VALIDACIÓN SECUNDARIA DEL MÉTODO DE RECUENTO EN PLACA EN...

VALIDACIÓN SECUNDARIA DEL MÉTODO DE RECUENTO EN PLACA EN

SUPERFICIE DE Bacillus cereus Y Staphylococcus aureus EN MUESTRAS

DE ALIMENTOS EN UN LABORATORIO DE REFERENCIA

JOSÉ ESTEBAN PADILLA GONZÁLEZ

TRABAJO DE GRADO Presentado como requisito parcial

Para optar al titulo de

Microbiólogo Industrial

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA

FACULTAD DE CIENCIAS

CARRERA DE MICROBIOLOGIA INDUSTRIAL

BOGOTÁ D.C.

2007

NOTA DE ADVERTENCIA

Artículo 23 de la Resolución Nº 13 de Julio de 1946

“La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus

alumnos en sus trabajos de tesis. Sólo velará por que no se publique nada

contrario al dogma y a la moral católica y por que las tesis no contengan

ataques personales contra persona alguna, antes bien se vea en ellas el anhelo

de buscar la verdad y la justicia”.





APROBADO

___________________________ Fernando Murcia, Microbiólogo.

Director





APROBADO

___________________________ Fernando Murcia, Microbiólogo.

Director

_____________________________ _______________________ María Clara Méndez, Microbióloga Adriana Páez, Microbióloga Jurado Jurado





APROBADO

__________________________ _______________________ Angela Umaña Muñoz, M. Phil David Gómez Méndez, Msc Decana Académica Director de carrera

TABLA DE CONTENIDO

Pág.

RESUMEN 1

1. INTRODUCCIÓN 2

2. MARCO TEORICO Y REVISIÓN DE LITERATURA 5

2.1 Generalidades de la validación 7

2.1.1 Validación 8

2.1.2 Validación Primaria 10

2.1.3 Validación secundaria 11

2.1.4 Tipos de validación 11

2.1.4.1 Validación prospectiva 11

2.1.4.2 Validación retrospectiva 12

2.1.4.3 Validación concurrente 12

2.1.4.4 Revalidación 13

2.1.5 Parámetros analíticos para la validación de una técnica o método 14

2.1.5.1 Precisión 14

2.1.5.2 Selectividad 15

2.1.5.3 Especificidad 15

2.1.5.4 Linealidad 16

2.1.5.5 Exactitud 16

2.1.5.6 Estabilidad 16

2.1.5.7 Limite de detección 16

2.1.5.8 Limite de cuantificación 16

2.2 Microorganismos de estudio 17

2.2.1 Bacillus cereus 17

2.2.2 Staphylococcus aureus 19

2.3 Toma de muestras y análisis microbiológico de alimentos 21

2.3.1 Toma de muestras 21

2.3.2 Análisis microbiológico de alimentos 23

2.4 Recuento y siembra en placa por superficie 24

2.4.1 Método de recuento en placa en superficie de Bacillus cereus 24

2.4.2 Método de recuento en placa en superficie de Staphylococcus aureus

coagulasa positiva 25

2.5 Control en la validación de los métodos 26

3. FORMULACIÓN DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACIÓN 28

4. OBJETIVOS 29

4.1 Objetivo general 29

4.2 Objetivos específicos 29

5. MATERIALES Y METODOS 30

5.1 Control de calidad de los medios de cultivo 30

5.2 Verificación del control de equipos 32

5.3 Control de ambientes 32

5.4 Validación secundaria del método de recuento en placa en superficie 33

5.4.1 Dilución y homogeneización de las muestras 33

5.4.2 Recuento en placa en superficie de Bacillus cereus 34

5.4.3 Recuento en placa en superficie de Staphylococcus aureus coagulasa

positiva 34

5.4.4 Evaluación de la validación 35

5.5 Informe de resultados 36

6. RESULTADOS Y DISCUSION 37

6.1 Control de calidad de los medios de cultivo 37

6.2 Verificación del control de equipos 43

6.3 Control de ambientes 44

6.4 Validación secundaria del método de recuento en placa en superficie 45

6.4.1 Ensayos de validación para Bacillus cereus 47

6.4.1.1 Ensayo de repetibilidad de Bacillus cereus 47

6.4.1.2 Ensayos de reproducibilidad de Bacillus cereus 53

6.4.2 Ensayos de validación para Staphylococcus aureus coagulasa positiva 64

6.4.2.1 Ensayo de repetibilidad de Staphylococcus aureus coagulasa positiva

64

6.4.2.2 Ensayos de reproducibilidad de Staphylococcus aureus coagulasa positiva

69

7. CONCLUSIONES 82

8. RECOMENDACIONES 84

9. REFERENCIAS 85

8.1 Recursos Electrónicos 89

10. ANEXOS 90

LISTA DE TABLAS

Pág.

Tabla 1. Método ecométrico del medio agar Bacillus cereus al inicio del estudio 39

Tabla 2. Método ecométrico del medio agar Bacillus cereus al finalizar el estudio 40

Tabla 3. Método ecométrico del medio agar Baird Parker al inicio del estudio 41

Tabla 4. Método ecométrico del medio agar Baird Parker al finalizar el estudio 41

Tabla 5. Recuento del control de ambientes 45

Tabla 6. Resultados de los recuentos obtenidos para siembra en placa en superficie de Bacillus cereus en una muestra de albahaca 48

Tabla 7. Análisis de varianzas, desviación estándar y coeficiente de variación prueba repetibilidad recuento en placa en superficie de Bacillus cereus en albahaca 50

Tabla 8. Análisis de varianza. Prueba de repetibilidad recuento en placa en superficie de Bacillus cereus en muestra de albahaca 50

Tabla 9. Prueba t para dos muestras. Prueba de repetibilidad recuento en placa en superficie de Bacillus cereus en muestra de albahaca 51

Tabla 10. Resultados de los recuentos obtenidos para siembra en placa en superficie de Bacillus cereus en una muestra de arroz cocido 51

Tabla 11. Resultados recuentos en placa en superficie de Bacillus cereus en una muestra de albahaca en diferentes horas (ensayo de reproducibilidad 1) 53

Tabla 12. Análisis de varianzas, desviaciones estándar y coeficiente de variación de la prueba de reproducibilidad para el recuento en placa en superficie de Bacillus cereus en albahaca evaluado en diferentes horas (ensayo de reproducibilidad 1) 55

Tabla 13. Prueba t para dos muestras. Prueba de reproducibilidad 1 para Bacillus cereus en muestra de albahaca 55

Tabla 14. Análisis de varianza de dos factores con varias muestras por grupo 56

Tabla 15. Resultados de los recuentos obtenidos para siembra en placa en superficie de Bacillus cereus en una muestra de arroz cocido evaluado en diferentes horas (ensayo de reproducibilidad 1) 57

Tabla 16. Resultados recuentos en placa en superficie de Bacillus cereus en una muestra de albahaca, variando los analistas (ensayo de reproducibilidad 2) 59

Tabla 17. Análisis de varianzas, desviaciones estándar y coeficiente de variación de la prueba de reproducibilidad para el recuento en placa en superficie de Bacillus cereus en albahaca evaluado por diferentes analistas (ensayo de reproducibilidad 2) 60

Tabla 18. Prueba t para dos muestras. Prueba de reproducibilidad 2 para Bacillus cereus en muestra de albahaca 61


Tabla 20. Resultados de los recuentos obtenidos para siembra en placa en superficie de Bacillus cereus en una muestra de arroz cocido evaluado por diferentes analistas (ensayo de reproducibilidad 2) 63

Tabla 21. Resultados de los recuentos obtenidos para siembra en placa en superficie de Staphylococcus aureus en una muestra de leche cruda 64

Tabla 22. Análisis de varianzas, desviaciones estándar y coeficiente de variación prueba repetibilidad recuento en placa en superficie de Staphylococcus aureus en leche cruda 67

Tabla 23. Análisis de varianza. Prueba de repetibilidad recuento en placa en superficie de Staphylococcus aureus en una muestra de leche cruda 67

Tabla 24. Prueba t para dos muestras. Prueba de repetibilidad para Staphylococcus aureus en una muestra de leche cruda 67

Tabla 25. Resultados de los recuentos obtenidos para siembra en placa en superficie de Staphylococcus aureus en una muestra de carne cocida 68

Tabla 26. Resultados recuentos en placa en superficie de Staphylococcus aureus en una muestra de leche cruda a las diferentes horas evaluadas (ensayo de reproducibilidad 1) 70

Tabla 27. Análisis de varianzas, desviaciones estándar y coeficiente de variación de la prueba de reproducibilidad para el recuento en placa en superficie de Staphylococcus aureus en leche cruda evaluado en diferentes horas (ensayo de reproducibilidad 1) 71

Tabla 28. Prueba t para dos muestras. Prueba de reproducibilidad 1 para Staphylococcus aureus en muestra de leche cruda 72


Tabla 30. Resultados de los recuentos obtenidos para siembra en placa en superficie de Staphylococcus aureus en una muestra de carne cocida evaluado en diferentes horas (ensayo de reproducibilidad 1) 74

Tabla 31. Resultados de los recuentos en placa en superficie de Staphylococcus aureus en una muestra de leche cruda, variando los analistas (ensayo de reproducibilidad 2) 76

Tabla 32. Análisis de varianzas, desviaciones estándar y coeficiente de variación de la prueba de reproducibilidad para el recuento en placa en superficie de Staphylococcus aureus en leche cruda evaluado por diferentes analistas (ensayo de reproducibilidad 2) 77

Tabla 33. Prueba t para dos muestras. Prueba de reproducibilidad 2 para Staphylococcus aureus en leche cruda 78


Tabla 35. Resultados de los recuentos obtenidos para siembra en placa en superficie de Staphylococcus aureus en una muestra de carne cocida evaluado por diferentes analistas (ensayo de reproducibilidad 2) 80

LISTA DE FIGURAS

Pág.

Figura 1. Método ecométrico agar Bacillus cereus Scharlau (Prueba) 40

Figura 2. Método ecométrico agar Bacillus cereus Scharlau (interferente) 40

Figura 3. Método ecométrico agar TSA (control) 40

Figura 4. Método ecométrico agar Baird Parker Oxoid (Prueba) 41

Figura 5. Método ecométrico agar Baird Parker Oxoid (interferente) 42

Figura 6. Método ecométrico agar TSA (control) 42

Figura 7. Gráfica de dispersión de la prueba de repetibilidad del recuento en placa en superficie de Bacillus cereus en albahaca 48

Figura 8. Crecimiento de Bacillus cereus en la prueba de repetibilidad 49

Figura 9. Confirmación bioquímica de Bacillus cereus con BBL Crystal 49

Figura 10. Prueba repetibilidad en arroz cocido 52

Figura 11. Gráfica de dispersión prueba de reproducibilidad de Bacillus cereus a las diferentes horas analizadas 54

Figura 12. Bacillus cereus en muestra de albahaca. Prueba reproducibilidad 1 54

Figura 13. Prueba reproducibilidad 1 en arroz cocido 58

Figura 14. Gráfica de dispersión prueba de reproducibilidad de Bacillus cereus realizado por diferentes analistas 59

Figura 15. Bacillus cereus en muestra de albahaca. Prueba reproducibilidad 2 60

Figura 16. Prueba reproducibilidad 2 en arroz cocido 63

Figura 17. Gráfica de dispersión de la prueba de repetibilidad del recuento en placa en superficie de Staphylococcus aureus en leche cruda 65

Figura 18. Staphylococcus aureus en muestra de leche cruda en la prueba de repetibilidad 66

Figura 19. Confirmación de Staphylococcus aureus coagulasa positiva con el kit Slidex Staph plus 66

Figura 20. Confirmación bioquímica de Staphylococcus aureus con BBL Crystal 66

Figura 21. Prueba repetibilidad en carne cocida 69

Figura 22. Gráfica de dispersión prueba de reproducibilidad de Staphylococcus aureus a las diferentes horas analizadas 70

Figura 23. Staphylococcus aureus en muestra de leche cruda. Prueba reproducibilidad 1 71

Figura 24. Prueba reproducibilidad 1 en carne cocida 75

Figura 25. Gráfica de dispersión prueba de reproducibilidad de Staphylococcus aureus realizado por diferentes analistas 76

Figura 26. Staphylococcus aureus en muestra de leche cruda. Prueba reproducibilidad 2 77

Figura 27. Prueba reproducibilidad 2 en carne cocida 81

LISTA DE ANEXOS

Pág.

Anexo 1. Certificados de calidad de las cepas ATCC 90

Anexo 2. Certificados de calidad de los medios de cultivo 93

Anexo 3. Certificados de calibración de los equipos 95

Anexo 4. Confirmación bioquímica por medio del kit de identificación rápida de

microorganismos Gram positivos BBL Crystal 111

AGRADECIMIENTOS

A Biotrends Laboratorios Ltda., por la financiación total del proyecto, en especial a la

doctora Maria Clara Méndez y al doctor Fernando Murcia, por su valiosa colaboración;

a todo el personal de Biotrends Laboratorios por su ayuda; a la profesora Lorena

Valencia por su asesoría y al profesor Miguel Pinzón por su asesoría estadística.

A mis padres por todo el apoyo que me han dado siempre.

A mis hermanos por su ayuda y tolerancia.

A Ana Maria,

y a mis amigos, You know who you are.

1

RESUMEN

Con el fin de brindar una mayor calidad a los consumidores, las empresas

productoras de alimentos deben realizar análisis microbiológicos y

fisicoquímicos para determinar la confiabilidad del producto y verificar si

aprueban los niveles de calidad exigidos para que dichos productos

puedan ser comercializados. Por esta razón, es necesario que los

laboratorios que llevan a cabo dichos análisis se comprometan a realizar

los respectivos análisis teniendo como objetivo principal proporcionar

resultados altamente confiables, razón por la cual, el laboratorio debe

controlar y asegurar la calidad de sus resultados, lo cual radica

principalmente en la alineación con parámetros nacionales e

internacionales, para así poder garantizar un buen desarrollo del

procedimiento y que este se realice en forma correcta cada vez que se

ejecute, lo cual se logra mediante la implementación de la validación de

las técnicas más utilizadas en el laboratorio.

En este estudio se llevó a cabo la validación secundaria del método de

recuento en placa en superficie de Bacillus cereus en muestras de

albahaca y arroz cocido y de Staphylococcus aureus en muestras de

leche cruda y carne cocida, debido a que es una de las técnicas más

frecuentemente utilizadas en Biotrends Laboratorios Ltda. De esta forma,

se obtuvieron resultados que permitieron validar esta técnica y que fueron

analizados estadísticamente, entre los cuales se encontró un alto grado

de concordancia en los coeficientes de variación de los diferentes

ensayos de repetibilidad y reproducibilidad realizados.

2

1. INTRODUCCIÓN

Las empresas productoras de alimentos deben brindar una mayor calidad

a los consumidores, ya que los productos que estas elaboran pueden

comprometer la salud de los mismos, razón por la cual es necesario llevar

a cabo análisis microbiológicos y caracterización físico química para

determinar la confiabilidad del producto y verificar si aprueban los niveles

de calidad exigidos para que dichos productos puedan ser

comercializados.

Es por esta razón que se ha visto la necesidad de crear laboratorios de

análisis de alimentos que lleven a cabo dichos análisis para determinar la

calidad de los productos de las empresas o personas que los elaboran, y

que además brinden asesoría en los respectivos análisis y en la

implementación de un sistema de calidad en estas empresas productoras

de alimentos.

Estos laboratorios se deben comprometer a realizar los respectivos

análisis teniendo como objetivo principal proporcionar resultados

altamente confiables, los cuales dependerán del programa que se haya

implementado en el laboratorio para garantizar la confiabilidad de los

resultados finales emitidos; razón por la cual, el laboratorio, debe controlar

y asegurar la calidad de sus resultados, entendiéndose calidad como el

grado en el que un conjunto de características inherentes cumplen con los

requisitos, lo cual radica principalmente en la alineación con parámetros

nacionales e internacionales.

Los programas de control interno de un laboratorio incluyen evaluación

continua y/o monitoreos de los principales materiales y objetos que se

utilizan dentro de los análisis, como medios de cultivo, reactivos, equipos

o instrumentos, además de la validación de procedimientos técnicos y del

3

personal, también debe incluir manuales de procedimientos y

documentación en general, para así poder garantizar un buen desarrollo

del procedimiento y que este se realice en forma correcta cada vez que se

ejecute, lo cual se logra mediante la implementación de la validación de

las técnicas más utilizadas en el laboratorio.

La validación de una técnica, es el proceso por el cual se establecen

mediante estudios de laboratorio si las características de desempeño del

método analítico cumplen los requerimientos para la aplicación analítica

propuesta, siendo su principal objetivo confirmar y documentar la

confiabilidad de los resultados obtenidos, en la cual se determinarán las

posibles variaciones que se presentan entre diferente número de

ensayos, para así disminuir las posibilidades de error dentro del método,

generando un alto grado de confianza en los resultados finales.

Para realizar la validación de un método microbiológico se debe tener en

cuenta la evaluación de los medios de cultivo a utilizar para la

recuperación de la microflora bacteriana presente en el producto; también

se debe llevar a cabo la calibración y verificación de los equipos que se

utilizan en este tipo de técnicas, tales como: balanzas, micropipetas,

incubadoras, autoclaves, etc. Además de realizar la evaluación de los

analistas que efectúan dichos procedimientos a diario, así como el

conocimiento de las técnicas que se desarrollan y si se han presentado

modificaciones o no de estas dentro del laboratorio, para así poder llevar

a cabo un proceso de validación secundaria, en el que se verifique que la

técnica que ha sido desarrollada en otra parte se está realizando

adecuadamente en el laboratorio.

Esta validación de técnicas microbiológicas es de gran importancia, ya

que permite emitir resultados confiables que garanticen que el proceso

planificado se efectuará uniformemente en conformidad con los resultados

previstos especificados, que conlleven a la toma de decisiones

4

adecuadas; además ayuda a la regulación y el cumplimiento de la

normatividad gubernamental, a la reducción de costos en el laboratorio y

como requisito para dar cumplimiento a la norma NTC ISO/IEC 17025

“Requisitos Generales para la competencia de laboratorios de Prueba y

calibración”, la cual es de vital cumplimiento en el proceso de acreditación

del laboratorio.

5

2. MARCO TEORICO Y REVISIÓN DE LITERATURA

El consumo de algunos alimentos representa un riesgo por la presencia

de microorganismos patógenos, de sus toxinas, metabolitos tóxicos o por

la de microorganismos capaces de deteriorar la calidad del alimento hasta

un estado inaceptable. Por lo tanto, deben tenerse muy en cuenta los

tipos de microorganismos presentes en el alimento y su número. Ciertos

microorganismos simplemente alteran el producto, algunos pueden

causar enfermedades y otros indican la posibilidad de que los alimentos

estén contaminados por patógenos. A menudo, el riesgo de enfermedad

alimentaria es tanto más elevado, conforme el patógeno va

multiplicándose en el alimento y, por tanto, su número aumenta; al

contrario el riesgo será menor si el microorganismo se multiplica

escasamente en el alimento. En algunos casos el alimento solo actúa

como vehiculo de transmisión del organismo infeccioso. La manipulación

sufrida por un alimento durante su distribución, almacenamiento y

preparación para el consumo puede provocar la disminución,

mantenimiento o aumento del número de microorganismos presentes,

mientras que las toxinas más lábiles se desactivan y las más resistentes

se mantienen (ICMSF, 1999).

Es por esto que se hace necesario llevar a cabo un análisis microbiológico

de los alimentos, que asegure que estos son aptos para el consumo

humano y que poseen las condiciones de calidad necesarias para cumplir

con la normatividad gubernamental y así poder ser comercializados.

El análisis microbiológico de alimentos permite valorar la carga microbiana

que se encuentra en los diferentes productos, por esta razón se debe

determinar en la industria cuales son los puntos de riesgo de

contaminación o multiplicación microbiana (los puntos críticos del

proceso) y evitarlos, siguiendo un código estricto de Buenas Practicas de

Manufactura (BPM) y distribución del alimento (Decreto 3075, 1997).

6

La calidad del producto puede garantizarse, mediante la identificación y

manejo de los diferentes puntos críticos de control que se dan en el

proceso, de una correcta manipulación que dependerá de las buenas

practicas de manufactura seguidas durante el proceso de producción, de

un adecuado proceso de envasado o empaquetado, del transporte y de

las características de almacenamiento del producto (Decreto 3075, 1997).

Debido a la importancia de garantizar la calidad de los alimentos, es

importante la verificación y validación de los procesos o técnicas de

evaluación y diagnóstico de la calidad higiénica de estos, que

proporcionen la confiabilidad de los productos de consumo, ya que los

consumidores exigen cada vez más, atributos de calidad en los productos

que adquieren para su consumo (Lightfoot & Maier, 2002).

Estos atributos de calidad son los que el laboratorio debe demostrar

mediante la implementación de un adecuado análisis microbiológico, en

donde se verifiquen los procedimientos que se usan para tal fin,

generando así confiabilidad por medio de técnicas reconocidas y

validadas que se encuentren contempladas en las especificaciones

técnicas propuestas por los entes reguladores, para así poder determinar

si un producto es apto para salir o no al mercado, y si se encuentra bajo

los más altos estándares de calidad; característica requerida para lograr

mayor aceptación por parte del consumidor.

El análisis microbiológico entonces, cobra gran importancia al ser un

punto álgido en la elaboración y distribución de los alimentos, por esta

razón el laboratorio encargado del análisis debe mantener estándares de

calidad aceptables en el procesamiento de muestras y en los resultados

que emitan sus técnicas para garantizar la seguridad e inocuidad de los

alimentos que sus clientes producen y/o distribuyen (ICMSF, 2000). Sin

embargo, la exactitud y precisión de los resultados microbiológicos no

solo dependen de los métodos utilizados y de la competencia del personal

7

del laboratorio, sino también del correcto funcionamiento de los equipos

empleados (Lightfoot & Maier, 2002).

La garantía de calidad en un laboratorio debe tomarse como un programa

para identificar el origen de las variaciones significativas y para minimizar

o aminorar sus efectos sobre la fiabilidad de los resultados analíticos.

Sus objetivos son:

1. Estandarizar los métodos y prácticas del laboratorio.

2. Lograr que su funcionamiento sea comparable, no solo entre

analistas individuales dentro de un mismo laboratorio, sino también

entre distintos laboratorios que realizan el mismo tipo de análisis y

examinan la misma clase de alimentos.

3. Impedir que informes de laboratorio inexactos o en los que no se

pueda confiar sean utilizados para decidir si un producto se ajusta

a las especificaciones aplicables a la industria o cumple los

requisitos legales (ICMSF, 2000).

2.1 Generalidades de la validación

Un adecuado proceso de validación debe desarrollarse dentro del marco

de buenas prácticas de manufactura, ya que garantizan la seguridad de

los datos obtenidos para poder así juzgar sobre la seguridad de un

producto, permitiendo obtener una documentación confiable y segura,

además, la validación permite obtener una optimización y estandarización

de procesos al disminuir el tiempo muerto, reducir costos y la probabilidad

de fallas (Medina & Quintana, 2002).

8

2.1.1 Validación

Es demostrar con un alto grado de confianza, por medio de evidencia

documentada que un proceso específico producirá de forma consistente y

permanente productos que poseerán las características de calidad

predefinidas (WHO Technical Report Series, No. 823, 1992). Es el

proceso por el cual se establecen mediante estudios de laboratorio que

las características de desempeño del método analítico cumplen los

requerimientos para la aplicación analítica propuesta (USP XXVI, 2003),

es decir, para detectar o cuantificar grupos microbianos específicos como

es el caso, siendo su principal objetivo confirmar y documentar la

confiabilidad de los resultados obtenidos.

Para validar un proceso se deben realizar sistemáticamente los

procedimientos de puesta a punto del mismo, mediante el seguimiento de

las siguientes fases:

Planificación:

Se busca establecer programas temporales y listas de verificación,

protocolos de la validación con criterios de aceptación/rechazo,

necesidades de recursos, análisis de riesgos, etc. (European

Commission, 2001).

Calificación del diseño:

El primer elemento de la validación es la evaluación de nuevas

instalaciones, sistemas o equipos. Se deberá demostrar y documentar la

adecuación del diseño a las normas de correcta fabricación (European

Commission, 2001).

Calificación de la instalación:

La calificación de la instalación busca establecer por evidencia objetiva

que todos los aspectos claves del equipo de proceso y la instalación de

9

sistemas auxiliares cumplan con las especificaciones aprobadas del

fabricante y las recomendaciones del abastecedor del equipo para el

correcto funcionamiento, y las exigencias de mantenimiento de este.

Además de esto, también se incluyen requisitos de calibración y

verificación de los materiales de construcción (European Commission,

2001).

Calificación del funcionamiento:

Esta calificación deberá realizarse tras la calificación de la instalación, y

busca establecer por medio de evidencia objetiva los límites de control de

proceso y los niveles de acción que resultan en un producto que cumpla

con todos los requerimientos predeterminados.

Debe incluir:

(a) Ensayos que hayan desarrollado especialistas con conocimiento sobre

procesos, sistemas y equipos.

(b) Ensayos que incluyan una situación o un conjunto de ellas que

abarquen los límites máximos y mínimos de trabajo, condiciones

denominadas como frecuencia “caso más desfavorable”.

La finalización de forma satisfactoria de la calificación del funcionamiento

permitirá terminar los procedimientos de calibración, fabricación y

limpieza, la formación del operario y las exigencias de mantenimiento

preventivo. Así, permitirá la aprobación formal de las instalaciones,

sistemas y equipos (European Commission, 2001).

Calificación de desempeño:

La calificación de desempeño deberá efectuarse una vez realizadas

satisfactoriamente la calificación de la instalación y de funcionamiento.

Esta proveerá evidencia documentada, bajo condiciones anticipadas, que

10

se produce de manera consistente un producto que cumpla con las

especificaciones y el criterio de diseño (European Commission, 2001).

La calificación de la ejecución del proceso incluirá, entre otras cosas, lo

siguiente:

(a) Ensayos, empleando materiales de producción (o componentes

sustitutivos calificados y/o simulaciones de productos), que se hayan

desarrollado a partir del conocimiento especializado sobre los procesos y

las instalaciones, sistemas o equipos.

(b) Ensayos que incluyan una situación o un conjunto de ellas que

abarquen los límites máximos y mínimos de funcionamiento (European

Commission, 2001).

2.1.2 Validación primaria

La validación primaria es un proceso exploratorio que tiene como metas

establecer los límites operacionales y las características de desempeño

de un método nuevo, modificado o caracterizado en forma inadecuada.

Debe dar origen a especificaciones numéricas y descriptivas para el

desempeño e incluir una descripción detallada y precisa del objeto de

interés.

Característicamente, la validación primaria procede mediante el uso de

esquemas de ensayo especialmente diseñados.

Los laboratorios que desarrollan un método “en casa” o una variante de

una norma existente deben realizar los pasos de la validación primaria

(GTC 84, 2003).

11

2.1.3 Validación secundaria

La validación secundaria tiene lugar cuando un laboratorio procede a

implementar un método desarrollado en otra parte. Esta validación se

centra en la reunión de evidencia acerca de que el laboratorio está en

capacidad de cumplir las especificaciones establecidas en la validación

primaria. Suele llamarse verificación; y es la confirmación, mediante el

aporte de pruebas objetivas, de que se han cumplido los requisitos

establecidos (ISO 9000, 2000).

Normalmente, la validación secundaria emplea formas seleccionadas y

simplificadas de los mismos procedimientos empleados en la validación

primaria, aunque posiblemente extendidas por un tiempo mayor. Las

muestras naturales constituyen el material de ensayo óptimo y el trabajo

solo requiere tratar el procedimiento dentro de los límites operacionales

establecidos por la validación primaria (GTC 84, 2003).

Para un laboratorio de análisis es importante validar sus técnicas para así

optimizar sus procesos, al mejorar el uso de equipos y de personal de

laboratorio y eliminar los tiempos muertos, lo cual genera confiabilidad en

los resultados, lo que a su vez implica reducción en los gastos (PDA

Suggested Revision, 2000). Así mismo sirve para dar cumplimiento a las

normas legales pertinentes o a normas internacionales de calidad,

contribuyendo a la credibilidad del laboratorio y a obtener altos niveles de

calidad que generen confianza dentro de sus clientes.

2.1.4 Tipos de validación

2.1.4.1 Validación prospectiva

Este tipo de validación se basa en información obtenida antes de

implantar el proceso de validación. Se debe realizar un análisis de riesgos

para determinar si podrían conducir a situaciones críticas; se investigan

12

posibles causas y se determina la probabilidad de que suceda. Luego se

efectúan los ensayos y se hace una valoración general; si los resultados

son aceptables al final, el proceso es satisfactorio. Los procesos no

satisfactorios se tienen que modificar y mejorar hasta que una nueva

validación demuestre su carácter satisfactorio (European Commission,

2001).

2.1.4.2 Validación retrospectiva

Este tipo de validación involucra la revisión y análisis de la información

histórica del proceso para proveer de la evidencia documentada necesaria

que el proceso está haciendo lo que debe hacer. Los pasos involucrados

en este tipo de validación requieren la preparación de un protocolo

específico, el reporte de los resultados de los datos analizados que

conlleven a unas conclusiones y recomendaciones (PDA Suggested

Revision, 2000), (WHO, 1997).

Este tipo de validación solo es aceptable para procesos bien establecidos

y sería inapropiado si recientemente se hubieran realizado cambios en la

composición del producto, en los procedimientos de operación o en los

equipos (PDA Suggested Revision, 2000), por lo tanto, nunca se debe

aplicar a nuevos procesos o productos. Esta validación puede ser útil en

el establecimiento de las prioridades en un programa de validación (WHO,

1997).

Dentro de la validación retrospectiva es necesario tener en cuenta el

control de la materia prima, controles ambientales, controles

microbiológicos, equipos, procedimientos, especificaciones y métodos

analíticos (European Commission, 2001).

2.1.4.3 Validación concurrente

Este tipo de validación sirve para demostrar y establecer evidencia

documentada que un proceso hace lo que debe hacer basado en

13

información generada durante una implementación real del proceso. La

validación concurrente es muy utilizada cuando se ha variado alguna

etapa del proceso. Esta da una información muy valiosa para modificar y

corregir el proceso. Podría considerarse como una evaluación continua

del proceso, mientras se controla al máximo para procurar que el producto

o resultado final sea correcto (ISO 14000, 1996).

Se debe tener en cuenta el monitoreo en proceso de las variables críticas

que demuestre que el proceso está bajo control y el registro de datos

sobre la marcha del proceso en estado productivo. Sin embargo, cada

aproximación tiene sus características y limitaciones y por lo tanto, antes

de desarrollar una validación deberá evaluarse qué tipo de validación

puede dar la mayor información sobre la seguridad y la estabilidad del

proceso (García, 2001).

2.1.4.4 Revalidación

Se aplica cuando se presenta el cambio de uno de los componentes

críticos de la formulación, cambio o reemplazo de una pieza crítica en un

sistema o equipo o cambio en instalaciones. La revalidación periódica se

presenta cuando los procesos experimentan cambios graduales

(European Commission, 2001).

Es la repetición de un procedimiento de validación o un procedimiento del

mismo. Esto no significa que el programa original deba ser repetido, pues

la revalidación se efectúa para asegurar que los cambios intencionales o

no intencionales en los procesos no afecten las características del

proceso ni la calidad del producto (European Commission, 2001), (WHO,

1997).

14

2.1.5 Parámetros analíticos para la validación de una técnica o

método

Son las propiedades, características o capacidades del método que

indican su grado de calidad en cuanto a exactitud, exactitud relativa,

desviación, desviación positiva, desviación negativa, efecto matricial,

repetibilidad, precisión intermedia, reproducibilidad, especificidad, límite

de detección, límite de cuantificación, linealidad, rango, sensibilidad,

fortaleza y solidez y robustez, entre otras características (OGA-016,

2005).

2.1.5.1 Precisión

Se relaciona con la dispersión de la medida alrededor de un valor medio o

central, que puede ser expresada en términos de varianza, desviación

estándar o coeficiente de variación. La precisión puede ser considerada a

tres niveles: repetibilidad, reproducibilidad y solidez y robustez (OGA-016,

2005).

- Repetibilidad

Medida de la precisión del método cuando se realizan mediciones

sucesivas por el mismo analista el mismo día, mismos reactivos, mismo

instrumento y condiciones de medición (precisión dentro del ensayo). Por

mediciones sucesivas se entiende aquellas mediciones repetidas dentro

de un corto periodo de tiempo (OGA-016, 2005), (WHO Technical Report

Series, No. 823, 1992).

- Reproducibilidad

Grado de concordancia entre los resultados de mediciones del mismo

analito realizadas en diferentes condiciones de medición. Una declaración

válida de reproducibilidad requiere que se especifiquen los cambios en las

condiciones del análisis o calibración. Estos cambios pueden incluir: el

principio en que se basa la medición, el método, analista/observador e

15

instrumento, material y patrones de referencia, ubicación, condiciones de

uso y tiempo. La reproducibilidad puede ser expresada cuantitativamente

en términos de los parámetros de dispersión de los resultados (desviación

estándar, varianza, coeficiente de variación) (OGA-016, 2005). La

reproducibilidad intra-laboratorio es uno de los principales objetivos de los

programas internos de aseguramiento de la calidad. Garantiza que un

laboratorio es capaz de producir resultados constantes a lo largo del

tiempo (Lightfoot & Maier, 2002).

- Solidez y robustez

Busca demostrar la veracidad de un análisis con respecto a variaciones

deliberadas en parámetros del método. Examina el efecto que las

condiciones operacionales y del medio ambiente tienen sobre los

resultados del análisis (diferentes temperaturas y porcentaje de humedad,

analistas con diferente experiencia, instrumentos y reactivos de diferentes

marcas). Se determina analizando muestras provenientes de un lote

homogéneo por diferentes analistas y que el procedimiento analítico no se

vea afectado por estas variaciones deliberadas (OGA-016, 2005).

2.1.5.2 Selectividad

Se define un método selectivo como aquel que produce resultados

exactos para todos los analitos de interés (WHO Technical Report Series,

No. 823, 1992).

2.1.5.3 Especificidad

Es la capacidad del método para diferenciar precisa y específicamente el

compuesto de interés, en presencia de los demás componentes, que se

espera estén presentes en la matriz de la muestra (WHO Technical

Report Series, No. 823, 1992). La especificidad se puede estudiar

agregando a la muestra algunas sustancias que se sospecha que

reaccionan de la misma manera que el componente estudiado y comparar

16

estadísticamente los resultados analíticos con y sin agregado (OGA-016,

2005).

2.1.5.4 Linealidad

Tiene que ver con la proporcionalidad entre la concentración del analito y

su respuesta, es decir, si la técnica o método produce resultados directa o

indirectamente proporcionales a la concentración o cantidad del analito,

dentro de un intervalo determinado (WHO Technical Report Series, No.

823, 1992).

2.1.5.5 Exactitud

Es el grado de concordancia entre el valor aceptado como un valor

verdadero convencional, o un valor de referencia, y el valor encontrado

(OGA-016, 2005). Se conoce también como error sistemático o sesgo.

2.1.5.6 Estabilidad

La estabilidad se considera adecuada si la desviación estándar relativa

calculada en los resultados obtenidos en diferentes intervalos de tiempo,

no excede el 20% del valor correspondiente de la precisión del sistema

(WHO Technical Report Series, No. 823, 1992).

2.1.5.7 Límite de detección

Concentración mínima del analito que puede detectarse en una muestra,

pero no es necesariamente cuantificada, bajo condiciones analíticas

específicas (OGA-016, 2005).

2.1.5.8 Límite de cuantificación

Corresponde a la concentración mínima del analito que puede ser

cuantificada con una exactitud y precisión aceptable en una muestra bajo

condiciones analíticas específicas (OGA-016, 2005).

17

2.2 Microorganismos de estudio

El análisis rutinario de los alimentos para poner de manifiesto un amplio

rango de bacterias patógenas resultaría poco práctico para la mayoría de

las industrias. Es por esto que se ha convertido en práctica corriente

investigar en los alimentos la presencia de grupos indicadores que

determinen la posibilidad de la existencia de microorganismos causantes

de intoxicaciones o de otros riesgos asociados con el crecimiento

microbiano (Hayes, 1993). Entre los microorganismos que se usan como

indicadores se encuentran las bacterias mesófilas esporuladas, de las

cuales hace parte Bacillus cereus, que revelan un tratamiento térmico

insuficiente de los alimentos enlatados o de un almacenamiento

prolongado sin refrigeración de los alimentos cocinados, tales como la

carne y el arroz. También se puede mencionar como indicador a

Staphylococcus aureus, cuya presencia en los alimentos se interpreta

como indicativo de contaminación a partir de la piel, la boca y las fosas

nasales de los manipuladores de alimentos, ya que el material y equipo

sucios y las materias primas de origen animal pueden ser también la

fuente de la contaminación (ICMSF, 2000).

2.2.1 Bacillus cereus

Bacillus cereus es un bacilo Gram positivo, móvil, esporoformador,

aerobio. Común en el suelo, en los vegetales, en los alimentos crudos y

procesados. Puede producir intoxicación alimentaria generalmente de

curso leve, que no suele durar más de 12 - 24 horas (ICMSF, 2000).

Bacillus cereus causa dos tipos diferentes de intoxicación por alimentos:

el tipo diarreico y el tipo emético (Sarrías et al., 2002). El tipo diarreico de

intoxicación alimentaria es causado por las enterotoxinas producidas

durante el crecimiento vegetativo de B. cereus en el intestino delgado, y

los alimentos asociados más frecuentemente a este tipo de enfermedad

son los postres, carnes y los productos lácteos; mientras que la toxina

18

emética, que causa vómito, es producida por las células que crecen en el

alimento. El arroz es el vehículo de intoxicación más común por este tipo

de toxina. Para ambos tipos de intoxicaciones, los alimentos implicados

usualmente han sido calentados, y las esporas sobrevivientes han sido la

fuente de la enfermedad. Carlin et al. (2006), evaluaron los riesgos de la

producción de la toxina emética en ciertos tipos de alimentos,

encontrando que la poca habilidad de crecer a bajas temperaturas

demuestra que las cepas de B. cereus productoras de la toxina emética

representan un bajo riesgo en alimentos refrigerados. Por el contrario, la

notable resistencia de sus esporas a altas temperaturas favorece su

crecimiento en alimentos calentados cuando estos son dejados a

temperatura ambiente por más de 2 horas.

Las esporas de B. cereus son un factor importante en las enfermedades

transmitidas por alimentos, ya que estas son mas hidrofóbicas que otras

esporas de Bacillus spp., lo cual permite que estas se adhieran a varios

tipos de superficies. De aquí que sean difíciles de remover de equipos

durante la limpieza, pues estas poseen apéndices y/o pilis que están, en

menor parte, involucrados en la adhesión. Estas propiedades de

adherencia no solo permiten que las esporas resistan los procedimientos

normales de saneamiento, y así contaminar los alimentos durante el

procesamiento, sino que ayudan a que se unan a las células epiteliales

(Doyle, 1997).

B. cereus no es un microorganismo competitivo, pero crece bien después

de cocinar el alimento y dejarlo enfriar (< 48° C). El tratamiento con calor

causa la germinación de las esporas y, en ausencia de flora competitiva,

B. cereus crece óptimamente (Doyle, 1997). B. cereus es un

microorganismo común del suelo y se propaga fácilmente a muchos tipos

de alimentos, especialmente los de origen vegetal, pero también es

aislado normalmente de carne, huevos, leche cruda y productos lácteos

debido a procesos de contaminación cruzada. Estos últimos, además del

19

arroz y las especias, están entre los alimentos que más frecuentemente

se contaminan con B. cereus.

Bacillus cereus produce intoxicaciones alimentarias solamente cuando el

alimento ingerido contiene números muy elevados de células,

generalmente superiores a 107 UFC/g o ml. Por ello, el recuento de B.

cereus es el factor decisivo a la hora de evaluar el significado de este

microorganismo en los alimentos (ICMSF, 2000). Sin embargo, las

enfermedades causadas por B. cereus no son muy reportadas, pues

ambos casos de intoxicaciones son relativamente poco agresivas y

usualmente duran menos de 24 horas (Doyle, 1997).

2.2.2 Staphylococcus aureus

Staphylococcus aureus es un coco Gram positivo, inmóvil que forma

agrupaciones irregulares de células usualmente parecidas a los racimos

de uvas. Son anaerobios facultativos, pero crecen mejor en presencia de

aire, siendo su temperatura óptima de crecimiento los 37° C, pero

desarrollándose hasta los 10° C o ligeramente menos (Hayes, 1993).

La intoxicación alimentaria estafilocócica es un síndrome caracterizado

por nauseas, vómitos, diarrea, malestar y debilidad general. Los síntomas

comienzan a manifestarse de 1 a 6 horas después de consumido el

alimento (ICMSF, 2000).

S. aureus ha sido ampliamente caracterizado, ya que se sabe que este

microorganismo produce una gran variedad de productos extracelulares.

Muchos de ellos, como las enterotoxinas estafilococales (SE en inglés),

son factores virulentos que han estado implicados en enfermedades de

humanos y animales. Estas enterotoxinas elaboran un juego de

propiedades biológicas que causan al menos dos enfermedades humanas

comunes, síndrome de shock tóxico (TSS en inglés) e intoxicaciones

20

debidas a Staphylococcus en alimentos (Doyle, 1997). Si en un alimento

asociado a un brote es identificado S. aureus, también se debe estudiar la

producción de enterotoxinas, lo cual incrementa la complejidad del

ensayo, ya que es usual que S. aureus produzca una o más toxinas

simultáneamente. Comúnmente, las SE han sido divididas en cinco

grandes clases serológicas (SE A, SE B, SE C, SE D, SE E) debido a sus

propiedades antigénicas, pero en los últimos años se han identificado

nueve clases más (SE G hasta SE O). Siendo la SE A la enterotoxina más

comúnmente recuperada de brotes de enfermedades transmitidas por

alimentos (Aznar et al., 2005).

Las intoxicaciones debidas a Staphylococcus en alimentos están

clasificadas como unas de las causas más prevalentes de gastroenteritis

en el mundo. Esto se debe a la ingestión de una o más enterotoxinas

estafilocócicas preformadas en alimentos contaminados por miembros del

género Staphylococcus, en donde predomina Staphylococcus aureus

(Doyle, 1997).

La principal fuente de contaminación de los alimentos por Staphylococcus

se debe a la manipulación de estos por parte de personas contaminadas,

ya que los humanos son el principal reservorio de este microorganismo. Si

bien muchas especies del género Staphylococcus se consideran

habitantes normales del cuerpo humano, S. aureus es el patógeno más

destacado. En los humanos, las fosas nasales son los sitios de

colonización predominantes, aunque se pueden encontrar células de S.

aureus en diferentes sitios de la piel. La diseminación de S. aureus entre

humanos y de los humanos a los alimentos puede ocurrir por contacto

directo o indirectamente por fragmentos de piel (Doyle, 1997).

Algunas propiedades únicas de resistencia de S. aureus facilitan la

contaminación y crecimiento en alimentos. Afuera del cuerpo humano,

21

S. aureus es uno de los patógenos humanos no esporoformador más

resistente, pues puede sobrevivir por extensos periodos de tiempo. Es por

esto que para algunos alimentos procesados o tratados, S. aureus es un

buen indicador del grado de contacto humano, o con alimentos naturales

no tratados de origen animal dentro de la fábrica de alimentos (ICMSF,

2000). Por tal razón, se debe realizar la búsqueda de S. aureus; pues su

presencia indica insuficiencia en los tratamientos con calor como

pasteurización de la leche o cocción de la carne y en el uso de agentes

químicos sanitizantes que generalmente destruyen a este microorganismo

(Ingham & Schoeller, 2001).

Los factores que originan las enfermedades transmitidas por alimentos

debido a la contaminación de estos por S. aureus son:

a) Refrigeración inadecuada.

b) Poca higiene personal (no lavar las manos o los instrumentos

apropiadamente o no usar tapabocas).

c) Cocción o calentamiento inadecuados de los alimentos.

d) Uso prolongado de platos para calentar cuando se sirven los alimentos,

una práctica que promueve el crecimiento del microorganismo y la

producción de enterotoxinas (Doyle, 1997).

2.3 Toma de muestras y análisis microbiológico de alimentos

2.3.1 Toma de muestras

La calidad del informe final emitido por un laboratorio dependerá

directamente de la calidad de la muestra recogida y analizada. Los

análisis se solicitan para obtener una respuesta a una demanda

específica, por lo que deben ser realizados sobre muestras recogidas de

forma correcta y aplicando las técnicas más adecuadas para obtener

resultados representativos. Para cumplir este objetivo se debe seguir un

22

adecuado plan de toma de muestras (Lightfoot & Maier, 2002). Los

criterios de análisis aplicados han de ser específicos de cada alimento

porque son diferentes los microorganismos patógenos y alterantes de

cada tipo de alimento (Romero, 2005).

El factor más importante en el análisis es el muestreo, el cual incluye: a)

evaluación de la muestra necesaria para evitar la distorsión producida por

los microorganismos presentes en las diferentes partes de la superficie

(canales, máquinas, platos, etc.); b) determinación del modo óptimo de

remoción del microorganismo de la muestra o lugar de muestro y c)

eliminación del riesgo de la contaminación ambiental durante la toma o

transporte de muestras (Romero, 2005).

En cuanto al transporte de muestras, es importante evitar que durante el

tiempo que este va a durar se produzca una multiplicación de los

microorganismos presentes o por el contrario, inactivación de algún

microorganismo (Romero, 2005). Para conseguir este objetivo, la muestra

debe ser protegida de los rayos ultravioletas, luz visible y las altas

temperaturas. Esto se consigue utilizando recipientes isotérmicos

refrigerados con bolsas de hielo o cualquier otro sistema adecuado

(Lightfoot & Maier, 2002).

En el momento de tomar las muestras es muy importante evitar sesgos y

propensiones, y obtener un número suficiente de unidades de muestra

para poder confiar en el juicio derivado de su análisis. El muestreo

aleatorio es el método más reconocido para evitar subjetividades y

proporciona mejores resultados que intentar recoger, de forma

consciente, unidades de muestra de varias partes de un lote. Aunque no

hay garantía de que la muestra elegida con los números aleatorios tenga

las mismas características que el lote, es más probable que las tenga,

que si las muestras no se hubieran tomado aleatoriamente (ICMSF,

1999).

23

2.3.2 Análisis microbiológico de alimentos

El análisis microbiológico en la industria de alimentos, se constituye en

una herramienta básica para el control de materias primas, procesos,

productos y manipuladores, ya que permite establecer el grado de

contaminación biológica de estos, por esta razón el control microbiológico

es parte fundamental de todo el proceso (Carrascal, et al., 2003).

Los principales objetivos del análisis microbiológico son:

- Asegurar que el alimento cumpla con las normas estatutarias.

- Que se ajuste a normas internas establecidas por la empresa que los

procesa y a las que exige el comprador.

- Que las materias alimenticias que llegan a la fábrica para ser

procesadas cumplan las normas exigidas y las pactadas con el productor.

- Que se mantenga el control del proceso y la higiene de la línea de

fabricación (Hayes, 1993).

Los métodos de examen microbiológico utilizados para controlar la calidad

del alimento son en sí mismos muy variados y dependientes, en gran

parte del alimento que va a ser analizado (Soler, 2006).

Para el análisis microbiológico se debe tomar un peso conocido del

alimento (10 o 25 g). El alimento se debe adicionar en un diluyente como

agua peptonada al 0.1%. El tratamiento implica una homogenización

mecánica o en el Stomacher. El volumen de diluyente utilizado

generalmente es nueve veces mayor que la muestra; para 25 g se utilizan

225 ml de diluyente de forma que se obtenga un homogeneizado de

dilución 10-1, a partir de la cual se preparan las correspondientes

diluciones seriadas en base 10, dependiendo de la calidad microbiológica

del producto objeto de análisis (Hayes, 1993).

24

2.4 Recuento y siembra en placa por superficie

Cada tipo de recuento de microorganismos viables es potencialmente útil

para fines específicos. Los recuentos de bacterias viables se basan en el

número de colonias que se desarrollan en placas de agar que han sido

previamente inoculadas con cantidades conocidas del alimento diluido e

incubadas en condiciones ambientales predeterminadas. Tales recuentos

se denominan, en algunos casos con evidente error, recuentos totales en

placa, cuando en realidad únicamente pueden contarse aquellas bacterias

que pueden crecer en las condiciones ambientales elegidas; pues se

pueden cambiar las condiciones ambientales, las de incubación, la

composición del medio de cultivo (añadiendo inhibidores selectivos al

medio o agentes con actividad de superficie o colorantes) favoreciendo

así el crecimiento de unos u otros microorganismos (ICMSF, 1999).

2.4.1 Método de recuento en placa en superficie de Bacillus cereus

-Sembrar por triplicado 0.1 ml de muestra líquida o 0.1 ml de dilución

madre a placas de Agar Bacillus cereus.

-Extender con un asa estéril sobre el agar.

-Repetir la operación con las siguientes diluciones decimales.

-Tapar y dejar absorber durante unos 15 minutos a temperatura ambiente.

-Incubar a 35° C ± 2° C durante 18 h – 24 h (+ 24 horas si es necesario).

Recuento:

Retener las placas que contengan menos de 150 colonias, si es posible al

nivel de 2 diluciones sucesivas.

Contar las colonias de presuntos Bacillus cereus (grandes, rosadas, que

no fermentan manitol y casi siempre rodeadas de una zona de

precipitado) (Holguín et al., 1998), (Allaert & Escolá, 2002).

25

Además de Bacillus cereus, otras especies dan reacciones positivas o

débilmente positivas en medios con yema de huevo. La actividad

hemolítica no es exclusiva de Bacillus cereus. Por estas razones, deben

someterse a confirmación colonias representativas procedentes del medio

(ICMSF, 2000).

2.4.2 Método de recuento en placa en superficie de Staphylococcus

aureus coagulasa positiva

Sembrar por triplicado 0.1 ml de la muestra líquida o 0.1 ml de dilución

madre en placas de petri con medio Baird Parker.

Extender con un asa estéril sobre el agar.

Repetir esta operación con 0.1 ml de cada una de las siguientes

diluciones decimales.

Tapar y dejar absorber durante 15 minutos a temperatura ambiente.

Incubar a 37° C ± 2° C durante 18 h – 24 h.

Recuento:

Después de 24 h ± 2 h de incubación, marcar en la placa las colonias

características (de 1 a 1.5 mm de diámetro, negras o grises, brillantes y

convexas, rodeadas de una zona clara).

Incubar durante 24 h ± 2 h más.

Marcar las colonias características (de 1.5 a 2.5 mm de diámetro; parte de

la zona clara puede volverse opaca y estar en contacto con las colonias),

y también las colonias no características (estas pueden no tener zona

clara).

Retener las placas que tengan un máximo de 300 colonias, con 150

colonias características y no características al nivel de dos diluciones

sucesivas (Holguín et al., 1998), (Allaert & Escolá, 2002).

26

A las colonias presuntivas de S. aureus, realizarles el test de confirmación

de coagulasa por medio del kit Slidex Staph plus, el cual es una prueba

para evidenciar la rápida combinación de látex y eritrocitos; desarrollado

para detectar el factor de aglutinamiento, proteína A y un inmunógeno

específico de superficie para S. aureus (Wichelhaus, 1999).

2.5 Control en la validación de los métodos

El método de recuento y siembra en placa provee un estimado de la

posible contaminación de un alimento, este estimado tiene sus bases en

principios científicos, que involucran la incorporación de controles de cada

uno de los lotes y de todas las pruebas (Akers, 1998).

Estos controles son los estipulados en las buenas prácticas de laboratorio

(BPL) e incluyen medio ambiente, analista y condiciones de esterilización

empleadas durante la elaboración, ensayo o análisis.

Los controles en las pruebas de siembra en placa son:

Control positivo del medio de cultivo: verificar la capacidad del medio de

cultivo de recuperación del microorganismo para el cual esta diseñado.

Control negativo del medio de cultivo: probar la esterilidad del medio.

Controles específicos: control de ambientes, analista, empaques, agua

peptonada, etc. (Romero, 2005).

Por lo anterior y como norma general conviene probar experimentalmente

los medios usados para determinar su selectividad y su productividad; así

como no debe usarse un medio diseñado para un producto en otro

producto diferente porque las condiciones ecológicas pueden ser

diferentes dando lugar a una distorsión de los resultados (Romero, 2005).

Dada la variabilidad debida a pequeños errores en la preparación de los

medios de cultivo, tanto los generales como los selectivos, es necesario

hacer controles periódicos que permitan comprobar tanto que las

bacterias a diagnosticar crecen incluso a partir de células aisladas, como

27

que las bacterias de la flora general son satisfactoriamente inhibidas. Este

tipo de control de los medios de cultivo se denomina ensayo ecométrico

(Doyle, et al., 1997).

El medio de cultivo debe proveer los requerimientos nutricionales básicos

para el crecimiento de los microorganismos, por lo tanto, debe cumplir con

dos características fundamentales: la selectividad y la productividad. La

selectividad hace referencia a la composición básica del medio que

favorece el crecimiento de la cepa esperada con las características

propias de su especie, además permite evaluar el equilibrio nutricional

pertinente para cada especie, mientras que la productividad se ocupa de

la formulación del medio con respecto a los inhibidores del crecimiento de

flora acompañante, indeseable en un análisis especifico y que obedezca a

factores externos al análisis del alimento. El fundamento de la técnica es

establecer la eficiencia con la cual un medio de cultivo sirve para

recuperar una cepa, mediante la comparación que se realiza entre un

microorganismo que crece fácilmente en un medio (de referencia) y un

microorganismo que se espera no crezca debido a la composición del

medio (interferente) (Romero, 2005).

28

3. FORMULACIÓN DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACIÓN

Los laboratorios de análisis microbiológico buscan realizar procedimientos

e implementar técnicas que permitan generar resultados altamente

confiables, para satisfacer las necesidades de los clientes, autoridades

reglamentarias u organizaciones que otorgan reconocimiento, mediante

procesos de planificación, que se efectuarán uniformemente en

conformidad con los resultados previstos, y originarán una reducción de

tiempo y de costos, para poder así cumplir con las especificaciones del

cliente, con los requisitos exigidos por la normatividad nacional y con

aquellas normas internacionales que les pueden dar un reconocimiento,

como la norma NTC ISO/IEC 17025.

Debido a lo anterior, se debe tener en cuenta una variedad de

procedimientos a seguir, dentro de los que se encuentra la

estandarización, documentación y validación de técnicas y/o métodos que

se llevan a cabo dentro del laboratorio de análisis microbiológico

Biotrends Laboratorios Ltda., para verificar que estos cumplen los

requerimientos para la aplicación analítica propuesta, es decir, para

detectar o cuantificar grupos microbianos específicos, siendo su principal

objetivo confirmar y documentar la confiabilidad de los resultados

obtenidos.

Por tal razón, es necesario implementar una validación de los métodos

analíticos utilizados más frecuentemente en Biotrends Laboratorios Ltda.,

como lo son los análisis de detección de Bacillus cereus y Staphylococcus

aureus en muestras de alimentos por medio del método de recuento en

placa en superficie, ya que son análisis que se llevan a cabo diariamente

en el laboratorio para evaluar la calidad de los alimentos, materias primas,

productos en proceso, producto terminado; o en análisis de operarios y

superficies de acuerdo a la especificación técnica de cada producto o

análisis.

29

4. OBJETIVOS

4.1 Objetivo General

Realizar la validación secundaria concurrente del método de recuento en

placa en superficie de Bacillus cereus y Staphylococcus aureus en

muestras de albahaca, arroz cocido, leche cruda y carne cocida.

4.2 Objetivos Específicos

• Evaluar la repetibilidad y reproducibilidad (estudio r y R) de la

técnica de recuento en placa en superficie de Bacillus cereus en

muestras de albahaca y arroz cocido y de Staphylococcus aureus

en muestras de leche cruda y carne cocida, mediante repeticiones

sucesivas realizadas en diferentes condiciones de medición.

• Realizar la evaluación de selectividad y especificidad de la técnica

de recuento en placa en superficie de Bacillus cereus y

Staphylococcus aureus.

• Evaluar los parámetros estadísticos de la validación de la técnica

de recuento en placa en superficie de Bacillus cereus y

Staphylococcus aureus.

• Evaluar la calidad de los medios de cultivo a utilizar en el análisis,

por medio de pruebas de esterilidad, pruebas de selectividad y

productividad (ensayo ecométrico) y control de pH.

• Realizar un análisis de control de datos de los resultados obtenidos

durante el estudio.

30

5. MATERIALES Y MÉTODOS Para llevar a cabo la validación secundaria del método de recuento en

placa en superficie de Bacillus cereus y Staphylococcus aureus en

muestras de alimentos, fue necesario realizar un control de la calidad de

los medios de cultivo que se trabajaron y se realizó la verificación del

estado de los equipos.

A los productos analizados (albahaca, arroz cocido, leche cruda y carne

cocida) se les realizó el recuento en placa en superficie de Bacillus cereus

y Staphylococcus aureus de acuerdo con la propuesta por Holguín et al.,

(1998). De la misma forma, se evaluó la repetibilidad y reproducibilidad de

la técnica de recuento en placa en superficie de estos microorganismos,

además de evaluar la selectividad, la especificidad y los demás

parámetros estadísticos de la validación.

Este proyecto se realizó en las instalaciones de Biotrends Laboratorios

Ltda., ubicado en la ciudad de Bogotá D.C.

5.1 Control de calidad de los medios de cultivo

A los medios de cultivo utilizados en el estudio se les realizaron diferentes

controles para asegurar que estuvieran en óptimas condiciones. Estos

controles fueron: control de esterilidad, control de pH a 25° C, control

macroscópico y un control para medir la productividad y selectividad por

medio del método ecométrico.

• Control de esterilidad: de cada lote disponible se eligió al azar un

2% de la totalidad de las cajas servidas con el medio de cultivo y

se llevaron a incubación durante 48 horas a 35 ± 1° C, para

verificar que no se presentara crecimiento de ningún tipo en las

cajas (Allaert & Escolá, 2002).

31

• Control de pH a 25° C: se tomó una muestra del medio de cultivo y

con un pH-metro se realizó una medición del medio a una

temperatura de 25° C. El valor de pH obtenido para los medios de

cultivo debe corresponder con el indicado en la ficha técnica del

medio, donde se da un intervalo de aceptación de ± 0.2 (Allaert &

Escolá, 2002).

• Control macroscópico: se realizó un examen visual para poder

descartar cualquier error importante en la preparación del medio.

Se observó si su consistencia (sólida), su color o aspecto

corresponden con los que indica la ficha técnica de estos (Allaert &

Escolá, 2002).

• Método ecométrico: este control se realizó para comprobar la

eficacia del medio de cultivo. Para realizar este método se preparó

una suspensión de un microorganismo blanco y otro interferente a

una concentración igual al tubo 1 de Mc Farland (3 x 108 UFC/ ml).

Para lo cual se tomó una asada de los microorganismos de prueba

(Bacillus cereus ATCC 11778 y Staphylococcus aureus ATCC

6538) y el microorganismo interferente (Escherichia coli ATCC

8739) (anexo 1) previamente crecidos en un medio de cultivo

nutritivo y resuspendidos en solución salina, hasta alcanzar un

patrón de turbidez igual al mencionado. Posteriormente se tomaron

los medios para evaluar a los microorganismos de prueba (agar

Bacillus cereus y agar Baird Parker), y al microorganismo

interferente (en los mismos medios de cultivo) y como control se

sembraron los microorganismos de prueba en agar Tripticasa

Soya, para verificar su crecimiento. Luego se dividieron en cuatro

cuadrantes y con un asa calibrada se tomó el microorganismo

indicado y se trazaron cinco estrías en la superficie del medio de

forma paralela por cuadrante y una central sin voltear ni retomar

32

muestra sobre el medio de prueba, interferente y de control para

cada microorganismo (Lightfoot & Maier, 2002). Se realizaron dos

repeticiones del método ecométrico para evaluar los medios de

cultivo (mismos lotes), una al comienzo y otra al finalizar el estudio

Se realizó además una revisión de la fecha de caducidad de cada uno

de los medios de cultivo utilizados. Después de la preparación, cada

caja con el medio se etiquetó con la fecha y hora de preparación,

además de la persona encargada y estas se almacenaron a 4° C por

periodos no mayores a 8 días.

5.2 Verificación del control de equipos

Se revisó el historial de los equipos involucrados en el estudio

incluyendo certificados de calibración, mantenimiento y registros de su

uso en los últimos meses.

5.3 Control de ambientes

Empleando la técnica de sedimentación, se colocaron cajas abiertas

con medio de cultivo para microorganismos mesófilos (TSA) y para

hongos y levaduras (Sabouraud) en diferentes puntos del cuarto de

siembra durante un periodo de 15 minutos. Posteriormente las cajas

se llevaron a incubar a una temperatura de 35 ± 2° C durante 48 horas

para mesófilos y a 22 ± 2° C durante 5 días para hongos y levaduras.

Este control se llevó a cabo durante todas las pruebas realizadas.

33

5.4 Validación secundaria del método de recuento en placa en

superficie

La metodología para realizar los análisis de alimentos en el laboratorio

se llevó a cabo de acuerdo al protocolo descrito por Holguín et al.,

(1998).

Se tomaron muestras de alta influencia en el laboratorio y las más

susceptibles a contaminación por S. aureus (leche cruda) y por B.

cereus (albahaca). Además, se tomaron dos muestras que se sabe

que presentan bajos recuentos de S. aureus y B. cereus, tales como

carne cocida y arroz cocido, respectivamente.

Se realizó la evaluación de repetibilidad, reproducibilidad intra-

laboratorio, especificidad, selectividad y los demás parámetros

estadísticos de la validación. Para esto, se tuvo en cuenta lo descrito

por el comité de expertos de la OMS (WHO Technical Report Series,

No. 823, 1992).

5.4.1 Dilución y homogeneización de las muestras

• La muestra se agitó manualmente antes de iniciar la prueba

• Se verificó que el recipiente de la muestra se encontrara limpio

y en buenas condiciones antes de abrirlo, para luego abrirlo de

forma aséptica.

• Se pesaron las muestras (albahaca, leche cruda, arroz cocido y

carne cocida) y se agregaron a recipientes con agua peptonada

(obteniendo la dilución 10-1). Posteriormente se homogenizaron

en el stomacher.

• Se realizaron diluciones seriadas en base 10 (obteniendo así

las diluciones 10-2, 10-3, 10-4, 10-5, etc.) (Holguín et al., 1998).

34

5.4.2 Recuento en placa en superficie de Bacillus cereus

• Luego de realizar las diluciones, se tomó 0.1 ml de cada

dilución y se agregó en la superficie de la caja de petri con agar

Bacillus cereus, este procedimiento se realizó por triplicado.

• Se extendió la muestra con un asa estéril sobre el agar.

• Se taparon las cajas y se dejó absorber la muestra durante

unos 15 minutos a temperatura ambiente.

• Se invirtieron las cajas y se llevaron a incubar a 35° C ± 2° C

durante 18 h – 24 h.

• Se realizó el recuento de UFC/g o ml de las colonias

características de Bacillus cereus.

• Se sometieron a confirmación colonias representativas

procedentes del medio por medio de coloración de Gram

(Holguín et al., 1998).

• Posterior a esto, se realizó una modificación de la técnica que

consistió en realizar la confirmación bioquímica por medio del kit

de bioquímicas rápidas Crystal BBL.

5.4.3 Recuento en placa en superficie de Staphylococcus aureus

coagulasa positiva

• Se tomó 0.1 ml de cada dilución y se agregó en la superficie

de la caja de petri con agar Baird Parker, este procedimiento

se realizó por triplicado.

• Se extendió la muestra con un asa estéril sobre el agar.

• Se taparon las cajas y se dejó absorber la muestra durante

unos 15 minutos a temperatura ambiente.

• Se invirtieron las cajas y se llevaron a incubar a 37° C ± 2° C

durante 18 h – 24 h.

• Después de 24 h ± 2 h de incubación, se marcaron en la

placa las colonias características (de 1 a 1.5 mm de

35

diámetro, negras o grises, brillantes y convexas, rodeadas

de una zona clara).

• Posteriormente se incubaron durante 24 h ± 2 h más.

• Se realizó el recuento de UFC/g o ml de la muestra (Holguín

et al., 1998).

• Se realizó una modificación a la técnica para evaluar S.

aureus coagulasa positiva, debido a que resulta ser más

práctica y además se encuentra validada por la AOAC; la

cual consiste en realizar la confirmación de S. aureus

coagulasa positiva con el kit Slidex Staph plus. Para llevar a

cabo esta prueba se debe depositar una gota del reactivo

anti - S. aureus y una gota del reactivo control sobre la

lámina. Luego, se deben tomar una o dos colonias

sospechosas y emulsificar en los reactivos. La aglutinación

(combinación de látex y células rojas sanguíneas) dentro de

30 segundos indica la presencia de S. aureus

(http://www.biomerieuxusa.com/clinical/microbiology/slidex/sl

idex_staph.htm) (2006).

• Además de esto, se realizó una confirmación bioquímica por

medio del kit de bioquímicas rápidas BBL Crystal (Gram-

Positive ID System) a las colonias características.

5.4.4 Evaluación de la validación

La evaluación de repetibilidad se realizó por medio de tres repeticiones

para cada producto, y cada repetición se hizo por triplicado. La

reproducibilidad se evaluó por medio de tres repeticiones para cada

producto, por triplicado, variando las condiciones de realización del

método (diferentes analistas y diferentes horas).

36

5.5 Informe de resultados

Mediante la evaluación de los parámetros estadísticos, tales como

media, desviación estándar, varianza y coeficiente de variación, se

analizaron los respectivos datos obtenidos durante el estudio, para

determinar la homogeneidad y los niveles de repetibilidad y

reproducibilidad de la técnica de recuento en placa en superficie de

Bacillus cereus en muestras de albahaca y arroz cocido y de

Staphylococcus aureus en muestras de leche cruda y carne cocida.

37

6. RESULTADOS Y DISCUSION

6.1 Control de calidad de los medios de cultivo

Control de esterilidad: de cada lote disponible se eligió al azar un 2% de la

totalidad de las cajas servidas con el medio de cultivo y se llevaron a

incubación durante 48 horas a 35 ± 1° C. Posteriormente se observó el

aspecto y se comprobó la esterilidad, ya que no hubo crecimiento de

ningún microorganismo en las cajas de los respectivos medios de cultivo,

permitiendo utilizar satisfactoriamente las cajas de petri con los medios de

cultivo. Este control se realizó cada vez que se preparaban medios para

las diferentes pruebas llevadas a cabo.

Control de pH a 25° C: el control del pH de los medios de cultivo

preparados después de la esterilización es esencial, esta única

comprobación podría ser suficiente, siempre y cuando el proceso de

esterilización esté bajo control (Lightfoot & Maier, 2002). Para esto, se

tomó una muestra del medio de cultivo estéril y con un pH-metro se

realizó una medición del medio a una temperatura de 25° C. El valor de

pH obtenido para el medio de cultivo agar Bacillus cereus de la casa

comercial Scharlau con lote 14800, fue de 6.82 (anexo 2), el cual

corresponde con el indicado en la ficha técnica del medio, donde se da un

intervalo de aceptación de ± 0.2. El valor de pH obtenido para el medio de

cultivo agar Baird Parker de la casa comercial Oxoid con lote 464615, fue

de 6.62 (anexo 2), que corresponde con el indicado en la ficha técnica del

medio donde se da un intervalo de aceptación de ± 0.2 (Allaert & Escolá,

2002).

Control macroscópico: se realizó un examen visual para poder descartar

cualquier error importante en la preparación de los medios. Se observó

que su consistencia (sólida), su respectivo color y aspecto corresponden

con los que indica la ficha técnica de estos (Allaert & Escolá, 2002). La

38

caducidad y las condiciones de conservación forman parte de la

documentación que acompañe a la preparación de los medios de cultivo

(Lightfoot & Maier, 2002). Para esto, se revisó la fecha de caducidad de

los medios de cultivo utilizados, y después de la preparación, cada caja

con el medio se etiquetó adecuadamente y estas se almacenaron a 4° C

por periodos no mayores a 8 días.

Método ecométrico: el control de la calidad rutinario de medios de cultivo

ya preparados suele ser considerado como superfluo dado que los lotes

de medios de cultivo deshidratados se controlan en fábrica y el proceso

de preparación también suele estar perfectamente controlado. Sin

embargo, dada la variabilidad debida a pequeños errores en la

preparación de medios de cultivo, es recomendable realizar un control

antes de la utilización de un lote de medio de cultivo, el cual puede

efectuarse mediante el método ecométrico (Lightfoot & Maier, 2002).

Se considera valida cualquier estría que crezca más del 25% de la línea.

Cada estría tiene un valor de 0.2 y la estría central un valor de 1, es decir,

que el crecimiento máximo que se puede presentar es de 5 ((0.2 * 20) + 1

= 5), por lo que se debe multiplicar el número de estrías que presentaron

crecimiento por 0.2 y sumar 1 en caso de que se haya presentado

crecimiento en la estría central, obteniendo así, el índice de crecimiento

absoluto (ICA) (Tortora, 1993).

El ICA va a determinar el grado de selectividad y productividad del medio

según el caso. El ICA obtenido del medio prueba (caja 1) va a determinar

la productividad del medio: ICA = 4.5 – 5, medios altamente productivos,

ICA = 2.5 – 4.5, medios medianamente productivos, ICA < 2.5, medios

poco productivos, ICA = 0, medios no productivos (Tortora, 1993).

El ICA resultante del interferente (caja 2) evalúa la selectividad, por lo que

a mayor selectividad, menor será el ICA: ICA = 0, medios altamente

39

selectivos, ICA = 0 – 2.5, medios medianamente selectivos, ICA > 2.5,

medios no selectivos (Tortora, 1993).

Se debe llevar a cabo un control en un medio nutritivo o enriquecido para

determinar que el microorganismo de estudio no tiene ningún problema

para crecer. Por otra parte el ICA obtenido en la caja 3 o de control debe

ser muy similar al ICA de la caja 1, lo cual quiere decir que el

microorganismo de prueba, no presenta ningún problema de crecimiento y

la cepa resulta viable para el estudio, dándole así validez a la prueba

(Tortora, 1993).

El índice de crecimiento relativo (ICR) determina la capacidad que tiene el

medio de prueba de recuperar la flora de una muestra determinada, frente

a un medio nutritivo como lo es el del control. El ICR se obtiene de la

división del ICA prueba / ICA control y al ser crecimientos similares el

valor debe estar por encima de 0.95 a 1, es decir, la prueba solo tiene

validez si existe por lo menos un crecimiento del 95 – 100% (Tortora,

1993).

Este control se efectuó para comprobar la eficacia del medio de cultivo

luego de someter las cajas a su respectivo periodo de incubación y se

observó el crecimiento en cada una de las líneas sembradas. Al inicio del

estudio se realizó la evaluación de productividad y selectividad para el

medio de cultivo agar Bacillus cereus Scharlau lote batch 14800 y se

obtuvieron los siguientes resultados (tabla 1):

Tabla 1. Método ecométrico del medio agar Bacillus cereus al inicio del estudio. MEDIO DE CULTIVO

Prueba ecométrico Medio de cultivo

Microorganismo

ICA

ICR Prueba Agar Bacillus cereus Bacillus cereus

ATCC 11778 3.8

Interferente Agar Bacillus cereus Escherichia coli ATCC 8739

0

Control Agar Tripticasa soya Bacillus cereus

ATCC 11778 4

0.95

Fuente: Autor

40

Como prueba complementaria, al finalizar el estudio se realizó una

evaluación de productividad y selectividad del mismo medio de cultivo, y

se obtuvieron los siguientes resultados (tabla 2):

Tabla 2. Método ecométrico del medio agar Bacillus cereus al finalizar el estudio.

MEDIO DE CULTIVO Prueba ecométrico Medio de cultivo

Microorganismo

ICA

ICR

Prueba Agar Bacillus cereus Bacillus cereus ATCC 11778

5

Interferente Agar Bacillus cereus Escherichia coli

ATCC 8739 0

Control Agar Tripticasa soya Bacillus cereus ATCC 11778

5

1.0

Fuente: Autor

Figura 1. Método ecométrico agar Bacillus cereus Scharlau (Prueba). Fuente: Autor

Figura 2. Método ecométrico agar Bacillus cereus Scharlau

(Interferente). Fuente: Fuente: Autor

Figura 3. Método ecométrico agar TSA (control). Fuente: Autor

41

También se realizó la evaluación de productividad y selectividad mediante

método ecométrico para el medio de cultivo agar Baird Parker Oxoid lote

464615 y se obtuvieron los siguientes resultados al iniciar el estudio (tabla

3):

Tabla 3. Método ecométrico del medio agar Baird Parker al inicio del estudio.


Microorganismo

ICA

ICR

Prueba Agar Baird Parker Staphylococcus aureus ATCC 6538

4.6

Interferente Agar Baird Parker Escherichia coli ATCC 8739

0

Control Agar Tripticasa soya Staphylococcus aureus ATCC 6538

4.6

1.0

Fuente: Autor Igualmente, se realizó una evaluación de productividad y selectividad del

mismo medio de cultivo al finalizar el estudio, y se obtuvieron los

siguientes resultados (tabla 4):

Tabla 4. Método ecométrico del medio agar Baird Parker al finalizar el estudio.


Microorganismo

ICA

ICR

Prueba Agar Baird Parker Staphylococcus aureus ATCC 6538

5

Interferente Agar Baird Parker Escherichia coli ATCC 8739

0

Control Agar Tripticasa soya Staphylococcus aureus ATCC 6538

5

1.0

Fuente: Autor Figura 4. Método ecométrico agar Baird Parker Oxoid (Prueba). Fuente: Autor

42

Figura 5. Método ecométrico Agar Baird Parker Oxoid

(Interferente). Fuente: Autor

Figura 6. Método ecométrico agar TSA (control). Fuente: Autor

El medio de cultivo agar Bacillus cereus para detectar Bacillus cereus en

muestras de alimentos de Scharlau, demostró ser al inicio del estudio un

medio medianamente productivo ya que presentó un ICA de 3.8. Sin

embargo, es un medio altamente selectivo ya que presentó un ICA de

interferencia de 0, lo que quiere decir que se presentó inhibición del

microorganismo interferente. Por otra parte, el valor de ICR fue de 0.95, lo

cual refleja la capacidad que tiene el medio de recuperar la flora y la

viabilidad del microorganismo (Tortora, 1993).

Por otro lado, en el ensayo realizado al finalizar el estudio se demostró

que este medio de cultivo es altamente productivo (ICA = 5) y altamente

selectivo (ICA = 0), además se obtuvo un ICR = 1, lo cual confirma lo

descrito anteriormente sobre la capacidad de este medio para recuperar

el microorganismo evaluado.

43

Según los resultados obtenidos en el método ecométrico realizado al

iniciar el estudio, se encontró que el agar Baird Parker de Oxoid es un

medio de cultivo altamente productivo, pues presentó un ICA de 4.6. Así

mismo, este medio presentó un ICA de interferencia de 0, demostrando

que es altamente selectivo, ya que se logró la inhibición del

microorganismo aquí evaluado. De la misma manera, se obtuvo un ICR

de 1, valor que demuestra la capacidad que tiene este medio de recuperar

los microorganismos, además de demostrar que el microorganismo de

prueba no presenta ningún problema de crecimiento y la cepa resulta

viable para el estudio, dándole así validez a la prueba (Tortora, 1993).

Por otro lado, con el método ecométrico realizado al finalizar el estudio se

demostró que este medio de cultivo es altamente productivo (ICA = 5) y

altamente selectivo (ICA = 0), además se obtuvo un ICR = 1, lo cual

confirma lo descrito anteriormente sobre la capacidad de este medio para

recuperar el microorganismo evaluado.

6.2 Verificación del control de equipos

Para el presente estudio es de relevancia considerar que los equipos de

medida y ensayo utilizados a diario en el laboratorio, y que tengan un

efecto sobre la exactitud o validez de los ensayos, se deberán encontrar

calibrados, además de poseer un adecuado mantenimiento. Es importante

que el laboratorio emplee métodos y procedimientos apropiados para

todos los ensayos y/o calibraciones, ya que el laboratorio debe equiparse

con todos los elementos que garanticen un margen de trazabilidad en las

medidas que se realizan durante su utilización dentro de la ejecución del

análisis o método microbiológico y así avalar los resultados de las

pruebas (Romero, 2005), (Soler, 2006).

El laboratorio debe en este caso, tener presente programas de

mantenimiento y calibración; calibrar y revisar el equipo antes de ponerse

44

en servicio con el fin de establecer si reúne los requisitos de las

especificaciones del laboratorio y si cumple las especificaciones de

normatividad pertinentes; plantear un programa de revisión periódica de

dichos equipos de conformidad con las disposiciones del laboratorio,

acorde con la normatividad vigente (Soler, 2006).

Todos los procedimientos para la calibración y uso de los equipos deben

estar en orden, asimismo se especificará cada verificación que se deba

efectuar antes de su empleo en el laboratorio. Igualmente, todos los

equipos deben ser registrados con la indicación de la frecuencia de

mantenimiento así como de las operaciones que comporta este y el

responsable de su realización (Lightfoot & Maier, 2002).

Al iniciar el proceso de validación se revisó el historial de los equipos

involucrados en el estudio incluyendo certificados de calibración,

mantenimiento y registros de su uso en los últimos meses, en los que se

verificó que presentaran características apropiadas para su utilización

como las descritas anteriormente (anexo 3).

6.3 Control de ambientes

Para llevar a cabo el control de ambientes, se empleó la técnica de

sedimentación en placa, colocando cajas abiertas con medio de cultivo

para microorganismos mesófilos (TSA) y para hongos y levaduras

(Sabouraud) en diferentes puntos del cuarto de siembra durante un

periodo de 15 minutos. Estas cajas se llevaron a incubar a una

temperatura de 35 ± 2° C durante 48 horas para mesófilos y a 22 ± 2° C

durante 5 días para hongos y levaduras. Este control se realizó durante

todas las pruebas realizadas, encontrando los siguientes recuentos de

mesófilos y de hongos y levaduras (tabla 5):

45

Tabla 5. Recuento del control de ambientes.

Prueba realizada

Recuento de Mesófilos en UFC / 15 min. de exposición

Recuento de Hongos y levaduras

en UFC / 15 min. de exposición Control de calidad de

medios de cultivo 0 0

Prueba de repetibilidad 3 0

Prueba de reproducibilidad (diferentes horas)

8:00 a.m.

0

0

12:00 m

1

0

4:00 p.m.

4

1

Prueba de reproducibilidad (diferentes analistas)

1

4

Fuente: Autor

Los resultados obtenidos para el control de ambientes del área de

siembra en donde se llevaron a cabo las diferentes pruebas indican la

baja carga de microorganismos presentes en el ambiente, lo que permite

deducir que se realizó una correcta limpieza de esta área, que no permitió

la proliferación de microorganismos en el ambiente que pudieran aportar

contaminación alguna a las diferentes pruebas realizadas.

6.4 Validación secundaria del método de recuento en placa en

superficie

Para llevar a cabo el proceso de validación de las técnicas de recuento en

placa en superficie de Bacillus cereus y Staphylococcus aureus se

evaluaron los parámetros de repetibilidad y reproducibilidad intra-

laboratorio de estas técnicas que se realizan a diario en el laboratorio

para el análisis de alimentos que puedan contener estos microorganismos

indicadores, que determinen la posibilidad de la existencia de

microorganismos causantes de intoxicaciones o de otros riesgos

asociados con el crecimiento microbiano (Hayes, 1993).

Para la evaluación de repetibilidad, se realizaron los respectivos métodos

bajo igualdad de condiciones, en cuatro diferentes tipos de alimentos;

teniendo en cuenta que la repetibilidad es el parámetro que evalúa el

46

grado de concordancia entre los resultados de mediciones sucesivas del

mismo elemento, realizadas bajo las mismas condiciones (GTC 84, 2003).

Para la evaluación de reproducibilidad intra-laboratorio, se realizaron los

respectivos métodos variando las condiciones de realización del método

(hora de realización y analistas), en cuatro diferentes tipos de alimentos,

ya que la reproducibilidad se define como el grado de concordancia entre

los resultados de las mediciones en el mismo elemento bajo condiciones

de medición alteradas (GTC 84, 2003), garantizando que el laboratorio es

capaz de producir resultados constantes a lo largo del tiempo (Lightfoot &

Maier, 2002).

Para reconocer el grado de concordancia de los métodos validados, se

llevó a cabo el estudio mediante estadística deductiva en la que se evaluó

tanto la repetibilidad como la reproducibilidad de las técnicas, y esto se

realizó mediante el análisis de coeficientes de variación y mediante el

análisis de varianza de dos factores con varias muestras por grupo.

La metodología para realizar los análisis de alimentos en el laboratorio se

llevó a cabo de acuerdo al protocolo descrito por Holguín et al., (1998).

Se tomaron muestras de alta influencia en el laboratorio y las más

susceptibles a contaminación por S. aureus (leche cruda) y por B. cereus

(albahaca). Además, se tomaron dos muestras que se sabe que

presentan bajos recuentos de S. aureus y B. cereus, tales como carne

cocida y arroz cocido, respectivamente, con las cuales se realizó el

estudio de validación secundaria del método de recuento en placa en

superficie de Staphylococcus aureus y Bacillus cereus.

Por otro lado, para realizar cada uno de los recuentos se usó lo estipulado

en la NTC 4092, Microbiología de alimentos y de alimentos para animales.

Reglas generales para el análisis microbiológico (NTC 4092, 1997).

N = ∑C

V [(n1+0.1*n2)*d]

47

Donde:

∑C: es la suma de las colonias contadas en todas las cajas de petri que

contienen dos diluciones sucesivas.

V: es el volumen del inóculo aplicado a cada caja, en mililitros.

n1: es el número de cajas retenidas en la segunda dilución.

n2: es el número de cajas retenidas en la segunda dilución.

d: es el factor de dilución correspondiente a la primera dilución retenida.

Una vez ha sido obtenido el recuento, se hace su equivalencia

redondeando el resultado calculado a dos cifras significativas. Para esto,

si la última cifra es inferior a 5 la cifra anterior no se modifica, si la última

cifra es 5 o mayor, la cifra anterior se incrementa en una unidad, y se

muestra el resultado en forma exponencial.

6.4.1 Ensayos de validación para Bacillus cereus

6.4.1.1 Ensayo de repetibilidad de Bacillus cereus

• Ensayo de repetibilidad de Bacillus cereus en una muestra que

presenta un alto recuento (albahaca).

En el ensayo de repetibilidad de Bacillus cereus en una muestra de

albahaca, se obtuvieron los siguientes recuentos (tabla 6):

48

Tabla 6. Resultados de los recuentos obtenidos para siembra en placa en superficie de Bacillus cereus en una muestra de albahaca.

Fuente: Autor

La dispersión de un conjunto de observaciones se refiere a la variedad

que muestran estas. Una medida de dispersión conlleva información

respecto a la cantidad total de variabilidad presente en el conjunto de

datos. Si todos los valores son iguales, no hay dispersión, pero si no

todos son iguales, entonces existe dispersión en los datos. La magnitud

de la dispersión es pequeña cuando los valores, aunque diferentes, son

cercanos entre sí (Daniel, 1996).

Según los datos presentados en la tabla 6, se presenta una dispersión

aunque es de pequeña magnitud, ya que los resultados que arrojaron las

repeticiones realizadas se encuentran dentro de un rango similar que

oscila entre las 10 x 105 y 14 x 105 UFC / g-ml de Bacillus cereus, lo que

permite ver la homogeneidad de los datos obtenidos entre repeticiones de

una misma prueba (figura 7).

Figura 7. Gráfica de dispersión de la prueba de repetibilidad del recuento en placa en superficie de Bacillus cereus en albahaca. Fuente: Autor

Repetición 1/10000 1/10000 1/10000 Promedio 1/100000 1/100000 1/100000 Promedio Recuento Según NTC 4092

1 10 9 13 11 2 1 2 2 1121212 11 x 105

2 9 9 11 10 1 1 2 1 1000000 10 x 105

3 13 14 12 13 2 3 1 2 1363636 14 x 105

Dispersión prueba repetibilidad Bacillus cereus

0

200000

400000

600000

800000

1000000

1200000

1400000

1600000

1800000

0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5

Numero de repeticiones

UFC / g-m

l

49

En el ensayo de repetibilidad de Bacillus cereus se obtuvo un

considerable crecimiento de este microorganismo aislado a partir de una

muestra de albahaca sobre el agar Bacillus cereus, en donde se evidenció

la morfología típica de las colonias (figura 8), que luego fue confirmada

por medio de una coloración de Gram, en la cual se obtuvieron bacilos

Gram positivos, comprobando así la presencia de este microorganismo en

la muestra de albahaca analizada. Asimismo, se realizó una confirmación

bioquímica de estas colonias por medio del kit de identificación rápida de

microorganismos Gram positivos BBL Crystal, con el cual se confirmó, con

un 99% de confianza (anexo 4), de que se trataba de Bacillus cereus

(figura 9).

Figura 8. Crecimiento de Bacillus cereus en la prueba de repetibilidad. Fuente: Autor

Figura 9. Confirmación bioquímica de

Bacillus cereus con BBL Crystal. Fuente: Autor

50

Por otra parte, se realizó un análisis de varianzas, desviación estándar y

coeficiente de variación para este ensayo, y se obtuvieron los resultados

presentados en la tabla 7; además, se realizó un análisis de varianza en

donde se establecieron los limites para un intervalo de confianza de 95%

(tabla 8).

Tabla 7. Análisis de varianzas, desviación estándar y coeficiente de variación prueba repetibilidad recuento en placa en superficie de Bacillus cereus en albahaca.

Fuente: Autor

El coeficiente de variación, muestra el grado de concordancia de los datos

presentados para la prueba de repetibilidad realizada a la técnica de

recuento en placa en superficie de Bacillus cereus en una muestra de

albahaca. Dicho coeficiente de variación (16%) muestra que hay un alto

grado de concordancia entre los resultados obtenidos en las tres

repeticiones, ya que se presenta en un porcentaje inferior al 20%,

demostrando así la varianza relativa presentada entre las dos mediciones.

Tabla 8. Análisis de varianza. Prueba de repetibilidad recuento en placa en superficie de Bacillus cereus en muestra de albahaca.

Intervalo de confianza para

la media al 95% N

Media

Desviación estándar Limite inferior Limite superior

3 1161616 185154,5735 739791 1660209

Fuente: Autor

Se realizó el análisis de distribución para construir intervalos de confianza

y se obtuvieron los datos presentados en la tabla 9:

Repetición Promedio 1/10000

Promedio 1/100000

Recuento X V SD CV Según NTC

4092

1 11 3 1121212 11 x 105

2 10 3 1000000 10 x 105

3 13 5 1363636

12 x 105

3,86111111

185154,574

15,9393937

14 x 105

51

Tabla 9. Prueba t para dos muestras. Prueba de repetibilidad recuento en placa en superficie de Bacillus cereus en muestra de albahaca.

Variable 1 Variable 2

Media 11,11111111 1,666666667

Varianza 3,861111111 0,5

Observaciones 9 9

Diferencia hipotética de las medias 0

Grados de libertad 10

Estadístico t 13,56747704

P(T<=t) una cola 4,56821E-08

Valor crítico de t (una cola) 1,812461102

P(T<=t) dos colas 9,13642E-08

Valor crítico de t (dos colas) 2,228138842

Fuente: Autor

En la tabla anterior se presenta el valor de t (coeficiente de confiabilidad),

que es 4,56821 x 10-8, y se puede deducir que el análisis de la hipótesis

alternativa utilizando la prueba t confirma que el promedio de recuentos

de la dilución 10-4 es mayor que el promedio de los recuentos de la

dilución 10-5 (P<0,005) (P = 4. 56821 x 10-8), aceptando así la hipótesis

alternativa, para concluir que se presenta repetibilidad para la técnica de

recuento en placa en superficie de Bacillus cereus.

• Ensayo de repetibilidad de Bacillus cereus en una muestra que

presenta un bajo recuento (arroz cocido).

En el ensayo de repetibilidad de Bacillus cereus en una muestra de arroz

cocido, se obtuvieron los siguientes resultados (tabla 10):

Tabla 10. Resultados de los recuentos obtenidos para siembra en placa en

superficie de Bacillus cereus en una muestra de arroz cocido.

Fuente: Autor

Repetición 1/100 1/100 1/100 Promedio 1/1000 1/1000 1/1000 Promedio Recuento Según

NTC 4092

1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 < 100

2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 < 100

3 0 0 0 0 0 0 0 0 0 < 100

52

Para llevar a cabo las pruebas de evaluación de los parámetros de

repetiblidad y reproducibilidad de la técnica de recuento en placa en

superficie de B. cereus se realizó el ensayo con una muestra de arroz

cocido, en donde no se encontró crecimiento alguno de B. cereus, lo cual

confirma lo que se esperaba para la muestra de arroz cocido analizada,

ya que este microorganismo no debe encontrarse en este alimento, pues

la presencia de B. cereus indica puntos críticos de contaminación que

pueden ir desde las materias primas que fueron utilizadas, errores de

manipulación durante el proceso de producción, hasta errores en el

proceso de cocción, un tratamiento térmico insuficiente o un

almacenamiento prolongado sin refrigeración, factores que pueden causar

intoxicaciones y otros riesgos asociados con el crecimiento microbiano

(Hayes, 1993).

Se presentaron datos homogéneos para las pruebas realizadas y la

evaluación de los parámetros establecidos, en la que la constante fue la

obtención en cada prueba de 0 UFC en la muestra (figura 10) y un

resultado de <100 UFC / g de Bacillus cereus a causa de las diluciones

trabajadas.

Figura 10. Prueba repetibilidad en arroz cocido. Fuente: Autor

53

6.4.1.2 Ensayos de reproducibilidad de Bacillus cereus

• Ensayo de reproducibilidad de Bacillus cereus en una muestra que

presenta un alto recuento (albahaca) en diferentes tiempos (ensayo de

reproducibilidad 1).

En el ensayo de reproducibilidad de Bacillus cereus en una muestra de

albahaca, se obtuvieron los siguientes recuentos a las diferentes horas

analizadas (tabla 11):

Tabla 11. Resultados recuentos en placa en superficie de Bacillus cereus en una muestra de albahaca en diferentes horas (ensayo de reproducibilidad 1).

Fuente: Autor

Según los valores presentados en la tabla 11, se presenta una dispersión

aunque es de pequeña magnitud, ya que los resultados que arrojaron las

repeticiones realizadas a las diferentes horas se encuentran dentro de un

rango similar que oscila entre las 20 x 105 y 25 x 105 UFC / g de Bacillus

cereus lo que permite ver la homogeneidad de los datos obtenidos (figura

11).

Tiempo 1/10000 1/10000 1/10000 Promedio 1/100000 1/100000 1/100000 Promedio Recuento Según

NTC 4092

Repetición 1 8:00 a.m.

24 22 25 24 2 2 4 3 2393939 24 x 105


26 22 24 24 3 2 2 2 2393939 24 x 105


20 22 21 21 2 1 1 1 2030303 20 x 105

Repetición 1

12:00 p.m. 22 27 25 25 2 4 2 3 2484848 25 x 105

Repetición 2 12:00 p.m.

25 25 23 24 3 2 2 2 2424242 24 x 105


25 21 23 23 3 2 1 2 2272727 23 x 105

Repetición 1

4:00 p.m. 23 21 24 23 2 2 3 2 2272727 23 x 105


22 20 20 21 2 1 1 1 2000000 20 x 105


20 25 23 23 1 3 2 2 2242424 22 x 105

54

Figura 11. Gráfica de dispersión prueba de reproducibilidad de Bacillus cereus a las diferentes horas analizadas. Fuente: Autor

En el ensayo de reproducibilidad 1 se obtuvo un notable crecimiento de

Bacillus cereus, el cual fue aislado a partir de una muestra de albahaca y

se evidenció la morfología típica de las colonias de este microorganismo

(figura 12), que posteriormente se confirmó mediante coloración de Gram,

en donde se obtuvieron bacilos Gram positivos, confirmando así la

morfología del microorganismo aislado.

Figura 12. Bacillus cereus en muestra de albahaca. Prueba reproducibilidad 1. Fuente: Autor

Igualmente, se realizó un análisis de varianzas, desviación estándar y

coeficiente de variación para este ensayo, en donde se obtuvieron los

resultados presentados en la tabla 12; además, se realizó el análisis de la

Dispersión prueba reproducibilidad diferentes horas Bacillus cereus

0

500000

1000000

1500000

2000000

2500000

3000000

0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5

Repeticiones

Recuentos UFC / g-m

l

08:00 a.m. 12:00 m 04:00 p.m.

55

prueba t para obtener la distribución, consiguiendo los datos presentados

en la tabla 13.

Tabla 12. Análisis de varianzas, desviaciones estándar y coeficiente de variación de

la prueba de reproducibilidad para el recuento en placa en superficie de Bacillus cereus en albahaca evaluado en diferentes horas (ensayo de reproducibilidad 1).

Tiempo Promedio 1/10000

Promedio 1/100000

Recuento X V SD CV Según

NTC 4092


24 3 2393939 24 x 105


24 2 2393939 24 x 105


21 1 2030303

23 x 10

5

3,86111111

209945,342

9,23759618

20 x 105

Repetición 1

12:00 p.m. 25 3 2484848 25 x 105


24 2 2424242 24 x 105


23 2 2272727

24 x 105 3,5 109259,02 4,56398514

23 x 105

Repetición 1

4:00 p.m. 23 2 2272727 23 x 105


21 1 2000000 20 x 105


23 2 2242424

22 x 105 3,5 149481,149 6,88308603

22 x 105

Fuente: Autor


presentados para la prueba de reproducibilidad a diferentes horas

realizada a la técnica de recuento en placa en superficie de Bacillus

cereus en una muestra de albahaca. Se obtuvieron coeficientes de

variación de 9.23% a la primera hora analizada (8:00 a.m.), 4.56% a la

segunda hora analizada (12:00 m) y 6.88% a la tercera hora analizada

(4:00 p.m.). Estos coeficientes de variación demuestran que hay un alto

grado de concordancia entre los resultados obtenidos en las diferentes

horas analizadas, ya que presentan un porcentaje inferior al 20%.

Tabla 13. Prueba t para dos muestras. Prueba de reproducibilidad 1 para Bacillus cereus en muestra de albahaca.

Repeticiones Variable 1

Observaciones 9



P(T<=t) una cola 5,43E-12

8:00 a.m.


56

Variable 1

Observaciones 9



P(T<=t) una cola 1,94019E-12

12:00 m.


Variable 1

Observaciones 9



P(T<=t) una cola 3,64281E-12

4:00 p.m.


Fuente: Autor

En la tabla anterior se presenta el valor de t en el ensayo de

reproducibilidad a las 8:00 a.m. (5,43 x 10-12), a las 12 m. (1,94019 x 10-12)

y a las 4:00 p.m. (3,64281 x 10-12), en donde se puede deducir que el

análisis de la hipótesis alternativa utilizando la prueba t confirma que el

promedio de recuentos de la dilución 10-4 es mayor que el promedio de

los recuentos de la dilución 10-5 (P<0,005) aceptando así la hipótesis

alternativa en los tres casos, para concluir que existe una reproducibilidad

para la técnica de recuento en placa en superficie de Bacillus cereus.

Adicional a esto, se realizó un análisis de varianza de dos factores con

varias muestras por grupo y se obtuvieron los resultados presentados en

la tabla 14.

Tabla 14. Análisis de varianza de dos factores con varias muestras por grupo.

RESUMEN dil 10-4 dil 10-5 Total

08:00 a.m.

Cuenta 3 3 6

Suma 71 8 79

Promedio 23,6666667 2,66666667 13,1666667

Varianza 2,33333333 1,33333333 133,766667

12:00 m.

Cuenta 3 3 6

Suma 74 8 82

Promedio 24,6666667 2,66666667 13,6666667

Varianza 6,33333333 1,33333333 148,266667

04:00 p.m.

Cuenta 3 3 6

Suma 68 7 75

Promedio 22,6666667 2,33333333 12,5

Varianza 2,33333333 0,33333333 125,1

57

Total

Cuenta 9 9

Suma 213 23

Promedio 23,6666667 2,55555556

Varianza 3,5 0,77777778

Fuente: Autor

• Ensayo de reproducibilidad de Bacillus cereus en una muestra que

presenta un bajo recuento (arroz cocido) en diferentes tiempos

(ensayo de reproducibilidad 1).


arroz cocido, se obtuvieron los siguientes recuentos a las diferentes horas

analizadas (tabla 15):

Tabla 15. Resultados de los recuentos obtenidos para siembra en placa en superficie de Bacillus cereus en una muestra de arroz cocido evaluado en diferentes

horas (ensayo de reproducibilidad 1).

Fuente: Autor


NTC 4092

Repetición 1

8:00 a.m. 0 0 0 0 0 0 0 0 0 < 100

Repetición 2

8:00 a.m. 0 0 0 0 0 0 0 0 0 < 100

Repetición 3

8:00 a.m. 0 0 0 0 0 0 0 0 0 < 100

Repetición 1

12:00 p.m. 0 0 0 0 0 0 0 0 0 < 100

Repetición 2

12:00 p.m. 0 0 0 0 0 0 0 0 0 < 100

Repetición 3

12:00 p.m. 0 0 0 0 0 0 0 0 0 < 100

Repetición 1

4:00 p.m. 0 0 0 0 0 0 0 0 0 < 100

Repetición 2

4:00 p.m. 0 0 0 0 0 0 0 0 0 < 100

Repetición 3

4:00 p.m. 0 0 0 0 0 0 0 0 0 < 100

58

En este ensayo tampoco se encontró crecimiento de B. cereus, lo cual


pues, como se mencionó anteriormente, este microorganismo no debe

encontrarse en este alimento porque puede causar graves intoxicaciones.

Se presentaron datos semejantes para las pruebas realizadas y la

evaluación de los parámetros establecidos, en donde se obtuvo en cada

prueba 0 UFC en la muestra (figura 13) y un resultado de <100 UFC / g de

Bacillus cereus.

Figura 13. Prueba reproducibilidad 1 en arroz cocido. Fuente: Autor

• Ensayo de reproducibilidad de Bacillus cereus en una muestra de

albahaca, variando los analistas (ensayo de reproducibilidad 2).


albahaca, se obtuvieron los siguientes recuentos para los diferentes

analistas (tabla 16):

59

Tabla 16. Resultados recuentos en placa en superficie de Bacillus cereus en una muestra de albahaca, variando los analistas (ensayo de reproducibilidad 2).

Fuente: Autor

De acuerdo con los valores presentados en la tabla 16, se presenta una

dispersión aunque es de pequeña magnitud, ya que los resultados que

arrojaron las repeticiones realizadas a las diferentes horas se encuentran

dentro de un rango similar que oscila entre 12 x 105 y 16 x 105 UFC / g de

Bacillus cereus, lo que permite ver la homogeneidad de los datos

obtenidos (figura 14).

Figura 14. Gráfica de dispersión prueba de reproducibilidad de Bacillus cereus realizado por diferentes analistas. Fuente: Autor

1/10000 1/10000 1/10000 Promedio 1/100000 1/100000 1/100000 Promedio Recuento Según 4092

Analista 1 Repetición 1

18 16 15 16 2 1 1 1 1606060 16 x 105


15 17 15 16 1 2 1 1 1545454 15 x 105


10 14 16 13 1 1 2 1 1333333 13 x 105

Analista 2

Repetición 1 12 14 9 12 1 2 2 2 1212121 12 x 105


11 10 14 12 1 1 2 1 1181818 12 x 105


15 16 10 14 1 2 1 1 1363636 14 x 105

Analista 3

Repetición 1 13 14 10 12 1 2 1 1 1242424 12 x 105


12 13 15 13 1 3 2 2 1393939 14 x 105


18 15 12 15 2 2 1 2 1515151 15 x 105

Dispersión prueba de reproducibilidad diferentes analistas Bacillus cereus

0

200000

400000

600000

800000

1000000

1200000

1400000

1600000

1800000

0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5Repeticiones

Recuentos UFC /g - ml

Analista 1 Analista 2 Analista 3

60

En el ensayo de reproducibilidad 2 se observó el crecimiento de Bacillus

cereus, aislado a partir de una muestra de albahaca, en donde se logró

evidenciar la morfología típica de sus colonias (figura 15), las cuales

fueron sometidas a coloración de Gram, y se confirmó la presencia de

este microorganismo, pues se observaron bacilos Gram positivos.

Figura 15. Bacillus cereus en muestra de albahaca. Prueba reproducibilidad 2. Fuente: Autor

También, se realizó un análisis de varianzas, desviación estándar y


resultados presentados en la tabla 17; además, se realizó el análisis de

prueba t para obtener la distribución, consiguiendo los datos presentados

tabla 18:


la prueba de reproducibilidad para el recuento en placa en superficie de Bacillus cereus en albahaca evaluado por diferentes analistas (ensayo de reproducibilidad 2).

Promedio 1/10000

Promedio 1/100000


NTC 4092 Analista 1

Repetición 1 16 1 1606060 16 x 105


16 1 1545454 15 x 105


13 1 1333333

15 x 10

5

5,11111111 143206,391 9,57934959

13 x 105

Analista 2

Repetición 1 12 2 1212121 12 x 105


12 1 1181818 12 x 105


14 1 1363636

12 x 10

5

6,25

97410,5163

7,7771315

14 x 105

61


12 1 1242424 12 x 105


13 2 1393939 14 x 105


15 2 1515151

14 x 10

5

5,27777778

136643,795

9,8742624

15 x 105

Fuente: Autor


presentados para la prueba de reproducibilidad con diferentes analistas

realizada a la técnica de recuento en placa en superficie de Bacillus

cereus en una muestra de albahaca. Se obtuvieron coeficientes de

variación de 9.57% (analista 1), 7.77% (analista 2) y 9.87% (analista 3).

Estos coeficientes de variación demuestran que hay un alto grado de

concordancia entre los resultados obtenidos entre los diferentes analistas,

ya que presentan un porcentaje inferior al 20%.

Tabla 18. Prueba t para dos muestras. Prueba de reproducibilidad 2

para Bacillus cereus en muestra de albahaca.

Analistas Variable 1

Observaciones 9



P(T<=t) una cola 1,23394E-08

1


Variable 1

Observaciones 9



P(T<=t) una cola 2,23918E-07

2


Variable 1

Observaciones 9



P(T<=t) una cola 1,94005E-08

3


Fuente: Autor


reproducibilidad variando los analistas. Analista 1 (1,23394 x 10-8),

analista 2 (2,23918 x 10-7) y analista 3 (1.94005 x 10-8), en donde se

puede deducir que el análisis de la hipótesis alternativa utilizando la

prueba t confirma que el promedio de recuentos de la dilución 10-4 es

62

mayor que el promedio de los recuentos de la dilución 10-5 (P<0,005),

aceptando así la hipótesis alternativa en los tres casos, para concluir que

existe una reproducibilidad intra-laboratorio para la técnica de recuento en

placa en superficie de Bacillus cereus.


varias muestras por grupo y se obtuvieron los resultados presentados en

la tabla 19.



Analista 1

Cuenta 3 3 6

Suma 49 4 53

Promedio 16,33333333 1,333333333 8,833333333

Varianza 2,333333333 0,333333333 68,56666667

Analista 2

Cuenta 3 3 6

Suma 35 5 40

Promedio 11,66666667 1,666666667 6,666666667

Varianza 6,333333333 0,333333333 32,66666667

Analista 3

Cuenta 3 3 6

Suma 37 4 41

Promedio 12,33333333 1,333333333 6,833333333

Varianza 4,333333333 0,333333333 38,16666667

Total

Cuenta 9 9

Suma 121 13

Promedio 13,44444444 1,444444444

Varianza 8,027777778 0,277777778

Fuente: Autor

• Ensayo de reproducibilidad de Bacillus cereus en una muestra de

arroz cocido, variando los analistas (ensayo de reproducibilidad 2).


arroz cocido, al realizarse por diferentes analistas, se obtuvieron los

siguientes resultados (tabla 20):

63

Tabla 20. Resultados de los recuentos obtenidos para siembra en placa en superficie de Bacillus cereus en una muestra de arroz cocido evaluado por diferentes

analistas (ensayo de reproducibilidad 2).

Fuente: Autor

En esta prueba no se encontró crecimiento alguno de B. cereus, lo cual


pues, como se ha mencionado, este microorganismo no debe poder

aislarse de este alimento ya que puede causar graves intoxicaciones.

Se presentaron los mismos valores en las pruebas realizadas y la



Bacillus cereus.

Figura 16. Prueba reproducibilidad 2 en arroz cocido. Fuente: Autor

1/100 1/100 1/100 Promedio 1/1000 1/1000 1/1000 Promedio Recuento Según 4092


0 0 0 0 0 0 0 0 0 < 100


0 0 0 0 0 0 0 0 0 < 100


0 0 0 0 0 0 0 0 0 < 100

Analista 2

Repetición 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 < 100


0 0 0 0 0 0 0 0 0 < 100


0 0 0 0 0 0 0 0 0 < 100

Analista 3

Repetición 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 < 100


0 0 0 0 0 0 0 0 0 < 100


0 0 0 0 0 0 0 0 0 < 100

64

6.4.2 Ensayos de validación para Staphylococcus aureus coagulasa

positiva

6.4.2.1 Ensayo de repetibilidad de Staphylococcus aureus coagulasa

positiva

• Ensayo de repetibilidad de Staphylococcus aureus coagulasa positiva

en una muestra que presenta un alto recuento (leche cruda).

En el ensayo de repetibilidad de Staphylococcus aureus en una muestra de

leche cruda, se obtuvieron los siguientes recuentos (tabla 21):


superficie de Staphylococcus aureus en una muestra de leche cruda.

Fuente: Autor

La estadística se ocupa de la dispersión de la distribución, es decir, si los

datos aparecen sobre todo alrededor de la media o si están distribuidos

por todo el rango. Una medida de dispersión conlleva información

respecto a la cantidad total de variabilidad presente en el conjunto de

datos. Si todos los valores son iguales, no hay dispersión, pero si no

todos son iguales, entonces existe dispersión en los datos. La magnitud

de la dispersión es pequeña cuando los valores, aunque diferentes, son

cercanos entre si (Daniel, 1996).

Acorde con los resultados presentados en la tabla 21, se puede deducir

que existe dispersión en los datos ya que todos los valores no son

iguales, y tampoco son muy parecidos; por lo tanto, no existe una

homogeneidad de los datos obtenidos entre repeticiones de una misma

prueba (figura 17).


NTC 4092

1 5 6 8 6 1 0 0 0 60606 60 x 103

2 5 5 7 6 0 1 1 1 57575 57 x 103

3 4 5 6 5 1 0 2 1 54545 54 x 103

65

Figura 17. Gráfica de dispersión de la prueba de repetibilidad del recuento en placa en superficie de Staphylococcus aureus en leche cruda. Fuente: Autor

En el ensayo de repetibilidad de Staphylococcus aureus se obtuvo un

apropiado crecimiento de este microorganismo aislado a partir de una

muestra de leche cruda sobre el agar Baird Parker, en donde se evidenció

la morfología típica de las colonias (figura 18), que posteriormente fueron

confirmadas por medio de coloraciones de Gram, en las cuales se

encontraron cocos Gram positivos, demostrando así la presencia de este

microorganismo en la muestra de leche cruda estudiada.

Por otro lado, se realizó la confirmación de S. aureus coagulasa positiva

con el kit Slidex Staph plus, depositando una gota del reactivo anti - S.

aureus y una gota del reactivo control sobre la lámina, luego se tomó una

colonia sospechosa y se emulsificó en los reactivos. Pasados

aproximadamente 30 segundos se observó la aglutinación mediante

combinación de látex y células rojas sanguíneas, confirmando así la

reacción positiva de coagulasa. Esta confirmación se realizó a todas las

colonias presuntivas de S. aureus en los diferentes ensayos llevados a

cabo durante el estudio (figura 19). Igualmente, se realizó una

confirmación bioquímica de las colonias presuntivas de S. aureus por

medio del kit de identificación rápida de microorganismos Gram positivos

BBL Crystal, con el cual se confirmó, con un 99% de confianza (anexo 4),

de que se trataba de Staphylococcus aureus (figura 20).

Dispersión prueba repetibilidad Staphylococcus aureus

53000

54000

55000

56000

57000

58000

59000

60000

61000

62000

63000

0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5

Numero de repeticiones

UFC / g-m

l

66

Figura 18. Staphylococcus aureus en muestra de leche cruda en la prueba de repetibilidad. Fuente: Autor

Figura 19. Confirmación de Staphylococcus aureus coagulasa positiva con el kit Slidex Staph plus. Fuente: Autor

Figura 20. Confirmación bioquímica de Staphylococcus aureus con BBL Crystal. Fuente: Autor

Se realizó un análisis de varianzas, desviación estándar y coeficiente de

variación para este ensayo, en donde se obtuvieron los resultados

presentados en la tabla 22; además, se realizó un análisis de varianza en

donde se establecieron los limites para un intervalo de confianza de 95%

(tabla 23).

67

Tabla 22. Análisis de varianzas, desviaciones estándar y coeficiente de variación prueba repetibilidad recuento en placa en superficie de Staphylococcus aureus en

leche cruda.

Fuente: Autor


presentados para la prueba de repetibilidad realizada a la técnica de

recuento en placa en superficie de Staphylococcus aureus en una

muestra de leche cruda. Dicho coeficiente de variación (5.3%) muestra

que hay un alto grado de concordancia entre los resultados obtenidos en

las tres repeticiones, ya que se presenta en un porcentaje inferior al 20%.

Tabla 23. Análisis de varianza. Prueba de repetibilidad recuento en placa en

superficie de Staphylococcus aureus en una muestra de leche cruda.

Intervalo de confianza para la media al 95%

N Media Desviación estándar

Limite inferior Limite superior 3 57575 3030,50001 49468 64532

Fuente: Autor

Se realizó el análisis de distribución para construir intervalos de confianza

y se obtuvieron los datos presentados en la tabla 24:

Tabla 24. Prueba t para dos muestras. Prueba de repetibilidad para

Staphylococcus aureus en una muestra de leche cruda.

Variable 1 Variable 2

Media 5,666666667 0,666666667

Varianza 1,5 0,5

Observaciones 9 9

Diferencia hipotética de las medias 0



P(T<=t) una cola 4,52372E-08


P(T<=t) dos colas 9,04745E-08

Valor crítico de t (dos colas) 2,160368652

Fuente: Autor

Repetición Promedio 1/1000

Promedio 1/10000


NTC 4092

1 6 0 60606 60 x 103

2 6 1 57575 57 x 103

3 5 1 54545

57 x 103

1,5

3030,50001

5,26353881

54 x 103

68

En la anterior tabla se presenta el valor de t (4,52372 x 10-8), en la cual se



mayor que el promedio de los recuentos de la dilución 10-4 (P<0,005) (P =

4,52372 x 10-8), aceptando así la hipótesis alternativa, para concluir que

se presenta repetibilidad para la técnica de recuento en placa en

superficie de Staphylococcus aureus.

• Ensayo de repetibilidad de Staphylococcus aureus coagulasa positiva

en una muestra que presenta un bajo recuento (carne cocida).

En el ensayo de repetibilidad de Staphylococcus aureus en una muestra

de carne cocida, se obtuvieron los siguientes resultados (tabla 25):

Tabla 25. Resultados de los recuentos obtenidos para siembra en placa en superficie de Staphylococcus aureus en una muestra de carne cocida.

Fuente: Autor

Para llevar a cabo las pruebas de evaluación de los parámetros de

repetiblidad y reproducibilidad de la técnica de recuento en placa en

superficie de S. aureus coagulasa positiva se realizó el ensayo con una

muestra de carne cocida, en la cual no se encontró crecimiento alguno de

este microorganismo, lo cual confirma lo esperado para la muestra de

carne cocida analizada, ya que este microorganismo no debe encontrarse

en este alimento, pues su presencia se interpreta como indicativo de

contaminación a partir de la piel, la boca y las fosas nasales de los

manipuladores de alimentos, y cuya intoxicación alimentaria estafilocócica

es un síndrome caracterizado por nauseas, vómitos, diarrea, malestar y


NTC 4092

1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 < 100

2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 < 100

3 0 0 0 0 0 0 0 0 0 < 100

69

debilidad general, que comienzan a manifestarse de 1 a 6 horas después

de consumido el alimento (ICMSF, 2000).

Se presentaron datos homogéneos para las pruebas realizadas y la

evaluación de los parámetros establecidos, en la que la constante fue la

obtención en cada prueba de 0 UFC en la muestra (figura 21) y un

resultado de <100 UFC / g de Staphylococcus aureus a causa de las

diluciones trabajadas.

Figura 21. Prueba repetibilidad en carne cocida. Fuente: Autor

6.4.2.2 Ensayos de reproducibilidad de Staphylococcus aureus

coagulasa positiva

• Ensayo de reproducibilidad de Staphylococcus aureus coagulasa

positiva en una muestra que presenta un alto recuento (leche cruda)

en diferentes tiempos (ensayo de reproducibilidad 1).

En el ensayo de reproducibilidad de Staphylococcus aureus en una

muestra de leche cruda, se obtuvieron los siguientes recuentos a las

diferentes horas analizadas (tabla 26):

70

Tabla 26. Resultados recuentos en placa en superficie de Staphylococcus aureus en una muestra de leche cruda a las diferentes horas evaluadas (ensayo de reproducibilidad 1).

Fuente: Autor

Según los resultados presentados en la tabla 26, se presenta una

dispersión, en los valores ya que los resultados que arrojaron las

repeticiones realizadas a las diferentes horas no son iguales y tampoco

parecidos; por lo tanto, no existe una semejanza de los datos obtenidos

entre repeticiones de una misma prueba (figura 22).

Figura 22. Gráfica de dispersión prueba de reproducibilidad de Staphylococcus aureus a las diferentes horas analizadas. Fuente: Autor


NTC 4092


4 3 5 4 1 1 0 1 42424 42 x 103


5 6 4 5 1 1 1 1 54545 54 x 103


3 5 2 3 1 1 1 1 39393 40 x 103

Repetición 1

12:00 p.m. 4 3 7 5 0 2 1 1 51515 51 x 103


3 3 5 4 1 1 1 1 42424 42 x 103


6 5 4 5 1 0 0 0 48484 48 x 103

Repetición 1

4:00 p.m. 5 3 5 4 1 0 1 1 45454 45 x 103


4 6 5 5 1 2 0 1 54545 54 x 103


7 3 6 5 0 1 0 0 51515 51 x 103

Dispersión prueba reproducibilidad diferentes horas Staphylococcus aureus

0

10000

20000

30000

40000

50000

60000

0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5Repeticiones

Recuento UFC / g-m

l

08:00 a.m. 12:00 m. 04:00 p.m.

71


Staphylococcus aureus, el cual fue aislado a partir de una muestra de

leche cruda y se evidenció la conformación típica de las colonias de este

microorganismo (figura 23). Posteriormente se realizó una coloración de

Gram a las colonias características de S. aureus, obteniendo cocos Gram

positivos agrupados en racimos, lo que confirma así la morfología del

microorganismo aislado.

Figura 23. Staphylococcus aureus en muestra de leche cruda. Prueba reproducibilidad 1. Fuente: Autor

Por otro lado, se realizó un análisis de varianzas, desviación estándar y

coeficiente de variación para el ensayo de reproducibilidad 1, en donde se

obtuvieron los resultados presentados en la tabla 27; además, se realizó

el análisis de la prueba t para obtener la distribución, consiguiendo los

datos presentados en la tabla 28:


la prueba de reproducibilidad para el recuento en placa en superficie de Staphylococcus aureus en leche cruda evaluado en diferentes horas


Tiempo Promedio 1/1000

Promedio 1/10000


NTC 4092


4 1 42424 42 x 103


5 1 54545 54 x 103


3 1 39393

45 x 103

1,61111111

8017,57139

17,6388687

40 x 103


5 1 51515 51 x 103


4 1 42424 42 x 103


5 0 48484

47 x 103

2,02777778

4628,8379

9,75019043

48 x 103

72


4 1 45454 45 x 103


5 1 54545 54 x 103


5 0 51515

50 x 103

1,86111111

4628,947

9,16538472

51 x 103

Fuente: Autor


presentados para la prueba de reproducibilidad a diferentes horas

realizada a la técnica de recuento en placa en superficie de

Staphylococcus aureus en una muestra de leche cruda. Se obtuvieron

coeficientes de variación de 17.63% a la primera hora analizada (8:00

a.m.), 9.75% a la segunda hora analizada (12:00 m) y 9.16% a la tercera

hora analizada (4:00 p.m.). Estos coeficientes de variación demuestran

que hay un alto grado de concordancia entre los resultados obtenidos en

las diferentes horas analizadas, ya que presentan un porcentaje inferior al

20%.

Tabla 28. Prueba t para dos muestras. Prueba de reproducibilidad 1 para Staphylococcus aureus en muestra de leche cruda.

Repeticiones Variable 1

Observaciones 9




8:00 a.m.


Variable 1

Observaciones 9




12:00 m.


Variable 1

Observaciones 9




4:00 p.m.


Fuente: Autor

73


reproducibilidad a las 8:00 a.m. (2,1271 x 10-5), a las 12 m. (1,1408 x 10-5)

y a las 4:00 p.m. (1,3815 x 10-6), en donde se puede deducir que el

análisis de la hipótesis alternativa utilizando la prueba t confirma que el

promedio de recuentos de la dilución 10-3 es mayor que el promedio de

los recuentos de la dilución 10-4 (P<0,005) aceptando así la hipótesis

alternativa en los tres casos, para concluir que existe una reproducibilidad

para la técnica de recuento en placa en superficie de Staphylococcus

aureus.


varias muestras por grupo y se obtuvieron los siguientes resultados (tabla

29).



08:00 a.m.

Cuenta 3 3 6

Suma 12 2 14

Promedio 4 0,666666667 2,333333333

Varianza 1 0,333333333 3,866666667

12:00 m.

Cuenta 3 3 6

Suma 14 3 17

Promedio 4,666666667 1 2,833333333

Varianza 4,333333333 1 6,166666667

04:00 p.m.

Cuenta 3 3 6

Suma 13 2 15

Promedio 4,333333333 0,666666667 2,5

Varianza 1,333333333 0,333333333 4,7

Total

Cuenta 9 9

Suma 39 7

Promedio 4,333333333 0,777777778

Varianza 1,75 0,444444444

Fuente: Autor

74

• Ensayo de reproducibilidad de Staphylococcus aureus en una muestra

que presenta un bajo recuento (carne cocida) en diferentes tiempos



muestra de carne cocida, se obtuvieron los siguientes recuentos a las

diferentes horas analizadas (tabla 30):


superficie de Staphylococcus aureus en una muestra de carne cocida evaluado en diferentes horas (ensayo de reproducibilidad 1).

Fuente: Autor

En este ensayo tampoco se encontró crecimiento de Staphylococcus

aureus, lo cual confirma lo que se esperaba para la muestra de carne

cocida examinada, ya que este microorganismo produce una gran

cantidad de productos extracelulares, muchos de ellos enterotoxinas. La

diseminación de S. aureus entre humanos y de los humanos a los

alimentos puede ocurrir por contacto directo o indirectamente por

fragmentos de piel (Doyle, 1997).


NTC 4092

Repetición 1

8:00 a.m. 0 0 0 0 0 0 0 0 0 < 100

Repetición 2

8:00 a.m. 0 0 0 0 0 0 0 0 0 < 100

Repetición 3

8:00 a.m. 0 0 0 0 0 0 0 0 0 < 100

Repetición 1

12:00 p.m. 0 0 0 0 0 0 0 0 0 < 100

Repetición 2

12:00 p.m. 0 0 0 0 0 0 0 0 0 < 100

Repetición 3

12:00 p.m. 0 0 0 0 0 0 0 0 0 < 100

Repetición 1

4:00 p.m. 0 0 0 0 0 0 0 0 0 < 100

Repetición 2

4:00 p.m. 0 0 0 0 0 0 0 0 0 < 100

Repetición 3

4:00 p.m. 0 0 0 0 0 0 0 0 0 < 100

75

Se presentaron datos semejantes para las pruebas realizadas y la



S. aureus.

Figura 24. Prueba reproducibilidad 1 en carne cocida. Fuente: Autor

• Ensayo de reproducibilidad de Staphylococcus aureus coagulasa

positiva en una muestra de leche cruda, variando los analistas (ensayo

de reproducibilidad 2).


muestra de leche cruda, se obtuvieron los siguientes recuentos para los

diferentes analistas (tabla 31):

76

Tabla 31. Resultados de los recuentos en placa en superficie de Staphylococcus aureus en una muestra de leche cruda, variando los analistas (ensayo de reproducibilidad 2)

Fuente: Autor

Según los resultados presentados en la tabla 31, se presenta una

dispersión en los valores, ya que los resultados que arrojaron las

repeticiones realizadas por los distintos analistas son diferentes entre si;

variando en un rango que se encuentra entre 40 x 103 y 57 x 103 UFC / ml

de Staphylococcus aureus, por lo tanto, la semejanza en los datos

obtenidos entre repeticiones de una misma prueba no es muy uniforme

(figura 25). Sin embargo, es lógico que se presenten estos resultados

debido a que se está tratando con microorganismos que varían según las

condiciones de crecimiento a las que fueron sometidos.

1/1000 1/1000 1/1000 Promedio 1/10000 1/10000 1/10000 Promedio Recuento Según

NTC 4092


3 4 5 4 1 1 1 1 45454 45 x 103


4 4 3 4 1 1 0 1 39393 40 x 103


4 5 5 5 0 1 2 1 51515 51 x 103

Analista 2

Repetición 1 5 6 5 5 1 1 1 1 57575 57 x 103


4 4 6 5 1 1 1 1 51515 51 x 103


4 3 5 4 1 2 1 1 48484 48 x 103

Analista 3

Repetición 1 3 5 6 5 1 0 1 1 48484 48 x 103


5 7 6 6 1 1 1 1 54545 54 x 103


5 5 3 4 2 1 1 1 51515 51 x 103

Dispersion prueba reproducibilidad diferentes analistas Staphylococcus aureus

0

10000

20000

30000

40000

50000

60000

70000

0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5

Repeticiones

Recuentos UFC / g-m

l

Analista 1 Analista 2 Analista 3

77

Figura 25. Gráfica de dispersión prueba de reproducibilidad de Staphylococcus aureus realizado por diferentes analistas. Fuente: Autor


Staphylococcus aureus, aislado a partir de una muestra de leche cruda,

en donde se observó la morfología típica de las colonias de este

microorganismo (figura 26), a las cuales se les realizó una coloración de

Gram, para confirmar posteriormente las características propias de tinción

de S. aureus, pues se observaron cocos Gram positivos agrupados en

forma de racimos.

Figura 26. Staphylococcus aureus en muestra de leche cruda. Prueba reproducibilidad 2. Fuente: Autor

Por otro lado, se realizó un análisis de varianzas, desviación estándar y


resultados presentados en la tabla 32; además, se realizó el análisis de

prueba t para obtener la distribución, obteniendo los datos presentados en

la tabla 33:


la prueba de reproducibilidad para el recuento en placa en superficie de Staphylococcus aureus en leche cruda evaluado por diferentes analistas

(Ensayo de reproducibilidad 2).

Promedio 1/1000

Promedio 1/10000


NTC 4092 Analista 1

Repetición 1 4 1 45454 45 x 103


4 1 39393 40 x 103


5 1 51515

45 x 10

3

0,61111111

6061

13,33436

51 x 103

78


5 1 57575 57 x 103


5 1 51515 51 x 103


4 1 48484

52 x 10

3

1

4628,8379

8,81269353

48 x 103


5 1 48484 48 x 103


6 1 54545 54 x 103


4 1 51515

51 x 10

3

1,75

3030,50001

5,88279069

51 x 103

Fuente: Autor


presentados para la prueba de reproducibilidad con diferentes analistas

realizada a la técnica de recuento en placa en superficie de

Staphylococcus aureus en una muestra de leche cruda. Se obtuvieron

coeficientes de variación de 13.33% (analista 1), 8.81% (analista 2) y

5.88% (analista 3). Estos coeficientes de variación demuestran que hay

un alto grado de concordancia en los resultados obtenidos entre los

diferentes analistas, ya que presentan un porcentaje inferior al 20%.

Tabla 33. Prueba t para dos muestras. Prueba de reproducibilidad 2

para Staphylococcus aureus en leche cruda.

Analistas Variable 1

Observaciones 9



P(T<=t) una cola 3,24058E-08

1


Variable 1

Observaciones 9



P(T<=t) una cola 7,12846E-07

2


Variable 1

Observaciones 9



P(T<=t) una cola 3,50212E-06

3


Fuente: Autor

79


reproducibilidad variando los analistas. Analista 1 (3,24058 x 10-8),

analista 2 (7,12846 x 10-7) y analista 3 (3,50212 x 10-6), en donde se



mayor que el promedio de los recuentos de la dilución 10-4 (P<0,005),

aceptando así la hipótesis alternativa en los tres casos, para concluir que

existe una reproducibilidad intra-laboratorio para la técnica de recuento en

placa en superficie de Staphylococcus aureus.

Para este ensayo también se realizó un análisis de varianza de dos

factores con varias muestras por grupo y se obtuvieron los resultados

presentados en la tabla 34.



Analista 1

Cuenta 3 3 6

Suma 12 3 15

Promedio 4 1 2,5

Varianza 1 0 3,1

Analista 2

Cuenta 3 3 6

Suma 16 3 19

Promedio 5,333333333 1 3,166666667

Varianza 0,333333333 0 5,766666667

Analista 3

Cuenta 3 3 6

Suma 14 2 16

Promedio 4,666666667 0,666666667 2,666666667

Varianza 2,333333333 0,333333333 5,866666667

Total

Cuenta 9 9

Suma 42 8

Promedio 4,666666667 0,888888889

Varianza 1,25 0,111111111

Fuente: Autor

80

• Ensayo de reproducibilidad de Staphylococcus aureus en una muestra

de carne cocida, variando los analistas (ensayo de reproducibilidad 2).


muestra de carne cocida, al realizarse por diferentes analistas, se

obtuvieron los siguientes resultados (tabla 35):


superficie de Staphylococcus aureus en una muestra de carne cocida evaluado por diferentes analistas (ensayo de reproducibilidad 2).

Fuente: Autor

En esta prueba no se encontró crecimiento alguno de B. cereus, lo cual

confirma lo que se esperaba para la muestra de carne cocida analizada,

ya que, como se ha mencionado, este microorganismo no debe poder

aislarse de este alimento porque puede causar graves intoxicaciones

debido a las enterotoxinas que produce. La principal fuente de

contaminación de los alimentos por Staphylococcus se debe a la

manipulación de estos por parte de personas contaminadas, ya que los

humanos son el principal reservorio de este microorganismo.

1/100 1/100 1/100 Promedio 1/1000 1/1000 1/1000 Promedio Recuento Según

NTC 4092


0 0 0 0 0 0 0 0 0 < 100


0 0 0 0 0 0 0 0 0 < 100


0 0 0 0 0 0 0 0 0 < 100

Analista 2

Repetición 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 < 100


0 0 0 0 0 0 0 0 0 < 100


0 0 0 0 0 0 0 0 0 < 100

Analista 3

Repetición 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 < 100


0 0 0 0 0 0 0 0 0 < 100


0 0 0 0 0 0 0 0 0 < 100

81

Se presentaron datos iguales para las pruebas realizadas y la evaluación

de los parámetros establecidos, en donde se obtuvo en cada prueba 0

UFC en la muestra (figura 27) y un resultado de <100 UFC / g de S.

aureus.

Figura 27. Prueba reproducibilidad 2 en carne cocida. Fuente: Autor

82

7. CONCLUSIONES

• Para los laboratorios de análisis microbiológico es importante

desarrollar técnicas que produzcan confiabilidad de resultados, lo

cual se logra a través de la validación secundaria de dichos

métodos, ya que de esta forma se consigue emitir resultados

exactos, que permiten al laboratorio mantener altos estándares de

calidad.

• La metodología ejecutada permitió evaluar la repetibilidad y

reproducibilidad de la validación secundaria concurrente del

método de recuento en placa en superficie de Bacillus cereus en

muestras de albahaca y arroz cocido, la cual arrojó coeficientes de

variación con altos grados de concordancia para los diferentes

ensayos realizados; lo que significa que entre ensayos existe una

variación menor al 20%.

• La validación secundaria concurrente del método de recuento en

placa en superficie de Staphylococcus aureus en muestras de

leche cruda y carne cocida, arrojó coeficientes de variación con

altos grados de concordancia para los diferentes ensayos

realizados; lo que significa que entre ensayos existe una variación

menor al 20%, logrando así evaluar la repetibilidad y

reproducibilidad de esta técnica.

• La evaluación de la repetibilidad y la reproducibilidad de la técnica

de recuento en placa en superficie de Bacillus cereus en muestras

de albahaca y arroz cocido y de Staphylococcus aureus en

muestras de leche cruda y carne cocida, mostró valores que

aseguran la estandarización de la técnica.

83

• El análisis estadístico permitió corroborar que las técnicas de

recuento en placa en superficie tanto para el análisis de Bacillus

cereus como para Staphylococcus aureus en muestras de

alimentos son repetibles y reproducibles.

• Mediante la realización del método ecométrico a los medios

utilizados en los ensayos de validación se pudo evidenciar la alta

productividad y selectividad del agar Bacillus cereus y del agar

Baird Parker, lo que permite confiar en los resultados obtenidos en

cada uno de los ensayos llevados a cabo en el proceso de

validación.

• La demostración de los parámetros de calidad de los medios de

cultivo, tales como esterilidad, selectividad, productividad y pH

arrojó altos grados de confiabilidad para el estudio realizado.

• El sistema de aseguramiento de calidad en lo concerniente a

instalaciones, equipos y controles minimiza las posibles

desviaciones y deficiencias en la obtención de resultados.

84

8. RECOMENDACIONES

1. Mediante el desarrollo de la validación secundaria dar continuidad a la

validación de otras técnicas como, recuento de esporas anaerobias de

sulfito reductores, Vibrio cholera, Listeria monocytogenes, entre otras.

2. Realizar pruebas interlaboratorios nacionales e internacionales para dar

una mayor confiabilidad a los resultados obtenidos.

3. Implementar esta metodología para realizar una evaluación de

analistas, para lograr estandarizar este método, de manera que el

personal nuevo la conozca y la ejecute siempre de la misma forma.

85

9. REFERENCIAS

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Wichelhaus, T. A., Kern, S., Schafer, V., Brade, V. 1999. Rapid

detection of epidemic strains of methicillin-resistant Staphylococcus

aureus. Journal of Clinical Microbiology. Vol 37. No 3. 690 - 693.

89

8.1 Recursos Electrónicos

• European Commission. 2001. Enterprise Directorate-General.

Working Party on Control of Medicines and Inspections. Final Version of

Annex 15 to the EU Guide to Good Manufacturing Practice. Julio de 2001.

[En línea] <http://ec.europa.eu/enterprise/pharmaceuticals/eudralex/vol-

4/pdfs-en/v4an15.pdf> [Consulta: 27 enero 2007. Hora 6 p.m.].

• García Montoya, E. 2001. Optimización, validación y modelización de

un proceso de fabricación de comprimidos. Desarrollo de una aplicación

interactiva multimedia. Doctorado en Farmacia. Universitat de Barcelona.

Facultat de Farmacia. Barcelona, España. 166 Págs. [En línea]

<http://www.tdx.cesca.es/TESIS_UB/AVAILABLE/TDX-0618102-

102213//TOL82A.pdf> [Consulta: 24 enero 2007. Hora 7 p.m.].

• PDA Suggested Revision. 2000. February 25. Annex 15, Validation

Principles. [En línea] <http://www.pda.org/pdf/Anx%2015%20PDA%20

Comments%20Final.pdf> [Consulta: 25 enero 2007. Hora 3 p.m.].

• WHO Expert Committee on Specifications for Pharmaceutical

Preparations. Reporte 32. Ginebra, Suiza. World Health Organization,

1992 (WHO Technical Report Series. No. 823). [En línea]

<http://whqlibdoc.who.int/trs/WHO_TRS_823.pdf> [Consulta: 27 enero

2007. Hora 5 p.m.].

• http://www.biomerieuxusa.com/clinical/microbiology/slidex/slidex_staph

.htm (2006) [Consulta: 14 febrero 2007. Hora 7 pm].

10. ANEXOS

Anexo 1. Certificados de calidad de las cepas ATCC.

Anexo 2. Certificados de calidad de los medios de cultivo.

Anexo 3. Certificados de calibración de los equipos

Anexo 4. Confirmación bioquímica por medio del kit de identificación rápida de microorganismos Gram positivos BBL

VALIDACIÓN SECUNDARIA DEL MÉTODO DE RECUENTO EN PLACA EN...

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