endo y en medio m-FC

FIGURA 7 Crecimiento de S. aureus en medio Endo y en medio m-FC

6.3. CONTROL DE EQUIPOS

En la implementación de la norma ISO 17025, es de gran importancia dentro de los

procesos de validación de análisis microbiológicos, utilizar equipos debidamente

calibrados. Es importante que el laboratorio emplee métodos y procedimientos

apropiados para todos los ensayos y/o calibraciones, ya que el laboratorio debe

equiparse con todos los elementos que garanticen un margen de trazabilidad en las

56

medidas que se realizan durante su utilización dentro de la ejecución del análisis o

método microbiológico y así avalar los resultados de las pruebas. (Soler, 2006).

En este caso el Laboratorio debe tener programas de mantenimiento y calibración;

calibrar y revisar los equipo antes de ponerse en servicio, con el fin de establecer si

reúne los requisitos de las especificaciones del Laboratorio y si cumple las

especificaciones de normatividad pertinente, (Soler, 2006).

De la misma manera, todos los equipos deben ser registrados con la indicación de la

frecuencia de mantenimiento así como de las operaciones que realiza este y el

responsable de su verificación. (Galeano, 2007).

Al iniciar el proceso de validación se reviso el historial de los equipos utilizados en el

proceso de validación, incluyendo certificados de calibración, mantenimiento y

registro de su uso durante el estudio, (Anexo 3). Los equipos utilizados, se

encontraban funcionando correctamente y dentro de los rangos esperados.

6.4. CONTROL DE AMBIENTES

Durante el proceso de validación se llevo a cabo el control de ambientes por medio

del método de sedimentación en medio Plate count para bacterias mesófilas aerobias

y en medio OGY para la determinación de hongos y levaduras. EL recuento obtenido

se muestra en la tabla 1.

57

TABLA 1 Recuento de bacterias aerobias mesófilas, hongos y levaduras

PRUEBA REALIZADA Recuento de bacterias

mesófilas aerobias UFC/

15 min. de exposición

Recuento de Hongos y

levaduras UFC/15 min.

De exposición

Prueba de esterilidad 0 0

Prueba repetibilidad

1 5 2

2 3 0

3 4 0

Fuente: Autor

Los resultados obtenidos del control de ambientes del área donde se realizo la

validación del método, indican una carga baja de microorganismos presentes, (Tabla

1), lo que permite inferir que se cumplen con buenas condiciones de limpieza y

desinfección de esta área.

Los formatos de registro de limpieza del Laboratorio se encuentran en el anexo 3.

6.5. VALIDACIÓN DEL METODO DE FILTRACION POR MEMBRANA

Es de vital importancia la validación de métodos dentro de un proceso de

acreditación, ya que mediante la utilización de técnicas validadas, se está dando la

confianza y seguridad requerida en los resultados que se emiten.

Para los Laboratorios de referencia se hace necesario llevar a cabo procesos de

validación de tipo secundario, ya que en la mayoría de estos laboratorios se emplean

58

métodos de referencia. En este caso, el laboratorio emplea el método de referencia de

filtración por membrana para la detección de coliformes totales y fecales en muestras

de aguas para consumo.

Para llevar a cabo el proceso de validación del método de filtración por membrana, se

evaluaron los parámetros de precisión y exactitud. La precesión fue evaluada en

función de repetibilidad y reproducibilidad. La repetibilidad solo fue evaluada en el

blanco ya que fue la única solución que se realizo por duplicado. Mientras que, la

reproducibilidad fue evaluada en todas las soluciones debido a que el estudio fue

realizado en seis días diferentes.

Se evaluó la desviación estándar total tanto para coliformes totales como para

coliformes fecales, en donde la desviación estándar se comparó con W (meta a

alcanzar). W fue tomado como el 5% de la concentración de la gran media ó como

0.25 veces el valor mínimo de interés del método. Para que la desviación estándar

fuera aceptada esta debía de ser menor que W.

La exactitud se evaluó mediante la recuperación de una concentración conocida de E.

coli a las dos muestras naturales utilizadas. Se tomo un nivel de confianza entre el 95

y 105%, con un margen de error del 5%. La recuperación satisfactoria fue aceptada si

los resultados obtenidos estaban dentro de esta meta.

6.5.1. Estandarización del tubo 0.5 de Mcfarland

Antes de iniciar con la etapa de validación, se estandarizo la lectura del tubo 0.5 de

Mcfarland y se realizaron ensayos preliminares con el fin de obtener dominio del

método.

En los resultados obtenidos de la estandarización de la lectura de la suspensión de

E.coli para comprobar que se estaba partiendo de 150 millones de bacterias, se

observo que las mediciones realizadas con una absorbancia cercana a la encontrada

59

en la lectura del tubo 0.5 de Macfarland (Tabla, 2), presentaban una concentración

inicial de 130 millones de bacterias/ mL. Al realizar las 10 replicas que se

establecieron, se obtuvo un rango de absorbancias entre 0.295 y 0.310, las cuales

permitían que cada vez que se preparaba la suspensión de E.coli se tenía certeza de

que se estaba partiendo de una concentración inicial de 130 millones de bacterias/mL

(Tabla 3) (Figura 8).

TABLA 2 Comparación de absorbancias del tubo 0.5 de Mcfarland y la suspensión de E. coli

Tubo 0.5 Suspensión E. coli

Absorbancia 0.296 0.295 – 0.310

Fuente: Autor

60

TABLA 3 Lectura de absorbancias de la suspensión de E. coli

ABSORBANCIA MEDIO ENDO

MEDIO

m-FC

R1 R2 PROMEDIO R1 R2 PROMEDIO

0.295 14 11 12 14 10 12

0.306 14 13 14 11 10 11

0.308 14 11 12 12 15 14

0.297 15 12 14 14 11 12

0.299 11 13 12 13 12 12

0.303 15 13 14 15 14 14

0.301 12 14 13 11 15 13

0.298 10 14 12 13 15 14

0.300 15 11 13 13 12 12

0.310 13 11 12 13 15 14

13 13

Fuente: Autor

61

a)

b)

FIGURA 8 Recuento de E. coli en medio Endo y m-FC. a) Recuento de E. coli a una absorbancia de 0.295. b) Recuento de E. coli a una absorbancia de 0.310.

6.5.2. Ensayo preliminar de repetibilidad

En el ensayo de repetibilidad se obtuvieron coeficientes de variación para las

concentraciones de 20 y 70 bacterias/mL menores al 10%, mientras que para la

concentración de 5 bacterias/mL estos coeficientes de variación se encontraron por

62

encima del 10% tanto para coliformes totales como para coliformes fecales,

presentando una mayor dispersión en los recuentos obtenidos, (Tabla 4) (Figura 6).

Esto es debido a que el valor de la concentración esta cerca al límite de detección del

método, donde existe mayor incertidumbre y probabilidad de error. (Palma, 2008).

Tabla 4 Calculo de la media, desviación estándar y coeficiente de variación de las concentraciones de 5, 20 y 70 bacterias/mL

Fuente: Autor

5 BACTERIAS 20 BACTERIAS 70 BACTERIAS ENDO m-FC ENDO m-FC ENDO m-FC

R1 8 7 29 27 73 74

R2 6 6 27 28 77 69

R3 7 6 28 26 75 72

R4 7 6 27 26 74 71

R5 6 7 28 27 75 73

R6 8 7 27 25 72 69

R7 6 8 29 28 77 74

R8 7 6 25 24 73 75

R9 6 5 28 27 72 74

R10 7 6 26 25 75 73

MEDIA 6.8 6.4 27.4 26.3 74.3 72.4

DESVIACION

ESTANDAR

0.79 0.84 1.26 1.34 1.828 2.118

COEFICIENTE

DE

VARIACION

11.62% 13.18% 4.59% 5.09% 2.46% 2.92%

63

5 BACTERIAS

20 BACTERIAS

70 BACTERIAS

FIGURA 9 Recuento de los estándares de 5, 20 y 70 bacterias /100 mL de E. coli

6.5.3. Validación del método de filtración por membrana

Los 48 resultados obtenidos fueron sometidos a tratamiento estadístico, mediante la

utilización del programa estadístico validar 1.1. Tanto para coliformes totales como

para coliformes fecales. Se obtuvieron datos como media, desviación estándar total

dentro de lotes y entre lotes, las que representan la repetibilidad y reproducibilidad

interna del laboratorio respectivamente y recuperación alcanzada.

En las tablas 5 y 6 se observan los resultados de los recuentos obtenidos de las

diferentes soluciones analizadas tanto para coliformes totales como para coliformes

64

fecales. En la figura 10 se observa el crecimiento de E. coli en medio Endo y medio

m-FC en las diferentes soluciones preparadas.

TABLA 5 Recuento de coliformes totales en medio Endo.

TABLA DE DATOS COLIFORMES TOTALES Constantes U C v V LMS

M1 0,00 3200 1 99 80

Solución LOTE1 LOTE2 LOTE3 LOTE4 LOTE5 LOTE6

1-BK1 0 0 0 0 0 0

2-BK2 0 0 0 0 0 0

3-E 0.9C 79 69 78 75 73 77

4-E 0.09C 5 9 8 7 4 8 5-M1 0 0 0 0 0 0

6-M2 0 0 0 0 0 0

7-M1+A1 34 31 36 33 35 32 8-M2+A2 60 57 55 52 56 58

Constantes U C v V

M2 0,00 5600 1 99 Fuente: Aplicativo validar 1.1

U: concentración del agua natural sin adición M1 y M2

C: Concentración de la dilución anterior del estándar M1


V: Volumen de agua natural adicionado en cada frasco

v: Volumen de la concentración M1 + A1 para ser analizado por el método de filtración por membrana

LMS: Límite máximo de detección del método.

65

TABLA 6 Recuento coliformes fecales en medio m-FC.

TABLA DE DATOS COLIFORMES FECALES Constantes U C v V LMS

M1 0,00 3200 1 99 80


1-BK1 0 0 0 0 0 0

2-BK2 0 0 0 0 0 0

3-E 0.9C 77 70 76 78 74 75

4-E 0.09C 6 9 5 8 7 4 5-M1 0 0 0 0 0 0

6-M2 0 0 0 0 0 0

7-M1+A1 32 33 37 34 36 35 8-M2+A2 57 58 59 55 58 56

Constantes U C v V

M2 0,00 5600 1 99 Fuente: Aplicativo validar 1.1

U: concentración del agua natural sin adición M1 y M2



V: Volumen de agua natural adicionado en cada frasco

v: Volumen de la concentración M1 + A1 para ser analizado por el método de filtración por membrana

LMS: Límite máximo de detección del método.

a) b)

66

c) d)

e) f)

67

g)

FIGURA 10 Recuento de E. coli en medio Endo y medio m-FC.

a) Recuento de blancos. b) Recuento del estandar 0.09C. c) Recuento del estandar 0.9C. d) Recuento del estandar 0.4C. e) Recuento del estandar 0.7C. f y g) Recuento de M1 y M2.

6.5.3.1. Determinación de la precisión

Se evaluó la desviación estándar total de cada solución la cual fue comparada con W

(meta a alcanzar). W se tomo como el 5% de la concentración de la gran media ó

como 0.25 veces el valor mínimo de interés del método, escogiendo la mayor de las

dos. Para que la desviación estándar fuera aceptada esta debía de ser menor que

cualquiera de los de niveles de meta a alcanzar.

En los datos obtenidos tanto para coliformes totales como para coliformes fecales, se

evaluó si la desviación estándar total de cada solución era menor o igual a la meta a

alcanzar. (Tablas 7 y 8), evidenciándose que la desviación estándar de cada solución

fue aceptada, lo cual indica que el método ha logrado su primer parámetro evaluado,

la precisión, ya que se cumplió con los requisitos de la meta establecida.

68

TABLA 7 Cálculo para determinar la aceptabilidad de las desviaciones estándares para coliformes totales

Valor mínimo de interés para el parámetro en cuestión: 8 BLANCO 0.9 C 0.09 C M1 M1+A1 M2 M2+A2 St = Se , (St = Sd) para el testigo Sd Se Se Se Se Se Se 0,0000 3,7103 1,9408 0,0000 1,8708 0,0000 2,7325 St2 = Se2 + Sd2 = Varianza 0,0000 13,7667 3,7667 0,0000 3,5000 0,0000 7,4667

St = Desviación estándar 0,0000 3,7103 1,9408 0,0000 1,8708 0,0000 2,7325

Concentración (GMC) 0,0000 75,1667 6,8333 0,0000 33,5000 0,0000 56,3333 W (meta a alcanzar)

0.05 X GMC 0,0000 3,7583 0,3417 0,0000 1,6750 0,0000 2,8167

0.25 X VMI 2,0000 2,0000 2,0000 2,0000 2,0000 2,0000 2,0000

W 2,0000 3,7583 2,0000 2,0000 2,0000 2,0000 2,8167 St < W ? SI SI SI SI SI SI SI

Tabla 8 Cálculo para determinar la aceptabilidad de las desviaciones estándares para coliformes fecales

Valor mínimo de ínteres para el parámetro en cuestión: 8 BLANCO 0.9 C 0.09 C M1 M1+A1 M2 M2+A2 St = Se , (St = Sd) para el testigo Sd Se Se Se Se Se Se 0,0000 2,8284 1,8708 0,0000 1,8708 0,0000 1,4720 St2 = Se2 + Sd2 0,0000 8,0000 3,5000 0,0000 3,5000 0,0000 2,1667 St (Desviacion estándar) 0,0000 2,8284 1,8708 0,0000 1,8708 0,0000 1,4720 Concentración (GMC) 0,0000 75,0000 6,5000 0,0000 34,5000 0,0000 57,1667 W (meta a alcanzar)

0.05 X GMC 0,0000 3,7500 0,3250 0,0000 1,7250 0,0000 2,8583

0.25 X VMI 2,0000 2,0000 2,0000 2,0000 2,0000 2,0000 2,0000 W 2,0000 3,7500 2,0000 2,0000 2,0000 2,0000 2,8583

St < W ? SI SI SI SI SI SI SI

69

6.5.3.2. Determinación de la exactitud

Para la recuperación se tomo un nivel de confianza entre el 95 y 105% , con un

margen de error del 5%. La recuperación fue aceptada si los resultados obtenidos

estaban dentro de esta meta.

En las tablas de la 9-12 se observan varias hipótesis de la recuperación experimental

contra la recuperación teórica. La primera hipótesis es 1) Observar si la recuperación

experimental/recuperación teórica es menor o igual a 0.95. Si el resultado es positivo,

se continua con el análisis. 2) Esta hipótesis consiste en evaluar si la recuperación

experimental/recuperación teórica es menor o igual a 1.05, si el resultado es sí,

entonces se infiere que la recuperación fue satisfactoria.

En los datos obtenidos se observo que la recuperación de M1 + A1 y M2 + A2 para

coliformes totales como para coliformes fecales fue satisfactoria (Tablas 9-12), por lo

tanto se cumplió con el segundo parámetro de la validación, la exactitud.

70

Tabla 9 Recuperación M1 + A1, coliformes totales

EVALUACION DE LA RECUPERACION DE LA ADICION ESTANDAR-A1.

S 1,8708 1,5352

t0.95=2.015

con y = 5 tabla t bílateral 2,01 2,01 1,5352

R/d R= 33,50 d= 32,00 1,047

R/d>=0.95?

SI NO

R/d<=1,05? 0,95Xd 30,4

SI NO

1,05Xd 33,6

Recuperación satisfactoria

35,14 .=A (ii)

28,86 .=B (i)

R<=A? R>=B?

NO SI SI NO


Recuperación no satisfactoria Revisar metodologia y técnica analítica

S

6201´ .

1056

201, ,´ + ´dS 0 95

62 01, ,´ - ´d

S

71

TABLA 10 Recuperación M1 + A1, coliformes fecales


S 1,8708 1,5352

t0.95=2.015

con y = 5 tabla t bilateral 2,01 2,01

1,5352

R/d R= 34,50 d= 32,00 1,078

R/d>=0.95?

SI NO

R/d<=1,05? 0,95Xd 30,4

SI NO

1,05Xd 33,6

Recuperación satisfactoria 35,14 .=A (ii)

28,86 .=B (i)

R<=A? R>=B?

NO SI SI NO



S

6201´ .

1056

201, ,´ + ´dS 0 95

62 01, ,´ - ´d

S

72

TABLA 11 Recuperación M2 + A2, coliformes totales


S 2,7325 2,2422 t0.95=2.015

con y = 5 tabla t bílateral 2,01

R/d R= 56,33 d= 56,00 1,006

R/d>=0.95?

SI NO

R/d<=1,05? 0,95Xd 53,2

SI NO

1,05Xd 58,8


50,96 .=B (i)

R<=A? R>=B?

NO SI SI NO



con y = 5 2,01

R= 56,33 d= 56,00

R/d>=0.95?

SI NO

R/d<=1,05? 0,95Xd

NO

1,1,05Xd

cuperación satisfactoria

73

TABLA 12 Recuperación M2 + A2, coliformes fecales


S 1,4720 1,2079 t0.95=2.015


R/d R= 57,17 d= 56,00 1,021 R/d>=0.95? SI NO R/d<=1,05? 0,95Xd 53,2

SI NO 1,05Xd 58,8 Recuperación satisfactoria 60,01 .=A (ii)

51,99 .=B (i)

R<=A? R>=B? NO SI SI NO


Recuperación no satisfactoria

Revisar metodologia y técnica

analítica

d R= 57,17 d= 56,00R/d>=0.95?

SI NOR/d<=1,05? 0,95Xd

SI NO1,05Xd

Recuperación satisfactoriaia

74

6.5.4. Cartas de control “R”

La grafica de control R, para coliformes totales arrojo un límite superior de control de

7.01, un límite medio de 2.14 , el límite inferior de control fue cero. (Ver figura 11).

La grafica de control R, para coliformes fecales arrojo un límite superior de control

de 7.32, un límite medio de 2.24 y el límite inferior de control fue de cero. (Ver figura

12).

Con los valores obtenidos en estas cartas de control, se analizo cada uno de los datos

después de realizada la validación, comprobándose que el proceso está bajo control

ya que ningún valor encontrado para coliformes totales como para coliformes fecales

estaban fuera de los limites de control superior calculados (ANEXO 8)

Grafico de Control “R”

LCS = 7.01 LC (R/) = 2.14 _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _

LCI = 0

Ensayo/Tiempo

DIF

ER

EN

CIA

S

FIGURA 11 Grafico de control para coliformes totales

75

Grafico de Control “R”

LCS = 7.32 LC (R/) = 2.24 _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _

LCI = 0

Ensayo/Tiempo

Figura 12.

Finalmente, gracias a los resultados obtenidos donde se evaluó la detección

simultanea de los microorganismos indicadores de contaminación presente en

muestras de aguas, se logró demostrar que se cumple con los parámetros evaluados

de precisión y exactitud.

Para que un método sea valido completamente bajo normas nacionales e

internacionales se deberán determinar además de éstos indicadores, otros parámetros

estadísticos como la determinación del límite de detección, el límite de

cuantificación, especificidad, sensibilidad y cálculo del límite de incertidumbre. Los

cuales deberán ser evaluados por el laboratorio para concluir de manera satisfactoria

con los requerimientos y necesidades del proceso de validación.

Con la realización de éste trabajo de grado se dio inicio al proceso de validación, en

donde se determinó la precisión y exactitud del método según los resultados

obtenidos, pero se deberá de complementar con otros indicadores estadísticos, cuya

determinación obedecerá a las necesidades del laboratorio.

D

IFE

RE

NC

IAS

FIGURA 12 Grafico de control para coliformes fecales

76

7. CONCLUSIONES

· La validación del método de filtración por membrana para el análisis de

coliformes totales y E. coli en muestras de agua para consumo humano, permitió

obtener resultados reproducibles y confiables.

· Se determinó la precisión del método mediante la aceptabilidad de las

desviaciones estándares de cada solución analizada cumpliéndose con el requisito de

la meta a alcanzada.

· Se determino la exactitud del método, en donde la recuperación de las

muestras adicionadas fue satisfactoria.

· Se estandarizo la lectura del tubo 0.5 de Mcfarland, a una turbiedad entre

0.295 y 0.310 absorbancia, medido en espectrofotómetro a 620 nm.

· Se verifico que los medios de cultivo utilizados para el análisis de coliformes

totales y E. coli, son altamente selectivos y eficaces ya que permitieron solo el

crecimiento del microorganismo de interés y completamente estériles ya que no se

evidencio crecimiento de ningún tipo de microorganismo.

· Se manejaron condiciones adecuadas de limpieza y desinfección, ya que se

evidencio baja carga de microorganismos presentes en el ambiente.

· El mantenimiento y calibración de los equipos garantizaron que las

mediciones realizadas arrojaran resultados confiables.

· El adecuado manejo del cepario (cepas completamente puras y viables),

facilito que no se encontraran microorganismos contaminantes que interfirieran en el

proceso de validación.

77

8. RECOMENDACIONES

· Se deberá tener un Contrato de Mantenimiento permanente para calibración

de equipos, con el fin de asegurar que se están utilizando equipos completamente

calibrados.

· Además de realizar validación secundaria, se deberá complementar con otras

pruebas, como el cálculo de la incertidumbre, permitiendo de esta manera obtener una

mayor confiabilidad en los resultados emitidos.

· Este método se debe comparar con otro alterno que permita asegurar la

veracidad de los resultados.

· Una vez determinados estos dos parámetros de la validación (Precisión y

exactitud), se deberá complementar con la determinación del Límite de detección

para asegurar resultados plenamente confiables que satisfagan las necesidades del

cliente.

78

9. BIBLIOGRAFÍA

· APHA- AWWA-WPCF, 2005. Standard methods for analysis of waters and wastewaters. Edición 21. Editorial Diaz de Santos. Madrid, España. 1150 páginas.

· Castillo, B. Gonzales, R. 1996. Protocolo de validación de métodos analíticos para la cuantificación de fármacos. Revista cubana de Farmacia. Enero – abril, Volumen 30. No 1.

· Cortes, Alejandra. 2002. Validación de la prueba de esterilidad para vacunas virales preparadas en vehículos oleoso y acuoso. Carrera Microbiología. Facultad Ciencias. Básicas. Departamento Microbiología. Pontificia Universidad Javeriana. Trabajo de Pregrado. Bogotá D.C. 93 páginas.

· Cortes, Natalia. Méndez, Y. Junio, 2006. Validación de las pruebas de esterilidad por la técnica de filtración por membrana y endotoxinas bacterianas por el método de LAL en 3 productos farmacéuticos. Carrera Microbiología. Facultad Ciencias. Básicas. Departamento Microbiología. Pontificia Universidad Javeriana. Trabajo de Pregrado. Bogotá D.C.

· Galeano, Norma. 2007. Validación de la retención microbiana en los filtros de acetato y nitrato de celulosa empleados en la técnica de filtración por membrana para la prueba de esterilidad. Carrera Microbiología. Facultad Ciencias. Básicas. Departamento Microbiología. Pontificia Universidad Javeriana. Trabajo de Pregrado. Bogotá D.C.182 paginas.

· GTC GUÍA TECNICA COLOMBIANA 84. 2003. Calidad del agua. Guía para la orientación acerca de la validación de métodos de análisis microbiológicos. Editado ICONTEC, Instituto Colombiano de Normas Técnicas y Científicas.

· ISO 9000:2000. Sistemas de gestión de calidad.

79

· MILLIPORE, 2005. Análisis microbiológico. Madrid, España. 48 paginas.

· NTC ISO /IEC 17025: 2005. Requisitos generales de competencia de laboratorios de ensayo y calibración.

· NTC 3529-2 Exactitud (veracidad y precisión) de métodos de medición y resultados. Parte 2: Método básico para la determinación de repetibilidad y reproducibilidad de un método normalizado de medición.

· Ordoñez, J. 2000. Microorganismos de los alimentos. Volumen 1, segunda edición. Editorial Acribia S.A, Zaragoza, España.

· Otálora Andrés. Ortiz, J. Peñaranda, S. Palma, R. Puentes, W. Murillo, C. Peralta, A. Tovar, G. Junio, 2005. Séptimo curso – taller VALIDACIÓN DE MÉTODOS ANALÍTICOS. Laboratorio Salud Ambiental. Programa de vigilancia de la calidad del agua potable, metales y no metales de interés en Salud Publica. Bogotá, D.C.

· Padilla, José Esteban. 2007. Validación secundaria del método de recuento en placa en superficie de Bacillus cereus y Staphylococcus aureus en muestras de alimentos en un laboratorio de referencia. Carrera Microbiología. Facultad Ciencias. Básicas. Departamento Microbiología. Pontificia Universidad Javeriana. Trabajo de Pregrado. Bogotá D.C. 109 paginas.

· Palma Ruth Marien. Ortiz, J. Garnica, E. López, L. Peñaranda, S. Raad, J. 1999. Análisis de agua para consumo humano. Instituto Nacional de Salud. Santa Fe de Bogotá, D.C.

· Sartorius. 2003. Microbiological testing of foods, beverages and Pharmaceuticals. SARTORIUS, Publication No SM-4017-e97116. Goettingen, Germany, 19 paginas.

· THE UNITED STATES PHARMACOPOEIA. USP 29. 2006. Pruebas microbiológicas. Prueba de esterilidad 71. Páginas 2728 – 2733.

· USP, 2003. The United States Pharmacopoeia XXVI. The National Formulary 21 (NF21), United States Pharmacopoeial convention, Rockville, MD.

80

9.1. RECURSOS ELECTRONICOS

· Garcia, E. 2001. Optimización, validación y modelización de un proceso de fabricación de comprimidos. Desarrollo de una aplicación interactiva multimedia. Doctorado en farmacia. Universitat de Barcelona. Facultat de farmacia. Barcelona, España, 166 paginas, [EN LINEA] http://www.tdx.cesca.es/TESIS UB/AVAILABLE/TDX-0618102-102213//TOL82A.pdf. Consulta 12 de febrero de 2008. Hora 10 am.

· Who Expert committee on Specifications for Pharmaceutical Preparation. Reporte 32 Ginebra, Suiza. World Healt Organization 1992. (WHO Technical Reports Series No. 823). [En linea]. <http//whglibdoc.who.int/trs/WHO TRS 823.pdf>. consulta 17 de febrero de 2008. Hora 3:30 pm.

81

10. ANEXOS

Anexo 1. Certificado de las cepas ATCC

83

Anexo 2. Certificados de medios de cultivo

85

Anexo 3. Certificados de mantenimiento y calibración de equipos

Destilador de agua

86

Equipo filtración por membrana

87

Analizador químico RA-50

88

Baño maría

90

Incubadora

92

Micropipeta 100-1000 UL

95

Anexo 4. Registro del uso de los equipos

97

ACTIVIDAD DIARIA: Cada vez que se use:

1. Limpiar exterior bomba de vacío 2. Lavar Manifold 3. Revisión funcionamiento llave de paso 4. Esterilizar portafiltros (alcohol y mechero)

ACTIVIDAD SEMANAL: Esterilizar en autoclave portafiltros y equipo

ACTIVIDAD ANUAL: Revisión técnica de la Bomba de vacío

Noviembre 2008

Día: Mes: Año:

Fecha

Bomba de vacío /

Limpieza exterior

de la bomba

Lavado

Manifold

Revisión

llave de

paso

Esteriliza

ción

portafiltro

s y

equipo

Firma

4 X X 1 JHISEL

PAEZ

5 X X 1 JHISEL

PAEZ

6 X X 1 JHISEL

PAEZ

7 X X 1 JHISEL

PAEZ

10 X X 1 JHISEL

PAEZ

98

11 X X 1 JHISEL

PAEZ

12 X X 1 JHISEL

PAEZ

13 X X 1 JHISEL

PAEZ

14 X X 1 JHISEL

PAEZ

18 X X 1 JHISEL

PAEZ

19 X X 1 JHISEL

PAEZ

20 X X 1 JHISEL

PAEZ

21 X X 1 JHISEL

PAEZ

24 X X 1 JHISEL

PAEZ

28 X X 1 JHISEL

PAEZ

1. C = CONFORME 2. NC = NO CONFORME

99

Anexo 4. Calculo de la Gran Media

Coliformes Totales Media

SOL. No LOTE 1 LOTE 2 LOTE 3 LOTE 4 LOTE 5 LOTE 6 X ( GMC )

1-BK1 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000

2-BK2 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000

3-E 0.9C 79,000 69,000 78,000 75,000 73,000 77,000 75,167

4-E 0.09C 5,000 9,000 8,000 7,000 4,000 8,000 6,833

5-M1 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000

6-M2 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000

7-M1+A1 34,000 31,000 36,000 33,000 35,000 32,000 33,500

8-M2+A2 60,000 57,000 55,000 52,000 56,000 58,000 56,333

COLIFORMES FECALES Media

SOL. No LOTE 1 LOTE 2 LOTE 3 LOTE 4 LOTE 5 LOTE 6 X ( GMC )

1-BK1 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000

2-BK2 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000

3-E 0.9C 77,000 70,000 76,000 78,000 74,000 75,000 75,000

4-E 0.09C 6,000 9,000 5,000 8,000 7,000 4,000 6,500

5-M1 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000

6-M2 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 7-M1+A1 32,000 33,000 37,000 34,000 36,000 35,000 34,500

8-M2+A2 57,000 58,000 59,000 55,000 58,000 56,000 57,167

100

Anexo 5. Calculo de factor unico

a) Cálculo factor único coliformes totales

SOLUCION TESTIGO COLIFORMES TOTALES Suma de

filas

LOTE1 LOTE2 LOTE3 LOTE4 LOTE5 LOTE6 � x

Prueba 1 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000

Prueba 2 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000

Suma de 0,000

columnas

L 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000

� L2 0,000

� x2 0,000

m = número de lotes. n 2 � L

2/n 0,000 n =

réplicas. m 6 � � L)2/mxn 0,000

Fuente: aplicativo validar 1.1

b) Cálculo factor único coliformes fecales.

SOLUCION TESTIGO COLIFORMES FECALES Suma de

filas


Prueba 1 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000

Prueba 2 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000

Suma de 0,000

columnas

L 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000

� L2 0,000

� x2 0,000

m = número de lotes. n 2 � L

2/n 0,000 n =

réplicas. m 6 � � L)2/mxn 0,000

Fuente: aplicativo validar 1.1

101

c) Cálculo factor único estándar 0.9C, coliformes totales

SOLUCION ESTANDAR

0,9C C. TOTALES Suma de filas LOTE1 LOTE2 LOTE3 LOTE4 LOTE5 LOTE6 � x

Prueba 1 79,000 69,000 78,000 75,000 73,000 77,000 451,000 Prueba 2 - - - - - - - Suma de 451,000 columnas

L 79,000 69,000 78,000 75,000 73,000 77,000 451,000 � L

2 33969,000 � x

2 33969,000 m = número de lotes. n 1 � L

2/n 33969,000 n = réplicas. m 6 � � L)

2/mxn 33900,167

d) Calculo factor único estándar 0.9C, coliformes fecales

SOLUCION ESTANDA

R 0,9C

C. FECALES Suma de

filas

LOTE1 LOTE2 LOTE3 LOTE

4 LOTE5 LOTE6 � x

Prueba 1 77,000 70,000 76,000 78,000 74,000 75,000 450,000 Prueba 2 - - - - - - - Suma de 450,000 Columna

s L 77,000 70,000 76,000 78,000 74,000 75,000 450,000

� L2

33790,000

� x2

33790,000

m = número de lotes. n 1 � L2/n

33790,000

n = réplicas. m 6

� � L)2/mx

n 33750,00

0

102

e) Calculo factor único estándar 0.09C, coliformes totales

SOLUCION ESTANDAR

0,09C C. TOTALES

Suma de

filas


Prueba 1 5,000 9,000 8,000 7,000 4,000 8,000 41,000

Prueba 2 - - - - - - -

Suma de 41,000

Columnas

L 5,000 9,000 8,000 7,000 4,000 8,000 41,000

� L2 299,000

� x2 299,000

m = número de lotes. n 1 � L2/n 299,000

n = réplicas. m 6 � � L)

2/mxn 280,167

f) Calculo factor único estándar 0.09C, coliformes fecales

SOLUCION ESTANDAR

0,09C C. FECALES Suma de

filas


Prueba 1 6,000 9,000 5,000 8,000 7,000 4,000 39,000

Prueba 2 - - - - - - -

Suma de 39,000

Columnas

L 6,000 9,000 5,000 8,000 7,000 4,000 39,000

� L2 271,000

� x2 271,000


n = réplicas. m 6

� � L)2/mx

n 253,500

103

g) Calculo factor único estándar 0.4C, coliformes totales

MUESTRA NATURAL

ADICIONADA M1+A1

C. TOTALES Suma de

Filas


Prueba 1 34,000 31,000 36,000 33,000 35,000 32,000 201,000

Prueba 2 - - - - - - -

Suma de 201,000

Columnas

L 34,000 31,000 36,000 33,000 35,000 32,000 201,000

� L2 6751,000

� x2 6751,000



2/mxn 6733,500

104

h) Calculo factor único estándar 0.4C, coliformes fecales

MUESTRA NATURAL

ADICIONADA M1+A1

C. FECALES Suma de

Filas

LOTE1 LOTE2 LOTE3 LOTE

4 LOTE

5 LOTE6 � x

Prueba 1 32,000 33,000 37,000 34,000 36,000 35,000 207,000

Prueba 2 - - - - - - -

Suma de 207,000 Columna

s

L 32,000 33,000 37,000 34,000 36,000 35,000 207,000

� L2 7159,000

� x2 7159,000


n = réplicas. m 6

� � L)2/mx

n 7141,500

105

i) Calculo factor único estándar 0.7C, coliformes totales

MUESTRA NATURAL

ADICIONADA M2+A2

C. TOTALES Suma de

Filas

LOTE1 LOTE2 LOTE

3 LOTE4 LOTE5 LOTE6 � x

Prueba 1 60,000 57,000 55,000 52,000 56,000 58,000 338,000

Prueba 2 - - - - - - -

Suma de 338,000

Columnas

L 60,000 57,000 55,000 52,000 56,000 58,000 338,000

� L2 19078,000

� x2 19078,000



2/mxn 19040,667

106

j) Calculo factor único estándar 0.7C, coliformes fecales

MUESTRA NATURAL

ADICIONADA M2+A2

C. FECALES Suma de

Filas


Prueba 1 57,000 58,000 59,000 55,000 58,000 56,000 343,000

Prueba 2 - - - - - - -

Suma de 343,000

Columnas

L 57,000 58,000 59,000 55,000 58,000 56,000 343,000

� L2 19619,000

� x2 19619,000

m = número de lotes. N 1 � L2/n 19619,000

n = réplicas. M 6 � � L)

2/mxn 19608,167

107

Anexo 6.

Análisis de varianza entre y dentro de lotes

Análisis de varianza para coliformes totales

ANALISIS DE VARIANZA

FUENTE DE VARIABILIDAD

Suma de los

Cuadrados Grados de Libertad Cuadrados Medios

SOLUCION Entre lotes

Dentro del lote TOTAL

Entre lotes

Dentro del lote Total

Entre lotes

Dentro del lote

SQ1 SQ0 SQt N1 No Nt M1 Mo

TESTIGO 1 Y 2 0,0000 0,0000 0,0000 5 6 11 0,0000 0,0000000

3-E 0.9C 3 68,8333 0,0000 68,8333 5 0 5 13,7667 -

4-E 0.09C 4 18,8333 0,0000 18,8333 5 0 5 3,7667 #¡DIV/0!

5-M1 5 0,0000 0,0000 0,0000 5 0 5 0,0000 - 6-M2 6 0,0000 0,0000 0,0000 5 0 5 0,0000 #¡DIV/0!

7-M1+A1 7 17,5000 0,0000 17,5000 5 0 5 3,5000 -

8-M2+A2 8 37,3333 0,0000 37,3333 5 0 5 7,4667 #¡DIV/0!

108

Análisis de varianza coliformes fecales ANALISIS DE VARIANZA FUENTE DE VARIABILIDAD

Suma de

los Cuadrados Grados de Libertad Cuadrados

Medios

SOLUCION Entre lotes Dentro

del lote TOTAL Entre

lotes Dentro

del lote Total Entre lotes Dentro del lote

SQ1 SQ0 SQt N1 No Nt M1 Mo TE

STIGO 1 Y 2 0,0000 0,0000 0,0000 5 6 11 0,0000 0,0000000 3-

E 0.9C 3 40,0000 0,0000 40,0000 5 0 5 8,0000 - 4-

E 0.09C 4 17,5000 0,0000 17,5000 5 0 5 3,5000 #¡DIV/0! 5-

M1 5 0,0000 0,0000 0,0000 5 0 5 0,0000 - 6-

M2 6 0,0000 0,0000 0,0000 5 0 5 0,0000 #¡DIV/0! 7-

M1+A1 7 17,5000 0,0000 17,5000 5 0 5 3,5000 - 8-

M2+A2 8 10,8333 0,0000 10,8333 5 0 5 2,1667 #¡DIV/0!

109

Anexo 7.

Calculo de las desviaciones estándares

Calculo desviaciones estándares coliformes totales

CALCULO DE LAS DESVIACIONES ESTANDARES.

BLANCO 0.9C 0.09C M1 M1+A1 M2 M2+A2

M0 0,0000000 - #¡DIV/0! - #¡DIV/0! - #¡DIV/0!

M1 0,00000 13,76667 3,76667 0,00000 3,50000 0,00000 7,46667

Sd 0,00000 - #¡DIV/0! - #¡DIV/0! - #¡DIV/0!

Se 0,00000 3,71035 1,94079 0,00000 1,87083 0,00000 2,73252

GMC 0,000 75,167 6,833 0,000 33,500 0,000 56,333 Calculo desviaciones estándares coliformes fecales

CALCULO DE LAS DESVIACIONES ESTANDARES.

BLANCO 0.9C 0.09C M1 M1+A1 M2 M2+A2

M0 0,0000000 - #¡DIV/0! - #¡DIV/0! - #¡DIV/0!

M1 0,00000 8,00000 3,50000 0,00000 3,50000 0,00000 2,16667

Sd 0,00000 - #¡DIV/0! - #¡DIV/0! - #¡DIV/0!

Se 0,00000 2,82843 1,87083 0,00000 1,87083 0,00000 1,47196

GMC 0,000 75,000 6,500 0,000 34,500 0,000 57,167

110

Anexo 8.

Datos para elaborar los gráficos de control

Datos para realizar la carta control de coliformes totales

ENSAYO CONCENTRACIÓN LECTURA

X1 LECTURA

X2 PROMEDIO DIFERENCIA

X1 – X2 1 BK 0 0 0 0 2 0.09C 6 4 5 2 3 0.9C 77 81 79 4 4 M1 0 0 0 0 5 M1 + A1 31 37 34 6 6 M2 0 0 0 0 7 M2 + A2 62 58 60 4 8 BK 0 0 0 0 9 0.09C 7 11 9 4 10 0.9C 70 68 69 2 11 M1 0 0 0 0 12 M1 + A1 33 29 31 4 13 M2 0 0 0 0 14 M2 + A2 54 60 57 6 15 BK 0 0 0 0 16 0.09C 7 9 8 2 17 0.9C 76 80 78 4 18 M1 0 0 0 0 19 M1 + A1 35 37 36 2 20 M2 0 0 0 0 21 M2 + A2 58 52 55 6 22 BK 0 0 0 0 23 0.09C 8 6 7 2 24 0.9C 74 76 75 2 25 M1 0 0 0 0 26 M1 + A1 31 35 33 4 27 M2 0 0 0 0 28 M2 + A2 50 54 52 4 29 BK 0 0 0 0 30 0.09C 4 4 4 0 31 0.9C 71 75 73 4 32 M1 0 0 0 0 33 M1 + A1 32 38 35 6 34 M2 0 0 0 0 35 M2 + A2 54 58 56 4 36 BK 0 0 0 0 37 0.09C 10 6 8 4 38 0.9C 75 79 77 4 39 M1 0 0 0 0 40 M1 + A1 29 35 32 6

111

41 M2 0 0 0 0 42 M2 + A2 56 60 58 4

Datos carta control para coliformes fecales

ENSAYO CONCENTRACIÓN LECTURA

X1 LECTURA

X2 PROMEDIO DIFERENCIA

X1 – X2

1 BK 0 0 0 0

2 0.09C 7 5 6 2

3 0.9C 79 75 77 4

4 M1 0 0 0 0

5 M1 + A1 34 30 32 4

6 M2 0 0 0 0

7 M2 + A2 56 58 57 2

8 BK 0 0 0 0

9 0.09C 11 7 9 4

10 0.9C 68 72 70 4

11 M1 0 0 0 0

12 M1 + A1 31 35 33 4

13 M2 0 0 0 0

14 M2 + A2 55 61 58 6

15 BK 0 0 0 0

16 0.09C 6 4 5 2

17 0.9C 73 79 76 6

18 M1 0 0 0 0

19 M1 + A1 34 40 37 6

20 M2 0 0 0 0

21 M2 + A2 58 60 59 2

22 BK 0 0 0 0

23 0.09C 6 10 8 4

24 0.9C 76 80 78 4

25 M1 0 0 0 0

26 M1 + A1 33 35 34 2

27 M2 0 0 0 0

28 M2 + A2 58 52 55 6

29 BK 0 0 0 0

30 0.09C 5 9 7 4

31 0.9C 71 77 74 6

32 M1 0 0 0 0

112

33 M1 + A1 32 33 39 6

34 M2 0 0 0 0

35 M2 + A2 60 56 58 4

36 BK 0 0 0 0

37 0.09C 5 3 4 2

38 0.9C 74 76 75 2

39 M1 0 0 0 0

40 M1 + A1 37 33 35 4

41 M2 0 0 0 0

42 M2 + A2 54 58 56 4

113

Anexo 9

INFORME DE VALIDACIÓN

114





Neiva, Noviembre de 2008

115

VALIDACIÓN SECUNDARIA DEL MÉTODO DE FILTRACIÓN POR MEMBRANA PARA LA DETECCIÓN DE COLIFORMES TOTALES Y

Escherichia coli EN MUESTRAS DE AGUAS PARA CONSUMO HUMANO ANALIZADAS EN EL LABORATORIO DE SALUD PÚBLICA DEL HUILA

OBJETIVO Realizar la validación secundaria del método de filtración por membrana para la

detección de Coliformes Totales y Escherichia coli en aguas para consumo humano

analizadas en el Laboratorio de Salud Publica del Huila.

INTRODUCCIÓN El recurso hídrico para consumo humano debe ser entregado a las comunidades, con

excelente calidad, la cual debe ser iniciada desde la misma generación, protección de

fuentes y recorridos hasta las plantas de tratamiento y posteriormente hasta el servicio

domiciliario.

Las enfermedades bacterianas, parasitarias, virales y químicas que tienen origen en la

transmisión de estos agentes por el agua adquieren una especial connotación sanitaria

cuando las poblaciones ribereñas con inadecuado suministro del agua potable o

aquellas comunidades que a través de muchos años han carecido del recurso hídrico

necesario para la vida del hombre, deben ser controlados por el estado.

En este sentido, los laboratorios de salud pública tienen la obligación de proteger las

comunidades bajo su cuidado territorial y por ello deben implementar la tecnología y

la metodología que les permita realizar el control de calidad del agua que consumen

los ciudadanos.

Cada laboratorio debe utilizar métodos y procedimientos apropiados para todas las

calibraciones y ensayos considerados en su alcance. Los laboratorios deben de

realizar controles internos los cuales garantizan que van generar resultados altamente

confiables, mediante el seguimiento de procedimientos altamente calificados

116

Estos programas de control interno incluyen evaluación continua de los principales

materiales y objetos que se utilizan en los diferentes análisis, tales como, control de

los medios de cultivo a utilizar, personal, equipos, estandarización y documentación

de los procesos, con el fin de garantizar un buen desarrollo del procedimiento y

asegurar que este se está efectuando en forma correcta cada vez que se ejecute, lo

cual se lograra con la realización de la validación de los métodos utilizados por el

laboratorio para sus respectivos análisis.

MÉTODOS Para la validación del método de filtración por membrana, se analizó

simultáneamente la detección de coliformes totales y fecales en medio Endo y m-FC.

El medio Endo se utiliza para la identificación de coliformes totales a 37°C durante

24 horas, usando filtros de celulosa con un tamaño de poro de 0.45 micras. Al pasar

la muestra de agua a través de este filtro mediante la aplicación de vacío las bacterias

las cuales son de mayor tamaño quedan retenidas en este. Los coliformes totales que

fermentan la lactosa crecen en este medio formando colonias rojas, brillantes y

convexas, en este medio E. coli crece con brillo verde metálico. El medio m-FC se

utiliza para la determinación de Escherichia coli y coliformes fecales, a temperatura

de incubación de 44.5°C. Estos microorganismos crecen formando colonias de color

azul intenso brillantes y convexas.

Procedimiento del método de filtración por membrana

· Esterilizar el equipo de filtración por membrana de acuerdo a las especificaciones

del fabricante

· Colocar el portafiltros estéril sobre la base del manifold

· Colocar el embudo estéril sobre el receptáculo y fijarlo con las pinzas que trae el

equipo

117

· Llenar el embudo con 80 a 100 ml de agua destilada estéril

· Dejar filtrar aplicando vacío

· Cerrar las llaves del manifold y adicionar 20 – 30 mL de alcohol al 70%

· Pasar el mechero por cada filtro para encender el alcohol, dejar el alcohol

encendido durante 3 minutos

· Abrir las llaves del manifold y dejar filtrar

· Adicionar nuevamente 100 ml de agua destilada estéril y dejar filtrar

· Cerrar las llaves del manifold y retirar el embudo

· Con pinzas estériles colocar un filtro de celulosa en cada portafiltros, con la

cuadricula hacia arriba, sobre la parte porosa del receptáculo

· Colocar el embudo y adicionar la muestra a analizar

· Para aguas tratadas filtrar 100 ml de la muestra a analizar y para aguas turbias

realizar dilución 1/10 y filtrar

· Cuando finalice el filtrado de cada una de las muestras cerrar las llaves del

manifold, retirar el embudo, tomar el filtro con pinzas estériles y colocarlo sobre

la superficie del medio Endo y m-FC

· Incubar las cajas a la temperatura adecuada, el medio Endo a 37°C +/- 2°C y el

medio m-FC: 44.5°C en baño maría

· Realizar el recuento de las colonias características:

Medio Endo: colonias rojas

Medio m-FC: colonias azules

MATERIALES Y METODOS

Filtros de membrana (poro de 0.45um)

Pinzas

Micro pipeta automática 100-1000 UL

118

Puntas azules estériles

Equipos

Incubadora a 35°C +/- 2°C

Baño de maría a 44.5°C

Espectrofotómetro RA-50

Vortex

Equipo de filtración por membrana

Medios de cultivo

Cajas de petri plásticas con medio Endo listo para su uso

Cajas de petri plásticas con medio m-FC listo para su uso

Agar plate Count

Agar OGY

Agar Mc Conkey

Agar Sangre

Cepas microbianas

Cepa de Escherichia coli con número de referencia ATCC 25922

Cepa de Staphylococcus aureus con número de referencia ATCC 25923

119

Material de vidrio

Tubos tapa rosca

Frascos grandes ámbar con alcohol al 70%

Frascos grandes ámbar con agua destilada estéril

Frascos Schott de 250 ml

Reactivos

Cloruro de bario

Acido sulfúrico

Preparación de suspensiones bacterianas:

Se utilizo agua destilada estéril para preparar las suspensiones de Escherichia coli y

Staphylococcus aureus, utilizadas en la validación para efectuar las diluciones

correspondientes y obtener la concentración bacteriana requerida.

Volumen de muestra:

Se utilizaron 100 mL de agua por cada suspensión de las bacterias utilizadas en

concentración conocida.

Volumen de trabajo diario:

Se utilizaron aproximadamente 3500 mL de agua destilada estéril, con las cuales se

realizaron diluciones y suspensiones.

Fuente:

Se utilizó agua de dos marcas de agua diferente, para ser analizadas por el método de

filtración por membrana.

120

Control de calidad:

Control de ambientes: Se realizo por el método de sedimentación durante 15

minutos, utilizando agar Plate Count para bacterias mesófilas aerobias y agar OGY

para hongos y levaduras. Las cajas con agar Plate count se incubaron a 37°C durante

48 horas y las cajas con agar OGY se dejaron a temperatura ambiente durante 5 días.

Esterilidad de los medios de cultivo: Se escogió el 10% de los medios de cultivo

utilizados siendo estos preparados en el laboratorio y listos para el uso, incubándose a

las respectivas temperaturas (m-FC a 44.5°C, OGY a temperatura ambiente, los

demás a 37°C), verificando crecimiento.

Selectividad y eficacia de los medios de cultivo: Se realizaron suspensiones de

Escherichia coli y Staphylococcus aureus en 10 ml de agua destilada estéril, cada

suspensión se analizo por el método de filtración por membrana incubando en medio

Endo y m-FC cada suspensión, verificando que solo hubiera crecimiento de

Escherichia coli.

Control de equipos: Se reviso el historial de mantenimiento y calibración de los

equipos utilizados en la validación.

Cepas utilizadas: Escherichia coli ATCC 25922 y Staphylococcus aureus ATCC

25923 obtenidas del cepario con que cuenta el Laboratorio de Salud Publica. A estas

cepas se les realizaron pruebas bioquímicas que incluyeron, oxidasa, coagulasa y

catalasa para Staphylococcus aureus y se monto API 20E para la identificación de

Escherichia coli, para verificar la pureza y viabilidad de las mismas.

121

VALIDACIÓN

Antes de llevar a cabo el proceso de validación se realizo la estandarización del tubo

0.5 del patrón de Mcfarland y ensayos preliminares de repetibilidad, con el fin de

obtener un dominio del método. Para los ensayos preliminares y la validación se

utilizo la cepa de Escherichia coli, la cual se mantenía en fase exponencial realizando

repiques diarios en agar Mc Conkey. De las colonias obtenidas se realizaron

suspensiones en tubos que contenían 10 ml de agua destilada estéril, equivalente a la

turbiedad del tubo 0.5 de Mcfarland correspondiente a 0.296 absorbencias, leído en

un espectrofotómetro a una longitud de onda de 620 nm, obteniéndose 130 millones

de bacterias/ml.

La cantidad de soluciones analizadas que conformaron el diseño experimental fue de

48 , distribuidas en seis (6) lotes, de ocho (8) soluciones cada una, analizando las

siguientes soluciones en cada lote: 2 blancos, dos muestras naturales, dos muestras

más adición de 0.4C y 0.7C y dos soluciones estándares. El estudio se procesó

durante seis días, en donde cada lote era un día.

A partir de la suspensión preparada de Escherichia coli se realizaron diluciones en

base 100 y 10 en frascos Schott que contenían 99 y 90 ml de agua destilada estéril,

necesarias para preparar los estándares 0.09C (7 bacterias/ml) , 0.9C(72

bacterias/mL), 0.4C (32 bacterias/mL) y 0.7C(56 bacterias/ml).

Para la preparación de estas soluciones se utilizo el siguiente procedimiento:

El límite superior de detección ( C ) para el método de filtración por membrana es de

80 UFC/100mL, teniendo estándares de 0.09C (7 bacterias/mL) , 0.9C(72

bacterias/mL), 0.4C (32 bacterias/mL) y 0.7C(56 bacterias/mL).

A partir de la suspensión de 130 millones de bacterias en 40 mL de agua destilada

estéril, para obtener el estándar de 72 bacterias/mL y 7 bacterias/mL, se utilizo la

fórmula V1 X C1 = V2 X C2 en donde:

122

V1= 10 ml

C1= 130.000.000 bacterias/ml

V2= ?

C2= 72.000.000 bacterias/ml

Despejando la formula se obtuvo un resultado en volumen que se denominó volumen

final.

V2 = 10 mL X 130.000.000 bac/mL = 18.1 mL

72.000.000 bac/ml

El volumen final para la concentración de 72 millones bacterias/ml fue de 18.1 ml,

como ya se tenían 10 ml del volumen inicial, al volumen final se le restaron estos 10

ml iniciales adicionando la diferencia en agua destilada estéril, para completar el

volumen final de 18.1 ml

Se agrego a un frasco Schott estéril 8.1 ml de agua destilada estéril y 10 ml de la

suspensión de E. coli, para obtener las 72 millones de bacterias/ml. A partir de esta

suspensión se realizaron diluciones en escala 100 hasta obtener 72 bacterias/ml y una

dilución en base 10 a partir de la concentración de 72 bacterias/ml para obtener una

concentración de 7 bacterias/mL aproximadamente. De la concentración de 72 y 7

bacterias/mL se tomaron 4 mL de cada una adicionando un mililitro de cada una a

frascos que contenían 99 mL de agua destilada estéril para completar un volumen

final de 100 y ser analizado por el equipo de filtración por membrana,. Se sembraron

dos replicas en medio endo y dos replicas en medio m-FC incubando a las

temperaturas adecuadas

Se realizo análisis estadístico de los resultados obtenidos mediante un programa

elaborado en Excel (Aplicativo Validar 1.1). La precisión del método fue evaluada

con la aceptabilidad de las desviaciones estándares de cada solución, las cuales

debían de estar en el rango de la meta a alcanzar (W), correspondiente al 5% de la

123

concentración de la gran media ó a 0.25 veces el valor mínimo de interés que en este

caso fue 8.

La exactitud se evaluó mediante la recuperación de una concentración conocida de

E. coli a las dos muestras naturales (0.4C y 0.7C), comprobándose que el promedio

de la recuperación no difiere significativamente del 95 al 105% de la recuperación

esperada.

RESULTADOS

Los resultados de la validación se muestran en las tablas siguientes tablas:

Tabla 1. Recuento de coliformes totales en medio Endo.

Tabla 2. Recuento coliformes fecales en medio m-FC.

Tabla 3. Cálculo para determinar la aceptabilidad de las desviaciones estándares para

coliformes totales

Tabla 4. Cálculo para determinar la aceptabilidad de las desviaciones estándares para

coliformes fecales

Tabla 5. Recuperación M1 + A1, coliformes totales

Tabla 6. Recuperación M1 + A1, coliformes fecales



DISCUSION

Los 48 resultados obtenidos se sometieron a tratamiento estadístico, mediante la

utilización del programa estadístico validar 1.1(Figura 1). Tanto para coliformes

totales como para coliformes fecales, se obtuvo media, desviación estándar total

124

dentro de lotes y entre lotes, las que representan la repetibilidad y reproducibilidad

interna del laboratorio respectivamente y recuperación alcanzada. (Tablas 1-8).

Se observo que los blancos fueron los únicos que presentaron reproducibilidad y

repetibilidad, reproducibilidad porque está en función de seis lotes y repetibilidad

porque fue el único que se analizo por duplicado. En las demás soluciones solamente

existe reproducibilidad.

Se evaluó la desviación estándar total tanto para coliformes totales como para

coliformes fecales, en donde la desviación estándar se comparó con W (meta a

alcanzar). W se tomo como el 5% de la concentración de la gran media ó como 0.25

veces el valor mínimo de interés del método. Para que la desviación estándar fuera

aceptada esta debía de ser menor que W. En los datos obtenidos tanto para coliformes

totales como para coliformes fecales, se observo que estas desviaciones fueron

aceptadas (Tablas 3-4), por lo cual se infiere que el método cumple con el primer

parámetro evaluado la precisión.

Para la recuperación satisfactoria se tomo un nivel de confianza entre el 95 y 105% ,

con un margen de error del 5%. La recuperación satisfactoria se aceptada si los

resultados obtenidos estaban dentro de esta meta. En los datos obtenidos se observo

que la recuperación de M1 + A1 y M2 + A2 para coliformes totales como para

coliformes fecales fue satisfactoria (Tablas 5-8), por lo tanto se cumplió con el

segundo parámetro de la validación, la exactitud.

Finalmente, los análisis realizados demostraron que se cumplió con los parámetros

evaluados de precisión y exactitud, gracias a los resultados obtenidos evaluando la

detección simultanea de los microorganismos indicadores de contaminación presentes

en muestras de aguas.

125

CONCLUSIONES

· La validación del método de filtración por membrana para el análisis de

coliformes totales y E. coli en muestras de agua para consumo humano, permitió

obtener resultados reproducibles y confiables.

· Se determinó la precisión del método mediante la aceptabilidad de las

desviaciones estándares de cada solución analizada cumpliéndose con el requisito de

la meta a alcanzada.

· Se determino la exactitud del método, en donde la recuperación de las

muestras adicionadas fue satisfactoria.

· Se estandarizo la lectura del tubo 0.5 de Mcfarland, a una turbiedad entre

0.295 y 0.310 absorbancia, medido en espectrofotómetro a 620 nm.

· Se verifico que los medios de cultivo utilizados para el análisis de coliformes

totales y E. coli, son altamente selectivos y eficaces ya que permitieron solo el

crecimiento del microorganismo de interés y completamente estériles ya que no se

evidencio crecimiento de ningún tipo de microorganismo.

· Se manejaron condiciones adecuadas de limpieza y desinfección, ya que se

evidencio baja carga de microorganismos presentes en el ambiente.

· El mantenimiento y calibración de los equipos garantizaron que las

mediciones realizadas arrojaran resultados confiables.

· El adecuado manejo del cepario (cepas completamente puras y viables),

facilito que no se encontraran microorganismos contaminantes que interfirieran en el

proceso de validación.

126

RECOMENDACIONES

· Se deberá tener un Contrato de Mantenimiento permanente para calibración

de equipos, con el fin de asegurar que se están utilizando equipos completamente

calibrados.

· Además de realizar validación secundaria, se deberá complementar con otras

pruebas, como el cálculo de la incertidumbre, permitiendo de esta manera obtener una

mayor confiabilidad en los resultados emitidos.

· Este método se debe comparar con otro alterno que permita asegurar la

veracidad de los resultados.

· Una vez determinados estos dos parámetros de la validación (Precisión y

exactitud), se deberá complementar con la determinación del Límite de detección

para asegurar resultados plenamente confiables que satisfagan las necesidades del

cliente.

REFERENCIAS

1. Cortes, Alejandra. 2002. Validación de la prueba de esterilidad para vacunas

virales preparadas en vehículos oleoso y acuoso. Carrera Microbiología. Facultad

Ciencias. Básicas. Departamento Microbiología. Pontificia Universidad Javeriana.

Trabajo de Pregrado. Bogotá D.C. 93 páginas.

2. Cortes, Natalia. Méndez, Y. Junio, 2006. Validación de las pruebas de

esterilidad por la técnica de filtración por membrana y endotoxinas bacterianas por el

método de LAL en 3 productos farmacéuticos. Carrera Microbiología. Facultad

127

Ciencias. Básicas. Departamento Microbiología. Pontificia Universidad Javeriana.

Trabajo de Pregrado. Bogotá D.C.

3. Galeano, Norma. 2007. Validación de la retención microbiana en los filtros de

acetato y nitrato de celulosa empleados en la técnica de filtración por membrana para

la prueba de esterilidad. Carrera Microbiología. Facultad Ciencias. Básicas.

Departamento Microbiología. Pontificia Universidad Javeriana. Trabajo de Pregrado.

Bogotá D.C.182 paginas.

4. NTC ISO /IEC 17025: 2005. Requisitos generales de competencia de

laboratorios de ensayo y calibración.

5. Otálora Andrés. Ortiz, J. Peñaranda, S. Palma, R. Puentes, W. Murillo, C.

Peralta, A. Tovar, G. Junio, 2005. Séptimo curso – taller VALIDACIÓN DE

MÉTODOS ANALÍTICOS. Laboratorio Salud Ambiental. Programa de vigilancia

de la calidad del agua potable, metales y no metales de interés en Salud Publica.

Bogotá, D.C.

6. Padilla, José Esteban. 2007. Validación secundaria del método de recuento en

placa en superficie de Bacillus cereus y Staphylococcus aureus en muestras de

alimentos en un laboratorio de referencia. Carrera Microbiología. Facultad Ciencias.

Básicas. Departamento Microbiología. Pontificia Universidad Javeriana. Trabajo de

Pregrado. Bogotá D.C. 109 paginas.

7. Palma Ruth Marien. Ortiz, J. Garnica, E. López, L. Peñaranda, S. Raad, J.

1999. Análisis de agua para consumo humano. Instituto Nacional de Salud. Santa Fe

de Bogotá, D.C.

128

ANEXOS

Tabla 1. Recuento coliformes totales en medio Endo

TABLA DE DATOS COLIFORMES TOTALES Constantes U C V V LMS

M1 0,00 3200 1 99 80


1-BK1 0 0 0 0 0 0

2-BK2 0 0 0 0 0 0 3-E 0.9C 79 69 78 75 73 77 4-E 0.09C 5 9 8 7 4 8 5-M1 0 0 0 0 0 0 6-M2 0 0 0 0 0 0 7-M1+A1 34 31 36 33 35 32 8-M2+A2 60 57 55 52 56 58

Constantes U C v V

M2 0,00 5600 1 99

Tabla 2. Recuento coliformes fecales en medio m-FC.

TABLA DE DATOS COLIFORMES FECALES Constantes U C V V LMS

M1 0,00 3200 1 99 80


1-BK1 0 0 0 0 0 0

2-BK2 0 0 0 0 0 0

3-E 0.9C 77 70 76 78 74 75 4-E 0.09C 6 9 5 8 7 4 5-M1 0 0 0 0 0 0

6-M2 0 0 0 0 0 0

7-M1+A1 32 33 37 34 36 35 8-M2+A2 57 58 59 55 58 56

Constantes U C V V

M2 0,00 5600 1 99

129

a) b) c)

d) e) f)

g)

Figura 1. Recuento de E. coli en medio Endo y medio m-FC. a) Recuento de blancos. b)

Recuento del estandar 0.09C. c) Recuento del estandar 0.9C. d) Recuento del estandar 0.4C.

e) Recuento del estandar 0.7C. f y g) Recuento de M1 y M2.

130

Tabla 3. Cálculo para determinar la aceptabilidad de las desviaciones estándares para coliformes totales Valor mínimo de interés para el parámetro en cuestión: 8 BLANCO 0.9 C 0.09 C M1 M1+A1 M2 M2+A2 St = Se , (St = Sd) para el testigo Sd Se Se Se Se Se Se 0,0000 3,7103 1,9408 0,0000 1,8708 0,0000 2,7325 St2 = Se2 + Sd2 = Varianza 0,0000 13,7667 3,7667 0,0000 3,5000 0,0000 7,4667

St = Desviación estándar 0,0000 3,7103 1,9408 0,0000 1,8708 0,0000 2,7325

Concentración (GMC) 0,0000 75,1667 6,8333 0,0000 33,5000 0,0000 56,3333 W (meta a alcanzar)

0.05 X GMC 0,0000 3,7583 0,3417 0,0000 1,6750 0,0000 2,8167

0.25 X VMI 2,0000 2,0000 2,0000 2,0000 2,0000 2,0000 2,0000


Tabla 4. Cálculo para determinar la aceptabilidad de las desviaciones estándares para coliformes fecales Valor mínimo de ínteres para el parámetro en cuestión: 8 BLANCO 0.9 C 0.09 C M1 M1+A1 M2 M2+A2 St = Se , (St = Sd) para el testigo Sd Se Se Se Se Se Se 0,0000 2,8284 1,8708 0,0000 1,8708 0,0000 1,4720 St2 = Se2 + Sd2 0,0000 8,0000 3,5000 0,0000 3,5000 0,0000 2,1667 St (Desviacion estándar) 0,0000 2,8284 1,8708 0,0000 1,8708 0,0000 1,4720 Concentración (GMC) 0,0000 75,0000 6,5000 0,0000 34,5000 0,0000 57,1667 W (meta a alcanzar)

0.05 X GMC 0,0000 3,7500 0,3250 0,0000 1,7250 0,0000 2,8583

0.25 X VMI 2,0000 2,0000 2,0000 2,0000 2,0000 2,0000 2,0000


131



S 1,8708 1,5352

t0.95=2.015

con y = 5 tabla t bílateral 2,01 2,01 1,5352

R/d R= 33,50 d= 32,00 1,047

R/d>=0.95?

SI NO

R/d<=1,05? 0,95Xd 30,4

SI NO

1,05Xd 33,6


28,86 .=B (i)

R<=A? R>=B?

NO SI SI NO



S

6201´ .

1056

201, ,´ + ´dS 0 95

62 01, ,´ - ´d

S

132



S 1,870

8

1,535

2

t0.95=2.015

con y = 5 tabla t bilateral

2,01 2,01

1,5352

R/d R= 34,50 d= 32,00 1,078

R/d>=0.95

?

SI NO

R/d<=1,05? 0,95Xd 30,4

SI NO

1,05Xd 33,6


28,86 .=B (i)

R<=A? R>=B?

NO SI SI NO



S

6201´ .

1056

201, ,´ + ´dS 0 95

62 01, ,´ - ´d

S

133



S 2,7325 2,2422 t0.95=2.015


R/d R= 56,33 d= 56,00 1,006

R/d>=0.95?

SI NO

R/d<=1,05? 0,95Xd 53,2

SI NO

1,05Xd 58,8


50,96 .=B (i)

R<=A? R>=B?

NO SI SI NO




d R= 56,33 d= 56,00

R/d>=0.95?

SI NO

R/d<=1,05? 0,95Xd

SI NO

1,05Xd


134



S 1,4720

1,2079

t0.95=2.015


R/d R= 57,17 d= 56,00 1,021

R/d>=0.95?

SI NO

R/d<=1,05? 0,95Xd 53,2

SI NO

1,05Xd 58,8


51,99 .=B (i)

R<=A? R>=B?

NO SI SI NO


Recuperación no satisfactoria

Revisar metodologia y técnica analítica

5 con y = 5 tabla t bílateral 2,01

d R= 57,17 d= 56,00

R/d>=0.95?

SI NO

R/d<=1,05? 0,95Xd

SI NO

1,05Xd

cuperación satisfactoria

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