VALORIZACIÓN DE UN SUBPRODUCTO DEL PROCESAMIENTO ...

UNIVERSIDAD DE COSTA RICA

FACULTAD DE CIENCIAS AGROALIMENTARIAS

ESCUELA DE TECNOLOGÍA DE ALIMENTOS

Trabajo Final de Graduación bajo la modalidad de proyecto presentado a la

Escuela de Tecnología de Alimentos como requisito parcial para optar por el grado de

Licenciatura en Ingeniería de Alimentos

VALORIZACIÓN DE UN SUBPRODUCTO DEL PROCESAMIENTO

AGROINDUSTRIAL DE GUAYABA (Psidium guajava) MEDIANTE LA

EXTRACCIÓN DE COMPUESTOS ANTIOXIDANTES

(POLIFENOLES Y CAROTENOIDES)

Valerie Dili Rangel Mena

Carné A95115

Ciudad Universitaria Rodrigo Facio

San José, Costa Rica

Julio 2018

ii

TRIBUNAL EXAMINADOR

Proyecto de graduación presentado a la Escuela de Tecnología de Alimentos como requisito

parcial para optar por el grado de Licenciatura en Ingeniería de Alimentos.

Elaborado por:

Valerie Dili Rangel Mena

Aprobado por:

_______________________________

M.Sc. Ana Incer González

Presidente del Tribunal

_______________________________

Ing. Eduardo Thompson Vicente

Director del Proyecto

_______________________________

M.Sc. Marvin Soto Retana

Asesor del Proyecto

_______________________________

Lic. Ana Lucía Mayorga Gross

Asesora del Proyecto

_______________________________

M.Sc. Hermes Alvarado Montero

Profesor Designado

iii

DERECHOS DE PROPIEDAD INTELECTUAL

Los resultados que se presentan son de carácter público.

iv

Haz lo que amas,

no hay otra manera de vivir.

-Facundo Cabral.

v

DEDICATORIA

A mi madre, porque hemos sido sólo ella y yo desde siempre,

y es quien con su amor, carácter, ejemplo y apoyo

me ha traído hasta acá.

vi

RECONOCIMIENTOS

Esta investigación es el resultado del aporte de numerosas personas e instituciones. Primero

que nada, agradezco a la Universidad de Costa Rica por abrir sus puertas a estudiantes extranjeros,

brindándonos las mismas oportunidades que estudiantes nacionales y formándonos con excelencia

para contribuir al país que amamos y en el que decidimos residir. A la Escuela de Tecnología de

Alimentos, por transmitir a sus estudiantes la capacidad de tener una visión práctica, crítica,

minuciosa y científica en cada detalle del quehacer profesional.

Un reconocimiento a Carlos Tobía, amigo venezolano de la familia, por su intachable ejemplo

durante sus estudios doctorales, por convertirse en familia escogida, y por ser el responsable de

impulsarme a estudiar en esta maravillosa Universidad.

Un especial agradecimiento al profesor Eduardo Thompson, Director del Proyecto, por

brindarme la oportunidad de trabajar como asistente y tesiaria de su proyecto de investigación, por

su dedicación como docente durante la carrera, su atención en horas de consulta, por transmitir su

pasión y curiosidad científica, su espíritu de servicio hacia los estudiantes, sus aportes y

observaciones ingenieriles, su confianza en mí, su agilidad para corregir y sus interesantes

conversaciones.

Al resto del Comité, el profesor Marvin Soto por sentar las bases de esta investigación con su

excelente tesis de Maestría, por su dedicación y paciencia en enseñarme las bases estadísticas y

uso de los programas de análisis de datos, y por transmitirnos la importancia de los detalles y del

buen formato. A la profesora Ana Lucía Mayorga, por darme la oportunidad de trabajar como

asistente en sus elevados y profundos proyectos de investigación en metabolómica, y por sus

cuestionamientos críticos y minuciosos.

Un profundo agradecimiento a Giovanni González, Luis Morales, Fernando Camacho,

Eduardo Calderón, Randall Cordero, Graciela Artavia, Carolina Cortés y Vanny Mora, por su

apoyo durante las largas y agotadoras horas de trabajo experimental en los laboratorios, por su

espíritu de servicio y amabilidad genuina, sus enseñanzas en el uso de equipos, su ayuda en la

solución de problemas, sus consejos sobre la vida y especialmente a sus chistes, que devolvían la

esperanza a los peores días de trabajo.

Una dedicatoria especial y agradecimiento a la profesora Jessie Usaga, por su inspiración, su

pasión, su empoderamiento y por ser la responsable de la mejor experiencia profesional que tuve

durante la carrera universitaria, la posibilidad de competir en el congreso IFT15 con el proyecto

Molibannann.

Un agradecimiento a Luis Urvina, por su apoyo y compañía durante largos días de trabajo

experimental, sus constantes cuestionamientos y críticas, por ayudarme a resolver dudas profundas,

por ser un ejemplo de excelencia académica y un gran amigo.

Por último, un agradecimiento al tesoro más importante que me dejó la Universidad, mis

colegas favoritos, amigos del alma y compañeros de vida: Johan Jiménez, Carlos Leandro, Luciana

Piza, Óscar Hernández, Sebastián González, Vanessa Córdoba, Ana Bonilla, Sofía Lara y Ana

María Quirós. Por ser ejemplos de vida, apoyo incondicional, compañeros de “palmadas”, motores

de fuerza, consejeros técnicos, constantes y fieles buzones de quejas, y por sembrar la duda de si

cursé una carrera profesional o una de risas y chistes.

vii

ÍNDICE GENERAL

TRIBUNAL EXAMINADOR ...................................................................................................... II

DERECHOS DE PROPIEDAD INTELECTUAL ................................................................... III

DEDICATORIA ............................................................................................................................ V

RECONOCIMIENTOS .............................................................................................................. VI

ÍNDICE DE CUADROS ............................................................................................................... X

ÍNDICE DE FIGURAS ............................................................................................................ XIII

NOMENCLATURA ................................................................................................................. XVI

RESUMEN ............................................................................................................................... XVII

1. JUSTIFICACIÓN ................................................................................................................ 18

2. OBJETIVOS ......................................................................................................................... 21

2.1. Objetivo general .............................................................................................................. 21

2.2. Objetivos específicos ....................................................................................................... 21

3. MARCO TEÓRICO ............................................................................................................ 22

3.1. Distribución, botánica, cultivo y mercado de la guayaba ................................................ 22

3.2. Procesamiento de la guayaba y subproductos ................................................................. 25

3.3. Composición de la guayaba y sus subproductos ............................................................. 26

3.4. Compuestos funcionales en la guayaba y sus subproductos ............................................ 28

3.4.1. Polifenoles ................................................................................................................ 28

3.4.2. Carotenoides ............................................................................................................. 35

3.5. Extracción batch sólido-líquido de compuestos funcionales .......................................... 37

3.5.1. Influencia de las variables de proceso ...................................................................... 39

4. MATERIALES Y MÉTODOS ............................................................................................ 42

4.1. Localización del proyecto ................................................................................................ 42

4.2. Materia prima .................................................................................................................. 42

4.2.1. Procedencia y características del subproducto de guayaba ...................................... 42

4.3. Metodología ..................................................................................................................... 44

4.3.1. Tratamiento, estabilización y muestreo del subproducto de guayaba ...................... 44

4.3.2. Caracterización fisicoquímica del subproducto de guayaba .................................... 45

4.3.3. Determinación de la relación sólido-líquido ............................................................ 46

4.3.4. Establecimiento del tiempo de proceso .................................................................... 51

4.3.5. Optimización del proceso de extracción .................................................................. 58

viii

4.3.6. Caracterización del proceso ..................................................................................... 66

4.4. Métodos de análisis fisicoquímicos ................................................................................. 69

4.4.1. Caracterización fisicoquímica del subproducto de guayaba .................................... 69

4.4.2. Determinación de la relación sólido-líquido ............................................................ 75

4.4.3. Establecimiento del tiempo de proceso .................................................................... 77

4.4.4. Optimización del proceso de extracción .................................................................. 77

4.4.5. Caracterización del proceso ..................................................................................... 80

5. ANÁLISIS DE RESULTADOS .......................................................................................... 82

5.1. Caracterización fisicoquímica del subproducto de guayaba ............................................ 82

5.2. Determinación de la relación sólido-líquido ................................................................... 86

5.3. Establecimiento del tiempo de proceso ........................................................................... 89

5.3.1. Modelo de primer orden ........................................................................................... 89

5.3.2. Modelo de dos velocidades ...................................................................................... 91

5.4. Optimización del proceso de extracción .......................................................................... 95

5.4.1. Polifenoles totales .................................................................................................... 96

5.4.2. Carotenoides totales ................................................................................................. 98

5.4.3. Turbidez ................................................................................................................... 99

5.4.4. Condiciones óptimas y función de deseabilidad .................................................... 100

5.5. Caracterización del proceso ........................................................................................... 104

5.5.1. Siguientes pasos y uso potencial del extracto ........................................................ 106

6. CONCLUSIONES .............................................................................................................. 107

6.1. Caracterización fisicoquímica del subproducto de guayaba .......................................... 107

6.2. Determinación de la relación sólido-líquido ................................................................. 107

6.3. Establecimiento del tiempo de proceso ......................................................................... 107

6.4. Optimización del proceso de extracción ........................................................................ 108

6.5. Caracterización del proceso ........................................................................................... 108

7. RECOMENDACIONES .................................................................................................... 109

8. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ............................................................................. 110

9. ANEXOS ............................................................................................................................. 118

9.1. Caracterización fisicoquímica del subproducto de guayaba .......................................... 118

9.2. Determinación de la relación sólido-líquido ................................................................. 119

9.2.1. Comprobación de los supuestos del análisis de varianza ....................................... 119

ix

9.2.2. Análisis de varianza ............................................................................................... 120

9.2.3. Comparaciones múltiples ....................................................................................... 120

9.3. Establecimiento del tiempo de proceso ......................................................................... 122

9.3.1. Regresión no lineal ..................................................................................................... 122

9.3.2. Cálculo del tiempo ..................................................................................................... 122

9.4. Optimización del proceso de extracción ........................................................................ 123

9.4.1. Análisis de varianza ............................................................................................... 123

9.4.2. Evaluación de validez de los modelos .................................................................... 124

9.4.3. Gráficos de contorno para obtener regiones óptimas ............................................. 126

x

ÍNDICE DE CUADROS

Cuadro I. Composición del fruto de guayaba rosada sin cáscara. ................................................ 26

Cuadro II. Composición de un subproducto, seco y molido, derivado del procesamiento de la

guayaba de pulpa rosada brasileña cv. Paluma. ............................................................................. 27

Cuadro III. Contenido de polifenoles (mg/100 g bs) en extractos liofilizados de guayaba de pulpa

blanca cv. Perla. ............................................................................................................................. 34

Cuadro IV. Distribución de la utilización del primer lote de SG recolectado. ............................. 45

Cuadro V. Distribución de la utilización del segundo lote de SG recolectado. ............................ 45

Cuadro VI. Diseño irrestricto aleatorio unifactorial para seleccionar la mejor S:L a utilizar en la

extracción batch de polifenoles a partir de un SG. ........................................................................ 46

Cuadro VII. Condiciones fijas utilizadas durante las corridas de extracción para seleccionar la S:L

a utilizar en la extracción batch de polifenoles totales a partir del SG. ......................................... 47

Cuadro VIII. Mediciones de masa para preparar la cantidad de disolvente (%EtOH=62,5 m/m)

necesaria para realizar las corridas de extracción de los cinco tratamientos. ................................ 48

Cuadro IX. Detalle de preparación de los niveles de S:L definidos para las corridas de extracción

y corroboración del volumen total de la mezcla. ........................................................................... 49

Cuadro X. Diseño de la toma de muestras para la construcción de las cinéticas, necesarias para la

selección del tiempo a utilizar durante la extracción batch de polifenoles totales a partir del SG.

........................................................................................................................................................ 51

Cuadro XI. Condiciones fijas utilizadas durante las corridas de extracción para seleccionar el

tiempo a utilizar en la extracción batch de polifenoles totales a partir del SG. ............................. 52

Cuadro XII. Detalle de preparación del disolvente y de las S:L en las corridas de extracción y

corroboración del volumen total de la mezcla. .............................................................................. 53

Cuadro XIII. Razones geométricas del reactor utilizado para la extracción batch de polifenoles a

partir de un subproducto de guayaba. ............................................................................................. 54

Cuadro XIV. Descripción de los accesorios del reactor, utilizado para la extracción batch de los

polifenoles totales, en las corridas correspondientes al objetivo 2. ............................................... 55

Cuadro XV. Variables independientes y niveles del DCCR utilizado para la optimización de la

extracción batch de polifenoles y carotenoides a partir del SG. .................................................... 58

Cuadro XVI. Condiciones de las corridas experimentales del DCCR, necesarias para la

optimización de la extracción batch de polifenoles y carotenoides a partir del SG. ...................... 60

Cuadro XVII. Condiciones fijas utilizadas durante las corridas de extracción para optimizar el pH,

T y %EtOH en la extracción batch de polifenoles y carotenoides totales a partir del SG. ............ 60

xi

Cuadro XVIII. Detalle de la preparación de las S:L en las corridas de extracción. ..................... 62

Cuadro XIX. Detalle de la preparación del disolvente para las corridas de extracción y


Cuadro XX. Condiciones utilizadas durante las corridas de extracción para validar y caracterizar

el proceso de extracción batch de polifenoles a partir del SG. ...................................................... 66

Cuadro XXI. Detalle de preparación del disolvente y la S:L en las corridas de extracción y


Cuadro XXII. Factores de dilución aplicados para la obtención de las CnAs de los EGs extraídos

con etanol al 62,5% y pH=4,50. ..................................................................................................... 75

Cuadro XXIII. Factores de dilución utilizados para la obtención de las CnAs de los EG extraídos

con etanol al 62,5% y pH=4,50. ..................................................................................................... 77

Cuadro XXIV. Diluciones necesarias de aplicar a los EGs, para estandarizar el %EtOH=0,3 m/m

en los tubos donde se realiza la reacción de Folin para determinar la CnA. .................................. 78

Cuadro XXV. Diluciones aplicadas a los EGs, para estandarizar el volumen de fase acuosa en 15

mL y el %EtOH en 62,5 m/m, para realizar la extracción con éter de petróleo ............................. 78

Cuadro XXVI. Propiedades fisicoquímicas del subproducto de guayaba, del primer lote, utilizado

como materia prima para la obtención de los extractos etanólicos correspondientes a los ensayos

de la determinación de la relación S:L, tiempo de proceso y optimización. .................................. 82

Cuadro XXVII. Modelo de primer orden de la cinética de extracción batch, en un reactor a escala

de laboratorio, de los polifenoles totales presentes en un subproducto de guayaba, para dos

diferentes relaciones sólido-líquido. ............................................................................................. 89

Cuadro XXVIII. Tiempos requeridos para extraer el 99% de la concentración de polifenoles en el

equilibrio (𝒏=0,99), según el modelo de primer orden, y utilizando un reactor como sistema de

extracción batch a escala de laboratorio. ....................................................................................... 90

Cuadro XXIX. Modelo de dos velocidades de la cinética de extracción batch, en un reactor a

escala de laboratorio, de los polifenoles totales presentes en un subproducto de guayaba, para dos

relaciones sólido-líquido. .............................................................................................................. 92

Cuadro XXX. Fracción extraída en la concentración en el equilibrio, según el modelo de dos

velocidades, para los tiempos de extracción evaluados, utilizando un reactor como sistema de

extracción batch a escala de laboratorio. ....................................................................................... 94

Cuadro XXXI. Comparación de la concentración de polifenoles totales alcanzada en la fase líquida

con los dos sistemas de extracción utilizados. ............................................................................... 95

xii

Cuadro XXXII. Evaluación del ajuste y la significancia de los modelos generados mediante la

metodología de superficie de respuesta. ......................................................................................... 96

Cuadro XXXIII. Regiones óptimas para cada variable respuesta evaluada en la optimización de

la extracción de polifenoles y carotenoides totales, a partir de un subproducto de guayaba, y

utilizando un reactor como sistema de extracción batch (S:L=1:5, t=35 min; y vag=450 rpm). .. 101

Cuadro XXXIV. Evaluación de la deseabilidad asociada a la optimización conjunta de las

variables respuesta. ....................................................................................................................... 101

Cuadro XXXV. Propiedades fisicoquímicas del subproducto de guayaba correspondiente a los

ensayos de validación del modelo de polifenoles totales y de caracterización del proceso. ........ 102

Cuadro XXXVI. Validación del modelo matemático que describe la extracción de los polifenoles

totales presentes en el subproducto de guayaba, utilizando un reactor como sistema de extracción

batch (condiciones: S:L=1:5, t=35 min, pH=2,00; T=65,0 °C; %EtOH=46,2 y vag=450 rpm). .. 103

Cuadro XXXVII. Rendimientos asociados al proceso de obtención del extracto etanólico rico en

polifenoles a partir de un subproducto de guayaba. ..................................................................... 106

xiii

ÍNDICE DE FIGURAS

Figura 1. Ejemplos de cultivares de guayaba con diferentes características morfológicas. ......... 23

Figura 2. Distribución mundial del cultivo de guayaba con fines comerciales. ........................... 24

Figura 3. Variedades de guayaba en Costa Rica. .......................................................................... 24

Figura 4. Polifenoles de mayor concentración entre los trece determinados en muestras de guayaba

rosada y blanca, tanto verde como madura, según el estudio de Lopes et al., 2017. ..................... 29

Figura 5. Proantocianidinas identificadas en diferentes variedades de guayaba de pulpa rosada. 29

Figura 6. Principales flavonoides identificados en diferentes cultivares de guayabas de pulpa

rosada. ............................................................................................................................................ 30

Figura 7. Estructura química del kaempferol, uno de los flavonoides mayoritarios en las guayabas

de pulpa rosadas de Malasia. .......................................................................................................... 31

Figura 8. Estructura de algunos compuestos fenólicos encontrados en extractos acuosos y

etanólicos de guayaba. .................................................................................................................... 31

Figura 9. Principales compuestos fenólicos encontrados en la pulpa y cáscara de la guayaba de

pulpa rosada costarricense cv. Criolla. ........................................................................................... 32

Figura 10. Estructura química de algunos compuestos fenólicos identificados en bagazo de

guayaba. .......................................................................................................................................... 34

Figura 11. Carotenoides aislados de la pulpa de guayabas rojas de Brasil cv. IAC-4. ................. 36

Figura 12. Carotenoides aislados de la pulpa de guayabas rosadas costarricenses cv. Criolla. .... 37

Figura 13. Transferencia del soluto del sustrato hacia el disolvente. ............................................ 38

Figura 14. Diagrama de bloques del proceso seguido por la empresa Ujarrás, S.A. para la

elaboración de jugo prensado de guayaba ...................................................................................... 43

Figura 15. Fotografía del subproducto de guayaba utilizado en el estudio. .................................. 43

Figura 16. Tratamiento del SG: a) homogeneización, b) empaque y c) sellado al vacío. ............. 44

Figura 17. Diagrama de bloques para la realización de las corridas de extracción y la obtención de

los EGs. .......................................................................................................................................... 48

Figura 18. Fotografías del sistema utilizado para realizar las corridas de extracción: a) Sistema de

extracción con balones y b) baño para recirculación del agua refrigerante. .................................. 49

Figura 19. Sistema de filtración utilizado para la separación del EG de la mezcla de extracción:

a) Trampa de vacío y Kitasato y b) Filtración de la mezcla al culminar la extracción. ................. 50

Figura 20. Diagrama de bloques para la realización de las corridas de extracción y la obtención

de los EGs correspondientes al objetivo 2. .................................................................................... 53

xiv

Figura 21. Dimensiones del tanque agitado utilizado para la extracción batch de polifenoles a partir

de un subproducto de guayaba. ...................................................................................................... 54

Figura 22. Diagrama simplificado del equipo utilizado durante las corridas de extracción batch de

polifenoles totales ........................................................................................................................... 56


los extractos de guayaba (EG). ....................................................................................................... 61


polifenoles totales. .......................................................................................................................... 64

Figura 25. Diagrama simplificado del equipo, utilizado para el prensado de la mezcla de

extracción. ...................................................................................................................................... 64

Figura 26. Diagrama de bloques para la realización de las corridas de extracción, y la obtención

de los extractos de guayaba (EG) y tortas de prensado (T). ........................................................... 67

Figura 27. Procedimiento de extracción analítica de polifenoles en muestras sólidas: a) extracción

en incubadora, b) filtración al vacío, c) recuperación de torta de filtración, d) aforo en balón y

e) microfiltración. ........................................................................................................................... 71

Figura 28. Representación gráfica simplificada de la matriz de extracción o SG. ....................... 83

Figura 29. Comparación del contenido de polifenoles totales del SG con el de 29 frutas y otros

subproductos (SPIM: subproducto del procesamiento industrial de mora). .................................. 84

Figura 30. Comparación del contenido de carotenoides totales del SG con el de 11 frutas y

vegetales. ........................................................................................................................................ 85

Figura 31. Efecto de la relación sólido-líquido de extracción sobre la concentración de polifenoles

totales en los extractos de guayaba. ............................................................................................... 87

Figura 32. Efecto de la relación sólido-líquido de extracción sobre los polifenoles totales extraídos

del subproducto de guayaba. .......................................................................................................... 87

Figura 33. Cinéticas de la extracción batch, en un reactor a escala de laboratorio, de los polifenoles

totales presentes en un subproducto de guayaba, utilizando dos diferentes relaciones sólido-líquido

y un ajuste a un modelo de primer orden. ...................................................................................... 91


totales presentes en un subproducto de guayaba, utilizando dos relaciones sólido-líquido y un ajuste

a un modelo de incremento exponencial hasta un máximo de cuatro parámetros. ........................ 93

Figura 35. Superficies de respuesta del efecto del pH, la T y el %EtOH sobre la concentración de

polifenoles totales en los EGs obtenidos utilizando un reactor como sistema de extracción batch.

........................................................................................................................................................ 97

xv


carotenoides totales en los EGs obtenidos utilizando un reactor como sistema de extracción batch.

........................................................................................................................................................ 99

Figura 37. Superficies de respuesta del efecto del pH, la T y el %EtOH sobre la turbidez en los

EGs obtenidos utilizando un reactor como sistema de extracción batch. .................................... 100

Figura 38. Diagrama de bloques para la obtención del extracto etanólico rico en polifenoles a partir

de un subproducto de guayaba. .................................................................................................... 104

Figura 39. Esquema ilustrativo de la extracción de polifenoles a partir del SG y de la separación

mecánica del EG. .......................................................................................................................... 105

xvi

NOMENCLATURA

ANDEVA Análisis de varianza MSG Masa de subproducto de guayaba

bh Base húmeda MTP Masa de torta de prensado

BHA Butilhidroxianisol MEG Masa del extracto de guayaba

BHT Butilhidroxitolueno MP Materia Prima

bs Base seca %PNR Polifenoles no recuperados

CITA Centro Nacional de Ciencia y Tecnología

de Alimentos PTse Polifenoles totales extraídos

R2-adj Coeficiente de determinación ajustado R Porcentaje de rendimiento

Cn Concentración %SEG Porcentaje de sólidos del extracto de

guayaba

CnCTs Concentración de carotenoides totales pH Potencial de hidrógeno

CnPTs∞ Concentración de polifenoles en el

equilibrio P Presión

CnPTs Concentración de polifenoles totales pfa Probabilidad de falta de ajuste

%EtOH Concentración en masa de etanol en el

disolvente pmodelo Probabilidad del modelo

k Constante de rapidez de extracción 2K Puntos axiales del DCCR

PTsSG Contenido de polifenoles totales en el SG n0 Puntos centrales del DCCR

N Corridas experimentales del DCCR 2K Puntos factoriales del DCCR

GC-MS Cromatografía de gases acoplada a

espectrómetro de masas S:L Relación sólido-líquido

HPLC-DAD Cromatografía líquida de alta resolución

con arreglo de diodos %RE Rendimiento de extracción

cv Cultivar %RPTse Rendimiento de polifenoles totales extraídos.

DBO Demanda biológica de oxígeno %RP Rendimiento de prensado

ρ Densidad SG Subproducto de guayaba

ρEG Densidad del extracto de guayaba SGA Subproducto de guayaba agotado (después

de la extracción)

DCCR Diseño Central Compuesto Rotable T Temperatura

EAC Equivalentes de ácido cítrico t Tiempo

EAG Equivalentes de ácido gálico te Tiempo de extracción

Eβ-C Equivalentes de β-caroteno TC Torta de centrifugación

ETA Escuela de Tecnología de Alimentos TF Torta de filtración

EtOH Etanol TP Torta de prensado

EG Extracto de guayaba Tb Turbidez

EGR Extracto de guayaba retenido en la TP FDA U.S. Food and Drug Administration

K Factores estadísticos del DCCR IU Unidad internacional de vitamina A

GRAS Generally Recognized As Safe UCR Universidad de Costa Rica

IC Intervalo de confianza Vag Velocidad de agitación

IP Intervalo de predicción vc Velocidad de centrifugación

Lic Licopeno VHCl Volumen de ácido clorhídrico

MD Masa de disolvente VD Volumen de disolvente

Mm Masa de mezcla de extracción Vm Volumen ocupado por mezcla de extracción

xvii

RESUMEN

En el presente estudio se planteó como objetivo desarrollar un proceso, a escala de laboratorio,

con las mejores condiciones para la extracción batch sólido-líquido de los polifenoles y

carotenoides presentes en un subproducto del procesamiento agroindustrial de guayaba, utilizando

una mezcla de etanol-agua como disolvente, para la obtención de un extracto líquido rico en

antioxidantes que permitiera la valorización de este material.

Como primera fase, se determinó la relación S:L utilizando un sistema de balones de fondo

plano con condensadores y pastillas de agitación, los cuales se encontraban inmersos en baños

maría; se trabajó a un pH de 4,50; a una T de 47,5°C y a un %EtOH de 62,5%. Se ensayaron los

tratamientos 1:5, 1:8, 1:10, 1:15 y 1:20. Posteriormente, se realizaron cinéticas en un reactor bajo

las mismas condiciones y con una duración de 8 horas, utilizando las relaciones que presentaron

una mayor concentración (1:5) y un mayor rendimiento de extracción de polifenoles totales (1:15).

Para las cinéticas, se realizaron regresiones no lineales con dos modelos matemáticos: de primer

orden y de dos velocidades. Con el primer modelo, se definió un tiempo de extracción de

35 minutos y la relación 1:5 como la más promisoria, pues esta permitió obtener extractos 60%

más concentrados respecto a la 1:15 y tan solo una diferencia en tiempo de extracción de 11 minutos

adicionales. Los parámetros de ajuste del modelo anterior fueron: R2-adj=0,8837 y pmodelo <0,0001,

con un 95% de confianza. Sin embargo, en un análisis posterior de los datos se obtuvo que el

sistema se ajusta mejor a un modelo de dos velocidades, pues los parámetros fueron: R2-

adj=0,9827; pmodelo<0,0001, con un 95% de confianza.

El proceso de extracción, utilizando un reactor, fue optimizado tomando en cuenta los factores

T, pH y %EtOH, en función de la extracción de polifenoles totales (PTs), carotenoides totales (CTs)

y turbidez (Tb), mediante la realización de superficies de respuesta con un Diseño Central

Compuesto Rotable (DCCR). Las condiciones que maximizan la extracción de CTs y minimizan

la Tb fueron un pH de 7,00; una T de 47,5 °C y un %EtOH de 95,0 %; obteniéndose una

concentración de 5 100 µg Eβ-C/ L. Para este modelo se obtuvieron los siguientes parámetros de

ajuste: R2-adj=0,9357; pfa=0,3202 y pmodelo=9,32x10- 10, con un 95% de confianza.

De igual forma, las condiciones que maximizan la extracción de PTs fueron un pH de 2,00; una

T de 65,0 °C y un %EtOH de 46,2 %; obteniéndose una concentración de 1 141 mg EAG/L. Para

este modelo se obtuvieron los siguientes parámetros de ajuste: R2-adj=0,9142; pfa=0,1148 y

pmodelo=2,11x10-7, con un 95% de confianza. Para la extracción de PTs se determinó que el

rendimiento obtenido es de 67 ± 12 % respecto a la cantidad total presentes en el SG. Se recomienda

realizar una segunda etapa de extracción para recuperar los polifenoles de la torta de prensado, lo

cuales suman un 26 ± 13 %.

Los resultados del presente estudio indican que fue posible la obtención de condiciones

preliminares de proceso para la extracción de polifenoles totales a partir de un subproducto

agroindustrial de guayaba; tomando en cuenta la concentración de los extractos obtenidos y los

rendimientos, se considera que esta es una oportunidad atractiva para la valorización de este

subproducto.

18

1. JUSTIFICACIÓN

La guayaba (Psidium guajava) es una fruta muy aromática, originaria de las regiones tropicales

de América, la cual cuenta con gran aceptación y popularidad comercial en todas las regiones

tropicales y subtropicales del mundo (Lim, 2011; Bhat et al.2015). En Costa Rica, se encuentran

principalmente la variedad criolla, con cáscara amarilla y pulpa rosada, y la variedad Tai-Kuo-Bar

conocida como guayaba china o taiwanesa, con cáscara verde y pulpa blanca. Ambas se cultivan

en las zonas de Paquera, Península de Nicoya, La Guácima, Sarapiquí y Turrialba, alcanzando en

conjunto niveles de producción superiores a 1 000 000 kg por año (PROCOMER, 2007).

La guayaba, en general, se caracteriza por ser fuente de fibra (69,1 g/ 100 g en base seca;

contenido similar al mango), de vitamina C (su contenido es de dos a cuatro veces mayor al de la

naranja) y de carotenoides (6 057 µg Eβ-C/100 g en base húmeda) (Lim, 2011; Martínez et al.,

2012; Moreno et al., 2014; Flores et al., 2015; Rojas et al., 2017). Además, en la pulpa de guayaba

se ha demostrado la presencia de polifenoles, alcanzando niveles de hasta 462 mg EAG/ 100 g en

base húmeda, lo cual se considera un contenido intermedio (Vasco et al., 2008).

Los carotenoides y polifenoles son compuestos naturales que se han asociado con la

disminución del riesgo de sufrir enfermedades cardiovasculares, infartos y cáncer, según estudios

epidemiológicos (Schieber et al., 2001; Balasundram et al., 2006). Es por esto que la guayaba ha

sido señalada en la literatura popular como una “súper-fruta” (Jiménez-Escrig et al., 2001; Flores

et al., 2015).

A pesar del potencial funcional y nutricional de la fruta fresca, la guayaba experimenta daño

por frío y un rápido decaimiento en la firmeza de su cáscara en los primeros diez días postcosecha,

lo cual la hace muy susceptible al daño mecánico y perecedera en su estado maduro (Abu-Goukh

y Bashir, 2003; Bashir y Abu-Goukh, 2003; Moreno et al., 2014; Bhat et al.2015). Por lo anterior,

esta fruta se comercializa más que todo en forma de productos procesados, siendo los de mayor

importancia económica a nivel mundial: la pulpa (aséptica, estabilizada químicamente, refrigerada

o concentrada-congelada) y el jugo clarificado, los cuales se utilizan en la elaboración de

mermeladas, jaleas, jugos y néctares (Lim, 2011; FAO, s.f.; Murillo, s.f.).

En Costa Rica, el mayor uso comercial de esta fruta radica en la producción de mermeladas y

jaleas, donde empresas como Ujarrás S.A., El Ángel S.A. y Fruta Dulce de Costa Rica S.A.

dominan el mercado (Armijo, 2016). Para la elaboración de estos productos, se someten las frutas

a operaciones preliminares de despulpado y prensado, donde algunos autores han reportado que se

desaprovecha hasta un 25% de la fruta (Schieber et al., 2001; Kong e Ismail, 2011), porción

compuesta por cáscaras, semillas y sólidos insolubles de la pulpa. Este subproducto es descartado

como un desecho, que en el caso de la empresa Ujarrás S.A., suma hasta 100 toneladas por año

(Armijo, 2016).

La disposición de este tipo de residuos agroindustriales representa un problema debido a que

el material vegetal es muy susceptible a la descomposición microbiana y ello genera: una alta

19

demanda biológica de oxígeno (DBO) en las aguas receptoras, formación de material flotante y

producción de malos olores por descomposición anaeróbica en el fondo de las aguas (Comisión

Nacional del Medio Ambiente, 1998; Schieber et al., 2001). De igual forma, la disposición en

rellenos sanitarios puede provocar serios problemas de operación debido al alto contenido de

humedad que presentan estos residuos y a los olores que genera su descomposición (Comisión

Nacional del Medio Ambiente, 1998).

Es por este potencial daño al ambiente que la disposición de estos subproductos se encuentra

sujeta a restricciones legales, en el caso de Costa Rica dictadas por la Ley para la Gestión Integral

de Residuos Nº 8839. Por ello, el tratamiento y disposición de los residuos es un costo obligatorio

en el que las empresas procesadoras de alimentos deben incurrir (Wijngaard et al., 2012).

La inestabilidad microbiológica ha limitado la explotación de los subproductos

agroindustriales como alternativa para compensar los costos de disposición, ya que para su

almacenamiento, es necesario aplicar procesos térmicos de estabilización, como secado o

congelación, lo cual hace que los costos para su aprovechamiento sean altos y no sean compensados

por los productos derivados tradicionales, normalmente fertilizantes y alimentos para animales,

pues estos son de bajo valor agregado (Schieber et al., 2001; Kong e Ismail, 2011).

Es debido a esta problemática que resulta importante investigar nuevas alternativas para la

utilización eficiente, de bajo costo y amigable con el ambiente de estos materiales, los cuales a su

vez generen productos de alto valor agregado (Lowe y Buckmaster, 1995). Bajo esta premisa, en

los últimos años se han desarrollado investigaciones que han revelado que muchos de estos

subproductos son una fuente potencial de compuestos bioactivos como antioxidantes, fibra y

aceites poliinsaturados (Kong et al., 2010; Wijngaard et al., 2012).

Específicamente, los subproductos de guayaba conservan parte de las propiedades funcionales

de la fruta fresca, según concluyen estudios realizados por Kong et al. (2010) y Kong e Ismail

(2011), donde estos subproductos muestran ser una fuente potencial de fibra, carotenoides y

polifenoles.

En la producción de jugo clarificado, las guayabas se someten a un despulpado para separar la

pulpa de semillas y cáscaras; luego, la pulpa es tratada enzimáticamente y prensada, para separar

el jugo clarificado de los sólidos insolubles en forma de una torta. Estos últimos son el subproducto

que se pretende aprovechar en la presente investigación y representa aproximadamente una

fracción del 13% de la fruta (Armijo, 2016).

Según datos obtenidos experimentalmente, este subproducto posee un contenido de

polifenoles, expresado como equivalentes de ácido gálico (EAG), mayor a 900 mg EAG/ 100 g en

base húmeda, el doble del contenido presente en la fruta fresca. Además, posee un contenido de

carotenoides totales, expresado como equivalentes de β-caroteno (Eβ-C), superior a

1 800 µg Eβ-C/ 100 g en base húmeda, 30% del contenido presente en la fruta, lo cual demuestra

el potencial que tiene esta fracción para ser aprovechada.

Los valores antes expuestos abren pie a una estrategia atractiva para revalorizar este

subproducto, al utilizarlo como sustrato para la extracción de polifenoles y carotenoides, con los

20

cuales se pueden desarrollar productos con alto valor de mercado en la industria alimentaria, como

lo son extractos antioxidantes (Kong et al., 2010; Wijngaard et al., 2012). De esta forma, no solo

es posible incorporar estos compuestos funcionales dentro de alimentos procesados para

enriquecerlos, sino que los extractos también pueden tener aplicaciones tecnológicas como

antioxidantes de lípidos y vitaminas, colorantes y antimicrobianos naturales que sustituyan la

utilización de productos sintéticos (Moure et al., 2001; Schieber et al., 2001).

La técnica de extracción más simple y económica para recuperar estos compuestos es la

extracción batch sólido-líquido, la cual consiste en someter un sólido al contacto con un disolvente

en un tanque agitado (Wijngaard et al., 2012). En esta operación, la transferencia de los compuestos

de la matriz hacia el disolvente está gobernada por distintas variables como: el tamaño de partícula

de la matriz, la velocidad de agitación, la razón sólido-disolvente, la composición del disolvente,

la temperatura y el tiempo de contacto (Takeuchi et al., 2009).

Para la extracción de polifenoles a partir de frutas y sus residuos, convencionalmente se han

utilizado mezclas de disolventes orgánicos con agua, en distintas proporciones, tales como: acetato

de etilo, acetona, metanol y etanol. Entre éstos, los más comunes son los dos últimos, especialmente

el metanol, pues ha mostrado ser más efectivo que el etanol (Moure et al., 2001; García et al., 2010;

Ignat et al., 2011).

Sin embargo, en el presente estudio se propone la utilización de una mezcla de agua con etanol,

pues a diferencia del metanol, el uso de etanol sí es permitido en alimentos por ser considerado

GRAS, según la clasificación de la FDA (Takeuchi et al., 2009). Además, el etanol tiene la ventaja

de que también puede ser utilizado para la extracción de carotenoides; tal y como lo demuestran

varios estudios donde se extrajeron estos compuestos a partir de subproductos agroindustriales de

tomate, palma, albaricoque y zanahoria, utilizando este disolvente (Wijngaard et al., 2012; Strati y

Oreopoulou, 2014; Cárdenas et al., 2015).

Las condiciones óptimas de extracción dependen de las características de cada matriz y de la

naturaleza química de los compuestos de interés que desean extraerse (Takeuchi et al., 2009). Por

lo anterior, para obtener condiciones específicas que maximicen la extracción de los polifenoles y

carotenoides, presentes en el subproducto de guayaba, es preciso determinarlas experimentalmente.

En la presente investigación se propone utilizar la metodología de superficie de respuesta para

optimizar las condiciones de concentración de etanol en el disolvente, pH y temperatura para la

extracción tanto de polifenoles como de carotenoides. Esta metodología es comúnmente utilizada

en los estudios científicos de extracción de fitoquímicos, ya que permite generar modelos

matemáticos que describen el proceso y permite obtener las condiciones que producen una

extracción óptima, utilizando un número mínimo de ensayos (Pompeu et al., 2009).

En conclusión, esta investigación tiene como objetivo desarrollar un proceso, a escala de

laboratorio y con potencial de escalamiento, que provea las mejores condiciones para la extracción

batch sólido-líquido de los polifenoles y carotenoides presentes en un subproducto del

procesamiento agroindustrial de guayaba, utilizando una mezcla de etanol-agua como disolvente,

para la obtención de un extracto etanólico rico en antioxidantes.

21

2. OBJETIVOS

2.1. Objetivo general

Desarrollar un proceso, a escala de laboratorio y con potencial de escalamiento, que provea las

mejores condiciones para la extracción batch sólido-líquido de los polifenoles y carotenoides

presentes en un subproducto del procesamiento agroindustrial de guayaba, utilizando una mezcla

de etanol-agua como disolvente, para la obtención de un extracto líquido rico en antioxidantes.

2.2. Objetivos específicos

2.2.1. Determinar la relación sólido-líquido más promisoria a utilizar durante la extracción

batch, a escala de laboratorio, de los polifenoles presentes en el subproducto del

procesamiento agroindustrial de guayaba, utilizando una mezcla de etanol-agua como

disolvente.

2.2.2. Establecer mediante cinéticas el mejor tiempo de proceso para la extracción batch

sólido-líquido, a escala de laboratorio, de los polifenoles presentes en el subproducto del

procesamiento agroindustrial de guayaba, utilizando una mezcla de etanol-agua como

disolvente.

2.2.3. Optimizar mediante la metodología de superficies de respuesta, las condiciones de

proceso de pH, temperatura y concentración de etanol en el disolvente, para la extracción

batch sólido-líquido a escala de laboratorio, de los polifenoles y carotenoides presentes

en el subproducto del procesamiento agroindustrial de guayaba.

2.2.4. Caracterizar mediante un balance de masa, el proceso desarrollado a escala de

laboratorio, para la obtención de un extracto líquido rico en antioxidantes a partir de un

subproducto del procesamiento agroindustrial de guayaba.

22

3. MARCO TEÓRICO

3.1. Distribución, botánica, cultivo y mercado de la guayaba

El árbol de guayaba pertenece a la familia Myrtaceae y el nombre científico de la especie es

Psidium guajava (Calderón y Moreno, 2009; Lim, 2011). Se presume que el origen geográfico de

la especie es la zona comprendida por el sur de México y Centroamérica, donde era cultivada antes

de la colonización (Singh, 2011; CONACYT y SAGARPA, s.f.). Sin embargo, la gran

adaptabilidad del árbol de guayaba a diferentes suelos y climas ha facilitado su naturalización en

otras áreas; por ello, se encuentra de forma silvestre y cultivada en todas las regiones tropicales y

subtropicales de América (PROCOMER, 2007; García 2010; Singh, 2011).

Se cree que los colonizadores españoles y portugueses la llevaron a Asia, donde también se

encuentra de forma silvestre y fue adoptada como cultivo desde hace varios siglos. Actualmente,

la especie se encuentra difundida en muchas regiones del mundo, con particular presencia en las

zonas calientes de África como Argelia y Egipto, en Palestina y en la costa Mediterránea de Francia

(PROCOMER, 2007; García 2010).

El fruto se clasifica como una baya y existen gran variedad de genotipos, producto de la mezcla

de materiales genéticos provenientes de diversos individuos silvestres con individuos de huertos

familiares; o bien, como resultado de la selección natural, de los programas de mejoramiento

genético propios de cada país y de la propagación por semilla durante largo tiempo (Singh, 2011;

Padilla et al., 2016; Rodríguez y Valdés-Infante, 2016; CONACYT y SAGARPA, s.f.). Es por lo

anterior que pueden encontrarse cultivares con gran variabilidad en las características internas y

externas de la fruta; en cada país, existen variedades con diferente sabor, perfil aromático, perfil

nutricional, forma y color de pulpa y cáscara (PROCOMER, 2007; Rodríguez y Valdés-Infante,

2016; MAG, s.f.).

Existen cultivares de forma esférica, ovalada, chata en los extremos, cilíndrica o piriforme,

donde el tamaño de la fruta puede variar entre 5-12 cm de largo y 3-6 cm de ancho; pueden

presentar un epicarpio liso o rugoso (Lim, 2011; Singh, 2011; Rodríguez y Valdés-Infante, 2016;

MAG, s.f.). La cáscara en estado maduro puede ser de color amarillo claro, amarillo oscuro,

amarillo verdoso, verde o morado; de igual forma, existen cultivares de pulpa blanca, amarilla

pálida, rosa pálido, rosado intenso, naranja o granada (ver Figura 1).

Los cultivares que poseen semillas, tienen una cantidad numerosa por fruto (16-632 unidades),

donde estas son de color amarillo, reniformes y semiduras; aunque se han encontrado algunas

variedades con semillas masticables (Lim, 2011; Singh, 2011; Rodríguez y Valdés-Infante, 2016).

El mesocarpio (parte externa de la pulpa) de los frutos es arenoso debido a la presencia de células

esclereidas (78%), las cuales poseen paredes celulares engrosadas y altamente lignificadas. En

contraposición, el endocarpio (tejido que recubre la semilla) es rico en células del parénquima y

bajo en células esclereidas (Singh, 2011).

23

Figura 1. Ejemplos de cultivares de guayaba con diferentes características morfológicas

(Lim, 2011).

Si bien la guayaba está presente en varias regiones alrededor del mundo, únicamente se cultiva

con propósito comercial en 21 países, específicamente en América por: Estados Unidos, Cuba,

Puerto Rico, México, Costa Rica, Colombia, Venezuela, Ecuador, Perú y Brasil; en África por:

Egipto, Sudán y Sudáfrica; en Asia por: India, Pakistán, Bangladesh, Tailandia, Vietnam, Filipinas,

Indonesia y Malasia; y en Oceanía por Australia (ver Figura 2).

En cada uno de estos países predominan diferentes cultivares de la fruta, por ejemplo, en

Brasil, Malasia y Sudáfrica predominan los cultivares rosados, y en la India y Egipto los de pulpa

blanca (PROCOMER, 2007; García, 2010; Singh, 2011; Padilla et al., 2016; Souza et al., 2016;

CONACYT y SAGARPA, s.f.).

La producción mundial de guayaba es mucho menor a la del resto de frutas tropicales

(Rodríguez y Valdés-Infante, 2016). Sin embargo, ha alcanzado los 2,7 millones de toneladas

anuales, cifra que se encuentra en el mismo orden de magnitud que el café, un cultivo reconocido

por su gran importancia. Esta producción es aportada en un 50 % por India y Pakistán, y en un 25%

por México; el resto, lo aportan los demás países productores (García 2010; ICO, 2015; Padilla

et al., 2016).

Específicamente Brasil, es el líder mundial de producción de guayabas de pulpa rosada (donde

el mayor cultivar es el Paluma), alcanzando producciones de hasta 342 000 toneladas anuales

(Souza et al., 2016). Los tres principales exportadores de la fruta son India, México y Brasil. Sin

embargo, los mayores consumidores son India, China e Indonesia (PROCOMER, 2007); y los

mayores importadores son Estados Unidos, Japón y Europa (Rodríguez y Valdés-Infante, 2016).

24

Figura 2. Distribución mundial del cultivo de guayaba con fines comerciales.

En Costa Rica, la producción y oferta de guayaba es muy baja, en comparación a otros

productos no tradicionales (PROCOMER, 2007). En el país, se encuentran y comercializan

principalmente dos cultivares: la guayaba Criolla (ver Figura 3.b.), de pulpa rosada y cáscara

amarilla, y la Tai-Kuo-Bar o guayaba taiwanesa (ver Figura 3.c.), de pulpa blanca y cáscara verde.

Ambas se cultivan en las zonas de Paquera, Península de Nicoya, La Guácima, San Carlos,

Sarapiquí y Turrialba, alcanzando en conjunto niveles de producción superiores a las

1 000 toneladas por año. Los canales de comercialización más comunes son: la venta a

intermediarios que la colocan en CENADA o ferias del agricultor (para su consumo en fresco),

venta a empresas exportadoras y venta a empresas procesadoras de la fruta (PROCOMER, 2007).

Figura 3. Variedades de guayaba en Costa Rica: a) Regiones de cultivo en el país, b) guayaba

Criolla y c) guayaba taiwanesa o Tai-Kuo-Bar.

b c a

25

3.2. Procesamiento de la guayaba y subproductos

La guayaba es una fruta altamente perecedera porque experimenta daño por frío y un rápido

decaimiento en la firmeza de su cáscara en los primeros diez días postcosecha, lo cual la hace muy

susceptible al daño mecánico en su estado maduro (Abu-Goukh y Bashir, 2003; Bashir y Abu-

Goukh, 2003; Moreno et al., 2014; Bhat et al. 2015). Por ello, la comercialización se orienta más

que todo hacia su procesamiento (PROCOMER, 2007; CONACYT y SAGARPA, s.f.). De hecho,

el comercio internacional de la fruta fresca de guayaba es muy limitado, pero los productos

procesados han mostrado un incremento en popularidad en el mercado europeo y norteamericano

(especialmente entre los grupos étnicos), debido al sabor y perfil aromático característico de esta

fruta (PROCOMER, 2007; Singh, 2011).

Los productos derivados de la guayaba con mayor importancia económica a nivel mundial son

el puré y el jugo clarificado, los cuales se comercializan empacados asépticamente, refrigerados o

congelados. El puré o pulpa es la materia prima de una vasta cantidad de productos como néctares,

jugos combinados de frutas, jarabes, mermeladas, bocadillos, helados, sorbetos, yogurts, alimentos

para bebé y batidos. De igual forma, el jugo clarificado se utiliza en la elaboración de néctares

clarificados, jugos combinados de fruta, bebidas naturales carbonatadas y jaleas (PROCOMER,

2007; García, 2010; Lim, 2011; Singh, 2011; FAO, s.f.; Murillo, s.f.).

Para la obtención del puré o pulpa de guayaba, se someten las frutas maduras y desinfectadas

a una operación preliminar de despulpado mecánico, en donde se genera un subproducto compuesto

por cáscaras y semillas, el cual representa el 12 % de la fruta (Kong e Ismail, 2011). De igual forma,

para obtener el jugo clarificado, se le aplica a la pulpa un tratamiento enzimático y un posterior

prensado o filtración, tras el cual los sólidos insolubles de la pulpa se generan como un subproducto

que representa el 13% de la fruta (Montenegro et al., 1995; Kong e Ismail, 2011).

Según Souza et al. (2016), solo la industria procesadora de jugo clarificado y jaleas de guayaba

de la ciudad de São Paulo, en Brasil, produce 5,5 millones de toneladas de estos subproductos al

año, los cuales son descartados en rellenos sanitarios porque su valor está poco documentado.

Las principales empresas procesadoras de guayaba a nivel mundial son Shimla Hills (India),

quien es el principal proveedor mundial de pulpa de guayaba, Al Sahid Trade Marketing

(Sudáfrica) que procesa pulpa de guayaba blanca y rosada empacada asépticamente, y Nutri Vita

(Brasil) que procesa pulpa congelada.

26

3.3. Composición de la guayaba y sus subproductos

En el Cuadro I se detalla la composición proximal de la porción comestible del fruto de

guayaba rosada. Como puede apreciarse, esta se caracteriza por un alto contenido de agua y bajas

concentraciones de carbohidratos, grasas y proteínas. Es importante resaltar que la guayaba se

considera fuente de fibra, pues contiene hasta un 28 % en base seca; donde la presencia de pectina

destaca como componente de la fibra soluble, pues su contenido en la pulpa supera el 5 % en base

seca (Lim, 2011; Rodríguez y Valdés-Infante, 2016).

Cuadro I. Composición del fruto de guayaba rosada sin cáscara (Lim, 2011).

Componente Cantidad por 100 g

Análisis proximal

Agua 80,80 g

Carbohidratos 14,32 g

Azúcares 8,92 g

Fibra dietética 5,4 g

Proteína 2,55 g

Ceniza 1,39 g

Lípidos totales 0,95 g

Vitaminas

C (ácido ascórbico) 228,3 mg

A (retinol) 624 IU

B3 (niacina) 1 084 µg

E (α-tocoferol) 730 µg

B5 (ácido pantoténico) 451 µg

B6 (piridoxina) 110 µg

B1 (tiamina) 67 µg

B2 (riboflavina) 40 µg

B9 (folatos) 46 µg

K (filoquinona) 2,6 µg

Antioxidantes

Polifenoles totales* 279 – 462 mg

Licopeno 5 204 µg

β-caroteno 374 µg

Minerales

Potasio (K) 417 mg

Fósforo (P) 40 mg

Magnesio (Mg) 22 mg

Calcio (Ca) 18 mg

Sodio (Na) 2 mg

Hierro (Fe) 260 µg

Zinc (Zn) 230 µg

Cobre (Cu) 230 µg

Manganeso (Mn) 150 µg

Selenio (Se) 0,6 µg

*(Rodríguez y Valdés-Infante, 2016; Vasco et al., 2008).

27

La guayaba es una fruta rica en vitaminas y minerales varios (ver Cuadro I), y ha sido

denominada comercialmente como una super-fruta debido a su composición y propiedades (Lopes

et al., 2017). Por ejemplo, se considera una fuente natural de vitamina C, pues su concentración es

hasta 4 veces mayor que la presente en el limón y la naranja. Los contenidos de vitamina A, B1,

B2, B3 y B5 son considerados como apreciables, al igual que las cantidades presentes de potasio,

fósforo, calcio y hierro (Montenegro et al., 1995; Oliva, 2011; Padilla et al., 2016; Rodríguez y

Valdés-Infante, 2016; Lopes et al., 2017).

La guayaba es una excelente fuente de antioxidantes como el ácido ascórbico, carotenoides y

compuestos fenólicos. De hecho, el color rosado-naranja del endocarpio, en la guayaba criolla, se

atribuye a la presencia de polifenoles y carotenoides, donde en el primer grupo predominan los

flavonoides de color amarillento; y en el segundo, el β-caroteno y licopeno, de color amarillo y

rojo, respectivamente (ver contenidos en Cuadro I). La guayaba madura también es rica en

triterpenos, aceites esenciales, y compuestos no tan beneficiosos como saponinas y lectinas

(Rodríguez y Valdés-Infante, 2016).

En cuanto a los subproductos del procesamiento de guayaba, existe un déficit de información

respecto a la composición proximal y perfil completo de compuestos funcionales de los

subproductos del despulpado de la fruta (cáscaras y semillas) y del prensado de la pulpa (sólidos

insolubles). Sin embargo, existen estudios que evidencian que estos contienen cantidades

importantes de compuestos funcionales como fibra, aceites y antioxidantes. Por ejemplo, en un

subproducto del despulpado de guayaba (previamente seco y molido), compuesto por pulpa y

semillas, se encontró la composición que se detalla en el Cuadro II.

Cuadro II. Composición de un subproducto, seco y molido, derivado del procesamiento de la

guayaba de pulpa rosada brasileña cv. Paluma.

Componente Cantidad por 100g

Agua 6,68 g

Fibra dietética 63,94 g

Fibra soluble 0,39 g

Carbohidratos disponibles 3,08 g

Pectina 0,58 g

Almidón 0,17 g

Lípidos 13,93 g

Proteína 11,19 g

Cenizas 1,18 g

Vitaminas

Vitamina C (Ácido ascórbico) 87,44 mg

Minerales

Hierro 13,8 mg

Zinc 3,31 mg

Antioxidantes

Carotenoides totales 1 250 µg

(Athayde et al., 2014)

28

Otro caso, es el estudio realizado por Kong et al. (2010), donde se optimizó el pH, tiempo y

temperatura para la extracción de polifenoles y flavonoides totales a partir de un subproducto del

despulpado de guayaba; y se encontraron contenidos de hasta 427,35 mg/100 g de flavonoides.

Por otro lado, Montenegro et al. (1995) comenta que, en la producción de jugo clarificado de

guayaba, se busca remover las partículas coloidales que causan turbidez en el jugo, las cuales

contienen compuestos que aportan sabor, color y son antioxidantes naturales. De hecho, todos estos

compuestos son retenidos en el tejido estructural durante el prensado. Es decir, que este

subproducto (compuesto por sólidos insolubles) es un potencial concentrado de las sustancias

antioxidantes que contenía originalmente la pulpa. Como prueba de lo anterior, se tiene el estudio

de Kong e Ismail (2011), en el cual determinaron el contenido de licopeno total en un subproducto

pulposo resultante de tamizar el puré de guayaba, obteniendo una concentración de

3 350 µg Lic/100 g.

3.4. Compuestos funcionales en la guayaba y sus subproductos

Es importante tener en cuenta que las especies y concentraciones de fitoquímicos funcionales

varían dependiendo de la parte de la fruta en cuestión (cáscara, pulpa o semillas) y del cultivar. Por

ejemplo, las variedades de guayaba de pulpa blanca tienen mayores concentraciones de ácido

ascórbico, polifenoles y azúcares, en comparación a las de pulpa rosada, en tanto que, estas poseen

un mayor contenido de carotenoides. De igual forma, los cultivares con semillas tienen contenidos

de polifenoles y ácido ascórbico más altos que los que no poseen semillas (Singh, 2011).

Por lo anterior, resulta fundamental tener en cuenta que los tipos de polifenoles y carotenoides,

identificados en los diferentes estudios que se describirán a continuación, están asociadas a un

cultivar específico. Entre variedades, los perfiles de estos compuestos pueden cambiar

drásticamente con tan solo algunas especies en común.

3.4.1. Polifenoles

Lim (2011) reporta que la pulpa y la cáscara de guayaba pueden tener fracciones entre 2,62 y

7,79 % en peso de polifenoles extraíbles. Existen estudios en los que se han identificado polifenoles

específicos en diferentes cultivares de guayaba, donde todos tienen en común la utilización de la

fruta liofilizada y la extracción de los compuestos utilizando como disolvente mezclas de

metanol/etanol, agua y ácido fórmico. Ahora bien, son escasos los estudios que muestran la

cantidad relativa de cada especie o grupo de compuestos fenólicos dentro de la fruta.

En la investigación de Lopes et al. (2017) se desarrolló un método para determinar

simultáneamente trece polifenoles en muestras de guayaba rosada y blanca, tanto verde como

madura (extraídas con metanol), por cromatografía de fase reversa HPLC-DAD. De todos los

29

compuestos, los que mostraron una mayor concentración entre las muestras se enlistan en la Figura

4.

Figura 4. Polifenoles de mayor concentración entre los trece determinados en muestras de guayaba

rosada y blanca, tanto verde como madura, según el estudio de Lopes et al., 2017.

Sin embargo, nótese de la figura anterior que las concentraciones de estos compuestos son

relativamente bajas, si se tiene como referencia que el contenido de polifenoles totales en la

guayaba se encuentra en el orden de los 2 000 mg EAG/100 g bs. Por lo tanto, se puede deducir

que estas especies no son mayoritarias.

Flores et al. (2015) realizaron un análisis más detallado en el que prepararon extractos de la

pulpa de diferentes cultivares de guayaba, previamente liofilizados, con una mezcla de metanol:

agua: ácido fórmico (70:25:5). Para las variedades de pulpa rosada se identificaron los compuestos

fenólicos mostrados en la Figura 5 y FIGURA 6, por HPLC-DAD acoplado a espectrometría de

masas.

Figura 5. Proantocianidinas identificadas en diferentes variedades de guayaba de pulpa rosada

(Adaptada de Flores et al., 2015).

30

Figura 6. Principales flavonoides identificados en diferentes cultivares de guayabas de pulpa rosada (Adaptada de Flores et al., 2015).

31

Nótese que se identificaron dos proantocianidinas, mostradas en la Figura 5, y que la mayoría

de los compuestos fenólicos encontrados pertenecen al grupo de los flavonoides, específicamente

glicósidos de miricetina, isoramnetina y principalmente quercetina (ver Figura 6). Es importante

mencionar que no se detectaron antocianinas en las variedades de pulpa rosada, únicamente en el

cultivar Thai Maroon (de pulpa color morado).

En el estudio de Musa et al. (2015) se cuantificaron diferentes flavonoides en la pulpa de dos

guayabas rosadas de Malasia (cv. Sungkai y Semenyih), por HPLC, tras su extracción con una

disolución al 80 % de metanol acidificado con HCl 2 mol/L. Los compuestos mayoritarios

encontrados en esta investigación fueron el kaempferol (ver Figura 7) y la isoramnetina (ver

Figura 6), representando el 50 % y 30 % del total de flavonoides, respectivamente.

Figura 7. Estructura química del kaempferol, uno de los flavonoides mayoritarios en las guayabas

de pulpa rosadas de Malasia (Musa et al. 2015).

Rojas et al. (2016) realizaron un estudio específico para la guayaba de pulpa rosada

costarricense cv. Criolla e identificaron sesenta polifenoles presentes en un extracto de

metanol: agua (9:1) acidificado con 1% de ácido fórmico. En esta investigación se encontró un

espectro más amplio de compuestos, con especies pertenecientes a diversos grupos de polifenoles

como: derivados de ácidos hidroxibenzoicos, derivados de ácidos hidroxicinámicos, flavonoides,

estilbenos, chalconas, benzofenonas y taninos (ver Figura 9).

En la investigación de Lin y Yin (2012), se estudió el efecto renoprotector, de extractos

acuosos y etanólicos de una guayaba de pulpa blanca taiwanesa (cv. Perla), sobre ratones

diabéticos; en los extractos se cuantificaron los compuestos fenólicos de la Figura 8, junto al ácido

elágico, rutina (Figura 4), quercetina, miricetina (Figura 6), ácido cinámico y ácido cumárico

(Figura 10). Los contenidos relativos de cada compuesto, en los extractos liofilizados, se muestran

en el Cuadro III.

Figura 8. Estructura de algunos compuestos fenólicos encontrados en extractos acuosos y

etanólicos de guayaba (Adaptada de Lin y Yin, 2012).

32

Figura 9. Principales compuestos fenólicos encontrados en la pulpa y cáscara de la guayaba de pulpa rosada costarricense cv. Criolla (Adaptada

de Rojas et al., 2015).

33

Figura 9 (Cont.). Principales compuestos fenólicos encontrados en la pulpa y cáscara de la guayaba de pulpa rosada costarricense cv. Criolla

(Adaptada de Rojas et al., 2015).

34

Cuadro III. Contenido de polifenoles (mg/100 g bs) en extractos liofilizados de guayaba de pulpa

blanca cv. Perla.

Compuesto Extracto acuoso Extracto etanólico

Ácido cafeico 67,1 29,0

Ácido cinámico - 13,4

Ácido cumárico 23,8 120,7

Ácido elágico 9,2 11,6

Ácido ferúlico 18,5 80,3

Ácido rosmarínico 104,2 98,1

Miricetina 68,0 37,4

Naringenina 44,7 48,5

Quercetina 133,2 92,5

Rutina 107,6 93,0

(Lin y Yin, 2012)

Por último, Denny et al. (2013) reportó la presencia de ácido gálico (Figura 4), epicatequina

(Figura 10), miricetina y quercetina (Figura 6) en extractos de pulpa de guayaba brasileña; en este

estudio las determinaciones fueron realizadas por GC-MS. Respecto a los subproductos, Siqueira

et al. (2011) encontró en un residuo del despulpado de guayaba (cáscaras y semillas) los

compuestos enlistados en la Figura 10, junto al ácido gálico y la quercetina.

Figura 10. Estructura química de algunos compuestos fenólicos identificados en bagazo de

guayaba (Adaptada de Siqueira et al. 2011).

35

3.4.2. Carotenoides

El perfil de carotenoides depende íntimamente de la variedad de guayaba en cuestión. Por

ejemplo, en el estudio de Mercadante et al. (1999) se identificaron dieciseis carotenoides presentes

en guayabas rojas de Brasil (cv. IAC-4), previamente liofilizadas y extraídas con t-butil metil éter,

acetato de etilo y metanol. Las estructuras fueron dilucidadas mediante la aplicación conjunta de

técnicas como espectros UV, espectrometría de masas (MS) y resonancia magnética nuclear

(NMR). Las especies se muestran a continuación en la Figura 11.

Por otro lado, en la investigación de Rojas et al. (2017) se estudió el perfil de carotenoides en

la pulpa de la guayaba rosada costarricense, variedad Criolla, y se encontraron las sustancias que

se enlistan en la Figura 12, adicional a algunas ya mencionadas en el Figura 11, como lo son:

luteína, criptoflavina, fitoflueno, σ-caroteno, (All-E)-β-caroteno, (15Z)-β-caroteno, γ-caroteno,

(15Z)-licopeno, (13Z)-licopeno, (9Z)-licopeno y (All-E)-licopeno. Además, se encontraron los

siguientes isómeros del licopeno: 13,15-di-cis-licopeno y 9,13-di-cis-licopeno. En este estudio, los

carotenoides fueron extraídos de la muestra liofilizada con una mezcla de metanol, acetato de etilo

y petróleo ligero (1:1:1), con 0,1 g/L de BHT y BHA.

A pesar de esta numerosa cantidad de compuestos reportados, generalmente a la guayaba se le

ha asociado únicamente la presencia de licopeno y β-caroteno, siendo el primero el de mayor

contenido (Lim, 2011; Nwaichi et al., 2015). De hecho, en el estudio de Chandrika et al. (2009)

encontraron únicamente licopeno (4 530 µg/100 g), β-caroteno (200 µg/ 100 g) y mínimas

cantidades de β-criptoxantina, en el cultivar Horana Red.

En esta misma línea, Rojas et al. (2017) también cuantificaron algunos carotenoides en la pulpa

de la guayaba madura, y se obtuvo que el (All-E)-licopeno y (All-E)-β-caroteno fueron los

carotenoides mayoritarios, con concentraciones de 6 038 µg/100 g y 1 460 µg/100 g,

respectivamente.

36

Figura 11. Carotenoides aislados de la pulpa de guayabas rojas de Brasil cv. IAC-4

(Adaptada de Mercadante et al., 1999).

37

Figura 12. Carotenoides aislados de la pulpa de guayabas rosadas costarricenses cv. Criolla

(Adaptada de Rojas et al., 2017).

3.5. Extracción batch sólido-líquido de compuestos funcionales

La extracción sólido-líquido se define como un fenómeno de transferencia de masa, en el cual

ciertas sustancias, contenidas en una matriz sólida, migran hacía un disolvente líquido cuando

ambos se ponen en contacto (Ignat et al., 2011; Lloyd y van Wyk, 2011). Este fenómeno es

utilizado como un proceso de separación, donde a la matriz se le conoce como sustrato, a la fracción

disuelta se le conoce como soluto y a la disolución o fase líquida resultante como extracto.

Dado que el objetivo es recuperar un compuesto de interés, la extracción implica operaciones

posteriores como: separación de la fase líquida y sólida, recuperación del disolvente para su

reutilización en futuras extracciones y purificación del soluto (Lloyd y van Wyk, 2011; Chanioti et

al., 2014).

Un sistema de extracción por lote (batch) consiste en un tanque que se llena con el sustrato,

tras lo cual el disolvente se percola a través de una cama del sólido o se añade al tanque hasta

sumergir el sustrato. En el caso anterior, la mezcla de disolvente y sólido se agita para favorecer la

38

transferencia de masa (Jaeger y Eggers, 2003). La ventaja de los sistemas batch es que son simples

de operar; sin embargo, tienen una capacidad limitada y su principal desventaja es que requieren

de una operación interrumpida para cargar el sustrato y disolvente, y luego, para descargar el

extracto (Jaeger y Eggers, 2003; Chanioti et al., 2014).

El proceso físico subyacente de la extracción es la diferencia en la concentración del soluto

(aproximación para el potencial químico) que existe entre el sustrato y el disolvente, la cual provoca

la transferencia de masa desde el sustrato (fase de mayor concentración) hacia el disolvente (fase

de menor concentración). En este proceso, ocurren los siguientes fenómenos sucesivos:

1transferencia del disolvente desde el seno de la disolución hacia la superficie de la matriz, 2-

penetración o difusión del disolvente en los poros de la matriz sólida, 3-disolución del soluto en el

disolvente, 4-transporte del soluto a la superficie de la matriz sólida y 5-migración del soluto

extraído de la superficie externa del material hacia el seno de la disolución (Lloyd y van Wyk,

2011).

El proceso de difusión del soluto hacia el disolvente (pasos 3-5) se ve obstaculizado por una

serie de fenómenos que determinan la velocidad de la transferencia de masa, tal y como se

esquematiza en la Figura 13. Antes de enumerarlos, debe entenderse de esta figura que la

concentración en el seno de cada fase es homogénea, excepto cerca de la interfase, donde la

difusión está ocurriendo. En la interfase propiamente, hay una caída en la concentración que refleja

la diferencia en el potencial químico (o concentración) entre ambos lados de la interfase. Ahora

bien, las siguientes tres capas ofrecen una resistencia a la transferencia de masa desde el sustrato

hacia el disolvente: 1-la capa de difusión del lado del sustrato, 2-la resistencia de la interfase y 3-

la capa de difusión del lado del disolvente (Chanioti et al., 2014).

Figura 13. Transferencia del soluto del sustrato hacia el disolvente (adaptada de Chanioti et al.,

2014).

En el procesamiento de alimentos, la última capa es insignificante, ya que el disolvente es

generalmente un líquido de baja viscosidad, lo cual significa que puede mezclarse fácilmente y el

grosor de la capa de difusión puede ser reducido a un mínimo. El reto, es minimizar las dos primeras

39

resistencias, pues la capa del sustrato no suele ser de baja viscosidad, ya que puede ser semifluida

con estructuras celulares o hasta relativamente sólida. Cual sea su estado, va a tener una resistencia

a la transferencia de masa mucho mayor en comparación a un fluido de baja viscosidad (Chanioti

et al., 2014).

La operación de extracción es muy utilizada en la industria alimentaria para recuperar

componentes presentes en matrices naturales, los cuales pueden tener diversas aplicaciones como:

ingredientes, saborizantes, colorantes o antioxidantes. Entre ellos, resaltan los componentes

bioactivos o funcionales, los cuales se encuentran en diversas fuentes de origen bacteriano, fúngico,

vegetal o animal, y a los cuales se les ha encontrado aplicaciones útiles para el enriquecimiento u

obtención de productos nutraceúticos o funcionales (Lloyd y van Wyk, 2011; Chanioti et al., 2014).

Aparte de los compuestos funcionales, se pueden encontrar otras aplicaciones de la extracción

en la obtención de aceite, a partir de semillas que contienen entre 15-50% de lípidos, tales como

soya, girasol, algodón y canola; donde primero se aplica un prensado mecánico y luego una

extracción con disolvente (usualmente hexano) para recuperar el 20% de aceite remanente en la

torta de prensado (Xu y Diosady, 2003).

Otra aplicación importante radica en la producción de aislados de proteína de soya, donde se

realiza una extracción, con una disolución acuosa ligeramente alcalina, de la proteína presente en

la torta desengrasada de soya (remanente de la producción de aceite). Luego, la proteína es

precipitada disminuyendo el pH hasta 4,5; lavada y secada para obtener el producto final (Xu y

Diosady, 2003).

En el caso del azúcar de caña o remolacha, entre las diversas operaciones que involucra el

proceso, se encuentra la extracción de los azúcares con agua a 70-80 °C, para obtener un jugo crudo

que posteriormente es purificado, filtrado, concentrado, cristalizado y secado para obtener el azúcar

de mesa (Christodoulou, 2003)

Un último ejemplo, es la producción de aceites esenciales a partir de cortezas, frutas, hierbas,

hojas, raíces y semillas, para ser utilizado como aromatizantes y saborizantes. En este proceso se

utiliza la hidrodestilación seguida de una extracción con disolvente para obtener la oleorresina, la

cual es un saborizante líquido concentrado con componentes volátiles y no volátiles (Lee y Lee,

2003).

3.5.1. Influencia de las variables de proceso

La eficiencia de la extracción, entendida como la rapidez y la concentración obtenida de los

compuestos de interés en el extracto, es función de diferentes condiciones de proceso (Ignat et al.,

2011), las cuales se detallan a continuación.

40

Velocidad de agitación

La agitación del disolvente es importante porque incrementa la difusión turbulenta y la rapidez

de transferencia del material de la superficie de la partícula al seno de la disolución (Chanioti et al.,

2014).

Tamaño de partícula

Aunque el soluto puede encontrarse en la superficie de la célula, en la mayoría de los casos

está almacenado en los espacios intracelulares, capilares o estructuras celulares. Entonces, el éxito

de una extracción con disolvente depende fuertemente de la condición del sólido. Uno de los

pretratamientos que debe ser considerado es la disminución del tamaño. La molienda antes de una

extracción promueve un aumento en el área de contacto entre el disolvente y la matriz sólida.

Mientras más pequeño es el tamaño de partícula, mayor es la rapidez de transferencia del soluto,

porque disminuye la resistencia a la difusión debido a que se acorta la longitud de los caminos

difusionales (Chanioti et al., 2014).

Relación sólido-líquido

La fuerza motriz de la transferencia de masa durante la extracción es el gradiente de

concentración entre el sólido y el seno de la fase líquida; este gradiente aumenta mientras mayor

sea la cantidad de disolvente empleada en relación con la cantidad de sólido. De hecho, cuanto

mayor sea esta relación, mayor es la cantidad de compuestos de interés que pueden recuperarse de

la fase líquida (Radojkovic et al., 2012).

Tiempo de extracción

La extracción es un proceso dinámico, por ende, la concentración del soluto en la fase líquida

varía en el tiempo hasta que el sistema llega a un estado de equilibrio, donde se alcanza un máximo

en la concentración, valor que se mantiene constante. El tiempo en el que se finalice la operación

determinará la concentración obtenida del soluto de interés en la fase líquida (Lloyd y van Wyk,

2011).

Potencial de hidrógeno (pH)

Los ácidos fenólicos existen en las matrices vegetales de forma disuelta y disponible para la

extracción, o unidos a polímeros de las paredes celulares, por medio de enlaces éster o glicosídicos.

Estos últimos no son extraíbles con disolventes orgánicos, por lo que se tienen que realizar

hidrólisis básicas o ácidas para liberarlos. El medio ácido o básico también puede favorecer la

extracción de los polifenoles disponibles al formar los ácidos y bases conjugadas correspondientes,

tras reaccionar con los grupos hidroxilo. Estas reacciones ácido-base generan iones con mayor

solubilidad respecto a la forma molecular. Se ha observado que el medio ácido favorece en mayor

41

medida los dos tipos de fenómenos mencionados en comparación al básico (Ignat et al., 2011;

Librán et al., 2013).

Temperatura

La solubilidad y difusividad del material que es extraído normalmente aumenta con el

incremento en la temperatura y, por ende, la rapidez de extracción aumenta. Además, disminuyen

propiedades del disolvente como la viscosidad, lo cual disminuye la resistencia a la transferencia

de masa. En la industria de alimentos, las altas temperaturas pueden generar reacciones de

degradación de componentes termolábiles, como hidrólisis. Por ende, existe un límite máximo de

temperatura que no debe excederse para evitar estas reacciones. Adicionalmente, el disolvente debe

permanecer en estado líquido durante el proceso, por lo que no se recomienda exceder la

temperatura de ebullición del mismo para evitar pérdidas de disolvente, extracción de componentes

indeseables o daño de compuestos sensibles (Chanioti et al., 2014).

Composición del disolvente

Los siguientes criterios deben ser tomados en cuenta a la hora de seleccionar un disolvente de

extracción batch: 1-que la sustancia de interés sea soluble en el disolvente (normalmente dictado

por la polaridad de ambos) y ojalá de forma selectiva, 2-que posea propiedades físicas como baja

tensión superficial y viscosidad, para que este pueda mojar el sólido y penetrar por los poros y

capilaridades de la matriz, 3- facilidad de recuperación, 4-que sea seguro de utilizar; es decir, que

posea baja toxicidad, sea inerte y no inflamable, por último, 5- que sea de bajo costo y esté

disponible (Ignat et al., 2011; Chanioti et al., 2014).

Para la extracción de polifenoles de frutos y sus residuos, por su naturaleza polar,

convencionalmente se han utilizado mezclas de disolventes orgánicos con agua en distintas

proporciones; tales como: acetato de etilo, acetona, metanol y etanol. Entre éstos, los más comunes

son los dos últimos, especialmente el metanol, pues ha mostrado ser más efectivo que el etanol

(Moure et al., 2001; García et al., 2010; Ignat et al., 2011). En el caso de los carotenoides, por su

naturaleza mayormente no polar, es común la utilización de hexano, éter etílico y éter de petróleo.

También se ha experimentado con etanol en subproductos de tomate, palma, albaricoque y zanahoria,

obteniendo resultados regulares (Wijngaard et al., 2012; Strati y Oreopoulou, 2014; Cárdenas et al.,

2015).

Sin embargo, en alimentos, el uso de metanol y hexano genera preocupación por su alta

toxicidad, por los residuos que puedan quedar en los extractos, la exposición de las personas al

disolvente y la contaminación del medio ambiente por la disposición de sus desechos. De hecho,

en alimentos, los remanentes de estos son estrictamente regulados por límites en el orden de las

partes por millón (Shi et al., 2003; FDA, 2017).

En contraposición, el etanol es clasificado por la FDA como GRAS y se considera una opción

más segura y ecológica (Nawaz et al., 2006; Takeuchi et al., 2009; Da Fonseca et al., 2015; FDA,

42

2017). Es importante aclarar que se prefiere el uso de etanol, sobre el uso de agua, debido a que en

un estudio realizado por Roopchand et al. (2013), el rendimiento de extracción de polifenoles

totales, a partir de cáscaras de arándano, puede llegar a ser hasta cuatro veces superior con etanol

acuoso al 50% que con agua.

4. MATERIALES Y MÉTODOS

4.1. Localización del proyecto

La totalidad del trabajo experimental se realizó en el Centro Nacional de Ciencia y Tecnología

de Alimentos (CITA) y en la Escuela de Tecnología de Alimentos (ETA). Específicamente, se

utilizaron las instalaciones de la Planta Piloto, el Laboratorio de Microbiología y Laboratorio de

Química del CITA, así como el Laboratorio de Análisis Químico de Alimentos de la ETA. Ambas

instituciones se localizan en la Sede Rodrigo Facio de la Universidad de Costa Rica (UCR), ubicada

en San Pedro de Montes de Oca, San José.

4.2. Materia prima

4.2.1. Procedencia y características del subproducto de guayaba

En el presente estudio, se utilizó un subproducto del procesamiento agroindustrial de guayaba

(SG) proveído por la empresa Productos Ujarrás, S.A., ubicada en San Diego de Tres Ríos, Cartago.

Esta empresa es el mayor procesador nacional de esta fruta, llegando a volúmenes de hasta

250 000 kg por año. Productos Ujarrás utiliza una mezcla de guayabas de las variedades criolla

(rosada) y Tai-Kuo-Bar (blanca), ambas son cosechadas en una finca orgánica en Turrialba y se

procesan durante la temporada de agosto a noviembre, para obtener la pulpa, la cual es almacenada

y utilizada durante todo el año para la elaboración de mermeladas, jaleas y bocaditos.

Específicamente, el SG es la torta que queda como remanente de prensar la pulpa de guayaba,

previamente pasteurizada y tratada enzimáticamente, para la obtención de un jugo bajo en sólidos

insolubles que la empresa utiliza como materia prima para la elaboración de jaleas de guayaba (ver

Figura 14). Durante este proceso, de la masa total de pulpa procesada, se genera un 13 % de SG

que es normalmente desechado. Este se caracteriza por tener la textura de una masa homogénea

color ladrillo (ver Figura 15), con un contenido de humedad aproximado del 70 % y un 20 % de

fibra.

43

Guayabas Mezcla de criolla y Tai-Kuo-Bar en estado maduro

SELECCIÓN Inspección visual

LAVADO Y DESINFECCIÓN Tanques de cemento, inmersión en agua

potable, Cn=80 ppm ácido peracético, t=5 min

DESPULPADO Despulpadora, una etapa,

tamiz de 3 mm de apertura, R=85%

TRATAMIENTO TÉRMICO Marmita de vapor, agitación mecánica,

T=63,0 °C, t=30 min

Frutas con daño mecánico,

microbiológico y otros defectos

Cáscaras y semillas

TRATAMIENTO ENZIMÁTICO Marmita de vapor, agitación mecánica, Cn=100 ppm enzima, T=37 ºC, t=1 h

PRENSADO Hidroprensa, P=3-4 bar, t=5 min, R=91%

Jugo prensado de guayaba (MP para elaboración de jaleas)

Torta de prensado (SG)

Preparado enzimático (Pectinex Ultra SP-L)

ALMACENAMIENTO Baldes plásticos, cámara de congelación,

T= -20 ºC

Figura 14. Diagrama de bloques del proceso seguido por la empresa Ujarrás, S.A.

para la elaboración de jugo prensado de guayaba

Figura 15. Fotografía del subproducto de guayaba utilizado en el estudio.

44

4.3. Metodología

4.3.1. Tratamiento, estabilización y muestreo del subproducto de guayaba

El SG se recolectó en un día convencional de producción de jaleas, en el cual se prensaron

200 kg de pulpa de guayaba, en cinco tandas de 40 kg, pues esa era la capacidad máxima de la

hidroprensa. En total se produjeron y recolectaron 18,0 kg de SG que, debido a la heterogeneidad

en el contenido de humedad entre tandas, fue inmediatamente homogeneizado en una amasadora

industrial HL-17010TK (Dynasty, Taiwán) durante 20 min (ver Figura 16.a.).

Posteriormente, en el mismo día de la recolección, el SG se empacó en bolsas metalizadas

previamente numeradas y con una cantidad de 100 g de SG por bolsa (ver Figura 16.b.). Todas las

bolsas se sellaron aplicando calor y un vacío de 25 in Hg en una selladora J-Y005 (New Diamond

Vac, Taiwán) (ver Figura 16.c.).

Figura 16. Tratamiento del SG: a) homogeneización, b) empaque y c) sellado al vacío.

Para realizar la caracterización fisicoquímica de la materia prima, se tomaron bolsas de manera

aleatoria y se almacenaron en un ultra-congelador a -80 ºC hasta el momento de su análisis. Las

bolsas restantes, se almacenaron en cámara de congelación a -20 °C para su utilización en pruebas

preliminares y en los ensayos de extracción definitivos del objetivo 1 al 3. La distribución del uso

que se le dio a la totalidad del lote de SG se muestra en el Cuadro IV.

Es importante mencionar que una vez finalizados los ensayos de extracción del objetivo 3, las

bolsas con SG que se encontraban en la cámara de congelación fueron accidentalmente descartadas,

sin haber realizados los ensayos correspondientes al objetivo 4. Debido a esto, se recolectó un

segundo lote de 3,6 kg de SG, que resultó del prensado de una tanda de 40 kg de pulpa de guayaba.

Este segundo lote fue homogeneizado, empacado, sellado y numerado siguiendo el mismo

procedimiento descrito para el primer lote.

Para realizar la caracterización fisicoquímica del segundo lote, se tomaron bolsas de manera

aleatoria y se almacenaron en un ultra-congelador a -80 ºC hasta el momento de su análisis. Las

a b c

45

bolsas restantes, se almacenaron en cámara de congelación a -20 °C para su utilización en los

ensayos de extracción definitivos del objetivo 4. La distribución del uso que se le dio a la totalidad

del lote de SG se muestra en el Cuadro V.

Cuadro IV. Distribución de la utilización del primer lote de SG recolectado.

Temperatura

almacenamiento de

SG (°C)

Tiempo

almacenamiento de

SG (meses)

Etapa de trabajo

experimental

Bolsas de 100 g

(unidades)

Masa

(kg)

-20 2 Pruebas preliminares 15 1,5

-50 31 Caracterización1 102 1,0

-20 4 Objetivo 1 25 2,5

-20 6 Objetivo 2 9 0,9

-20 8 Objetivo 3 60 6,0

Cantidad utilizada: 119 11,9

Descartado accidentalmente: 61 6,1

Cantidad inicial del lote: 180 18,0 1Excepto el contenido de polifenoles totales, que se determinó a los 8 meses, después de obtener las

condiciones óptimas de extracción en reactor. 2Se utilizó una bolsa diferente para cada análisis de la caracterización.

Cuadro V. Distribución de la utilización del segundo lote de SG recolectado.

Tiempo almacenamiento

de SG a -20 ºC (meses)

Etapa de trabajo

experimental

Bolsas de 100 g

(unidades)

Masa

(kg)

1 Caracterización 21 0,2

1 Objetivo 4 9 0,9

Cantidad utilizada: 11 1,1

Sobrante: 25 2,5

Cantidad inicial del lote: 36 3,6 1Se utilizó una bolsa diferente para cada análisis de la caracterización.

Antes de tomar muestras de SG para pruebas preliminares, mediciones de caracterización y

ensayos definitivos de extracción, se utilizó el generador de número aleatorios de una calculadora

científica fx-991LA PLUS (Casio, Japón), para determinar el número de bolsa a utilizar.

4.3.2. Caracterización fisicoquímica del subproducto de guayaba

Procedimiento

Con el doble propósito de cuantificar el contenido inicial de los compuestos de interés en el

SG y de obtener información que permita explicar el efecto de la matriz sobre el proceso de

extracción, se realizó una caracterización fisicoquímica del SG del primer lote; esta incluyó un

46

análisis proximal: determinación de humedad, fibra dietética, proteína, cenizas y grasa; así como

la medición de los siguientes parámetros adicionales: acidez titulable, polifenoles totales, vitamina

C, carotenoides totales, sólidos solubles y pH.

Las variables del análisis proximal se determinaron por duplicado utilizando los servicios

analíticos del Laboratorio de Química del CITA; contrario a los parámetros adicionales que se

determinaron por triplicado. Para cada análisis se utilizó una bolsa diferente, de las diez tomadas

aleatoriamente del primer lote de SG, excepto para acidez y pH, para los cuales se aprovechó una

misma bolsa.

Para el segundo lote de SG, utilizado en los ensayos del objetivo 4, se determinó únicamente

el contenido de humedad y de polifenoles totales, ambos por triplicado. Lo anterior, se debe a que

estos eran los únicos parámetros que podían variar considerablemente entre lotes de SG, teniendo

repercusiones importantes sobre las conclusiones que derivasen de los resultados de ese objetivo.

Para cada análisis se utilizó una bolsa diferente.

En todos los casos, las muestras se manejaron de la misma forma: se almacenaron en ultra-

congelador a -80 ºC, y luego se descongelaron en un baño de agua a 50 ºC, antes de ser analizadas.

Los métodos químicos y fórmulas utilizadas para determinar cada variable de la caracterización se

describen y especifican en el Apartado 4.4.1.

Análisis estadístico

Para cada medición, se reporta la mediana de las réplicas realizadas y la desviación estándar

correspondiente. Para el control de réplicas se calculó el coeficiente de variación, el cual debía ser

inferior al 10% para aceptar el análisis. Estos valores se calcularon utilizando el programa Excel

2016 (Microsoft®, Estados Unidos).

4.3.3. Determinación de la relación sólido-líquido

Diseño experimental

Antes de realizar la optimización de la extracción batch de polifenoles a partir del SG, se deben

prefijar una serie de variables, entre ellas, la relación en masa sólido-líquido (S:L). Para ello, se

utilizó un diseño irrestricto aleatorio unifactorial con cinco niveles o tratamientos, tal y como se

muestra en el Cuadro VI.

Cuadro VI. Diseño irrestricto aleatorio unifactorial para seleccionar la mejor S:L a utilizar en la

extracción batch de polifenoles a partir de un SG.

Factor Relación sólido-líquido S:L (MSG:MD)

Niveles o tratamientos 1:5 1:8 1:10 1:15 1:20

47

Respecto a la escogencia de los niveles, la menor S:L se determinó según pruebas preliminares

y corresponde al valor mínimo en el que se obtuvo una mezcla de consistencia agitable. Por otro

lado, la velocidad de agitación escogida (Vag) fue de 450 rpm y corresponde al valor que permitía

mantener todos los sólidos en suspensión para la mínima S:L escogida.

La S:L correspondiente al tratamiento número tres, fue escogida debido a que es una

proporción comúnmente utilizada para la extracción sólido-líquido de polifenoles en diversas frutas

(Kong et al., 2010; Chavan & Singhal, 2013; Roopchand et al., 2013). De igual forma, el último

tratamiento se escogió para tener dos S:L por encima de la esperada como óptima.

Las variables respuestas empleadas fueron: la concentración de polifenoles totales (𝐶𝑛𝑃𝑇𝑠) en

el extracto de guayaba (EG) y los polifenoles totales extraídos en base seca (𝑃𝑇𝑠𝑒). Los métodos

químicos y fórmulas utilizadas para determinar cada variable se describen y especifican en el

Apartado 4.4.2.

Las bolsas metalizadas con 100 g de SG fueron las unidades experimentales empleadas. Se

efectuaron cinco repeticiones y, para cada tratamiento, las bolsas fueron seleccionadas de manera

aleatoria.

Procedimiento

Los tratamientos descritos en el Cuadro VI son de corridas de extracción, en las cuales se

varió el factor S:L y se mantuvieron constantes las variables detalladas en el Cuadro VII.

Cuadro VII. Condiciones fijas utilizadas durante las corridas de extracción para seleccionar la S:L

a utilizar en la extracción batch de polifenoles totales a partir del SG.

Velocidad de

agitación

Vag (rpm)

Tiempo de

extracción

te (h)

Potencial de

hidrógeno pH

Temperatura

T (ºC)

Concentración de

etanol en disolvente

%EtOH (m/m)

450 2,0 4,50 47,5 62,5

El tiempo se seleccionó con base en los resultados obtenidos por Pompeu et al. (2009), donde

empleó un tiempo de 3 h para llegar al equilibrio de extracción de polifenoles a partir de frutos

enteros de açaí (condiciones de extracción: S:L=1:4; sin agitación; pH=1,40; T=45 ºC y

%EtOH=50). Se tomó un tiempo menor porque los ensayos del presente estudio se realizaban con

una matriz de menor tamaño de partícula, con agitación, a mayores S:L y a mayor temperatura.

El resto de los valores anteriores corresponden a las condiciones del punto central del Diseño

Central Compuesto Rotable (DCCR) que se utilizó en la etapa de optimización del objetivo 3 (ver

Apartado 4.3.5, Cuadro XV).

El proceso seguido para las corridas de extracción y la obtención de los EGs se muestra en la

Figura 17. Todos los tratamientos fueron ejecutados el mismo día y se realizaron en dos grupos:

48

primero tres y luego dos, con un desfase de 15 min entre las corridas de extracción de cada

tratamiento del grupo. Los turnos de cada tratamiento fueron seleccionados de forma aleatoria.

El proceso iniciaba con la descongelación de las bolsas de SG, 25 min antes de la extracción,

introduciéndolas en un baño de agua a 50 °C. Posteriormente, se preparó la masa total de disolvente

necesaria para las corridas del día, como se indica en el Cuadro VIII. La cantidad de disolvente

total era almacenada en botellas de HDPE de 1 L, con tapa, para minimizar la evaporación del

etanol.

Cuadro VIII. Mediciones de masa para preparar la cantidad de disolvente (%EtOH=62,5 m/m)

necesaria para realizar las corridas de extracción de los cinco tratamientos.

Masa total de disolvente

MD total (g)

Masa de etanol

MEtOH 95%m/m (g)

Masa de agua

MH2O (g)

1 200,00 789,47 410,53

Una vez preparado el disolvente, se midió la masa de SG (MSG) y MD para cumplir la S:L

correspondiente al tratamiento. La MSG se midió directamente dentro del balón de fondo plano y la

Subproducto de guayaba

(SG)

DESCONGELACIÓN Baño de agua, T=50 °C, t=25 min

EXTRACCIÓN Sistema de balones, S:L=variable,

Vag

=450 rpm, pH=4,50, T=47,5 ºC, t=2,0 h

FILTRACIÓN Embudo Büchner y Kitasato acoplado a bomba

de vacío, t=5 min

Extracto de guayaba

(EG)

Disolvente (D)

%EtOH=62,5 m/m

Torta de filtración

(TF)

ALMACENAMIENTO Botella ámbar, congelador, T= -80 ºC/ 5 ºC*

Figura 17. Diagrama de bloques para la realización de las corridas de extracción y la

obtención de los EGs (*T de almacenamiento depende del análisis fisicoquímico).

49

cantidad de disolvente, para los tratamientos individuales, era medida y almacenada en botellas de

HDPE de 250 mL con tapa, a las cuales se les añadió ácido clorhídrico 1 M, para obtener un

pH=4,50 en la mezcla de extracción (m) (ver Cuadro IX).

Cuadro IX. Detalle de preparación de los niveles de S:L definidos para las corridas de extracción

y corroboración del volumen total de la mezcla.

Relación

sólido-líquido

S:L (MSG:MD)

Mediciones para satisfacer S:L Volumen total

de la mezcla2

Vm total (mL)

Masa de

disolvente

MD (g)

Volumen de HCl1

VHCl (µL)

Masa de

subproducto

MSG (g)

Masa total

de la mezcla

Mm total (g)

1:5 208,33 800 41,67 250,00 284

1:8 222,22 800 27,78 250,00 286

1:10 227,27 600 22,73 250,00 287

1:15 234,38 400 15,63 250,00 288

1:20 238,10 350 11,90 250,00 289

1Los VHCl de cada tratamiento fueron estimados en pruebas preliminares, en las cuales se valoró con HCl 1 mol/L, una

mezcla con las mismas masas de D y SG indicadas en el cuadro, hasta llevarlas a un pH=4,50. 2Estimado con el valor

de densidad de una mezcla etanol-agua al 62,5% y 49 ºC (ρ=0,86 g/mL valor obtenido de: Petong et al., 2000 y Perry

et al., 1997) y asumiendo que el volumen total de la mezcla es la suma del VD y la MSG.

Es importante notar del cuadro anterior, que se trabajó con una masa de mezcla de extracción

constante para todos los tratamientos y que los volúmenes totales de mezcla también eran muy

similares entre sí, variando en no más de 2 %.

En las corridas de extracción batch se utilizó un sistema compuesto por balones esmerilados

24/40 de 500 mL con fondo plano, unidos a condensadores, y a su vez sumergidos en baños de

agua calentados por plantillas eléctricas PC-420D (Corning, Estados Unidos) (ver Figura18..a),

con sistema de agitación magnético. Se utilizó una pastilla de 3 cm dentro de cada balón. Los

condensadores se acoplaron en serie y como refrigerante se utilizó agua suavizada a temperatura

ambiente, la cual era recirculada con recirculador de inmersión (HAAKE, Alemania).

Figura 18. Fotografías del sistema utilizado para realizar las corridas de extracción: a) Sistema de

extracción con balones y b) baño para recirculación del agua refrigerante.

50

Para realizar la corrida, se calentó el baño de agua a 50-51 ºC, se acopló el balón de fondo

plano (con SG y pastilla de agitación) al condensador y se introdujeron en el baño. Inmediatamente,

se añadió el disolvente acidificado por el extremo superior del condensador, con ayuda de un

embudo plástico, se encendió el sistema de agitación, se llevó a la Vag fijada y se empezó a tomar

el tiempo en cronómetro. Es importante indicar que el sistema alcanzó en menos de medio minuto

la temperatura de trabajo, la cual era medida en la pared del balón con un termómetro de alcohol

(0 a 100 ºC). La T se monitoreó cada 10 min y se mantuvo constante, aumentando la potencia de

calentamiento de la plantilla o añadiendo hielo al baño de agua.

Una vez transcurridos los 15 min de extracción, se iniciaba la corrida del segundo tratamiento

y así sucesivamente hasta completar los tratamientos del grupo. Al finalizar el tiempo de

extracción, se retiró el balón del condensador y se filtró el extracto al vacío con un embudo Büchner

y papel filtro Whatman Nº 4. El EG se recolectó en un Kitasato, inmerso en un baño de agua con

hielo (ver Figura 19).

Figura 19. Sistema de filtración utilizado para la separación del EG de la mezcla de extracción:

a) Trampa de vacío y Kitasato y b) Filtración de la mezcla al culminar la extracción.

Posteriormente, se determinó la masa del EG (MEG) obtenida, y se llenó una botella de vidrio

ámbar de 30 mL que se almacenó en un ultra-congelador, hasta el día siguiente, para la

determinación de la 𝐶𝑛𝑃𝑇𝑠. Otra parte del extracto se colocó en una botella ámbar de 250 mL que

se almacenó en refrigeración, hasta el día siguiente, para determinar su densidad (ρEG). El sobrante,

se almacenó en viales de 30 mL que se temperaron y se utilizaron para comprobar que el EG tuviera

un pH=4,50.

Los métodos para la medición de la 𝐶𝑛𝑃𝑇𝑠 y la ρEG, así como el cálculo de las dos variables

respuesta del diseño experimental: concentración de polifenoles totales en el extracto (𝐶𝑛𝑃𝑇𝑠) y

los polifenoles totales extraídos en base seca (𝑃𝑇𝑠𝑒), se muestra con detalle en el Apartado 4.4.2.

51


El cálculo de las variables respuesta, a partir de los datos experimentales, se realizó en el

programa Excel 2016 (Microsoft®, Estados Unidos). Por otro lado, el tratamiento estadístico de

los datos se realizó con el programa estadístico JMP 13© (SAS Institute Inc., Inglaterra).

Para ambas variables se comprobaron los supuestos del ANDEVA mediante la Prueba de

Shapiro-Wilk (normalidad) y la Prueba de Levene (igualdad de varianzas). Posteriormente, para la

𝐶𝑛𝑃𝑇𝑠 se realizó un ANDEVA y una prueba de Tukey para identificar cuáles promedios eran

diferentes (p<0,05). Debido a que la variable 𝑃𝑇𝑠𝑒 evidenció la existencia de heterocedasticidad

entre los grupos, se realizó un ANDEVA de Welch y, como comparación múltiple, se utilizó la

prueba de Games-Howell.

4.3.4. Establecimiento del tiempo de proceso


Es importante aclarar que, según los resultados del objetivo anterior, se obtuvieron dos S:L

promisorias: la 1:15, que extrae una mayor cantidad de polifenoles por gramo de SG en base seca,

y la 1:5, que si bien extrae 9 % menos polifenoles por gramo de SG respecto a la anterior, permite

obtener extractos 60 % más concentrados y ello facilitaría la concentración posterior del EG.

Por lo anterior, se decidió definir el tiempo de extracción para ambas relaciones, de manera

que este parámetro no solo sirviera para prefijar cuánto durarían las corridas de extracción batch

de la etapa de optimización, sino que también fuera un criterio de decisión para escoger entre ambas

relaciones.

Se realizaron cinéticas de extracción, con el tiempo como variable independiente, para

determinar la duración de la extracción batch de polifenoles totales para las dos S:L de interés. El

tiempo total de duración de las corridas fue de 8 h (480 min) y se midieron mínimo dieciséis puntos

experimentales para la construcción de cada cinética (ver Cuadro X).

Cuadro X. Diseño de la toma de muestras para la construcción de las cinéticas, necesarias para la

selección del tiempo a utilizar durante la extracción batch de polifenoles totales a partir del SG.

Punto experimental 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

Tiempo te (min) 0 10 20 30 40 50 60 70 80 110 140 200 260 320 370 480

La cantidad de puntos experimentales, y los tiempos de extracción ( 𝑡𝑒 ) evaluados, se

escogieron según los resultados de las cinéticas realizadas por Pompeu et al. (2009). Por otro lado,

la duración total de las corridas se definió según la metodología propuesta por Kamran et al. (2010)

52

La variable respuesta o dependiente utilizada fue la concentración de polifenoles totales

(𝐶𝑛𝑃𝑇𝑠). El método químico y fórmula utilizada para determinarla se describe y especifica en el

Apartado 4.4.3.

Las bolsas metalizadas con 100 g de SG fueron las unidades experimentales empleadas. Para

realizar las cinéticas de la S:L 1:5 se utilizaron tres bolsas y para las de la S:L 1:15, únicamente

una bolsa. Se efectuaron dos repeticiones por cada tratamiento, y las bolsas fueron seleccionadas

de manera aleatoria.

Procedimiento

Para obtener las cinéticas descritas en el Cuadro X se realizaron corridas de extracción, en las

que se tomaron muestras a diferentes tiempos, y se mantuvo constante las variables detalladas en

el Cuadro XI.

Cuadro XI. Condiciones fijas utilizadas durante las corridas de extracción para seleccionar el

tiempo a utilizar en la extracción batch de polifenoles totales a partir del SG.

Velocidad de

agitación

Vag (rpm)

Relación

sólido-líquido

S:L (MSG:MD)

Potencial de

hidrógeno pH

Temperatura

T (ºC)

Concentración de

etanol en disolvente

%EtOH (m/m)

450 1:5 4,50 47,5 62,5

450 1:15 4,50 47,5 62,5

Las S:L, se seleccionaron con base en los resultados obtenidos en el objetivo 1. El resto de los

valores corresponden a las condiciones del punto central del DCCR que se utilizó en la etapa de

optimización del objetivo 3 (ver Apartado 4.3.5, Cuadro XV).

El proceso seguido en las corridas de extracción y la obtención de los extractos de guayaba

(EG) se muestra en la Figura 20. Debido a la larga duración, cada corrida se realizó un día

diferente.

El proceso inició con la descongelación de las bolsas de SG, 25 min antes de la extracción,

introduciéndolas en un baño de agua a 50 °C. Se utilizaron tres bolsas de SG para las corridas 1:5

y solo una para las corridas 1:15. Posteriormente, se preparó la MD necesaria para la corrida del

día, tal y como se indica en el Cuadro XII. El disolvente era preparado y almacenado en botellas

de HDPE de 1 L, con tapa, para minimizar la evaporación del etanol.

Una vez preparado el disolvente, se midió la cantidad de MSG en un beaker de 600 mL, tal que

se cumpliera con la S:L correspondiente (ver Cuadro XII) . En el caso de las corridas a 1:5, el

contenido de las tres bolsas de SG era mezclado previamente.

53

Figura 20. Diagrama de bloques para la realización de las corridas de extracción y la obtención

de los EGs correspondientes al objetivo 2.

Cuadro XII. Detalle de preparación del disolvente y de las S:L en las corridas de extracción y

corroboración del volumen total de la mezcla.

Relación

sólido-líquido

S:L (MSG:MD)

Mediciones para satisfacer

%EtOH=62,5 % m/m Mediciones para satisfacer S:L

Volumen total

de la mezcla1

Vm total (L) Masa de etanol

MEtOH 95%m/m (g)

Masa

de agua

MH2O (g)

Masa de

disolvente

MD (g)

Masa de

subproducto

MSG (g)

Masa total

de la mezcla

Mm total (g)

1:5 877,19 456,14 1 333,33 266,67 1 600,00 1,82

1:15 986,84 513,16 1 500,00 100,00 1 600,00 1,84

1Estimado con el valor de densidad de una mezcla etanol-agua al 62,5 % y 49 ºC (ρ=0,86 g/mL, valor obtenido de:

Petong et al., 2000 y Perry et al., 1997) y asumiendo que el volumen total de la mezcla es la suma del VD y la MSG.


(SG)


EXTRACCIÓN Reactor, agitador de doble turbina,

S:L=variable, Vag

=450 rpm, pH=4,50,

T=47,5 ºC, t=8,0 h

FILTRACIÓN Jeringa 5 mL acoplada a filtro

de celulosa regenerada de 0,45 µm

Extracto de guayaba

(EG)

Disolvente (D)

%EtOH=62,5 m/m

Sólidos finos

ALMACENAMIENTO Tubos Eppendorf de 2 mL, bolsa metalizada,

congelador, T= -80 ºC

CENTRIFUGACIÓN Microcentrífuga, v

c=10 000 rpm, t=2 min

Sólidos insolubles

(TC)

54

Es importante notar en el cuadro anterior, que se trabajó con una masa de mezcla de extracción

constante y que los volúmenes totales de mezcla también fueron muy similares entre sí, variando

en tan sólo 1 %.

En las corridas de extracción batch se utilizó un reactor BioFlo® 110 (New Brunswick

Scientific, Estados Unidos), con un tanque de 2 L de capacidad, cuyas dimensiones se muestran en

la Figura 21 y en el Cuadro XIII.

Figura 21. Dimensiones del tanque agitado utilizado para la extracción batch de polifenoles a partir

de un subproducto de guayaba.

Cuadro XIII. Razones geométricas del reactor utilizado para la extracción batch de polifenoles a

partir de un subproducto de guayaba.

Razón geométrica Rango típico Reactor

H/T 1,0 – 3,0 1,2

D/T 0,25 – 0,66 0,47

C/T 0,25 – 0,50 0,34

C/D ~ 1,0 0,71

ND N.A. 6 x 2

N.A: No aplica, ND: número de hojas en el agitador.

Se utilizaron los siguientes accesorios para armar el sistema de extracción: un medidor de

temperatura acoplado a una chaqueta de calentamiento eléctrica, un agitador de doble turbina con

D

W

T

H

C

Dimensiones

D= 5,9 cm

T= 12,5 cm

H= 15,0 cm

C=4,2 cm

W=2,0 cm

55

motor, un medidor de pH (pHmetro) y un condensador acoplado a un recirculador con

mantenimiento de temperatura; este último, utilizaba agua destilada a 20 ºC como refrigerante para

el condensador. En el Cuadro XIV se ofrecen más detalles acerca de los accesorios utilizados, y

en la Figura 22, un esquema de todo el sistema.

Cuadro XIV. Descripción de los accesorios del reactor, utilizado para la extracción batch de los

polifenoles totales, en las corridas correspondientes al objetivo 2.

Accesorio Modelo Marca Características

Chaqueta de calentamiento R05171A2 D1529 HI-HEAT IND.MT 120/240 V; 150 W

Motor del agitador C21-L400X Magmotor Corporation

Medidor de pH 405-DPAS-SC-K8S/225 Mettler Toledo pH: 0,0-12,0; T:0-130 °C

Recirculador LS5 PolyScience T: -20-40 ºC

En cada corrida, se llenó el recirculador con agua destilada hasta el nivel adecuado, se

removieron las prensas en las mangueras de entrada y salida del condensador, y se prendió el

recirculador para ir enfriando el agua a 20 ºC. Posteriormente, se aseguró que la MSG se encontrase

a 25 ºC, se introdujo en el tanque del reactor y se atornilló la tapa, en cruz, con ayuda de arandelas

y tuercas.

Luego, se prendió la unidad de control, se conectó del pHmetro y se calibró con el buffer de

pH=4, previamente temperado a 25 ºC. Una vez finalizada la calibración, se atornilló este

instrumento en el agujero correspondiente. Posteriormente, se conectó y se introdujo el sensor de

temperatura en su receptáculo, previamente lleno con agua destilada, seguido del motor del

agitador y la chaqueta de calentamiento.

Por último, se especificaron los valores de Vag y T en el panel de control (ver Cuadro XI), se

precalentó la MD a 45 ºC, se añadió la MD al reactor con ayuda de un embudo e inmediatamente

después, se cerró el orificio. Luego de esto, se encendió el agitador, el control de T y se inició el

conteo del tiempo. Inmediatamente después, se procedió a regular manualmente el pH, añadiendo

HCl o NaOH 2 M con un gotero, por el orificio destinado para tal fin. Durante el resto de la corrida,

todos los agujeros se mantuvieron cerrados con tuercas y empaques para evitar la evaporación del

etanol en el disolvente.

Es importante mencionar que el sistema alcanzó la T de trabajo en menos de 25 min (tiempo

de inducción). El pH se monitoreó y se reguló (cuando fue necesario) cada 30 min.

56


polifenoles totales

Durante la corrida, cada vez que el cronómetro indicó los tiempos señalados en el Cuadro X,

se procedió a tomar una muestra de la mezcla de extracción.

Antes de tomar la muestra, se enjuagó la manguera succionando mezcla por la jeringa de 30

mL y devolviendo el contenido al interior del reactor. Luego, se extrajeron 10 mL de mezcla, se

recolectaron en un beaker de 50 mL y se anotó el tiempo exacto en el que la muestra fue tomada

(estos fueron los tiempos que se utilizaron para la construcción de las curvas). El contenido de la

manguera fue devuelto al reactor inyectando aire con la jeringa.

Con el contenido del beaker, se llenaron 5 tubos Eppendorf de 2 mL y se centrifugaron en una

centrífuga mini Spin plus (Eppendorf, Alemania), por 2 min a 10 000 rpm. Luego, se tomó el

sobrenadante con pipeta Pasteur y se trasvasó a una jeringa de 5 mL, acoplada a un filtro de celulosa

regenerada de 0,45 µm; con ayuda del émbolo de la jeringa, se filtró el sobrenadante y los filtrados

se recolectaron en otros 3 tubos Eppendorf de 2 mL.

Por último, se rotularon los tubos con el tiempo correspondiente, y se introdujeron en una bolsa

metalizada que se almacenó en un ultra-congelador hasta el momento del análisis, el cual se realizó

en los dos días posteriores a la corrida. El cálculo de la variable respuesta (𝐶𝑛𝑃𝑇𝑠), a partir de los

datos experimentales, se muestra con detalle en el Apartado 4.4.3.

57



programa Excel 2016 (Microsoft®, Estados Unidos).

Con el programa estadístico SigmaPlot 12 (Systat Software Inc., Estados Unidos), se graficó

la variable 𝐶𝑛𝑃𝑇𝑠 en función del 𝑡𝑒 para ambas repeticiones y se les realizó una regresión no lineal

a las dos repeticiones en conjunto. Se utilizó un modelo de incremento exponencial con dos

parámetros, los cuales son: la concentración de polifenoles en el equilibrio ( 𝑪𝒏𝑷𝑻𝒔∞ ) y la

constante de rapidez de extracción (𝒌). El modelo utilizado se representa en la Ecuación (1.

𝐶𝑛𝑃𝑇𝑠 = 𝑪𝒏𝑷𝑻𝒔∞ ∙ (1 − 𝑒−𝒌∙𝑡𝑒) (1)

Después de obtener el valor de los parámetros 𝑪𝒏𝑷𝑻𝒔∞ y 𝒌, se evaluó la bondad del ajuste

por medio del coeficiente de determinación ajustado (R2-adj) y la probabilidad del modelo (pmodelo).

Además, se obtuvo la curva de regresión con sus respectivos intervalos de confianza (IC) y

predicción (IP). Finalmente, para calcular el tiempo de extracción, se definió que 𝑛 es la fracción

que se desea extraer de 𝐶𝑛𝑃𝑇𝑠∞, y por ende, 𝐶𝑛𝑃𝑇𝑠 se describió mediante la expresión descrita

por la Ecuación (2.

𝐶𝑛𝑃𝑇𝑠 = 𝑛 ∙ 𝐶𝑛𝑃𝑇𝑠∞ (2)

Al sustituir la Ecuación (2 en (1, linealizarla y despejar 𝑡𝑒, se obtuvo una fórmula que permitía

obtener un 𝑡𝑒 para diferentes valores de 𝑛 (ver Ecuación (3).

𝑡𝑒 =− ln(1 − 𝑛)

𝑘 (3)

En el programa Excel 2016 (Microsoft®, Estados Unidos), se calculó el tiempo de extracción

a utilizar en las corridas del objetivo 3, para ello se prefijaron diferentes valores de 𝑛 en el intervalo

de 0 a 1 y se graficaron en función del 𝑡𝑒 obtenido con la Ecuación (3. Se escogió, de forma

cualitativa, el tiempo en que los valores de 𝑛 empezaron a mostrar un comportamiento asintótico

en el gráfico.

Por último, se obtuvo la diferencia entre los tiempos de extracción para ambas S:L; como la

diferencia era muy baja a nivel práctico, se decidió utilizar la S:L 1:5 con su respectivo 𝑡𝑒, para

realizar las corridas correspondientes al objetivo 3.

Después de haber definido el tiempo de extracción, como análisis adicional, se decidió realizar

una segunda regresión no lineal a las dos repeticiones en conjunto. En esta ocasión, se utilizó un

modelo de incremento exponencial con cuatro parámetros, el cual se representa en la Ecuación (4).

(4)

𝐶𝑛𝑃𝑇𝑠 = 𝑪𝒏𝑷𝑻𝑺∞𝟏 ∙ (1 − 𝑒−𝒌𝟏∙𝑡𝑒)+ 𝑪𝒏𝑷𝑻𝑺∞𝟐 ∙ (1 − 𝑒−𝒌𝟐∙𝑡𝑒)

58

Nótese que este modelo contempla dos 𝑪𝒏𝑷𝑻𝒔∞ y dos 𝒌. Después de obtener el valor de estos

parámetros, se evaluó la bondad del ajuste y se obtuvo la curva de regresión tal y como se describió

para el modelo anterior. A partir de los datos anteriores, se concluyó que este modelo se ajustaba

mejor a los datos experimentales y se procedió a determinar qué valores de 𝑛 permitía obtener este

modelo si se utilizaban los tiempos de extracción previamente definidos.

Para lo anterior, se definió la 𝐶𝑛𝑃𝑇𝑠 en términos del parámetro 𝑛 como indica la Ecuación (5)

y se sustituyó en la Ecuación (4), obteniendo la expresión de la Ecuación (6), la cual fue utilizada

para el cálculo de 𝑛 a partir del tiempo.

𝐶𝑛𝑃𝑇𝑠 = 𝑛 ∙ (𝐶𝑛𝑃𝑇𝑠∞1 + 𝐶𝑛𝑃𝑇𝑠∞2) (5)

𝑛 =𝐶𝑛𝑃𝑇𝑆∞1 ∙ (1 − 𝑒−𝑘1∙𝑡𝑒) + 𝐶𝑛𝑃𝑇𝑆∞2 ∙ (1 − 𝑒−𝑘2∙𝑡𝑒)

𝐶𝑛𝑃𝑇𝑆∞1 + 𝐶𝑛𝑃𝑇𝑆∞2

(6)

Los cálculos anteriores se realizaron en el programa Excel 2016 (Microsoft®, Estados Unidos).

4.3.5. Optimización del proceso de extracción


Una vez definidas las variables S:L y 𝑡𝑒, se procedió a determinar los rangos de potencial de

hidrógeno (pH), temperatura (T) y concentración de etanol en el disolvente (%EtOH), que

maximizaran la extracción batch de los polifenoles y carotenoides totales presentes en el SG. Para

ello, se utilizó la metodología de superficie de respuesta, específicamente, un Diseño Central

Compuesto Rotable (DCCR), cuya rotabilidad estuvo dada por un α=1,682.

El diseño contempló tres factores (K) o variables independientes: pH (2-7), T (30-65 ºC) y

%EtOH (30-70 m/m). Cada factor se trabajó con cinco niveles, tal y como se representa en el

Cuadro XV.

Cuadro XV. Variables independientes y niveles del DCCR utilizados para la optimización de la

extracción batch de polifenoles y carotenoides a partir del SG.

Factores

K

Niveles codificados

-1,68 -1,00 0,00 +1,00 +1,68

Niveles naturales

Potencial de hidrógeno pH 2,00 3,01 4,50 5,99 7,00

Temperatura T (ºC) 30,0 37,1 47,5 57,9 65,0

Concentración de etanol %EtOH (m/m) 30,0 43,2 62,5 81,8 95,0

59

Los rangos de las variables independientes se definieron según rangos comúnmente

utilizados en diversos artículos científicos de extracción de compuestos fenólicos y carotenoides,

a partir de frutas y matrices vegetales (Ghafoor et al., 2009; Pompeu et al., 2009; Kong et al.,

2010a; Chavan y Singhal, 2013; Roopchand et al., 2013).

El límite superior de T es la máxima temperatura que se puede trabajar en el reactor y el

límite superior de %EtOH corresponde a la máxima concentración en el etanol comercial de grado

alimentario. Debido a las dos limitantes anteriormente mencionadas, se fijaron los puntos axiales

del diseño, para evitar trabajar con condiciones que excedieran estos límites.

Se determinaron tres variables respuesta: concentración de polifenoles totales ( 𝐶𝑛𝑃𝑇𝑠 ),

concentración de carotenoides totales (𝐶𝑛𝑃𝑇𝑠) y turbidez (𝑇𝑏); donde se buscaba maximizar las

primeras dos y minimizar la última. Los métodos y fórmulas utilizados para determinar cada

variable se describen y especifican en el Apartado 4.4.4. Las bolsas metalizadas con 100 g de SG

fueron las unidades experimentales. Para realizar cada ensayo se utilizaron tres bolsas

seleccionadas de manera aleatoria.

El diseño contempló la realización de un total de veinte ensayos o corridas experimentales (N),

constituidas por ocho puntos factoriales (2K), seis puntos axiales (2K) y seis repeticiones en el

punto central (n0) para tener un diseño de precisión uniforme. Las condiciones de las corridas del

diseño experimental completo, de tres factores con cinco niveles, se muestra en el Cuadro XVI.

Los ensayos se realizaron en orden aleatorio.

60

Cuadro XVI. Condiciones de las corridas experimentales del DCCR, necesarias para la

optimización de la extracción batch de polifenoles y carotenoides a partir del SG.

Ensayo Orden

aleatorio

Factores K

Potencial de hidrógeno

pH

Temperatura

T (ºC)

Concentración de etanol

%EtOH (m/m)

1 2 3,01 (-1) 37,1 (-1) 43,2 (-1)

2 8 3,01 (-1) 37,1 (-1) 81,8 (+1)

3 1 3,01 (-1) 57,9 (+1) 43,2 (-1)

4 14 3,01 (-1) 57,9 (+1) 81,8 (+1)

5 17 5,99 (+1) 37,1 (-1) 43,2 (-1)

6 5 5,99 (+1) 37,1 (-1) 81,8 (+1)

7 16 5,99 (+1) 57,9 (+1) 43,2 (-1)

8 3 5,99 (+1) 57,9 (+1) 81,8 (+1)

9 15 2,00 (-1,68) 47,5 (0) 62,5 (0)

10 6 7,00 (+1,68) 47,5 (0) 62,5 (0)

11 12 4,50 (0) 30,0 (-1,68) 62,5 (0)

12 13 4,50 (0) 65,0 (+1,68) 62,5 (0)

13 9 4,50 (0) 47,5 (0) 30,0 (-1,68)

14 10 4,50 (0) 47,5 (0) 95,0 (+1,68)

15 20 4,50 (0) 47,5 (0) 62,5 (0)

16 19 4,50 (0) 47,5 (0) 62,5 (0)

17 7 4,50 (0) 47,5 (0) 62,5 (0)

18 11 4,50 (0) 47,5 (0) 62,5 (0)

19 18 4,50 (0) 47,5 (0) 62,5 (0)

20 4 4,50 (0) 47,5 (0) 62,5 (0)

( ) Entre paréntesis se detalla el valor codificado correspondiente al valor natural.

Procedimiento

Los ensayos descritos en el Cuadro XVI involucraron la realización de corridas de extracción

a diferentes condiciones de pH, T y %EtOH, en las que se mantuvo constante las variables

detalladas en el Cuadro XVII. La Vag, como se explicó en el Apartado 4.3.3, se definió en pruebas

preliminares. Por otro lado, las variables S:L y te, se seleccionaron con base en los resultados

obtenidos en los objetivos 1 y 2.

Cuadro XVII. Condiciones fijas utilizadas durante las corridas de extracción para optimizar el pH,

T y %EtOH en la extracción batch de polifenoles y carotenoides totales a partir del SG.


S:L (MSG:MD)

Velocidad de agitación

Vag (rpm) Tiempo de extracción

te (min)

1:5 450 35

61

El proceso que se siguió para la realización de las corridas de extracción y la obtención de los

extractos de guayaba (EG) se muestra en la Figura 23. Debido a su corta duración, se realizaron

cuatro corridas por día.


los extractos de guayaba (EG).

El proceso inició con la descongelación de las tres bolsas de SG, 25 min antes de la extracción,

introduciéndolas en un baño de agua a 50 °C. Posterior a la descongelación, se mezcló el contenido

de las tres bolsas y se pesó la MSG a utilizar en un beaker de 600 mL, tal que se cumpliera con la

S:L correspondiente (ver Cuadro XVIII).

Mientras tanto, se preparó la cantidad de disolvente (D) de cada corrida del día como se indica

en el Cuadro XIX. El disolvente era preparado y almacenado en botellas de HDPE de 1 L, con

tapa para minimizar la evaporación del etanol, y rotuladas con el número de ensayo

correspondiente.


(SG)


EXTRACCIÓN Reactor, agitador de doble turbina, S:L=1:5,

Vag

=450 rpm, pH=variable,

T=variable, t=35 min

Extracto de guayaba

(EG)

Disolvente (D)

%EtOH=variable

ALMACENAMIENTO Botella ámbar, congelador, T= -80 ºC/ 5 ºC

PRENSADO Prensa hidráulica, P=419 MPa, t=3 min

Torta de prensado

(TP)

62

Cuadro XVIII. Detalle de la preparación de las S:L en las corridas de extracción.


S:L (MSG:MD)

Masa total de la mezcla

Mm total (g)

Masa de subproducto

MSG (g)

Masa de disolvente

MD (g)

1:5 1600,00 266,67 1333,33

Cuadro XIX. Detalle de la preparación del disolvente para las corridas de extracción y


Ensayo Temperatura1

T (ºC)

Concentración

de etanol1

%EtOH (m/m)

Masa de etanol

MEtOH 95%m/m

(g)

Masa de agua

MH2O (g)

Volumen total

de la mezcla2

Vm total (L)

1 37,1 43,2 605,97 727,36 1,72

2 37,1 81,8 1148,42 184,92 1,88

3 57,9 43,2 605,97 727,36 1,75

4 57,9 81,8 1148,42 184,92 1,93

5 37,1 43,2 605,97 727,36 1,72

6 37,1 81,8 1148,42 184,92 1,88

7 57,9 43,2 605,97 727,36 1,75

8 57,9 81,8 1148,42 184,92 1,93

9 47,5 62,5 877,19 456,14 1,80

10 47,5 62,5 877,19 456,14 1,80

11 30,0 62,5 877,19 456,14 1,79

12 65,0 62,5 877,19 456,14 1,81

13 47,5 30,0 421,05 912,28 1,73

14 47,5 95,0 1333,33 0,00 1,98

15-20 47,5 62,5 877,19 456,14 1,80

1Son las condiciones de los ensayos según DCCR, 2: Estimado con el valor de ρ del D al %EtOH y T indicadas en el

cuadro (valores obtenidos de: Petong et al., 2000 y Perry et al., 1997) y asumiendo que el volumen total de la mezcla

es la suma del VD y la MSG.

Es importante notar de los dos cuadros anteriores, que se trabajó con una masa de mezcla de

extracción constante. Sin embargo, los volúmenes totales de mezcla mostraron una variación de

hasta 13 %.


Scientific, Estados Unidos), el mismo descrito en el Apartado 4.3.4. El esquema del sistema

utilizado se muestra en la Figura 24 y la única variación respecto al sistema utilizado en el objetivo

2, fue la forma en extraer la mezcla del reactor.

Antes de realizar la corrida, se llenó el recirculador con agua destilada hasta el nivel adecuado,

se removió las prensas en las mangueras de entrada y salida del condensador, y se prendió el


a 25 ºC, se introdujo en el tanque del reactor y se atornilló la tapa, en cruz, con ayuda de arandelas

y tuercas.

63

Luego, se prendió la unidad de control, se conectó del pHmetro y se calibró con el buffer

correspondiente según el pH de trabajo (buffer de pH=4 si el pH <6 y buffer de pH=7 si pH≥6),

previamente temperado a 25 ºC. Una vez finalizada la calibración, se atornilló este instrumento en

el agujero correspondiente. Posteriormente, se conectó y se introdujo el sensor de temperatura en

su receptáculo, previamente lleno con agua destilada, seguido del motor del agitador y la chaqueta

de calentamiento.

Por último, se especificaron los valores de Vag y T en el panel de control (ver Cuadro XVI y

Cuadro XVII), se precalentó la MD a la T de trabajo, se añadió la MD al reactor con ayuda de un

embudo e inmediatamente después, se cerró el orificio. Luego de esto, se encendió el agitador, el

control de T y se inició el conteo del tiempo.

Inmediatamente después, se procedió a regular manualmente el pH, añadiendo HCl o NaOH

2 M con un gotero, por el orificio destinado para tal fin. Durante el resto de la corrida, todos los

agujeros se mantuvieron cerrados con tuercas y empaques para evitar la evaporación del etanol en

el disolvente.

Es importante indicar que el sistema alcanzó la T de trabajo en menos de 10 min (tiempo de

inducción). El pH se monitoreó y se reguló (cuando fue necesario) cada 5 min. Al finalizar la

corrida, se procedió a traspasar la mezcla de extracción del reactor a dos botellas ámbar de 1 L, con

ayuda de una bomba de desplazamiento positivo. Las botellas receptoras se mantuvieron

sumergidas en un baño de agua con hielo, tal y como se muestra en la Figura 10.

Para separar el EG (ver Figura 25), se colocó el contenido de ambas botellas ámbar en una

bolsa de manta, que a su vez se colocó dentro de un recipiente de metal perforado, y se aplicó una

presión de 1600 lbf (419 MPa) por 3 min cronometrados, con ayuda de una prensa hidráulica

3351-0 (Carver, Estados Unidos) y un recipiente colector de metal con salida.

El EG recogió a la salida del colector de metal con una jarra de plástico de 5 L. Luego, se

tomaron muestras del EG de la siguiente forma: se llenó un vial de 30 mL para la medición de 𝑇𝑏,

el cual se almacenó en refrigeración, y se llenaron dos botellas ámbar de 30 mL para la medición

de la 𝐶𝑛𝑃𝑇𝑠 y 𝐶𝑛𝐶𝑇𝑠, respectivamente.

Estas últimas muestras se almacenaron en un ultra-congelador hasta el momento de su

análisis. La medición de 𝑇𝑏 y 𝐶𝑛𝑃𝑇𝑠 se realizó el día después de realizar el ensayo

correspondiente. En el caso de la 𝐶𝑛𝐶𝑇𝑠, se midió un mes después de haber finalizado con todos

los ensayos del DCCR. El cálculo de las variables respuesta, a partir de los datos experimentales,

se muestra con detalle en el Apartado 4.4.4.

64

Figura 24. Diagrama simplificado del equipo utilizado durante las corridas de extracción batch

de polifenoles totales.

Figura 25. Diagrama simplificado del equipo, utilizado para el prensado de la mezcla de

extracción.

65



programa Excel 2016 (Microsoft®, Estados Unidos). Por otro lado, la regresión no lineal y las

superficies de respuesta se realizaron con el programa Statistica 7 (Statsoft®, Estados Unidos).

Para las tres variables respuesta: 𝑇𝑏 , 𝐶𝑛𝑃𝑇𝑠 y 𝐶𝑛𝐶𝑇𝑠 , se obtuvieron los coeficientes de la

regresión y se les realizó un ANDEVA. Se construyeron los modelos matemáticos tomando en

cuenta únicamente los términos cuyos coeficientes resultaron significativos.

Para determinar la validez de los modelos matemáticos obtenidos, se evaluó el R2, el R2-adj,

la pmodelo, la probabilidad de falta de ajuste (pfa) y la gráfica de distribución de valores observados

contra predichos. Luego, se obtuvieron las superficies de respuesta y los gráficos de contorno para

𝑇𝑏, 𝐶𝑛𝑃𝑇𝑠 y 𝐶𝑛𝐶𝑇𝑠; con estos últimos, se identificaron las regiones (rangos de pH, T y %EtOH)

que permitían obtener un óptimo en la respuesta correspondiente: se buscó minimizar la 𝑇𝑏 y

maximizar tanto la 𝐶𝑛𝑃𝑇𝑠 como la 𝐶𝑛𝐶𝑇𝑠.

Una vez obtenidos los óptimos individuales para 𝑇𝑏, 𝐶𝑛𝑃𝑇𝑠 y 𝐶𝑛𝐶𝑇𝑠, se procedió a evaluar

la posibilidad de obtener condiciones de pH, T y %EtOH que optimizaran simultáneamente las

siguientes combinaciones de las variables respuesta: 1- 𝐶𝑛𝑃𝑇𝑠 y 𝑇𝑏, 2- 𝐶𝑛𝐶𝑇𝑠 y 𝑇𝑏, 3- 𝐶𝑛𝑃𝑇𝑠 y

𝐶𝑛𝐶𝑇𝑠 y 4- 𝐶𝑛𝑃𝑇𝑠, 𝐶𝑛𝐶𝑇𝑠 y 𝑇𝑏. Lo anterior se realizó utilizando la función de deseabilidad en el

programa Statistica 7 (Statsoft®, Estados Unidos).

Para los cuatro sets anteriores de pH, T y %EtOH, se determinó el valor de deseabilidad y el

valor individual de las tres variables respuesta (𝑇𝑏, 𝐶𝑛𝑃𝑇𝑠 y 𝐶𝑛𝐶𝑇𝑠); esto último, introduciendo

las condiciones a los modelos matemáticos respectivos. Luego de analizar cuáles eran las

condiciones más favorables de utilizar, se procedió a validar la región óptima escogida y el modelo

matemático correspondiente.

Validación de las condiciones óptimas

Según el análisis anterior, se escogió validar la región óptima del modelo matemático para la

𝐶𝑛𝑃𝑇𝑠. Para ello, se seleccionó un punto dentro la región óptima y se realizaron tres ensayos a

esas condiciones, siguiendo el procedimiento descrito en el Apartado 4.3.5. Los valores

experimentales de 𝐶𝑛𝑃𝑇𝑠 se compararon con los valores predichos por el modelo. Para concluir si

el modelo era adecuado, se determinó si el valor predicho se encontraba dentro del intervalo de

confianza de los valores experimentales.

Es preciso aclarar que las corridas de validación se realizaron utilizando el segundo lote de

SG, el cual poseía un contenido de polifenoles totales inicial (𝑃𝑇𝑠𝑆𝐺) superior al del SG del primer

lote, con el que se realizaron las corridas del DCCR. Para subsanar esta diferencia, se utilizó la

variable rendimiento de extracción (%𝑅𝐸 ), calculada a partir de la 𝐶𝑛𝑃𝑇𝑠 y el 𝑃𝑇𝑠𝑆𝐺 , para

comparar el valor predicho con el experimental. El cálculo de esta variable respuesta, se muestra

con detalle en el Apartado 4.4.5.

66

4.3.6. Caracterización del proceso

Procedimiento

Con el fin de caracterizar el proceso desarrollado, se aprovecharon las tres corridas de

validación del modelo matemático de extracción de polifenoles totales, para realizar balances de

masa en las dos operaciones del proceso: extracción y prensado. La información recolectada en los

balances de masa, permitieron calcular rendimientos de prensado (%RP) y de extracción de

polifenoles (%RE), así como estimar la cantidad de polifenoles no recuperados (%PNR).

Durante estos ensayos, se mantuvieron constantes las variables detalladas en el Cuadro XX.

La Vag, como se explicó en el Apartado 4.3.3, fue definida en pruebas preliminares. Por otro lado,

los valores de S:L, te, pH, T y %EtOH se seleccionaron con base en los resultados obtenidos en

los objetivos 1, 2 y 3.

Cuadro XX. Condiciones utilizadas durante las corridas de extracción para validar y caracterizar

el proceso de extracción batch de polifenoles a partir del SG.

Relación

sólido-líquido

S:L (MSG:MD)

Velocidad de

agitación

Vag (rpm)

Tiempo de

extracción

te (min)

Potencial de

hidrógeno pH

Temperatura

T (ºC)

Concentración

de etanol

%EtOH (m/m)

1:5 450 35 2,00 65,0 46,3

El proceso seguido para la realización de las corridas de extracción se muestra en la Figura 26.

Debido a su corta duración, se realizaron las tres corridas en un mismo día.

El proceso inició con la descongelación de las tres bolsas de SG, 25 min antes de la extracción,

introduciéndolas en un baño de agua a 50 °C. Posterior a la descongelación, se mezcló el contenido

de las tres bolsas y se pesó la MSG a utilizar en un beaker de 600 mL, tal que se cumpliera con la

S:L correspondiente (ver Cuadro XXI).

Mientras tanto, se preparó la cantidad de disolvente (MD) de cada corrida del día según se

indica en el Cuadro XXI. El disolvente se preparó y almacenó en botellas de HDPE de 1 L, con

tapa para minimizar la evaporación del etanol, y se rotularon con el número de ensayo

correspondiente. Es importante notar del Cuadro XXI, que se trabajó con una masa y volumen de

mezcla de extracción constante en los tres ensayos realizados.

67

Figura 26. Diagrama de bloques para la realización de las corridas de extracción, y la obtención

de los extractos de guayaba (EG) y tortas de prensado (T).

Cuadro XXI. Detalle de preparación del disolvente y la S:L en las corridas de extracción y


Relación

sólido-líquido

S:L (MSG:MD)

Mediciones para satisfacer

%EtOH=46,3 % m/m Mediciones para satisfacer S:L

Volumen total

de la mezcla1

Vm total (L) Masa de etanol

MEtOH 95%m/m (g)

Masa

de agua

MH2O (g)

Masa de

disolvente

MD (g)

Masa de

subproducto

MSG (g)

Masa total

de la mezcla

Mm total (g)

1:5 394,77 415,23 1 333,33 266,67 1 600,00 1,75

1Estimado con el valor de densidad de una mezcla etanol-agua al 46,3% y 60 ºC (ρ=0,9015 g/mL, valor obtenidos de:

Petong et al., 2000 y Perry et al., 1997) y asumiendo que el volumen total de la mezcla es la suma del VD y la MSG.


Scientific, Estados Unidos), el mismo descrito en el Apartado 4.3.4. El esquema del sistema

utilizado se muestra en la Figura 24 y es el mismo que el utilizado en el objetivo 3.

Antes de realizar la corrida, se llenó el recirculador con agua destilada hasta el nivel adecuado,

se removieron las prensas en las mangueras de entrada y salida del condensador, y se prendió el


a 25 ºC, se introducía en el tanque del reactor y se atornillaba la tapa, en cruz, con ayuda de


(SG)


EXTRACCIÓN Reactor, agitador de doble turbina,

S:L=1:5, Vag

=450 rpm, pH=2,00,

T=65,0 ºC, t=35 min

Extracto de guayaba

(EG)

Disolvente (D)

%EtOH=46,3

ALMACENAMIENTO 1 Botella ámbar, congelador, T= -80 ºC


Torta de prensado

(TP)

ALMACENAMIENTO 2 Bolsa metalizada, congelador/

refrigerador, T= -80/5 ºC

68

arandelas y tuercas. Además, se midió la masa del beaker de 600 mL con residuo de SG, para

conocer la MSG exacta que fue agregada.

Luego, se prendió la unidad de control, se conectó el pHmetro y se calibró con el buffer pH=4,

previamente temperado a 25 ºC. Una vez finalizada la calibración, se atornilló este instrumento en

el agujero correspondiente. Posteriormente, se conectó y se introdujo el sensor de temperatura en

su receptáculo, previamente lleno con agua destilada, seguido del motor del agitador y la chaqueta

de calentamiento.

Por último, se especificaron los valores de Vag y T en el panel de control (ver Cuadro XVI y

Cuadro XVII). En esta sección, la T indicada al panel de control era 5 °C superior a la de trabajo

para hacer que el tiempo de inducción fuera inferior a 25 min, ya que las corridas eran de 30 min,

una vez se alcanzaba el valor deseado, se realizaba el cambio correspondiente en el panel. Se

precalentó la MD a la T de trabajo, se añadió la MD al reactor con ayuda de un embudo e

inmediatamente después, se cerró el orificio. Luego de esto, se encendió el agitador, el control de

T y se inició el conteo del tiempo.

Inmediatamente después, se procedió a regular manualmente el pH, añadiendo HCl o NaOH

2 M con un gotero, por el orificio destinado para tal fin. Durante el resto de la corrida, todos los

agujeros se mantuvieron cerrados con tuercas y empaques para evitar la evaporación del etanol en

el disolvente.

Es importante indicar que el sistema alcanzó la T de trabajo en menos de 10 min (tiempo de

inducción). El pH se monitoreó y reguló (cuando fue necesario) cada 5 min. Una vez estable el

sistema, se procedió a determinar la masa de las botellas de HDPE de 1L con residuos de disolvente,

para conocer con exactitud la MD agregada.

Al finalizar la corrida, se procedió a traspasar la mezcla de extracción del reactor a dos botellas

ámbar de 1 L, con ayuda de una bomba de desplazamiento positivo. Las botellas receptoras se

mantuvieron sumergidas en un baño de agua con hielo, tal y como se muestra en la Figura 10.

Para determinar la masa exacta de torta de prensado (MTP), se pesó el recipiente de metal

perforado con la bolsa de manta humedecida adentro. La separación del EG se realizó colocando

el contenido de ambas botellas ámbar en el recipiente anterior y aplicando una presión de 1600 lbf

(419 MPa) por 3 min cronometrados, con ayuda de una prensa hidráulica 3351-0 (Carver, Estados

Unidos) y un recipiente colector con salida (ver Figura 25).

El EG se acumuló en una jarra de plástico de 5 L previamente pesada y luego se determinó la

masa de la jarra con EG para conocer con exactitud la MEG obtenida. De igual forma, se pesó el

recipiente perforado con la manta y la torta de prensado.

Se tomaron muestras del EG de la siguiente forma: se llenó un vial de 30 mL para la medición

de 𝑇𝑏, una botella de 250 mL para determinar el porcentaje de sólidos (%𝑆𝐸𝐺) y otra igual para

determinar la ρEG, estas tres muestras se almacenaron en refrigeración. También se llenó una botella

ámbar de 30 mL para la medición de la 𝐶𝑛𝑃𝑇𝑠, esta se almacenó en un ultra-congelador hasta el

69

momento de su análisis. La medición de 𝑇𝑏 y 𝐶𝑛𝑃𝑇𝑠 se realizó el día después de realizar los

ensayos correspondientes.

También se tomaron muestras de la TP; para esto, se vació el contenido de la bolsa de manta

hacia un beaker de 600 mL, se homogenizó con una cucharilla y se dividió en dos bolsas

metalizadas: una para la medición del contenido de sólidos y otra para determinar su contenido de

polifenoles (PTs). La primera se almacenó en refrigeración y la segunda en ultra-congelador, hasta

el momento de su análisis. El cálculo %𝑅𝑃, %𝑅𝐸 y%𝑃𝑁𝑅, a partir de los datos experimentales,

se muestra con detalle en el Apartado 4.4.5.


Para las tres variables de interés: %𝑅𝑃, %𝑅𝐸 y%𝑃𝑁𝑅, se reportó el promedio de las tres

repeticiones realizadas y el intervalo de confianza correspondiente. Estos valores se calcularon

utilizando el programa Excel 2016 (Microsoft®, Estados Unidos).

4.4. Métodos de análisis fisicoquímicos

4.4.1. Caracterización fisicoquímica del subproducto de guayaba

Humedad

Se determinó con estufa al vacío, siguiendo el método termogravimétrico P-SA-MQ-002 del

Laboratorio de Química del CITA, el cual está basado en el Método Gerber C-140, prueba 874,

con condiciones específicas para purés de frutas (Gerber, s.f.).

Carbohidratos totales

Calculado por diferencia, substrayendo de 100 el resto de los componentes analizados, tal y

como se muestra en la Ecuación 7:

𝐶𝐻𝑂𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙𝑒𝑠(𝑔/100 𝑔 𝑆𝐺) = 100 − 𝐻 − 𝑃𝑟𝑜 − 𝐴𝑐 − 𝐶𝑒𝑛 − 𝐺 −𝑃𝑇𝑠

1 000−

𝑉𝑖𝑡. 𝐶

1 000−

𝐶𝑇𝑠

1 000 000 (7)

Donde: 𝐻: humedad (g /100 g), 𝑃𝑟𝑜: proteína (g/ 100 g), 𝐴𝑐: acidez titulable (g EAC/100 g), 𝐶𝑒𝑛:

cenizas (g/100 g), 𝐺: grasa (g/ 100 g), 𝑃𝑇𝑠: polifenoles totales (mg EAG/100 g), 𝑉𝑖𝑡. 𝐶: vitamina

C total (mg/ 100 g) y 𝐶𝑇𝑠: carotenoides totales (µg Eβ-C/100 g).

Fibra dietética

Se determinó mediante la precipitación de la fibra con etanol posterior a la hidrólisis

enzimática del almidón y la proteína en la muestra, tal y como se describe en el método P-SA-MQ-

70

007 del Laboratorio de Química del CITA, el cual está basado en el método AOAC 985.29 (AOAC,

2005).

Carbohidratos disponibles

Como puede apreciarse en la Ecuación 8, se calculó por diferencia, restando a los

carbohidratos totales el contenido de fibra.

𝐶𝐻𝑂𝑑𝑖𝑠𝑝𝑜𝑛𝑖𝑏𝑙𝑒𝑠(𝑔/100 𝑔 𝑆𝐺) = 𝐶𝐻𝑂𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙𝑒𝑠 − 𝐹𝐷 (8)

Donde: 𝐶𝐻𝑂𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙𝑒𝑠: carbohidratos totales (g/100 g) y 𝐹𝐷: fibra dietética (g/100 g).

Proteína

Se determinó por el Método de Kjeldahl, tal y como se detalla en el método P-SA-MQ-003 del

Laboratorio de Química del CITA. Este último, está basado en el Método AOAC 920.152, con

condiciones específicas para purés de frutas (N=6,25) (AOAC, 2005).

Acidez titulable

Se determinó por valoración potenciométrica, según el procedimiento del método P-SA-

MQ-011 del Laboratorio de Química del CITA, el cual está basado en el Método AOAC 942.15

para frutas y purés (AOAC, 2005).

Cenizas

Se determinó por calcinación de la muestra a ≤525 °C en una mufla, según el método P-SA-

MQ-004 del Laboratorio de Química del CITA, el cual está basado en el Método AOAC 940.26

(AOAC, 2005), con condiciones específicas para frutas frescas y jugos.

Grasa

Se determinó por hidrólisis ácida y extracción con éter de petróleo, según se detalla en el

método P-SA-MQ-009 del Laboratorio de Química del CITA, el cual está basado en el Método

AOAC 922.06 (AOAC, 2005).

Polifenoles totales en muestras sólidas

Extracción analítica

La extracción analítica de los polifenoles totales se realizó con base en el método P-SA-Q-017

del Laboratorio de Química del CITA. Sin embargo, se utilizaron las condiciones de extracción

determinadas en los objetivos 1, 2 y 3 del presente estudio. A continuación, se detalla el

procedimiento seguido.

71

Se midieron 3,0000 g de muestra (previamente homogeneizada) en balanza analítica, por

triplicado, en Erlenmeyers ámbar de 250 mL. A estos, se les añadió 45 mL de etanol (C2H6O) al

46,3 %m/m y pH=2,00, para tener una S:L de 1:15. Posteriormente, se les colocó un tapón de

algodón y se introdujeron en una incubadora con agitación orbital (modelo SI-600, marca Lab.

Companion) por 30 minutos a 450 rpm y 65 ºC (ver Figura 27.a.). Nótese que se utilizaron las

condiciones de extracción de S:L, te, pH, %EtOH y T determinadas a lo largo del estudio.

Una vez culminada la extracción, en un cuarto oscuro con luz amarilla, se filtró la mezcla al

vacío hacia un Kitasato de 250 mL, utilizando un embudo de Büchner (9 cm) y papel Whatman #4

(ver Figura 27.b.). La torta de filtrado se raspó, cuidadosamente, con ayuda de una espátula, y se

devolvió al Erlenmeyer ámbar para realizar dos extracciones adicionales (ver Figura 27.c.). En la

tercera extracción, ya el filtrado obtenido carecía de color.

Se realizó un trasvase cuantitativo de los filtrados acumulados en el Kitasato hacia un balón

de 200,00 mL y se aforó con el mismo disolvente de extracción (ver Figura 27.d.). De este volumen

se tomó una muestra de 30 mL, la cual que se filtró con una jeringa acoplada a un filtro de celulosa

regenerada de 0,45 µm (ver Figura 27.c.) y luego se almacenó en una botella ámbar. Los extractos

se mantuvieron en un ultra-congelador a -80 ºC, hasta el día del análisis de polifenoles totales, el

cual se realizó al día posterior a la extracción analítica.

Figura 27. Procedimiento de extracción analítica de polifenoles en muestras sólidas: a) extracción

en incubadora, b) filtración al vacío, c) recuperación de torta de filtración, d) aforo en balón y

e) microfiltración.

Determinación

La cuantificación espectrofotométrica de los polifenoles totales presentes en el extracto de la

muestra se realizó con base en el método P-SA-MQ-048 del Laboratorio de Química del CITA. En

este, el extracto de la muestra se hace reaccionar, en un medio básico, con el reactivo de Folin-

Ciocalteu: una mezcla de tungstato de sodio (Na2WO4 ∙ 2H2O), molibdato de sodio

(Na2MoO4∙2H2O), ácido clorhídrico concentrado (HClcn), ácido fosfórico (H3PO4) y sulfato de litio

(Li2SO4).

a b c d e

72

La reacción se basa en la reducción de los polifenoles, ácido ascórbico, derivados de vitaminas

y otras sustancias antioxidantes presentes en el extracto de la muestra (Everette et al., 2010; Shahidi

y Naczk, 2011), para formar complejos con molibdeno (V), los cuales tienen una absorbancia

máxima a una longitud de onda ʎ=760 nm. La concentración se determina por interpolación en una

curva de calibración de ácido gálico en el disolvente del extracto de la muestra.

El método incluye la medición directa de todas las sustancias antioxidantes en la muestra

(CnA) y una etapa de separación, en donde el extracto se hace correr por un cartucho C18 para

retener los polifenoles y obtener únicamente las interferencias en el extracto de la muestra

(vitaminas). A estas últimas, se les mide su concentración para utilizarla como corrección (CnB).

La diferencia entre la CnA y la CnB da la concentración real de polifenoles en el extracto.

A continuación, se describe con detalle el procedimiento utilizado. El extracto analítico de SG

se descongeló en un baño de agua a temperatura ambiente, se homogeneizó el contenido de la

botella ámbar y se trasvasó, por cada réplica, una alícuota de 1 000 µL hacia un tubo de ensayo,

cuyo contenido se diluyó con 4,00 mL de agua destilada para aplicarle un factor de dilución

FdA=5,00 al extracto de la muestra. El contenido del tubo se agitó con vórtex y se tomó una alícuota

de 500 µL, la cual se llevó a un segundo tubo de ensayo. Se prepararon dos tubos de ensayo

adicionales con 500 µL de agua destilada para ser utilizados como blanco.

Al set de tubos anterior, se les agregó 2,50 mL de reactivo de Folin-Ciocalteu (Sigma-Aldrich,

previamente diluido 1:10 v/v con agua destilada), se dejaron en reposo durante 2 min

cronometrados y se les añadió 2,00 mL de disolución de carbonato de sodio (Na2CO3) 75 g/L.

Inmediatamente, los tubos fueron agitados en vórtex e incubados en agua a 50 ºC por 15 min

cronometrados, en un baño con temperatura controlada y agitación.

Posteriormente, se temperaron los tubos introduciéndolos en un baño de agua a temperatura

ambiente y se procedió a medir su absorbancia en espectrofotómetro UV-Vis de doble haz

Pharmaspec UV-1700 (Shimadzu, Japón), a una longitud de onda ʎ=760 nm y con cubeta de

cuarzo. Con estos datos se obtuvo la CnA.

Es importante aclarar que para lograr extraer la totalidad de los polifenoles presentes en el SG,

se realizaron tres extracciones seguidas con una S:L de 1:15, por ende, los extractos resultantes

(después de aforar hasta 200,00 mL) presentaron concentraciones muy bajas. Por lo anterior, las

absorbancias de la parte B (determinación de interferencias) eran muy cercanas a 0 UA.

Para estimar el aporte de las interferencias, se modificó la corrección de la parte B que se

detalla en el método original, por la siguiente: se utilizó la relación promedio de CnB/CnA de los

EG de la validación (donde las condiciones de extracción utilizadas eran casi iguales a las del

método analítico, a excepción de la S:L) y se utilizó ese dato para estimar una CnB que permitiera

corregir el valor de CnA.

Para calcular el contenido de polifenoles totales en el SG, primero se calculó la concentración

de polifenoles totales en el extracto analítico (CnPTs) con la Ecuación 9 y luego se calculó la masa

de polifenoles por gramo de muestra (PTs), expresada como equivalentes de ácido gálico (EAG),

con la Ecuación 10.

73

𝐶𝑛𝑃𝑇𝑠 (𝑚𝑔 𝐸𝐴𝐺/𝐿) = 𝐶𝑛𝐴 − 𝐶𝑛𝐵 = [(𝐴𝑏𝑠𝐴 − 𝑏)

𝑚∙ 𝐹𝑑𝐴] − [𝐶𝑛𝐴 ∙ (𝐶𝑛𝐵

𝐶𝑛𝐴⁄ )𝑣𝑒𝑟

] (9)

Donde: 𝐶𝑛𝐴: concentración de polifenoles e interferencias (mg EAG/L), 𝐶𝑛𝐵: concentración de

interferencias (mg EAG/L), 𝐴𝑏𝑠𝐴 : absorbancia de polifenoles e interferencias (UA), 𝑏 𝑦 𝑚:

intercepto y pendiente (respectivamente) de la curva de calibración de ácido gálico en 46,3%EtOH

y pH=2,00, 𝐹𝑑𝐴: factor de dilución aplicado al extracto en la parte A, (𝐶𝑛𝐵𝐶𝑛𝐴⁄ )

𝑣𝑒𝑟: relación

promedio de concentraciones de parte B y A en los extractos de la validación.

𝑃𝑇𝑠 (𝑚𝑔 𝐸𝐴𝐺/100 𝑔 𝑆𝐺) =𝐶𝑛𝑃𝑇𝑠 ∙

𝑉𝑏𝑎𝑙ó𝑛

1 000𝑀𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎

∙ 100 (10)

Donde: 𝑉𝑏𝑎𝑙ó𝑛: volumen del balón aforado utilizado en la etapa de extracción (mL) y 𝑀𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎:

masa de la muestra determinada en balanza analítica (g).

Vitamina C total

Se determinó por HPLC luego de su extracción con ácido metafosfórico y reducción con

fosfina, según el método P-SA-MQ-024 del Laboratorio de Química del CITA.

Carotenoides totales en muestras sólidas

Se midieron 4,0000 g de muestra (previamente homogeneizada) en balanza analítica, por

triplicado, en beakers de 150 mL. A estos, se les añadió una punta de espátula de carbonato de

magnesio (MgCO3) y 30 mL de metanol (CH4O). Posteriormente, se mezcló por 2 min

cronometrados, a máxima velocidad, en un homogeneizador Ultra-turrax® previamente lavado con

agua destilada. Lo anterior se realizó en un espacio con una baja incidencia de luz.

Una vez culminada la extracción, en un cuarto oscuro con luz amarilla, se dejó el beaker en

reposo durante 5 min para sedimentar los sólidos y se filtró el sobrenadante al vacío hacia un

Kitasato de 250 mL, utilizando un embudo de Büchner (9 cm) y papel Whatman #4. A los sólidos

en el beaker, se les realizó dos lavados con 10 mL de acetona (C3H6O): hexano (C6H14) 60:40 v/v

(0,1 %m/v de BHT), sedimentando y filtrando el sobrenadante entre ambos lavados. Los sólidos

se trasvasaron cuantitativamente al embudo, realizando tres lavados al beaker con 2 mL de acetona:

hexano 60:40; posteriormente, se efectuaron tres lavados a los sólidos en el embudo con 2 mL de

la misma mezcla de disolventes.

El filtrado del Kitasato se trasvasó cuantitativamente, con 8 mL de mezcla de disolventes,

hacia un embudo separador de 250 mL, en el cual se añadieron 30 mL de agua destilada para

favorecer la separación de fases. El embudo se agitó tres veces, liberando presión entre cada

74

agitación, y se dejó en reposo hasta observar la separación de las fases orgánica y acuosa. La fase

orgánica se recolectó en un Erlenmeyer de 50 mL y la acuosa en uno de 125 mL; a esta última se

le realizaron cinco extracciones adicionales con 5 mL de hexano (0,1 %m/v de BHT), tal que en la

extracción final ya no era posible observar color en la fase orgánica.

Al Erlenmeyer con fase orgánica, se le añadió una punta de espátula de sulfato de sodio

(Na2SO4) y se filtró por gravedad, con papel Whatman #4, hacia un balón aforado de 50,00 mL. Se

aforó el balón con hexano (0,1 %m/v de BHT) y se procedió a medir la absorbancia en

espectrofotómetro UV-Vis de doble haz Pharmaspec UV-1700 (Shimadzu, Japón), a una longitud

de onda ʎ=450 nm, con cubeta de cuarzo y utilizando hexano (0,1 %m/v de BHT) como blanco.

Finalmente, la Ecuación 11 detalla cómo se calculó el contenido de carotenoides totales en la

muestra.

𝐶𝑇𝑠 (µ𝑔 𝐸𝛽𝐶/ 100 𝑔 𝑆𝐺 ) =𝐴𝑏𝑠 ∙ 𝑉𝑏𝑎𝑙ó𝑛 ∙ 106

𝛼 ∙ 𝑀𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎 (11)

Donde: 𝐴𝑏𝑠: absorbancia del extracto (UA), 𝑉𝑏𝑎𝑙ó𝑛 : volumen del balón aforado (mL), 𝛼 :

absortividad del β-caroteno en hexano (𝛼= 2592 100 mL/g cm) y 𝑀𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎: masa de la muestra

determinada en balanza analítica (g).

Es importante aclarar que, para utilizar la ecuación anterior, los valores de absorbancia deben

encontrarse en el rango de 0,2-0,8 para asegurar el cumplimiento de la Ley de Lambert-Beer.

Sólidos solubles

Esta determinación se realizó homogeneizando la muestra y colocando dos cucharadas de esta

en una pequeña bolsa de tela tergal, la cual se presionó hasta extraer 10 mL de líquido. Con un

gotero, se tomó una muestra de este líquido y se determinó, por triplicado, el contenido de sólidos

solubles utilizando un refractómetro de Abbe (Atago, Japón) con escala de °Brix y medidor de

temperatura. Para cada medición, se tomó tanto el dato de sólidos solubles como el de la

temperatura asociada.

Todas las mediciones fueron corregidas por temperatura y por contenido de acidez en el SG.

La Ecuación 12 describe cómo se calculó el contenido de sólidos solubles en la muestra.

𝑆𝑆𝑟𝑒𝑎𝑙𝑒𝑠(°𝐵𝑟𝑖𝑥) = 𝑆𝑆 𝑇 + 𝐹𝑐20 °𝐶 + 𝐹𝑐𝐴𝑐 (12)

Donde: 𝑆𝑆 𝑇: sólidos solubles medidos a la temperatura T, 𝐹𝑐20 °𝐶: factor de corrección para

obtener los SS a 20 ºC (Shachman, 2004a) y 𝐹𝑐𝐴𝑐: factor de corrección por presencia de ácido

cítrico (Shachman, 2004b).

75

Potencial de hidrógeno (pH)

Se determinó siguiendo el método P-SA-MQ-012 del Laboratorio de Química del CITA, el

cual está basado en el método AOAC 981.12, con las condiciones específicas para productos semi-

sólidos (AOAC, 2005).

4.4.2. Determinación de la relación sólido-líquido

Concentración de polifenoles totales en el extracto

El EG se descongeló en un baño de agua a temperatura ambiente, se homogeneizó el contenido

de la botella ámbar y se filtraron 10 mL, con un filtro-jeringa 0,45 µm de celulosa regenerada,

hacia un Erlenmeyer de 25 mL.

El EG filtrado se diluyó en un tubo de ensayo, según se describe en el Cuadro XXII. El

contenido del tubo se agitó con vórtex y se tomaron, por triplicado, alícuotas de 500 µL que se

llevaron a un segundo set de tubos de ensayo (parte A). Se prepararon dos tubos de ensayo

adicionales con 500 µL de agua destilada para ser utilizados como blanco.

Cuadro XXII. Factores de dilución aplicados para la obtención de las CnAs de los EGs extraídos

con etanol al 62,5% y pH=4,50.*


S:L (MSG:MD)

Volumen de EG

VEG (µL)

Volumen de agua

VH2O (mL)

Factor de dilución

parte A FdA

1:5 500 9,50 20,00

1:8 500 9,50 20,00

1:10 1 000 9,00 10,00

1:15 1 000 9,00 10,00

1:20 1 000 4,00 5,00

*Rango de absorbancias de la curva: 0,02-0,9 UA.

Para estimar el aporte de las interferencias, se tomaron alícuotas de 500 µL de EG filtrado

(VEG), por triplicado, y se colocaron en cartuchos de extracción en fase sólida C18 (Oasis® HLB)

para retener los polifenoles presentes. El líquido resultante se acumuló en una probeta de

5 ± 0,05 mL, se lavó el cartucho con 2,50 mL de agua grado HPLC, colectando los lavados en la

misma probeta, y se anotó el volumen final contenido en esta (Vf B).

El contenido de las probetas se homogeneizó en vórtex, se trasvasó a tubos de ensayo pequeños

y se tomaron alícuotas de 500 µL que se llevaron a un segundo set de tubos de ensayo (parte B).

A ambos sets de tubos (parte A y B), se les agregó 2,50 mL de reactivo de Folin-Ciocalteu

(Sigma-Aldrich y previamente diluido 1:10 v/v con agua destilada), se dejaron en reposo durante

2 min cronometrados y se les añadió 2,00 mL de disolución de carbonato de sodio (Na2CO3) 75 g/L.

76

Inmediatamente, los tubos sea agitaron en vórtex y se incubaron en agua a 50 ºC por 15 min

cronometrados, en un baño con temperatura controlada y agitación.

Posteriormente, se temperaron los tubos introduciéndolos en un baño de agua a temperatura

ambiente y se procedió a medir su absorbancia en espectrofotómetro UV-Vis de doble haz

Pharmaspec UV-1700 (Shimadzu, Japón), a una longitud de onda ʎ=760 nm y con cubeta de

cuarzo. Finalmente, la concentración de polifenoles totales en el EG (CnPTs) se calculó mediante

la Ecuación 13.

𝐶𝑛𝑃𝑇𝑠 (𝑚𝑔 𝐸𝐴𝐺/𝐿) = 𝐶𝑛𝐴 − 𝑀𝑒𝐶𝑛𝐵 = [(𝐴𝑏𝑠𝐴 − 𝑏)

𝑚∙ 𝐹𝑑𝐴] − 𝑀𝑒 [

(𝐴𝑏𝑠𝐵 − 𝑏)

𝑚∙ 𝐹𝑑𝐵] (13)

Donde: 𝐶𝑛𝐴: concentración de polifenoles e interferencias (mg EAG/L), 𝑀𝑒𝐶𝑛𝐵: la mediana de la

concentración de interferencias de las tres réplicas (mg EAG/L), 𝐴𝑏𝑠𝐴: absorbancia de polifenoles

e interferencias (UA), 𝑏 𝑦 𝑚: intercepto y pendiente (respectivamente) de la curva de calibración

de ácido gálico en 62,5 %EtOH y pH=4,50, 𝐹𝑑𝐴: factor de dilución aplicado al extracto en la parte

A, 𝐴𝑏𝑠𝐵: absorbancia de interferencias (UA) y 𝐹𝑑𝐵: factor de dilución aplicado al extracto en la

parte B (VfB/VEG).

Procedimiento de acondicionamiento y lavado de cartuchos Oasis®HLB

Antes de utilizar los cartuchos C18, se les realizó un acondicionamiento, por filtración al vacío

con un colector múltiple para cartuchos VisiprepTM (Supelco, Estados Unidos), que consistía en un

lavado con 6,00 mL de metanol seguido de uno con 6,00 mL de agua grado HPLC. Luego de su

utilización, los cartuchos se lavaron cuatro veces con 6,00 mL de metanol y una con 6,00 mL de

agua grado HPLC. Cada cartucho se utilizó un máximo de cinco veces.

Polifenoles totales extraídos en base seca

Para calcular esta variable respuesta, se utilizó la 𝐶𝑛𝑃𝑇𝑠, cuya determinación se describió en

el apartado anterior. Además, se utilizó el valor de la densidad del EG, la cual se determinó por

picnometría con base en el método 962.37 AOAC; la fórmula respectiva se muestra en la

Ecuación 14 (AOAC, 2005).

𝜌𝐸𝐺(𝑔/𝑚𝐿) =𝑀𝑝𝑖𝑐𝑛ó𝑚𝑒𝑡𝑟𝑜+𝐸𝐺

15 °𝐶

𝑀𝑝𝑖𝑐𝑛ó𝑚𝑒𝑡𝑟𝑜+𝐻2𝑂15 °𝐶

∙ 𝜌𝐻2𝑂15 °𝐶 (14)

Donde: 𝑀𝑝𝑖𝑐𝑛ó𝑚𝑒𝑡𝑟𝑜+𝐸𝐺 15 °𝐶 : masa del picnómetro con extracto a 15 ºC, 𝑀𝑝𝑖𝑐𝑛ó𝑚𝑒𝑡𝑟𝑜+𝐻2𝑂

15 °𝐶 : masa del

picnómetro con agua destilada a 15 ºC y 𝜌𝐻2𝑂15 °𝐶: densidad del agua destilada a 15 ºC (ρ=0,9991016

g/mL, obtenida en las tablas de Perry et al., 1997).

77

Una vez obtenida la densidad, la determinación final de la variable respuesta se realizó

mediante la aplicación de la fórmula que se muestra en la Ecuación 15.

𝑃𝑇𝑠𝑒 (𝑚𝑔 𝐸𝐴𝐺/100 𝑔 𝑆𝐺𝑏𝑠) =𝐶𝑛𝑃𝑇𝑠 ∙

𝑀𝐸𝐺𝜌𝐸𝐺 ∙ 1 000

𝑀𝑆𝐺 ∙ (1 −%𝐻𝑆𝐺100

)∙ 100 (15)

Donde: 𝐶𝑛𝑃𝑇𝑠: concentración de polifenoles totales en el extracto (mg EAG/L), 𝑀𝐸𝐺: masa total de

extracto obtenido en la corrida (g), 𝜌𝐸𝐺: densidad del extracto (g/mL), 𝑀𝑆𝐺: masa de subproducto utilizado

en la corrida (g) y %𝐻𝑆𝐺: humedad del subproducto (g/100 g).

4.4.3. Establecimiento del tiempo de proceso


Este análisis se realizó en los dos días posteriores a la corrida de extracción, analizándose un

total de ocho muestras por día. Se siguió el mismo procedimiento descrito en el Apartado 4.4.2

para determinar la CnPTs, con excepción de los pasos preliminares a la dilución del EG.

Los tubos Eppendorf con EG se descongelaron a temperatura ambiente en una gradilla, como

se tenían tres tubos por cada tiempo, se trasvasó el contenido de cada tubo hacia un tubo de ensayo

pequeño con una pipeta Pasteur y se homogeneizó el contenido de este agitando en vórtex. La

dilución de la parte A, se realizó según se describe en el Cuadro XXIII.

Cuadro XXIII. Factores de dilución utilizados para la obtención de las CnAs de los EG extraídos

con etanol al 62,5% y pH=4,50.*

Relación

sólido-líquido

S:L (MSG:MD)

Tiempo de

extracción

te (min)

Volumen

de EG

VEG (µL)

Volumen

de agua

VH2O (mL)

Factor de dilución

parte A FdA

1:5 0-480 500 9,50 20,00

1:15 0-90 1 000 9,00 10,00

1:15 120-480 500 9,50 20,00

*Rango de absorbancias de la curva: 0,02-0,9 UA.

4.4.4. Optimización del proceso de extracción


Se siguió el mismo procedimiento descrito en el Apartado 4.4.2 para determinar la CnPTs,

con excepción de la dilución de los EGs, la cual se realizó como se describe a continuación.

Para este objetivo, las muestras de EGs contenían diferentes %EtOH, y como la composición

del disolvente afecta la absortividad de los polifenoles, era necesario aplicar factores de dilución

en la parte A, tales que permitieran estandarizar el %EtOH entre muestras y hacerlas comparables

78

(ver Cuadro XXIV). La estrategia anterior presentaba la ventaja de permitir siempre el uso de la

misma curva de calibración (%EtOH=62,5).

Cuadro XXIV. Diluciones necesarias de aplicar a los EGs, para estandarizar el %EtOH=0,3 m/m

en los tubos donde se realiza la reacción de Folin para determinar la CnA.*


%EtOH (m/m)

Factor de dilución

parte A FdA*

Volumen de EG

VEG (µL)

Volumen de H2O

VH2O (mL)

30,0 10,0 1 000 9,00

43,2 14,4 694 9,31

46,3 15,4 648 9,35

62,5 20,8 500 9,50

81,8 27,3 367 9,63

95,0 31,7 316 9,68 *Estas diluciones permitían obtener absorbancias dentro del rango de la curva: 0,02-0,9 UA.

Concentración de carotenoides totales en el extracto

El EG se descongeló en un baño de agua a temperatura ambiente y se homogeneizó el

contenido de la botella ámbar. Se tomó, por duplicado, una alícuota de EG (VEG) y se añadió a un

embudo separador de 125 mL, seguido de una alícuota de agua o etanol, según lo descrito en el

Cuadro XXV.

Estas alícuotas se calcularon para obtener siempre un mismo volumen de fase acuosa en el

embudo separador, de manera que siempre se trabajara la misma proporción de fase acuosa/fase

orgánica (FA/FO). De igual forma, se calcularon para trabajar siempre la misma composición de

fase acuosa durante la extracción líquido-líquido (%EtOH). La estandarización de la FA/FO y el

%EtOH permitían obtener un mismo coeficiente de distribución de los CTs entre muestras.

Cuadro XXV. Diluciones aplicadas a los EGs, para estandarizar el volumen de fase acuosa en

15 mL y el %EtOH en 62,5 m/m, para realizar la extracción con éter de petróleo


%EtOH (m/m)

Volumen de EG

VEG (mL)

Volumen de EtOH

VEtOH (mL)

Volumen de H2O

VH2O (mL)

30,0 7,03 8,35 0,00

43,2 9,06 6,22 0,00

62,5 15,00 0,00 0,00

81,8 12,24 0,00 3,16

95,0 10,99 0,00 4,58

Posteriormente, se añadió 2,50 mL de una disolución saturada cloruro de sodio (NaCl) para

favorecer la separación de fases, una punta de espátula de MgCO3 y 2,50 mL de éter de petróleo

(0,1 %m/v de BHT). El embudo se agitó tres veces, liberando presión entre cada agitación, y se

79

dejó en reposo hasta observar la separación de las fases orgánica y acuosa. La fase orgánica se

recolectó en un Erlenmeyer de 25 mL y la acuosa en otro; a esta última, se le realizaron dos

extracciones adicionales con éter de petróleo, tal que la última extracción ya no era posible observar

color en la fase orgánica.

Al Erlenmeyer con fase orgánica, se le añadió una punta de espátula de sulfato de sodio

(Na2SO4) y se filtró por gravedad, con papel Whatman #4, hacia un balón aforado de 10,00 mL. Se

aforó el balón con éter de petróleo (0,1 %m/v de BHT) y se procedió a medir la absorbancia en

espectrofotómetro UV-Vis de doble haz Pharmaspec UV-1700 (Shimadzu, Japón), a una longitud

de onda ʎ=450 nm, con cubeta de cuarzo y utilizando éter de petróleo (0,1 %m/v de BHT) como

blanco. Finalmente, la Ecuación 16 detalla cómo se calculó el contenido de carotenoides totales

en la muestra de EG.

𝐶𝑛𝐶𝑇𝑠 (µ𝑔 𝐸𝛽𝐶/ 𝐿 ) =𝐴𝑏𝑠 − 𝑏

𝑚∙

𝑉𝑏𝑎𝑙ó𝑛

𝑉𝐸𝐺 (16)

Donde: 𝐴𝑏𝑠: absorbancia del extracto (UA), 𝑏 𝑦 𝑚: intercepto y pendiente (respectivamente) de la

curva de calibración de β-caroteno en éter de petróleo (0,1 %m/v de BHT), 𝑉𝑏𝑎𝑙ó𝑛: volumen del

balón aforado (mL), 𝑉𝐸𝐺: volumen de la alícuota de extracto añadida al embudo separador.

Rendimiento de extracción

Se refiere a la relación en masa de los polifenoles extraídos (presentes en el EG) sobre la

totalidad de polifenoles presentes en el SG. La Ecuación (17) muestra la expresión utilizada para

calcularlo. Para ello, se utilizaron las mediciones de masa de EG y SG tomadas durante las corridas

de validación, así como el contenido de polifenoles presente en el EG y SG, determinados según

los procedimientos descritos en Concentración de polifenoles totales en el extracto del

Apartado 4.4.2 y Polifenoles totales en muestras sólidas del Apartado 4.4.1, respectivamente,

además, se utilizó la densidad del EG que se midió por picnometría. Se calculó mediante la

Ecuación (14).

%𝑅𝐸 (𝑚/𝑚) =𝑀𝑃𝑇𝑠𝐸𝐺

𝑀𝑃𝑇𝑠𝑆𝐺=

𝐶𝑛𝑃𝑇𝑠 ∙𝑀𝐸𝐺

𝜌𝐸𝐺 ∙ 1 000

𝑃𝑇𝑠𝑆𝐺 ∙ 𝑀𝑆𝐺∙ 100 (17)

Donde: 𝐶𝑛𝑃𝑇𝑠: concentración de polifenoles totales en el extracto (mg EAG/L), 𝑀𝐸𝐺: masa total de

extracto obtenida en la corrida (g), 𝜌𝐸𝐺: densidad del extracto (g/mL), 𝑃𝑇𝑠𝑆𝐺: contenido de polifenoles

totales en el subproducto determinado por el método analítico (mg EAG/ 100 g SG) y 𝑀𝑆𝐺: masa de

subproducto utilizada para la obtención del extracto (g).

Esta variable permitió validar el modelo matemático de polifenoles totales, ya que este modelo

y los EGs de la validación se obtuvieron con lotes de SG diferentes.

80

4.4.5. Caracterización del proceso

Rendimiento de prensado del extracto

Esta variable indica la cantidad de EG obtenido en relación con la masa total de mezcla

utilizada en la extracción y fue calculada por medio de la Ecuación 18. Se utilizaron los datos de

masa de SG, D y EG, recolectados durante la realización de las corridas de validación del modelo

de PTs.

%𝑅𝑃 (𝑚/𝑚) =𝑀𝐸𝐺

𝑀𝑆𝐺 + 𝑀𝐷∙ 100 (18)

Donde: 𝑀𝐸𝐺: masa del extracto obtenido después del prensado (g), 𝑀𝑆𝐺 y 𝑀𝐷: masa del

subproducto y disolvente (g), respectivamente, utilizados durante la extracción. Todas estas masas

fueron medidas por diferencia.

Polifenoles totales no recuperados

Polifenoles retenidos en la torta de prensado

Son los polifenoles que quedaron retenidos en la torta de prensado, y por ende, no lograron

recuperarse en el EG. Para calcular esta variable, se utilizaron los datos de masa de TP y SG,

recolectados durante la realización de las corridas de validación, así como el contenido de

polifenoles presente en ambos, determinado según el procedimiento descrito en Polifenoles totales

en muestras sólidas del Apartado 4.4.1. La fórmula de cálculo utilizada se expone mediante la

Ecuación 19.

%𝑃𝑁𝑅𝑇 (𝑚/𝑚 ) =𝑀𝑃𝑇𝑠𝑇𝑃

𝑀𝑃𝑇𝑠𝑆𝐺∙ 100 =

𝑀𝑇 ∙𝑃𝑇𝑠𝑇𝑃

100

𝑀𝑆𝐺 ∙𝑃𝑇𝑠𝑆𝐺

100 ∙ 100 (19)

Donde: 𝑃𝑇𝑃: masa total de polifenoles en la torta de prensado (mg EAG), 𝑃𝑆𝐺: masa total de

polifenoles presente en la cantidad de subproducto utilizado para la extracción (mg EAG), 𝑀𝑇:

masa de torta generada en el prensado (g), 𝑃𝑇𝑠𝑇𝑃: contenido de polifenoles totales en la torta (mg

EAG/ 100 g SG) y 𝑃𝑇𝑠𝑆𝐺: contenido de polifenoles totales en el subproducto (mg EAG/ 100 g SG).

Polifenoles en el extracto de guayaba retenido en la torta de prensado

Son los polifenoles extraídos que se encuentran en el extracto de guayaba retenido (EGR), es

decir la porción del disolvente con polifenoles disueltos que quedó retenida en la torta de prensado

y, por ende, no forma parte del EG. En la Ecuación (20) se muestra la fórmula de cálculo utilizada.

Para ello, se utilizó la masa del EGR (ver Ecuación (22)), la densidad del EG, que se midió por

picnometría y se calculó mediante la Ecuación (14), así como el contenido de polifenoles presente

81

en el EG y SG, determinados según los procedimientos descritos en Concentración de polifenoles

totales en el extracto del Apartado 4.4.2 y Polifenoles totales en muestras sólidas del

Apartado 4.4.1, respectivamente. Por último, se utilizó la masa de SG recolectada durante las

corridas de validación.

%𝑃𝑁𝑅𝐸𝐺𝑅 (𝑚/𝑚 ) =𝑀𝑃𝑇𝑠𝐸𝐺𝑅

𝑀𝑃𝑇𝑠𝑆𝐺∙ 100 =

𝐶𝑛𝑃𝑇𝑠𝐸𝐺 ∙𝑀𝐸𝐺𝑅

𝜌𝐸𝐺 ∙ 1000

𝑀𝑆𝐺 ∙𝑃𝑇𝑠𝑆𝐺

100 ∙ 100 (20)

Donde: 𝑃𝐸𝐺𝑅: masa total de polifenoles en el EGR (mg EAG), 𝑃𝑆𝐺: masa total de polifenoles

presente en la cantidad de subproducto utilizado para la extracción (mg EAG), 𝑀𝐸𝐺𝑅: masa del

extracto retenido determinada por la Ecuación (21) (g), 𝐶𝑛𝑃𝑇𝑠𝐸𝐺: concentración de polifenoles

totales en el extracto (mg EAG/L), 𝜌𝐸𝐺: densidad del extracto (g/mL), 𝑀𝑆𝐺: masa de subproducto

utilizada para la extracción (g) y 𝑃𝑇𝑠𝑆𝐺: contenido de polifenoles totales en el subproducto (mg

EAG/ 100 g SG).

Nótese que para calcular la masa del EGR (ver Ecuación (21)), se utilizaron los datos de la

masa de TP recolectado durante las corridas de validación y el contenido de sólidos totales de la

TP y el EG. Estos últimos fueron determinados por el método P-SA-MQ-002 del Laboratorio de

Química del CITA, con condiciones específicas para purés de frutas y bebidas, respectivamente.

𝑀𝐸𝐺𝑅 =𝑀𝑇𝑃 ∙ (

%𝑆𝑇𝑃100 − 1)

%𝑆𝐸𝐺100

− 1 (21)

Donde: 𝑀𝑇𝑃: masa de torta generada en el prensado (g), %𝑆𝑇𝑃: contenido de sólidos totales en la

torta (g sólidos/ 100 g de TP) y %𝑆𝐸𝐺: contenido de sólidos totales en el extracto (g sólidos/ 100 g

de EG).

Polifenoles en el subproducto de guayaba agotado

Son los polifenoles que no fueron extraídos y que se encuentran en el subproducto de guayaba

agotado (SGA). En la Ecuación (22) se muestra la fórmula de cálculo utilizada, nótese que la

cantidad total de polifenoles en el SGA se obtuvo por diferencia entre los presentes en la TP y en

el EGR, los primeros se calcularon mediante la expresión del numerador en la Ecuación (19) y los

segundos mediante la expresión en el denominador de la misma ecuación.

%𝑃𝑁𝑅𝑆𝐺𝐴 (𝑚/𝑚 ) =𝑀𝑃𝑇𝑠𝑆𝐺𝐴

𝑃𝑆𝐺∙ 100 =

𝑀𝑃𝑇𝑠𝑇𝑃 − 𝑀𝑃𝑇𝑠𝐸𝐺𝑅

𝑀𝑃𝑇𝑠𝑆𝐺∙ 100 (22)

82

Donde: 𝑀𝑃𝑇𝑠𝑆𝐺𝐴: masa total de polifenoles en el subproducto agotado (mg EAG), 𝑀𝑃𝑇𝑠𝑆𝐺: masa

total de polifenoles en el subproducto inicial (mg EAG), 𝑀𝑃𝑇𝑠𝑇𝑃: masa total de polifenoles en la

torta (mg EAG) y 𝑀𝑃𝑇𝑠𝐸𝐺𝑅: masa total de polifenoles en el extracto retenido (mg EAG).

5. ANÁLISIS DE RESULTADOS

5.1. Caracterización fisicoquímica del subproducto de guayaba

A continuación, en el Cuadro XXVI, se muestran los resultados de la caracterización

fisicoquímica realizada al SG, seguidamente se comenta su implicación sobre el valor del

subproducto como fuente de compuestos antioxidantes y sobre la extracción de estos.

Cuadro XXVI. Propiedades fisicoquímicas del subproducto de guayaba, del primer lote, utilizado

como materia prima para la obtención de los extractos etanólicos correspondientes a los ensayos

de la determinación de la relación S:L, tiempo de proceso y optimización.

Análisis químico Resultado

Composición química

Humedad1 (g/100 g) 72,58 ± 0,08

Carbohidratos totales2 (g/100 g) 23,53 N/A

Fibra dietética1 (g/100 g) 18,90 ± 0,07

Carbohidratos disponibles2 (g/100 g) 4,63 N/A

Proteína1 (g/100 g) 1,30 ± 0,01

Acidez3 (g EAC/100 g) 0,74 ± 0,02

Cenizas1 (g/100 g) 0,60 ± 0,01

Grasa1 (g/100 g) 0,20 ± 0,03

Polifenoles totales3 (mg EAG/100 g) 979 ± 16

Vitamina C total3 (mg/100 g) 69,4 ± 0,6

Carotenoides totales3 (µg Eβ-C/100 g) 1867 ± 123

Otros parámetros fisicoquímicos

Sólidos solubles3 * (°Brix) 9,1 ± 0,50

pH3 3,61 ± 0,02

1: Reportado como promedio ± desviación estándar (n=2),

2: Obtenido por diferencia, 3: Reportado como promedio ±

desviación estándar (n=3) y *: Corregido por acidez. N/A: No

Aplica.

El SG está compuesto en un 91% por agua y fibra dietética, lo cual invita a visualizar la matriz

de extracción como una red de fibras hidratadas entre las que se encuentra inmersa una fracción

83

importante de compuestos hidrosolubles como azúcares, ácidos orgánicos, minerales, antioxidantes

y vitamina C. Esquemáticamente, se puede representar como se muestra en la Figura 28.

Nótese que, en esta simplificación, se considera la presencia de polifenoles en su estado

disponible y asociados a los polisacáridos o fibras que conformaban las paredes celulares

(Ignat et al., 2011). Además, considera que la red de fibras está conformada, en parte, por

estructuras celulares laceradas debido a la aplicación de operaciones mecánicas y enzimáticas

durante el procesamiento de la pulpa (ver Figura 28).

Figura 28. Representación gráfica simplificada de la matriz de extracción o SG.

Es importante tener en cuenta que la fracción de compuestos hidrosolubles se coextrae con los

compuestos antioxidantes de interés, debido a que se están utilizando mezclas de agua-etanol como

disolvente, cuya polaridad es afín a esta amplia gama de compuestos y no es exclusivamente

selectiva para polifenoles y carotenoides. Por ende, es razonable asumir que los extractos obtenidos

a lo largo del estudio tienen una fracción de sólidos no caracterizados que corresponde a estos

compuestos polares co-extraídos.

En cuanto al contenido de vitamina C, en el SG queda un remanente aproximado del 30% del

contenido de la fruta fresca (Lim, 2011). Esta vitamina, al ser una sustancia antioxidante, se

considera una interferencia en la cuantificación de polifenoles totales por el método de Folin-

Ciocalteu (CITA, 2015). Por lo anterior, se cuantificó para determinar la necesidad de agregar

pasos de eliminación de interferencias en el método de análisis. En concordancia con el resultado,

se utilizaron cartuchos de separación en fase sólida que permitieron la separación y estimación del

aporte de las interferencias al resultado del método.

84

Respecto al contenido de polifenoles, se puede decir que es considerablemente alto si se

compara con el presente en otras frutas tropicales (ver Figura 29). De hecho, se encuentra en el

mismo nivel que la mora y sus semillas, los cuales han mostrado ser una fuente muy importante y

valiosa de compuestos fenólicos (Soto, 2014).

Figura 29. Comparación del contenido de polifenoles totales del SG con el de 29 frutas

y otros subproductos (SPIM: subproducto del procesamiento industrial de mora) (González, 2011;

Soto, 2014).

Algo interesante de rescatar de la figura anterior es que el contenido de polifenoles en el SG es

casi 50% superior al de la fruta fresca (guayaba rosada); lo cual puede atribuirse a que el SG resulta

de un tratamiento enzimático, el cual normalmente aumenta el contenido de polifenoles disponibles

por la hidrólisis de los polisacáridos a los que estos están asociados (Buchert et al., 2005;

Puupponen-Pimiä et al., 2008). Además, a la pulpa se le aplica un prensado posterior, operación

en la que se elimina hasta un 10% de agua, y ello puede conllevar a la concentración de los

polifenoles presentes inicialmente en la pulpa, los cuales quedan atrapados (en su mayoría) en la

torta de prensado.

El SG de guayaba también posee un contenido apreciable de carotenoides totales, el cual se

encuentra en un nivel intermedio-bajo, si se compara con diferentes frutas y vegetales (ver

Figura 30). Nótese que la cantidad de carotenoides remanente en el SG (6 809 µg/100 g bs) es

aproximadamente un 30% de la cantidad presente en la fruta, la cual por sí sola tiene un alto

contenido.

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600A

rándan

o

SG

SP

IM

Mora

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añón

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fé

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ey

Guay

aba…

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Guav

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Guan

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ón c

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Pit

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Mar

acuyá

Pit

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illa

Mel

ón

Pap

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San

día

Nar

anji

lla

Poli

fen

ole

s to

tale

s P

Ts

(mg

EA

G/1

00

gb

h)

85

El subproducto del prensado de aceite de palma contiene carotenoides en el mismo orden que

el SG (4 360 µg/100 g bs) y con este se han realizado estudios de extracción donde se han

desarrollado procesos sencillos, con altos rendimientos y económicamente factibles (Cárdenas et

al., 2015), lo cual conlleva a pensar que el SG es una fuente promisoria para el aprovechamiento

de estos compuestos.

Otro detalle importante que se deriva de la caracterización es que el SG tiene un pH

natural menor a 4. Es decir, en la etapa de optimización, se esperaría que parte de la fracción de

polifenoles no extraíbles se libere utilizando valores de pH inferiores o superiores a este valor. Sin

embargo, la explicación y tendencias obtenidas serán discutidas más adelante.

Figura 30. Comparación del contenido de carotenoides totales del SG con el de 11 frutas y

vegetales (Kumar, 2015; USDA, 2017).

En esta primera etapa del estudio, no se contempló la obtención del perfil de polifenoles y

carotenoides en el SG. Sin embargo, el conocimiento de las especies específicas presentes, así

como sus cantidades relativas, es de gran utilidad para evaluar con mayor profundidad el valor del

subproducto y sus extractos. Existen estudios en los que se identifican exhaustivamente las especies

de polifenoles y carotenoides presentes en la guayaba cv. Criolla; sin embargo, estas pueden variar

con el procesamiento al que se somete la pulpa para obtener el SG (despulpado, tratamiento térmico

y enzimático y prensado). Además, actualmente no existen estudios en donde se hayan determinado

las concentraciones de cada especie, por lo que no es posible identificar grupos mayoritarios.

Conocer las especies y las cantidades presentes en la matriz hubiera, no solo permitido

monitorear la migración de compuestos específicos de interés durante la extracción, sino también

determinar la ocurrencia reacciones de degradación para evitar las condiciones que las promuevan.

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

8000

9000

10000

Ca

rote

no

ides

to

tale

s C

Ts

(µg/

10

0 g

)

86

Es decir, con esta información, se hubieran obtenido condiciones de extracción aún más

específicas.

5.2. Determinación de la relación sólido-líquido

Antes de iniciar con la discusión de los resultados, es preciso aclarar que la variable S:L fue la

primera en ser prefijada debido a que Nawaz et al. (2006) recomienda adoptar esta estrategia al

realizar estudios de optimización de extracciones. De hecho, existe una gran cantidad de estudios

de extracción de polifenoles, a partir de frutas o sus subproductos, en donde esta variable se fija

realizando experimentos preliminares a la optimización por superficies de respuesta. Además, los

rangos de S:L trabajados se encuentran de 1:4 a 1:25, como el utilizado en el presente estudio

(Nawaz et al., 2006; Kong et al., 2010; Librán et al., 2013; Roopchand et al., 2013).

La razón de esta estrategia es que un aumento en el valor de S:L produce un aumento en el

rendimiento de extracción. Se ha visto que esta tendencia se mantiene independientemente del valor

de variables como T, %EtOH y pH, mientras estos sean constantes para todos los niveles de S:L

en evaluación. Sin embargo, esto se cumple solo si los valores de S:L se comparan en un tiempo

en que todos los sistemas hayan alcanzado el equilibrio, de lo contrario, las variaciones en las

velocidades de transferencia pueden conllevar a resultados sesgados donde las S:L menores, y más

lentas, mostrarán menores valores de concentración a los que realmente se pueden alcanzar en el

equilibrio (Bucic´ et al., 2007; Pompeu et al., 2009).

Es importante recalcar que los ensayos se realizaron considerando estas recomendaciones. El

tiempo de extracción utilizado fue de 2 h, suficiente para que todos los tratamientos se encontrasen

próximos a un estado de equilibrio, tal y como se demuestra a continuación.

En el sistema de balones utilizado en estos ensayos, el menor nivel (S:L=1:5) alcanzó una

concentración de 1 116 mg EAG/L a las 2 h de extracción, valor que se encuentra en el mismo

orden de magnitud que el valor de equilibrio alcanzado en las cinéticas realizadas en el reactor:

1 024 mg EAG/L (Apartado 5.3.2.). Respecto al resto de niveles, al ser procesos más rápidos, es

razonable pensar que a las 2 h también se aproximaron al estado de equilibrio.

El objetivo del diseño experimental utilizado era estimar a partir de cuál valor de S:L ya no se

obtenía un aumento importante en los polifenoles totales extraídos por unidad de masa de SG. A

continuación, en las Figura 31 y 32, se muestran los resultados de la determinación. En la primera,

se reportan las concentraciones de polifenoles en los extractos y, en la segunda, los polifenoles

totales extraídos por masa de SG expresado en base seca.

87

Figura 31. Efecto de la relación sólido-líquido de extracción sobre la concentración de polifenoles

totales en los extractos de guayaba (pH=4,50; T= 47,5 °C; %EtOH= 62,5 m/m; te=2 h y vag=450

rpm). I: intervalo de confianza al 95%, n=5. Letras diferentes indican diferencias significativas

(α=0,05).

Figura 32. Efecto de la relación sólido-líquido de extracción sobre los polifenoles totales extraídos

del subproducto de guayaba (pH=4,50; T= 47,5 °C; %EtOH= 62,5 m/m ºC; te=2 h y vag=450 rpm).

I: intervalo de confianza al 95%, n=5. Letras diferentes indican diferencias significativas (α=0,05).

2 155 a2 226 ab

2 316 a2 472 bc

2 470 ac

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

1:5 1:8 1:10 1:15 1:20

Po

life

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tota

les

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PT

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(mg E

AG

/10

0 g

SG

bs)


S:L (MSG: MD)

0

250

500

750

1000

1250

1500

1:5 1:8 1:10 1:15 1:20

Co

nce

ntr

aci

ón

de

po

life

no

les

tota

les

Cn P

Ts

(mg E

AG

/L E

G)

Relación de extracción sólido-líquido

S:L (MSG: MD)

1 116 a

720 b

600 c

428 d 321 e

88

Al observar la tendencia de la Figura 31, es claro que al aumentar los valores de S:L

disminuye la concentración de polifenoles en el extracto o fase líquida, lo cual se debe a que se

utiliza una mayor proporción de disolvente y ello produce un efecto de dilución en el soluto

extraído. Una mayor proporción de la fase líquida durante la extracción es deseable ya que, al haber

proporcionalmente más disolvente, este tiene mayor capacidad para extraer y contener soluto, pues

el límite de solubilidad de los compuestos está más distante (Radojkovic et al., 2012).

La condición de equilibrio en un sistema de extracción es el estado en donde la concentración

de soluto en el sustrato es igual a la de la fase líquida (Tzias, 2003); por ende, concentraciones

bajas en la fase líquida equivalen a una menor cantidad de polifenoles remanentes en el sustrato y

a un mayor rendimiento de extracción. Considerando que estos resultados corresponden a sistemas

en equilibrio, se esperaría que un aumento en el valor de S:L, produjera una mayor extracción de

polifenoles por unidad de masa de SG, lo cual es precisamente la tendencia obtenida en la

Figura 32.

Ahora bien, nótese en esta misma figura que el aumento en los valores de S:L provoca un

aumento apreciable, a nivel práctico y no estadístico, de los polifenoles extraídos, alcanzando

incrementos de hasta 13%, si se compara la S:L 1:5 con la 1:15. Esto es cierto hasta alcanzar la

relación 1:15, punto a partir del cual parece haberse alcanzado un máximo en la transferencia de

masa, pues no se da un aumento a nivel práctico del contenido de polifenoles extraídos en

comparación con la 1:20.

Esto puede deberse a que a partir de 1:15, el sustrato ya se encuentra cerca de estar agotado y

se requieren cambios más espaciados de S:L para observar mayores incrementos en los polifenoles

extraídos (Tzias, 2003; Bucic´ et al., 2007; Pompeu et al., 2009). Sin embargo, utilizar valores S:L

muy elevados dificulta el manejo posterior del disolvente, debido a que se obtienen extractos de

muy baja concentración que luego deben ser concentrados (Tzias, 2003). Por ejemplo, autores

como Ghafoor et al. (2009) utilizaron relaciones S:L de 1:50 para semillas de uva molidas y las

concentraciones de los extractos obtenidos eran inferiores a los 50 mg EAG/L.

A partir de estos resultados se podría concluir que la mejor relación a utilizar es la 1:15, debido

a que es la mínima que permite extraer una mayor cantidad de polifenoles por gramo de SG, y

porque al tener asociada las menores concentraciones en la fase líquida, la transferencia de masa

ocurre más rápido y, por ende, se tendrá un proceso más eficiente debido a que hay un mayor

gradiente de concentración entre el sustrato y el disolvente (Tzias, 2003; Bucic´ et al., 2007;

Pompeu et al., 2009).

Sin embargo, otro criterio de decisión que debe tomarse en cuenta es que luego de la extracción,

se deben aplicar operaciones de evaporación-recuperación del disolvente, y hasta secado por

liofilización o atomización, para obtener un extracto concentrado. Con esto en consideración, la

concentración en el extracto debe ser lo suficientemente elevada como para poder facilitar estos

pasos posteriores, los cuales son energéticamente demandantes (Caballero, Olivares y Zúñiga,

2017).

89

Con esto en mente, el tratamiento 1:5 también fue considerado, pues si bien con este se obtiene

13% menos polifenoles y se requiere de un mayor tiempo para alcanzar el equilibrio, en

comparación con el 1:15, los extractos son 60 % más concentrados. Por ello, valía la pena evaluar

si la diferencia en tiempo y polifenoles extraídos por masa de SG que ofrecía la relación 1:15

realmente compensaba la diferencia en la concentración de ambos extractos. Para ello, se procedió

a determinar el tiempo de extracción mediante cinéticas, utilizando ambas relaciones.

5.3. Establecimiento del tiempo de proceso

A continuación, se muestran los resultados obtenidos en la determinación del tiempo de proceso

para la extracción de polifenoles en un reactor a escala de laboratorio. Los datos experimentales

tomados para la construcción de las cinéticas de extracción fueron ajustados a dos diferentes

modelos de incremento exponencial hasta un máximo: el de primer orden, con dos parámetros; y

el de dos velocidades, con cuatro parámetros.

El tiempo de proceso escogido para la realización de las corridas de optimización fue definido

a partir del modelo de primer orden. Sin embargo, la idoneidad de cada modelo, el ajuste de ambos

a los datos experimentales, las diferencias entre los valores de S:L evaluados y el error asociado a

la determinación del tiempo con el modelo de primer orden, se discutirán en los dos siguientes

apartados.

5.3.1. Modelo de primer orden

En el Cuadro XXVII, se muestran los resultados de los parámetros de regresión y el ajuste

del modelo a los datos experimentales, para los dos valores de S:L evaluados (ver Ecuación (1)) .

La concentración de equilibrio es la máxima concentración que puede ser alcanzada en la fase

líquida, una vez el sistema ha entrado en equilibrio, punto a partir del cual la concentración se

mantiene constante en el tiempo (mientras no ocurra una degradación del soluto). Por otro lado, la

constante de rapidez es un indicador de la velocidad de transferencia del soluto, desde la fase sólida

hacia el disolvente (Sant’Anna et al., 2012).

Cuadro XXVII. Modelo de primer orden de la cinética de extracción batch, en un reactor a escala

de laboratorio, de los polifenoles totales presentes en un subproducto de guayaba, para dos

diferentes relaciones sólido-líquido. *


S:L (MSG:MD)

Concentración de equilibrio

𝐶𝑛𝑃𝑇𝑆∞(mg EAG/L)

Constante de rapidez

𝑘 (min-1)

Coeficiente de

determinación ajustado

R2-adj

1:5 936 ± 30 0,14 ± 0,05 0,8837

1:15 373 ± 9 0,20 ± 0,05 0,9468 *Condiciones de extracción: pH=4,50; T= 47,5 °C; %EtOH= 62,5 m/m y vag=450 rpm.

±: Intervalo de confianza al 95% (n=2).

90

Lo primero que debe notarse del cuadro anterior es que la concentración de equilibrio del

tratamiento 1:5 es 60% superior a la del 1:15, la magnitud de esta diferencia es igual a la obtenida

en los ensayos del objetivo 1. Lo anterior, se atribuye al fenómeno de dilución que experimenta el

soluto con los valores de S:L superiores debido a la adición de una mayor proporción de disolvente

(Radojkovic et al., 2012). En contraposición, la constante de rapidez es mayor para el 1:15, debido

a que mayores gradientes de concentración entre la fase sólida y líquida, hacen más rápida la

transferencia del soluto desde el sólido hacia el disolvente (Sant’Anna et al., 2012).

Este modelo ha sido ampliamente utilizado para describir la extracción de polifenoles a partir

de matrices vegetales, especialmente de subproductos del procesamiento de uvas (Sant’Anna et al.,

2012). De hecho, obsérvese como los coeficientes de determinación ajustados resultaron superiores

a 0,85, por lo cual se consideraron aceptables, llevando a la conclusión de que el modelo era el

adecuado para predecir el comportamiento de la variable respuesta.

Con base en lo anterior, se procedió a calcular el tiempo de extracción para cada valor de S:L

(ver Ecuación (3)), cuyos resultados se muestran en el Cuadro XXVIII.

Cuadro XXVIII. Tiempos requeridos para extraer el 99% de la concentración de polifenoles en el

equilibrio (𝒏=0,99), según el modelo de primer orden, utilizando un reactor como sistema de

extracción batch a escala de laboratorio.


S:L (MSG:MD)


𝑡𝑒 (min)

1:5 33,9

1:15 23,0

Tal y como se esperaba, el tiempo de extracción de la relación 1:15 es menor al de la 1:5

debido a la diferencia en las velocidades de transferencia de masa comentadas anteriormente. Cabe

destacar que esa diferencia de 11 minutos no representa una ventaja substancial a nivel de proceso,

contrario a la diferencia de 60% en la concentración de equilibrio que tiene de ventaja la relación

1:5 respecto a la 1:15. Por ende, es claro que la relación 1:5 es la más adecuada para utilizar en la

etapa de optimización. El tiempo establecido para las corridas del tercer objetivo fue de 35 minutos.

Una vez prefijado este parámetro de proceso, es preciso observar con detalle la Figura 33,

donde se muestran las curvas de mejor ajuste de las cinéticas. Es claro que, para ambos valores de

S:L, la ecuación de la curva parece llegar a la concentración de equilibrio antes de lo que parecen

sugerir los puntos experimentales. Además, a partir de los 200 min, los puntos experimentales

rebasan la línea asintótica correspondiente a la concentración de equilibrio. Ambas situaciones

parecen provocar intervalos de predicción demasiado amplios.

A pesar de que ya se había establecido el tiempo de proceso, en un análisis posterior de los

datos, se notaron las señas anteriores y se procedió a utilizar otro modelo de regresión, el cual

presenta un mejor ajuste. Debido a esto, una discusión más profunda sobre el comportamiento del

91

sistema, el error asociado a la determinación del tiempo con el modelo de primer orden y la

comparación de los resultados con otros estudios se ofrece en el Apartado 5.3.2.


totales presentes en un subproducto de guayaba, utilizando dos diferentes relaciones sólido-líquido

y un ajuste a un modelo de primer orden (pH=4,50; T= 47,5 ºC; %EtOH= 62,5 m/m y vag=450

rpm). IC: Intervalo de confianza (n=2), IP: Intervalo de predicción.

5.3.2. Modelo de dos velocidades

En el Cuadro XXIX, se muestran los resultados de los parámetros de regresión y el ajuste del

modelo a los datos experimentales (ver Ecuación (4)), para los dos valores de S:L evaluados. Este

modelo aplica para sistemas en lo que suceden dos procesos de extracción simultáneos: uno rápido

y otro lento. Los primeros parámetros de concentración de equilibrio y constante de rapidez están

asociado al proceso rápido y los últimos al proceso lento.

Este modelo ha sido utilizado anteriormente en la extracción de polifenoles a partir de

matrices que han experimentado una fragmentación mecánica previa de la estructura celular, como

Tiempo de extracción te (min)

0 100 200 300 400 500

Co

nc

en

tra

ció

n d

e p

olife

no

les

CnP

Ts (

mg

EA

G/L

EG

)

0

200

400

600

800

1000

1200

S:L = 1:5

S:L = 1:15

Curva de regresión

IC al 95%

IP al 95%

𝐶𝑛𝑃𝑇𝑠 = 𝐶𝑛𝑃𝑇𝑆∞ ∙ (1 − 𝑒−𝑘∙𝑡𝑒)

S:L=1:5

S:L=1: 15

92

frutos de grosella negra molidos (Cacace y Mazza, 2003). Este es el caso del SG, el cual ha

experimentado operaciones como despulpado, tratamiento enzimático y prensado.

Cuadro XXIX. Modelo de dos velocidades de la cinética de extracción batch, en un reactor a

escala de laboratorio, de los polifenoles totales presentes en un subproducto de guayaba, para dos

relaciones sólido-líquido. *

Relación sólido-

líquido

S:L (MSG:MD)

Concentración de equilibrio

(mg EAG/L)

Constantes de rapidez

(min-1)

Coeficiente de

determinación

ajustado R2-adj 𝐶𝑛𝑃𝑇𝑆∞1 𝐶𝑛𝑃𝑇𝑆∞2 𝑘1 𝑘2

1:5 690 ± 77 334 ± 70 0,3 ± 0,2 0,012 ± 0,005 0,9827

1:15 287 ± 51 102 ± 48 0,4 ± 0,3 0,02 ± 0,01 0,9796 *Condiciones: pH=4,50; T= 47,5; %EtOH= 62,5 m/m ºC y vag=450 rpm).

±: Intervalo de confianza al 95% (n=2).

Utilizar este modelo tiene sentido si se considera que en el SG existe una fracción de polifenoles

de bajo peso molecular que está más disponible y, por ende, se extrae rápido, mientras hay otra de

polifenoles de alto peso molecular asociados a componentes de la pared celular que requieren de

hidrólisis ácida y más tiempo para ser extraída (ver constantes de rapidez). Por ejemplo, según la

caracterización de polifenoles presentes en la guayaba rosada cv. Criolla realizada por Rojas et al.

(2015), algunos de esos polifenoles disponibles pueden ser flavonoides, derivados de ácido gálico

y cinámico, benzofenonas y dihidrochalconas; mientras que los no disponibles pueden ser

proantocianidinas y elagitaninos.

Nótese que si se suman las dos concentraciones de equilibrio de ambos procesos se obtiene una

concentración de equilibrio total cuya magnitud es similar a la obtenida con el primer modelo

(reportada en el Cuadro XXVII), reafirmando que el proceso de extracción sugerido por el modelo

de primer orden puede ser descompuesto es dos procesos de diferentes velocidades y este último

describe mejor el comportamiento de los datos experimentales.

Del cuadro anterior también es importante resaltar que los coeficientes de determinación

ajustados son superiores a los que se muestran en el Cuadro XXVII, evidenciando que el presente

modelo es más adecuado para describir el sistema de extracción utilizado. De hecho, en la siguiente

figura, es claro que la curva de regresión se ajusta mejor a los datos experimentales, ya que estos

se encuentran aleatoriamente dispersos por arriba y debajo de la curva. Incluso, los intervalos de

predicción son más estrechos; es decir, el modelo podría utilizarse para obtener una predicción más

precisa de los valores no medidos.

93


totales presentes en un subproducto de guayaba, utilizando dos relaciones sólido-líquido y un ajuste

a un modelo de incremento exponencial hasta un máximo de cuatro parámetros (pH=4,50; T=

47,5 ºC; %EtOH= 62,5 m/m y vag=450 rpm). IC: Intervalo de confianza (n=2), IP: Intervalo de

predicción.

En el estudio realizado por Quirós (2017), se obtuvo una constante de rapidez para la extracción

de polifenoles totales, a partir de semilla de mora entera y con un sistema similar, de 0,0130 min-1

(aplicando un modelo de pseudo primer orden, T=60 °C, S:L=1:2,5; %EtOH=67,5 y Vag=275 rpm).

Este valor es al menos 10 veces inferior al obtenido en el presente estudio, incluso cuando se trabajó

a una temperatura más de 10 °C superior.

Esto puede deberse a que los modelos de pseudo primer orden aplican para sustratos cuya

velocidad de extracción está determinada por procesos de difusión del soluto dentro del sustrato

antes de llegar al seno del disolvente, los cuales suelen ser lentos debido a la interacción del soluto

con las microestructuras y poros del sustrato (Sant’Anna et al., 2012); tal es el caso de los

polifenoles que se encuentran en el interior de la semilla de mora.

Caso contrario al SG, en el cual una alta fracción de polifenoles parece encontrarse disponible

para su extracción inmediata al entrar en contacto con el disolvente, debido a las operaciones de

fragmentación enzimática y mecánica que este ha experimentado. Otra razón es que la relación S:L

Tiempo de extracción te (min)

0 100 200 300 400 500

Co

nc

en

tra

ció

n d

e p

olife

no

les

to

tale

s

CnP

Ts (

mg

EA

G/ L

EG

)

0

200

400

600

800

1000

1200

S:L = 1:5

S:L = 1:15

Curva de regresión

IC al 95%

IP al 95%

𝐶𝑛𝑃𝑇𝑠 = 𝐶𝑛𝑃𝑇𝑆∞1 ∙ (1 − 𝑒−𝑘1∙𝑡𝑒)+ 𝐶𝑛𝑃𝑇𝑆∞2 ∙ (1 − 𝑒−𝑘2∙𝑡𝑒)

S: L=1:5

S: L=1: 15

94

y la Vag utilizadas para el SG son de casi el doble de magnitud, y se sabe que ambas variables

agilizan la transferencia de masa.

Con el modelo de dos velocidades se observa que el proceso de extracción descrito es más lento

de lo que sugería el modelo de primer orden (comparar Figura 33 y 34), por lo que el tiempo de

extracción prefijado con este último modelo es inferior al que realmente se requiere para que se

extraiga el 99% de los polifenoles en el equilibrio. La consecuencia es que, con el tiempo

predefinido para los ensayos de optimización, en realidad se estará extrayendo una fracción inferior

de polifenoles, tal y como se muestra en el Cuadro XXX.

Cuadro XXX. Fracción extraída en la concentración en el equilibrio, según el modelo de dos

velocidades, para los tiempos de extracción evaluados, utilizando un reactor como sistema de

extracción batch a escala de laboratorio.


S:L (MSG:MD)

Tiempo de extracción*

𝑡𝑒 (min)

Fracción de la concentración

de equilibrio 𝑛

1:5 33,9 0,79

1:15 23,0 0,85

*Definido utilizando el modelo de primer orden.

Tal y como se discutió en el apartado anterior, en la Figura 34, se sigue manteniendo la

tendencia de que la relación 1:15 es un proceso más rápido, pues se llega en un menor tiempo a la

concentración de equilibrio. De hecho, en el Cuadro XXX puede verse que esta relación alcanza

una fracción mayor de la concentración de equilibrio 11 minutos antes que la 1:5. Sin embargo,

aunque el tiempo es menor, la concentración de la relación 1:5 sigue siendo inferior, debido al

efecto de dilución. Por ello, se mantiene la conclusión de que la diferencia en tiempo no compensa

la diferencia en concentración y la 1:5 sigue siendo la relación más adecuada.

5.3.3. Comparación del sistema de balones y el reactor

En el siguiente cuadro se muestra una comparación de la concentración obtenida en la fase

líquida a las 2 h de extracción en los dos diferentes sistemas utilizados. Lo anterior se realizó con

el objetivo de evaluar si existe alguna consecuencia importante por haber definido la relación S:L

en un sistema diferente al utilizado para definir el resto de variables.

95

Cuadro XXXI. Comparación de la concentración de polifenoles totales alcanzada en la fase líquida

con los dos sistemas de extracción utilizados.


S:L (MSG:MD)

Concentración a las 2 h de extracción (mg EAG/L)

Sistema de balones* Reactor**

1:5 1 116 ± 58 945

1:15 428 ± 7 383

*Utilizado para definir la relación S:L.

**Sistema utilizado para definir el resto de las variables. Concentraciones obtenidas por ecuación de

la curva de regresión correspondientes al modelo de dos velocidades.

Como puede apreciarse, las concentraciones obtenidas en el reactor son inferiores a las

obtenidas con el sistema de balones, contrario a lo esperado, considerando que el reactor suele ser

un sistema más eficiente. Sin embargo, este último presenta un área de calentamiento inferior a la

que del sistema de balones, pues en este último los balones se encontraban totalmente inmersos en

un baño de agua a la temperatura de trabajo (ver Figura 18), mientras que el reactor estaba cubierto

solo en la franja media por una chaqueta eléctrica (ver Figura 22).

De hecho, los tiempos de inducción evidencian la influencia de este factor, ya que en el

sistema de balones los tiempos eran inferiores al minuto, mientras que los del reactor se

encontraban entre los 20 y 25 min. Una oportunidad de mejora para el equipo utilizado es usar un

reactor con doble chaqueta para aumentar el área de transferencia de calor y minimizar los tiempos

de inducción.

Además, al utilizar el sistema de balones se tuvo una gran dificultad para regular la temperatura

de los cinco baños al mismo tiempo, en algunos casos las temperaturas alcanzaban hasta 60 ° C por

algunos minutos, mientras se intentaba corregir añadiendo hielo. Un aumento en la temperatura

conlleva a un aumento en la solubilidad de los compuestos en el disolvente y aumenta la capacidad

de extracción de este, probablemente esta sea la razón por la que se pudieron alcanzar

concentraciones superiores con el sistema de balones (Wijngaard et al., 2012).

A pesar de esta situación, la diferencia en concentración entre ambas relaciones es de

aproximadamente 60% en ambos sistemas. Por ende, podría decirse que los resultados obtenidos

en el sistema de balones son extrapolables al reactor.

5.4. Optimización del proceso de extracción

Para encontrar las mejores condiciones de pH, T y %EtOH a utilizar durante la extracción,

tanto de polifenoles como de carotenoides, se obtuvieron las ecuaciones matemáticas del modelo

cuadrático y las superficies de respuesta asociadas, las cuales se muestran en las Ecuaciones (23),

(24) y (25), y en las Figuras 35, 36 y 37, respectivamente. En el caso de los polifenoles y

carotenoides, se identificó una región de máxima extracción y, en el caso de la turbidez, una región

mínima, ya que valores altos de este parámetro pueden generar inconvenientes en el rendimiento y

96

desempeño de operaciones posteriores de purificación como la microfiltración tangencial (Soto,

2014).

Para la obtención de los modelos, se tomaron únicamente los términos significativos de los

modelos obtenidos (ver ANDEVAs en Cuadro A-V, A-VI y A-VII). Además, se evaluó la calidad

del ajuste con los parámetros que se resumen en el siguiente cuadro.

Cuadro XXXII. Evaluación del ajuste y la significancia de los modelos generados mediante la

metodología de superficie de respuesta.

Modelo Coeficiente de

determinación

ajustado R2-adj

Probabilidad

de falta de

ajuste pfa

Probabilidad

del modelo

pmodelo

Distribución

de residuos**

Concentración de polifenoles

totales CnPTs (mg EAG/L) 0,914 0,115 2,11 x10-7* Aleatoria

Concentración de carotenoides

totales CnCTs (µg Eβ-C/L) 0,936 0,320 9,32 x10-10* Aleatoria

Turbidez

Tb (NTU) 0,867 0,446 3,43 x10-6* Aleatoria

*Resultado significativo por tener una probabilidad inferior a α=0,05. **Gráficas se muestran en Figura A-7 en

apartado de Anexos.

De ellos, es importante resaltar lo siguiente: todos los modelos presentaron R2-aj superiores a

0,85, la pfa no fue significativa en ningún caso, es decir, los modelos obtenidos se ajustan

adecuadamente al comportamiento de las variables respuesta y la magnitud del error puro o

experimental es aceptable. Por último, para todos, la probabilidad del modelo fue significativa y la

distribución de residuos aleatoria, indicando que los modelos son capaces de predecir el

comportamiento de las variables respuesta de manera significativa, sin sobreestimar o subestimar

los valores.

5.4.1. Polifenoles totales

La siguiente ecuación y figura muestran el comportamiento de la extracción de los

polifenoles totales en función de las variables independientes. Las regiones rojas representan una

máxima extracción, mientras que las verdes son de mínima extracción.

(23) 𝐶𝑛𝑃𝑇𝑠 = 685,230 − 46,882 ∙ 𝑝𝐻 + 40,953 ∙ 𝑝𝐻2 + 80,914 ∙ 𝑇 − 212,554 ∙ %𝐸𝑡𝑂𝐻 − 76,315 ∙ %𝐸𝑡𝑂𝐻2

97


polifenoles totales en los EGs obtenidos utilizando un reactor como sistema de extracción batch

(S:L=1:5, t=35 min y vag=450 rpm).

Es claro en la Figura 35.a que rangos de pH entre 4,50 y 6,00 desfavorecen la extracción de

polifenoles, mientras que valores de pH más ácidos y cercanos a 2,00 la favorecen. De igual forma,

valores de pH cercanos a la neutralidad parecen indicar un incremento en la extracción de

polifenoles; si bien este incremento parece ser inferior a lo obtenido en pH ácidos, la tendencia

parece indicar que si se hubieran incluido puntos experimentales a pH básicos el incremento

hubiera sido similar al que se obtuvo para pH ácidos.

Lo anterior concuerda con lo esperado, ya que las reacciones de hidrólisis de ésteres pueden

ser catalizadas tanto a valores de pH ácidos, como básicos (Yurkanis, 2008). Estas reacciones son

las que permiten la liberación de los polifenoles no disponibles que se encuentran asociados a

componentes de la membrana celular (Ignat et al., 2011; Librán et al., 2013), por lo que el aumento

en la concentración de polifenoles en estos extremos de pH se podría atribuir a la liberación de este

tipo de compuestos.

La razón de limitar el rango de pH a la escala ácida es porque algunos autores han reportado

que a pH ácidos aumentan las propiedades antioxidantes de los polifenoles pues, al desprotonarse,

el grupo hidroxilo pasa a su forma aniónica y ello aumenta la capacidad antioxidante de la molécula

(Apak et al., 2011).

En el caso de la temperatura, en la Ecuación (23) puede observarse que solo resultó

significativo el efecto lineal; por ello, en la Figura 36.a, se observa que al aumentar la temperatura

se da un aumento en la extracción de polifenoles. Lo anterior se debe a que al incrementar la

temperatura las propiedades termodinámicas del agua como la tensión superficial y la constante

dieléctrica disminuyen considerablemente, alcanzando valores similares a la de los de disolventes

orgánicos; además, aumenta la solubilidad de los compuestos y con ello la capacidad de extracción

del disolvente (Wijngaard et al., 2012).

Si bien se ha reportado que temperaturas muy elevadas pueden causar la degradación de los

polifenoles (Chanioti et al., 2014), los tiempos utilizados en el presente estudio fueron muy cortos

98

(inferiores a 1 h) y no se logró observar este efecto. Además, se utilizaron temperaturas no mayores

de 60 °C. También es posible que el tipo de compuestos presentes en el SG no sean tan susceptibles

a la degradación, como lo son las antocianinas, por ejemplo, las cuales son conocidas como

térmicamente susceptibles, tanto que temperaturas superiores a 50°C aceleran su degradación (Dai

et al., 2009).

Es importante aclarar que es posible que las concentraciones asociadas a temperaturas

inferiores a los 47,5 °C hayan sido subestimadas por el modelo, debido a que se utilizó un tiempo

de extracción determinado a 47,5 °C, y al disminuir la temperatura se requiere de un mayor tiempo

para alcanzar la concentración de equilibrio (Pompeu et al., 2009). Es decir, que utilizando un

tiempo de extracción de 35 minutos estas temperaturas pueden mostrar concentraciones menores a

las reales, porque probablemente en ese tiempo el sistema está más lejos del equilibrio respecto a

las temperaturas superiores.

Por la razón anterior, para definir el tiempo, es preferible realizar una cinética utilizando las

condiciones que se sospechen producirán los tiempos más largos, en vez de utilizar las condiciones

del punto central del DCCR, ya que esta forma permite comparar el efecto de la temperatura

estando todos los tratamientos cerca del equilibrio. La desventaja, es que esto hubiera generado

corridas más largas. Además, al final de la optimización, igual es necesario realizar una cinética a

la temperatura determinada como óptima para determinar el tiempo real de proceso.

Por último, en la Figura 35.b, es claro que para maximizar la extracción de polifenoles se

requieren concentraciones de etanol entre 30-50%, ya que valores inferiores y superiores parecen

reducir las concentraciones obtenidas, aunque faltan puntos experimentales en los valores

inferiores para poder realizar esta aseveración. Esto concuerda con lo reportado por

Roopchand et al. (2013), donde la incorporación de 50% etanol al disolvente, aumentó la

solubilidad de los polifenoles de la cáscara de arándano cuatro veces más respecto al agua.

Es importante notar en la Ecuación (23) que no se obtuvieron interacciones significativas

entre los factores evaluados. Es decir, que la magnitud del efecto de cada variable independiente

sobre la concentración de polifenoles no se ve modificada por el valor que tomen las otras dos

variables restantes.

5.4.2. Carotenoides totales

La siguiente ecuación y figura muestran el comportamiento de la extracción del otro grupo

de compuestos estudiados, los carotenoides totales. Las regiones rojas son de máxima extracción,

mientras que las verdes son de mínima extracción.

(24) 𝐶𝑛𝐶𝑇𝑠 = 1499,06 − 244,99 ∙ 𝑝𝐻2 + 1654,31 ∙ %𝐸𝑡𝑂𝐻 + 534,30 ∙ %𝐸𝑡𝑂𝐻2

99


carotenoides totales en los EGs obtenidos utilizando un reactor como sistema de extracción batch

(S:L=1:5, t=35 min y vag=450 rpm).

En el caso de los carotenoides, el efecto del pH es inverso al obtenido para los polifenoles

totales, ya que se obtiene un máximo a un valor de pH cercano al del SG (4-5) y un decrecimiento

en los valores extremos. No obstante, el efecto de esta variable es muy leve en comparación al

efecto del %EtOH (ver coeficientes de ambas variables en Ecuación (24) y Figura 37.b. Los

carotenoides en la guayaba se encuentran en forma de grandes cristales en los cromoplastos (Rojas

et al., 2017), cuya solubilidad en etanol podría estar afectada por el valor pH debido al efecto de

este sobre la ionización de las xantófilas (Tyssandier et al., 2001).

La temperatura, en la Figura 36.a y b, no parece tener un efecto sobre la extracción de estos

compuestos; de hecho, no es un término significativo (Ecuación (24)). Por otro lado, un aumento

en el %EtOH provoca que se obtenga una mayor concentración de carotenoides en el extracto,

probablemente porque esta última variable determina la polaridad del disolvente y las fuerzas

intermoleculares en juego que permiten o no la disolución de estos compuestos.

5.4.3. Turbidez

A continuación, en la Ecuación (25) y la Figura 37, se muestra el comportamiento de la

turbidez de los extractos con el objetivo de identificar las regiones que minimicen esta variable,

pues es considerada una impureza. Las regiones rojas son de máxima turbidez, mientras que las

verdes son de mínima turbidez.

(25) 𝑇𝑏 = 128,167 + 21,917 ∙ 𝑝𝐻 + 35,133 ∙ 𝑇 − 62,181 ∙ %𝐸𝑡𝑂𝐻 + 23,638 ∙ %𝐸𝑡𝑂𝐻2 − 30,7625 ∙ 𝑇 ∙ %𝐸𝑡𝑂𝐻

100

Figura 37. Superficies de respuesta del efecto del pH, la T y el %EtOH sobre la turbidez en los EGs

obtenidos utilizando un reactor como sistema de extracción batch (condiciones: S:L=1:5, t=35 min y

vag=450 rpm).

Se presume que la turbidez en los EG se debe a la coextracción de pectinas presentes en la

pulpa de guayaba (Athayde et al., 2014). Como es claro en la Figura 37.a y c, las condiciones que

minimizan la turbidez son los valores más bajos de T y pH, y los valores más altos de %EtOH. Lo

anterior se debe a que bajo estas condiciones las pectinas precipitan, por ende, no se encuentran

disueltas en el extracto causando turbidez (Sanati y Zokaee, 2006).

5.4.4. Condiciones óptimas y función de deseabilidad

En algunas ocasiones, resulta útil encontrar las condiciones que produzcan la mejor

extracción en términos de diferentes variables respuesta. Por ejemplo, en el presente estudio se

esperaba obtener extractos ricos en polifenoles y carotenoides, con el nivel más bajo de turbidez

posible. Para obtener las condiciones que satisfacen esos tres criterios, se utilizó la función de

deseabilidad calculada mediante el programa estadístico Statistica 7 (Statsoft®, Estados Unidos),

la cual fue desarrollada para optimizar simultáneamente múltiples variables dependientes.

El valor de deseabilidad varía entre 0,0 y 1,0; e indica cuán cerca se encuentra la respuesta

del valor ideal; una deseabilidad de 1,0 indica que la respuesta alcanza el valor óptimo o ideal bajo

esas condiciones y un valor de 0,0 indica lo contrario. La solución toma en cuenta el hecho de que

las condiciones que maximizan una respuesta no necesariamente maximizan la otra; por ello, si

alguna de las repuestas analizadas no alcanza su valor ideal, la conveniencia para esa respuesta en

específico y la conveniencia total serán menores a 1,0 (Raissi y Farsani, 2009).

101

En el Cuadro XXXIII, se comparan los intervalos de las variables independientes que

maximizan o minimizan las variables respuesta estudiadas, obtenidos con los gráficos de contorno

(ver Figura A-8 y A-9). Nótese que los intervalos de pH, T y %EtOH no parecen coincidir en todos

los casos para las tres variables respuesta. Por ello, resulta necesario evaluar qué variables pueden

ser optimizadas de manera conjunta sin un detrimento importante en alguna de ellas. Para ello, se

determinó el valor de deseabilidad asociado a cada combinación optimizada y los resultados se

presentan en el Cuadro XXXIV.

Cuadro XXXIII. Regiones óptimas para cada variable respuesta evaluada en la optimización de

la extracción de polifenoles y carotenoides totales, a partir de un subproducto de guayaba, y

utilizando un reactor como sistema de extracción batch (S:L=1:5, t=35 min; y vag=450 rpm).

Condiciones

Variables respuesta

Concentración de

polifenoles totales1

CnPTs (mg EAG/L EG)

Concentración de

carotenoides totales1

CnCTs (µg Eβ-C/L EG)

Turbidez2

Tb (NTU)

pH 2,00 - 2,27 3,76 - 5,24 2,00 - 2,27

T (ºC) 57,9 - 65,0 30,0 - 65,0 30,0 - 31,9

%EtOH (m/m) 30,0 - 52,8 91,5 - 95,0 81,8 - 95,0

Se consideran óptimas las condiciones que: 1maximizan y 2minimizan estas variables.

Cuadro XXXIV. Evaluación de la deseabilidad asociada a la optimización conjunta de las

variables respuesta.

Combinaciones

optimizadas

Condiciones óptimas

para combinaciones

Valor individual de variables respuesta

bajo condiciones óptimas combinación* Deseabilidad

pH T

(°C)

%EtOH

(m/m) CnPTs

(mg EAG/L EG) CnCTs

(µg Eβ-C/L EG) Tb

(NTU)

CnPTs1 2,00 65,0 46,2 1 141 0 176 1,0

CnCTs1 4,50 Cualquiera 95,0 248 5 793 150 1,0

Tb2 7,00 47,5 95,0 149 5 100 40 1,0

CnPTs1 y Tb2 2,00 30,0 46,2 869 0 58 0,8

CnCTs1 y Tb2 7,00 47,5 95,0 149 5 100 40 1,0

CnPTs1 y CnCTs1 5,75 65,0 78,8 578 3 095 148 0,5

CnPTs1, CnCTs1 y Tb2 3,25 56,3 78,8 589 3 095 125 0,6

Se consideran óptimas las condiciones que: 1maximizan y 2minimizan estas variables. *Obtenidos introduciendo las

condiciones óptimas de extracción a los modelos matemáticos de cada variable respuesta.

En el cuadro anterior, en las primeras tres filas, se detallan las condiciones óptimas que

maximizan los compuestos de interés: CnPTs y CnCTs, y minimizan la Tb. Nótese que si se utilizan

las condiciones que maximizan los polifenoles totales, no se extraen carotenoides del todo, pues el

valor de esta variable en ese punto de pH, T y %EtOH es cero. Del mismo modo, utilizando

102

condiciones que maximicen los carotenoides, se puede llegar a extraer una fracción de apenas el

22% de los polifenoles, respecto a las condiciones específicas para estos.

En contraposición, las condiciones que minimizan la turbidez coinciden con las condiciones

que maximizan los carotenoides totales. Por ende, si bien no parece posible coextraer polifenoles

y carotenoides con un rendimiento aceptable de ambos, si es posible obtener extractos ricos en

carotenoides con niveles bajos de turbidez, así como extractos ricos en polifenoles con ausencia de

carotenoides.

En las siguientes tres filas, puede verse que, si se utilizan condiciones que maximicen los

polifenoles y minimicen la presencia de pectinas en el extracto, se pierde aproximadamente un 24%

de los polifenoles y el valor de la función deseabilidad es de 80%. Entonces, es preferible la

utilización de las condiciones que optimicen únicamente la CnPTs, para evitar pérdidas tan

elevadas en el rendimiento de estos compuestos. En contraposición, sí es posible maximizar la

extracción de carotenoides y minimizar la turbidez con una deseabilidad máxima.

Además, nótese que, si se utilizan condiciones para coextraer polifenoles y carotenoides, se

obtiene una deseabilidad del 50% con un detrimento muy elevado en los rendimientos de ambos.

Esto se atribuye a que ambos grupos de compuestos tienen una naturaleza química distinta, donde

los primeros son de naturaleza polar por la presencia de un gran número de grupo hidroxilo y

asociaciones con carbohidratos, y los segundos son de naturaleza no-polar, debido a sus largas

cadenas carbonadas con un número reducido de grupos hidroxilo. De hecho, la diferencia en

condiciones que más dificulta su coextracción es la obtenida en el %EtOH, pues los polifenoles

son afines a valores bajos y los carotenoides a valores altos.

Por último, si se quisiera realizar la extracción conjunta de polifenoles y carotenoides, vale la

pena utilizar las condiciones que incluyen la minimización de la Tb, pues la deseabilidad que se

obtiene bajo estas condiciones es incluso superior a la de solo CnPTs y CnCTs.

Como los óptimos de las dos variables más importantes (CnPTs y CnCTs) no coinciden,

entonces ambos modelos deben validarse por separado. Sin embargo, en el presente estudio se

escogió validar únicamente el punto óptimo para la extracción de polifenoles, ya que estos son los

compuestos que se encuentran en mayor cantidad dentro del extracto (orden de ppm) y para los

cuales se pre-fijaron las variables S:L y t.

En la etapa de validación del modelo matemático para la extracción de polifenoles totales, se

utilizó un lote diferente de SG, al cual se le determinaron los parámetros señalados en el Cuadro

XXXV.

Cuadro XXXV. Propiedades fisicoquímicas del subproducto de guayaba correspondiente a los

ensayos de validación del modelo de polifenoles totales y de caracterización del proceso.

Análisis químico Resultado*

Humedad (g/100 g) 70,62 ± 0,08

Polifenoles totales (mg EAG/100 g) 1 017 ± 52

*Reportados como promedio ± desviación estándar (n=2).

103

En comparación con el SG del primer lote, este presentó un menor contenido de humedad y

una mayor cantidad inicial de polifenoles totales. Estas diferencias impactaron directamente la

CnPTs obtenida en los ensayos de validación, afectando la utilidad de esta variable respuesta para

comparar estos valores con los predichos por el modelo.

Para corregir estas diferencias, se decidió utilizar otra variable respuesta: rendimiento de

extracción (%RE) (ver Ecuación (17)), calculada a partir de la CnPTs y el contenido inicial de

polifenoles en el SG. Esta variable permite que los valores predichos y experimentales fueran

comparables, incluso cuando se obtuvieron a partir de lotes diferentes de SG.

En el siguiente cuadro, se muestra como el valor predicho por el modelo de la variable CnPTs

queda fuera del intervalo de confianza experimental, llevando a la conclusión incorrecta de que el

modelo no es válido. Sin embargo, al utilizar la variable %RE, se observa exactamente lo contrario,

dado que esta sí se encuentra dentro del intervalo experimental; por ende, se concluye que el

modelo matemático obtenido para describir la extracción de polifenoles totales es válido para

realizar predicciones.

Cuadro XXXVI. Validación del modelo matemático que describe la extracción de los polifenoles

totales presentes en el subproducto de guayaba, utilizando un reactor como sistema de extracción

batch (condiciones: S:L=1:5, t=35 min, pH=2,00; T=65,0 °C; %EtOH=46,2 y vag=450 rpm).

Variable respuesta Promedio

experimental

IC

experimental*

Valor predicho

por modelo

IC

predicción**

CnPTs (mg EAG/L) 1 331 1 148 - 1 514 1 141 1 022 – 1 260

%RE (m/m) 67 54 - 78 56 50 - 62

*Al 95% de confianza (n=3). **Calculado con el LI y LS al 95% de confianza de los parámetros de la ecuación.

Es importante aclarar que utilizar el 𝑃𝑇𝑠𝑒 (contenido de polifenoles totales en el extracto en

base seca), o bien, el %RE, como variables respuesta de la superficie, hubiera anulado el efecto de

la diferencia en contenido de humedad y contenido inicial de polifenoles de ambos lotes de

subproducto. Sin embargo, expresar los resultados en esos términos requería de la determinación

de la masa final de todos los extractos después del prensado y sus densidades por picnometría (ver

Ecuación (15) y (17), respectivamente). Lo anterior, hubiera alargado y complicado el trabajo

experimental.

104

5.5. Caracterización del proceso

A continuación, en la siguiente figura se resume el proceso desarrollado para la extracción de

polifenoles a partir del SG. La primera operación consta de un mezclado, pues el SG proviene de

diferentes lotes de prensado, donde existen variaciones de carga, tiempo y presión, que hacen que

estos lotes sean heterogéneos en humedad y consistencia. Por ende, es necesario homogeneizar su

composición.

El siguiente paso es un almacenamiento en congelación para estabilizar el SG. Normalmente,

las empresas procesadoras de frutas, especialmente si trabajan frutas estacionales, cuentan con

sistemas de refrigeración y congelación en sus instalaciones, por lo que, si se opta por este método

de estabilización, solo se debe asumir el costo adicional por aumento en la carga de enfriamiento

en cámaras. Es decir, no es necesaria la inversión en equipo, contrario al secado, otra opción de

estabilización frecuentemente utilizada en estudios de valorización de subproductos. Además, se

ha demostrado que, en congelación, las guayabas pueden conservar su valor de polifenoles y

carotenoides hasta por un año sin detrimentos importantes (Dalla et al., 2014).

Figura 38. Diagrama de bloques para la obtención del extracto etanólico rico en polifenoles a partir

de un subproducto de guayaba.


(SG)

ALMACENAMIENTO Baldes plásticos, congelador, T=-20 ºC

EXTRACCIÓN Reactor, agitador de doble turbina, S:L=1:5,

Vag

=450 rpm, pH=2,00,

T=65 ºC, t=35 min

Extracto de guayaba

(EG)

Disolvente (D)

%EtOH=46,3

%m/m


Torta de prensado

(TP)

MEZCLADO Amasadora, t=20 min

105

Respecto a la extracción, esta puede realizarse en un tanque agitado, o reactor, escalado con

dimensiones mayores respecto al utilizado en el presente estudio, pero utilizando las razones

geométricas detalladas en la Figura 21 y en el Cuadro XIII, para emplear los modelos de

predicción desarrollados en el presente estudio. Para lograr una extracción de polifenoles óptima,

deben utilizarse las condiciones de relación sólido-líquido, velocidad de agitación, pH y

temperatura especificadas en el diagrama de bloques.

Respecto al tiempo de extracción, es importante tomar en cuenta que éste fue definido a una

temperatura de 47,5 °C, donde se presenta una menor velocidad de transferencia de masa en

comparación a la T que resultó como óptima. También, se utilizó el modelo matemático de primer

orden que tiende a sobreestimar la velocidad del sistema, por ende, el valor de tiempo definido

debe ser ajustado a las nuevas condiciones de pH, T, %EtOH y modelo matemático de dos

velocidades. Es decir, es importante realizar una cinética adicional a una temperatura de 65 °C, con

el modelo de dos velocidades, para establecer un tiempo real de proceso. El beneficio de realizar

este ejercicio es que el tiempo podría resultar menor a los 35 min, debido a que al aumentar la

temperatura aumenta la velocidad de transferencia de masa (Pompeu et al., 2009).

Tal y como se esquematiza en la Figura 39, en la extracción, el mezclado del SG con el

disolvente diluye y separa las fibras del SG; y los polifenoles migran hacia el seno del disolvente.

Una vez finalizada esta etapa, la mezcla de extracción debe ser evacuada del reactor con ayuda de

una bomba y luego prensada en una prensa hidráulica o hidroprensa. Tras esta etapa, se obtiene la

fase líquida o extracto como producto y la torta de prensado como subproducto; esta última

contiene una menor cantidad de polifenoles respecto al SG inicial, porque la mayoría quedó en el

extracto. La torta de prensado se puede ver como la mezcla de dos componentes: los sólidos del

SG con polifenoles remanentes que no lograron extraerse (SGA), y el extracto que retienen las

fibras (EGR), el cual contiene polifenoles extraídos, pero que se consideran como no recuperados

debido a que no se encuentran en el producto final o EG.

Figura 39. Esquema ilustrativo de la extracción de polifenoles a partir del SG y de la separación

mecánica del EG.

106

De acuerdo con el proceso descrito anteriormente y realizando los balances de masa

correspondientes, se obtienen los rendimientos detallados en el Cuadro XXXVII. El rendimiento

de prensado corresponde a la masa obtenida de extracto respecto a la masa inicial de mezcla.

Cuadro XXXVII. Rendimientos asociados al proceso de obtención del extracto etanólico rico en

polifenoles a partir de un subproducto de guayaba.

Rendimiento

de prensado

%RP (m/m)

Rendimiento

de extracción1

%RE (m/m)

Polifenoles no recuperados %PNR (m/m)

Torta de prensado

TP

Extracto de

guayaba retenido

EGR

Subproducto de

guayaba agotado

SGA

80 ± 10 67 ± 12 26 ± 13 13 ± 8 13 ± 11

1Masa de polifenoles extraídos respecto al total presente en el SG, ±: intervalo de confianza al 95% (n=3).

El rendimiento de extracción es la masa de polifenoles presente en el EG respecto a la

presente originalmente en el SG; es decir, los polifenoles recuperados. La cantidad que no se

recupera es aquella que quedó en la torta de prensado. De esos polifenoles no recuperados, una

fracción corresponde a aquellos que se encuentran en el EGR; esta fracción puede reducirse si se

aumenta la presión más lentamente para obtener mayor cantidad de extracto y así una torta más

seca. La otra fracción son los polifenoles que no se lograron extraer del SG. Para recuperar esa

fracción en la torta de prensado, se recomienda realizar una segunda extracción bajo las

condiciones óptimas determinadas en el presente estudio.

5.5.1. Siguientes pasos y uso potencial del extracto

En la presente investigación se logró obtener un extracto con una importante concentración

de polifenoles (1 354 mg EAG/L). Además, el proceso desarrollado resulta sencillo, fácilmente

replicable y escalable, amigable con el ambiente y eficiente. Por ello, se considera una alternativa

atractiva para la valorización del subproducto agroindustrial de guayaba.

Es importante aclarar que el extracto obtenido es un producto intermedio; para convertirlo en

un producto final, es preciso estudiar la aplicación de operaciones posteriores de concentración,

como evaporación al vacío y secado por atomización. Con ello, se obtendría el extracto de

presentación en polvo, ingrediente que facilita su aplicación en alimentos o como suplemento.

107

6. CONCLUSIONES


6.1.1. El subproducto evaluado presenta un contenido de polifenoles totales importante

(979 mg EAG/100 g), superior al de la misma guayaba y al de otra gran cantidad de

frutas y subproductos, como las semillas de mora, el cas, marañón, la mora y la broza de

café. Esto indica que el SG tiene un alto potencial como sustrato de extracción de

polifenoles.

6.1.2. El subproducto evaluado presenta un contenido de carotenoides totales apreciable

(1 867 µg Eβ-C/100 g), el cual se encuentra en el mismo rango que la papaya, el brócoli

y el subproducto del prensado de aceite de palma. Esto indica que el SG tiene potencial

como sustrato de extracción de carotenoides.


6.2.1. Las relaciones sólido-líquido potenciales para ser utilizadas durante la extracción de

polifenoles totales del SG son: la 1:5, debido a que produce los extractos con mayor

concentración (1 116 mg EAG/ L EG); y la 1:15, porque con ella se obtiene un mayor

contenido de polifenoles por unidad de masa (2 472 mg EAG/ 100 SG bs) y

probablemente un menor tiempo de proceso.


6.3.1. El modelo de dos velocidades es más adecuado para describir el proceso de extracción,

en comparación con el modelo de primer orden, debido a que presenta un coeficiente de

determinación ajustado superior, los puntos experimentales se encuentran dispersos

aleatoriamente por arriba y debajo de la curva, y los intervalos de predicción son más

estrechos.

6.3.2. La relación 1:5 resulta más adecuada que la relación 1:15 para realizar la extracción, ya

que la primera produce un extracto 60% más concentrado que la segunda, aunque emplea

un tiempo de extracción 11 minutos superior.

108


6.4.1. Las condiciones que maximizan la extracción de polifenoles totales son: un pH ácido,

entre 2,00 y 2,27; una temperatura alta, entre 57,9 y 65,0 °C, y una concentración de

etanol intermedia, entre 30,0 y 52,8%. Con estas condiciones se obtiene una

concentración en el extracto de 1 141 mg EAG/L.

6.4.2. Las condiciones que maximizan la extracción de carotenoides totales y minimizan la

turbidez en los extractos son un pH neutro de 7,00; una temperatura intermedia de 47,5

°C y una concentración de etanol alta de 95,0%. Obteniendo una concentración en el

extracto de 5 793 µg Eβ-C/L.

6.4.3. El modelo matemático que describen la extracción de polifenoles totales predicen

adecuadamente los valores de la variable respuesta.

6.5. Caracterización del proceso

6.5.1. Con el proceso establecido es posible obtener un rendimiento de extracción de 67% de

los polifenoles presentes en el subproducto y un extracto con una concentración de

polifenoles de 1 354 mg EAG/L.

109

7. RECOMENDACIONES

7.1. Para determinar condiciones de extracción más específicas que eviten la ocurrencia de

reacciones de degradación o promuevan la migración de grupos de compuestos

específicos, es preciso incluir la determinación del perfil completo de polifenoles y

carotenoides presente en el SG.

7.2. Para definir la relación sólido-líquido es importante que el sistema que se utilice permita

un control estricto de la temperatura, ya que el sistema de balones utilizado en este

estudio presenta el inconveniente de que la temperatura de los baños de agua es difícil

de mantener contante y ello generó variaciones indeseadas entre los tratamientos.

7.3. Para evaluar el efecto de la temperatura en una superficie de respuesta, se recomienda

predefinir el tiempo realizando una cinética previa bajo las condiciones que sean las

más lentas, para comparar todos los ensayos en condiciones de equilibrio.

7.4. Se recomienda realizar una cinética a las condiciones óptimas de pH, T y %EtOH para

polifenoles totales y establecer el tiempo real de extracción para evaluar la posibilidad

de acortar el mismo.

7.5. Se recomienda validar el modelo matemático de carotenoides totales y aprovechar las

corridas de extracción para la realización de balances de masa que permitan caracterizar

este proceso.

7.6. Para aumentar el rendimiento de extracción, se recomienda realizar una segunda

extracción de los polifenoles remanentes en la torta de prensado, bajo las condiciones

óptimas determinadas en el presente estudio.

110

8. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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118

9. ANEXOS


Figura A-1. Reporte del análisis químico, realizado al subproducto de guayaba del primer lote, en

el Laboratorio de Análisis Químico del CITA.

119


9.2.1. Comprobación de los supuestos del análisis de varianza

Cuadro A-I. Comprobación de los supuestos del ANDEVA para la concentración de polifenoles

totales y los polifenoles totales extraídos en los EGs obtenidos bajo diferentes S:L.

Variable respuesta Supuesto Prueba Resultado

CnPTs

(mg EAG/L EG)

Muestras

independientes

Cada tratamiento se aplicó a diferentes unidades

experimentales seleccionadas de manera aleatoria Figuraa

Normalidad Bondad del ajuste normal con Prueba de Shapiro-Wilk P (W)=0,0858

Homocedasticidad Desigualdad de varianzas con Prueba de Levene P (F)=0,1112

PTse

(mg EAG/ 100 g SG bs)

Muestras

independientes

Cada tratamiento se aplicó a diferentes unidades

experimentales seleccionadas de manera aleatoria Figurab

Normalidad Bondad del ajuste normal con Prueba de Shapiro-Wilk P (W)=0,3339

Homocedasticidad Desigualdad de varianzas con Prueba de Levene P (F)=0,0367*

*: Resultado significativo por tener una probabilidad inferior a α=0,05.

Figura A-2. Gráficos de residuos frente a valores predichos: a) concentración de polifenoles totales

y b) polifenoles totales extraídos presentes en los EGs obtenidos bajo diferentes S:L.

a

b

120

9.2.2. Análisis de varianza

Cuadro A-II. ANDEVA para la concentración de polifenoles totales (mg EAG/L EG) en los EGs

obtenidos bajo diferentes S:L.

Fuente Grados de libertad

g.l.

Suma de cuadrados

SC

Cuadrado medio

CM

Estadístico

F

Probabilidad

P(F)

Tratamiento (S:L) 4 1903877,2 475969 314,2907 <0,0001*

Error 20 30288,5 1514

Total 24 1934165,7


Cuadro A-III. ANDEVA de Welch para los polifenoles totales extraídos (mg EAG/ 100 g SG bs) en los EGs obtenidos bajo diferentes S:L.

Estadístico

F

Grados de libertad del numerador

g.l. num.

Grados de libertad del denominador

g.l. denom.

Probabilidad

P(F)

12,4608 4 9,216 0,0009*


9.2.3. Comparaciones múltiples

Figura A-3. Prueba de Tukey para comparar los promedios de la concentración de polifenoles

totales (mg EAG/L EG) en los EGs obtenidos bajo diferentes S:L.

121

Simbología α=0,05

SE: Desviación estándar entre los grupos df: Grados de libertad entre los grupos qij: Diferencia entre los grupos qc: Mínima diferencia significativa

1:5 1:8 1:10 1:15 1:20

1:5

75,27 37,85 33,33 61,15

6 7 5 6

0,948 4,24 9,517 5,152

5,305 5,060 5,673 5,305

1:8

71,88 69,61 86,46

5 4 8

1,241 3,532 2,819

5,673 6,287 4,886

1:10

24,76 56,94

6 5

6,328 2,715

5,305 5,673

1:15

54,04

4

Nivel Media 0,039

1:20 A 2 470 6,287

1:15 AB 2 472

1:20 1:10 A 2 316

1:8 BC 2 226

1:5 AC 2 155

Los niveles no conectados por la misma letra son significativamente

distintos.

Figura A-4. Prueba de Games-Howell para comparar los promedios de los polifenoles totales

extraídos (mg EAG/ 100 g SG bs) bajo diferentes S:L.

122


9.3.1. Regresión no lineal

Cuadro A-IV. Evaluación de la significancia y el ajuste de los modelos utilizados en la regresión

no lineal de las cinéticas de extracción realizadas en un reactor como sistema de extracción batch

a escala de laboratorio.

Modelo Relación sólido-líquido

S:L (MSG:MD)

Probabilidad del

modelo pmodelo

Coeficiente de

determinación R2

Dos parámetros 1:5 <0,0001* 0,8837

1:15 <0,0001* 0,9468

Dos velocidades 1:5 <0,0001* 0,9827

1:15 <0,0001* 0,9796

*Resultado significativo por tener una probabilidad inferior a α=0,05.

9.3.2. Cálculo del tiempo

Figura A-5. Determinación del tiempo necesario para extraer el 99% de los polifenoles en el

equilibrio, según el modelo de incremento exponencial hasta un máximo con dos parámetros, y

utilizando un reactor como sistema de extracción batch a escala de laboratorio (condiciones de

extracción: pH=4,50; T= 47,5; %EtOH= 62,5 m/m ºC y vag=450 rpm).

𝑡𝑒 =−ln (1 − 𝑛)

𝑘

123

Figura A-6. Determinación de la fracción extraída de la concentración de equilibrio para los

tiempos de extracción previamente definidos, según el modelo de incremento exponencial hasta un

máximo con cuatro parámetros, y utilizando un reactor como sistema de extracción batch a escala

de laboratorio (condiciones de extracción: pH=4,50; T= 47,5; %EtOH= 62,5 m/m ºC y vag=450

rpm).


9.4.1. Análisis de varianza

Cuadro A-V. ANDEVA para el modelo de concentración de polifenoles totales (mg EAG/L) en

el EG, generado mediante la metodología de superficie de respuesta, utilizando un reactor como

sistema de extracción batch a escala de laboratorio.

Fuente Suma de

cuadrados SC

Grados de

libertad g.l.

Cuadrado medio

CM

Estadístico

F

Probabilidad

P (F)

pH 30017,0 1 30017,0 19,3691 0,011682*

pH2 23398,0 1 23398,0 15,0980 0,017756*

T 89413,0 1 89413,0 57,6956 0,001612*

%EtOH 617008,7 1 617008,7 398,1375 0,000037*

%EtOH2 81250,0 1 81250,0 52,4282 0,001931*

Falta de ajuste 50250,3 9 5583,4 3,6028 0,114760

Error puro 6198,9 4 1549,7

Total 910633,5 18


0,00

0,10

0,20

0,30

0,40

0,50

0,60

0,70

0,80

0,90

1,00

0,0 100,0 200,0 300,0 400,0 500,0 600,0 700,0

Fra

cció

n d

e la

co

nce

ntr

aci

ón

de

equ

ilib

rio

n


te (min)

S:L=1:15

S:L=1:5(23,0; 0,85)

(33,9; 0,78)

𝑛 =𝐶𝑛𝑃𝑇𝑆∞1 ∙ 1 − 𝑒−𝑘1∙𝑡𝑒 + 𝐶𝑛𝑃𝑇𝑆∞2 ∙ 1 − 𝑒−𝑘2∙𝑡𝑒

𝐶𝑛𝑃𝑇𝑆∞1 + 𝐶𝑛𝑃𝑇𝑆∞2

124

Cuadro A-VI. ANDEVA para el modelo de concentración de carotenoides totales (µg Eβ-C/L) en

el EG, generado mediante la metodología de superficie de respuesta, utilizando un reactor como

sistema de extracción batch a escala de laboratorio.

Fuente Suma de

cuadrados SC

Grados de

libertad g.l.

Cuadrado medio

CM

Estadístico

F

Probabilidad

P (F)

pH2 837320 1 837320 7,8789 0,048468*

%EtOH 37375486 1 37375486 351,6910 0,000048*

%EtOH2 3982790 1 3982790 37,4767 0,003606*

Falta de ajuste 1996312 11 181483 1,7077 0,320216

Error puro 425095 4 106274

Total 45172859 18


Cuadro A-VII. ANDEVA para el modelo de turbidez (NTU) en el EG, generado mediante la

metodología de superficie de respuesta, utilizando un reactor como sistema de extracción batch a

escala de laboratorio.

Fuente Suma de

cuadrados SC

Grados de

libertad g.l.

Cuadrado medio

CM

Estadístico

F

Probabilidad

P (F)

pH 6559,9 1 6559,91 10,26288 0,032789*

T 16857,0 1 16857,02 26,37256 0,006813*

%EtOH 52803,4 1 52803,43 82,61018 0,000813*

%EtOH2 7925,3 1 7925,28 12,39898 0,024423*

T*%EtOH 7570,7 1 7570,65 11,84417 0,026257*

Falta de ajuste 7173,9 9 797,10 1,24705 0,446406

Error puro 2556,8 4 639,19

Total 101446,9 18


9.4.2. Evaluación de validez de los modelos

Cuadro A-VIII. Evaluación del ajuste y la significancia de los modelos generados mediante la

metodología de superficie de respuesta, utilizando un reactor como sistema de extracción batch a

escala de laboratorio.

Variable respuesta Coeficiente de

determinación R2

Coeficiente de

determinación

ajustado R2-adj

Probabilidad del

modelo pmodelo

Concentración de polifenoles

totales CnPTs (mg EAG/L) 0,93801 0,91417 2,10781 x10-7*

Concentración de carotenoides

totales CnCTs (µg Eβ-C/L) 0,94640 0,93568 9,32 x10-10*

Turbidez

Tb (NTU) 0,90408 0,86719 3,43246 x10-6*


125

Figura A-7. Gráficos de valores predichos frente a observados para los modelos de: a)

concentración de polifenoles totales y b) concentración de carotenoides totales y c) turbidez,

generados mediante la metodología de superficie de respuesta.

126

9.4.3. Gráficos de contorno para obtener regiones óptimas

Figura A-8. Gráficos de contorno del efecto del pH, la T y el %EtOH sobre: a-c) la concentración

de polifenoles totales y d-f) la concentración de carotenoides totales en los EGs obtenidos a partir

de un subproducto de guayaba y utilizando un reactor como sistema de extracción batch

(condiciones: S:L=1:5, t=35 min; y vag=450 rpm).

127

Figura A-9. Gráficos de contorno del efecto del pH, la T y el %EtOH sobre la turbidez en los EGs

obtenidos a partir de un subproducto de guayaba y utilizando un reactor como sistema de extracción

batch (condiciones: S:L=1:5, t=35 min; y vag=450 rpm).

VALORIZACIÓN DE UN SUBPRODUCTO DEL PROCESAMIENTO ...

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