Vanessa Martínez MadridR4 Análisis Clínicos

Hospital Virgen de la Luz (Cuenca)

ANTICUERPOS ANTICITOPLASMA DE NEUTROFILOS (ANCA)

� Autoanticuerpos dirigidos contra antígenos localizados en el citoplasma de los neutrófilos y monocitos.

Gránulos específicos:-Lisozima-Lactoferrina

Gránulos azurófilos:-Mieloperoxidasa (MPO)-Proteinasa 3 (PR3)-Proteina incrementadora de la permeabilidad bacteriana (BPI)-Elastasa-Captesina G

VASCULITIS

VASCULITIS

Diagnóstico:

Clínica: isquemia a los tejidos irrigados por los vasos comprometidos + sintomatología general.

VASCULITIS: Inflamación de los vasos sanguíneos , comprometiendo su función (isquemia y necrosis)

CLASIFICACIÓN DE VASCULITIS

• CLASIFICACIÓN DE CHAPEL HILL

De vasos grandes:

�Arteritis de células gigantes

�Arteritis de Takayasu

De vasos medianos:

�Poliarteritis nodosa (PAN)

�Enfermedad de Kawasaki

De vasos pequeños:

�Granulomatosis de Wegener (GW)

�Síndrome de Churg-Strauss (SCS)

�Poliangeítis microscópica (PAM)

�Púrpura de Henoch-Schönlein

�Crioglobulinemia

�Vasculitis leucocitoclástica

VASCULITIS ASOCIADAS A ANTICUERPOS

ANTICITOPLASMA DE NEUTRÓFILO (ANCA)

GRANULOMATOSIS DE WEGENER

• Vasculitis necrotizante con formación de granulomas.

• Síntomas en vías respiratorias superiores, pulmones y riñones.

• Incidencia: 10 casos/millón hab.

• Prevalencia: 100 casos/millón hab.

• Edad media de diagnóstico: 40 años

POLIANGEITIS MICROSCÓPICA

• Vasculitis de pequeño vaso con implicación de los capilares glomerulares y alveolares pulmonares.

• Afectación renal (glomerulonefritis) y pulmonar (capilaritis con hemorragia alveolar)

• Sin inflamación granulomatosa.

• Causa común del síndrome pulmón-riñón.

• Varones de alrededor de 50 años

• Incidencia: 3,5/ millón hab.

SÍNDROME DE CHURG STRAUSS

• Inflamación granulomatosa con afectación del TR

• Asociado con

– Asma

– Eosinofilia

– Rinitis alérgica

• Incidencia anual: 3/millón hab. aprox.

• Mayor incidencia entre quinta y sexta década de vida.

MODELO PATOGÉNICO DE LOS ANCA EN VASCULITIS

Bosch,X, Guilabert, A; Espinosa, G; Mirapeix, E.Treatment of Antineutrophi CytoplasmicAntibody–Associated VasculitisJAMA. 2007;298(6):655-669

Peter Heeringa. Anti-neutrophil cytoplasmica autoantibodies and leukocite-endotheilial interactions: a sticky connection?. Trends in inmunology. Vol 26. Nov 2005.

MODELO PATOGÉNICO DE LOS ANCA

EN VASCULITIS

OTRAS ENFERMEDADES RELACIONADAS CON ANCA

• Otras enfermedades autoinmunes (LES, AR, etc.)

• Infecciones (tuberculosis, SIDA, etc)

• Reacciones a drogas (cocaina, propiltiouracilo,etc.)

• Vasculitis paraneoplásicas

• Hepatitis autoinmune, colangitis escleorante primaria y enfermedad inflamatoria intestinal

Especificidad PR3 y MPO negativa

DETECCIÓN DE ANCA: INMUNOFLUORESCENCIA INDIRECTA

(IFI)

• Porta de vidrio con neutrófilos humanos fijados con etanol .

• Suero del paciente y controles (dilución 1/20).

• Lavar• Aplicar el conjugado fluorescente.• Lavar• Microscopio de fluorescencia• Informar patrón:

� c-ANCA, p-ANCA, a-ANCA

y título.

PATRÓN C-ANCA

• Fluorescencia citoplasmática fina y granulosa

• Mayor tinción en las zonas interlobulares del núcleo.

• Reconoce el antígeno PR3 (raro BPI o MPO)

• Se asocia con la GW.

PATRÓN P-ANCA

• Tinción perinuclear que se puede extender al núcleo.

• Lóbulos individuales no visibles.

• Posible falsos positivos si ANA +.

• Reconoce Ag MPO, elastasa, lisozima, captesina G y lactoferrina.

• Patrón asociado con la PAM y SCS.

DETECCIÓN DE ANCA: IFI

Neutrófilos humanos Etanol Formaldehido

P-ANCA Perinuclear* citoplasmático

C-ANCA citoplasmático citoplasmático

* Artefacto de fijación (en realidad los antígenos son citoplasmáticos).

PATRÓN C-ANCA

• Patrón citoplasmático en ambos.

• Los gránulos más grandes y claros en los portas con formalina.

EN ETANOL

EN FORMALINA

PATRÓN P-ANCA

• Al fijar con formalina, los antígenos permanecen en el citoplasma

• La tinción se observa como c-ANCA

EN ETANOL

EN FORMALINA

PATRÓN ATÍPICO A-ANCA

• Tinción principalmente alrededor del núcleo → similar al patrón p-ANCA.

• En portas fijados con metanol: patrón p-ANCA.

• Anticuerpos anti-PR3 y anti-MPO negativos.

• Reconocen Ag: lactoferrina, lisozima, catepsina G, glucoronidasa o elastasa.

• Se asocia a conectivopatías, enfermedad inflamatoria intestinal y hepatitis autoinmune.

PRECAUCIONES AL INTERPRETAR RESULTADO IFI POSITIVO

• Componente subjetivo de IFI

• Dificil comparar títulos entre diferentes laboratorios.

• IFI tiene baja especificidad (p-ANCA). VPP <50%

• Falsos positivos de ANCA si ANA + (IFI en formalina: negativa)

• Muestras ANA positivas que puedan enmascarar p-ANCA: determinar siempre PR3 Y MPO.

ANA POSITIVO

IFI-Patrones: características

Tipo de anticuerpos

Neutrófilos fijados con etanol

Neutrófilos fijados con formalina

Hep-2

C-ANCA Citoplasmático Citoplasmático Negativo

P-ANCA Perinuclear Citoplasmático Negativo

A-ANCA Perinuclar Negativo Negativo

ANA Nuclear/Perinuclear Negativo Positivo

P-ANCA+ANA Nuclear/Perinuclear Citoplasmático Positivo

DETERMINACIÓN DEMPO-ANCA Y PR3-ANCA

• Detección cuantitativa de ANCA IgG anti-PR3 e IgG anti-MPO por ELISA.

• Existen variantes de ELISA:

ELISA de captura y de anclaje vs ELISA directo: �evitan falsos (-)�Mayor sensibilidad•Mayor paralelismo IFI

Limitación: variación intra e interensayo entre los diferentes laboratorios.

DETERMINACIÓN DEMPO-ANCA Y PR3-ANCA

� Sensibilidad diferente (45-62,5%).

� La mayor sensibilidad para PR3 con kit de ELISA de hs y de captura.

� Para MPO mayor sensibilidad los kits de ELISA directos.

� Especificidad fue elevada.

� La mayoría de kits no estandarizados→ resultados no comparables.

• M. Mahler. Development and performance evaluation of novel chemiluminescence assays for detection of anti-PR3 and anti-MPO antibodies. Clinica Chimica Acta 413 (2012) 719-726.

El método quimioluminiscente:� buena precisión, linealidad y concordancia con los ensayos de ELISA.�Para PR3 mostró correlación entre los títulos de anticuerpo y la actividad de la enfermedad (no para MPO)

DETERMINACIÓN DEMPO-ANCA Y PR3-ANCA

PREVALENCIA DE ANCA EN VASCULITIS DE VASO PEQUEÑO

Allan Wiik. Clinical and pathophysiological significance of anti-neutrophil citoplasmic autoantibodies in vasculitis syndromes. Modern Rheumatol (2009)19:590-599

ANCA PANEL

• Utilidad:– Screening de especificidad de muestras con ANCA-IFI positivas y

MPO/PR3 negativas.– Estudio de enfermedades inflamatorias, hepatitis autoinmune,

enfermedad inflamatoria intestinal, etc

• Técnica: ELISA.• Detección de anticuerpos IgG anti:

– Azurocidina– BPI– Catepsina G– Elastasa– Lactoferrina– lisozima

Prevalencia de ANCA en enfermedades distintas a VAA.

García-Catro, M. ¿Cuándo solicitar los anticuerpos anticitoplasma de neutrófilo? Semin Fund Esp Reumatol. 2008;09:235-9, vol.09 núm 04

Allan Wiik. Clinical and pathophysiological significance of anti-neutrophil citoplasmic autoantibodies in vasculitis syndromes. Modern Rheumatol (2009)19:590-599

Recomendaciones para detección de ANCA en enfermedades autoinmunes asociadas a ANCA:

�Screening IFI

�Confirmar + con ELISA e indicar niveles de anticuerpo.

�Si la sospecha clínica es elevada: determinar PR3 y MPO aunque ANCAs negativos.

�Muestras ANA + que puedan enmascarar p-ANCA deben ser testadas PR3 y MPO.

RECOMENDACIONES DE ESTAMENTO CONSENSO INTERNACIONAL SOBRE ANCA

Otros estudios….

ALGORITMO DE ANCA EN EL LABORATORIO DE AUTOINMUNIDAD

ANCA-IFI +ANCA-IFI +ANCA-IFI Y MPO/PR3

NEGATIVOS

ANCA-IFI Y MPO/PR3

NEGATIVOS

FINFIN Vasculitis asociada a ANCA

Vasculitis asociada a ANCA

ANCA PANELANCA PANEL

PR3 Y MPO -PR3 Y MPO - PR3 ó MPO +PR3 ó MPO +

C-ANCA/PR3 +C-ANCA/PR3 + p-ANCA /MPO+p-ANCA /MPO+

GWGW PAM/SCSPAM/SCSCONFIRMACIÓN

HISTOLÓGICA

CONFIRMACIÓN HISTOLÓGICA

ANA (Hep-2)

ANA (Hep-2)

ANCA-IFIANCA-IFI MPO-PR3MPO-PR3

• Uso IFI + ELISA: mejor aproximación al análisis de ANCA.

• Los niveles de ANCA-IFI pueden no correlacionarse con los de ELISA para PR3 y MPO

• La combinación de los anticuerpos c-ANCA/anti-PR3 y/o p-ANCA/anti-MPO:

– sensibilidad del 72%

– especificidad del 98% en el diagnóstico de vasculitis.

INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS

• Sensibilidad y especificidad variable según:

– Disparidad de criterios en la selección de los pacientes.

– Actividad clínica en el momento de estudio

– Inclusión de formas generalizadas o limitadas de la enfermedad.• Antigen-Specific ANCA ELISAs have different sensitivities for active and treated vasculitis and for

nonvasculitic disease. Michelle Trevisin. Am. J. Pathol. 2008. 129:42-53

John H. Stone. Test Characteristics of Immunofluorescence and ELISA tests in 856 consecutive patients with possible ANCA-Associated conditions. Arthritis care and research. Vol,13, Nº.6, December 2000

INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS

• Los ANCA suelen aumentar antes de la recidiva.

• Boomsma et al. Prediction of relapses in GW by measurement of ANCA levels. Arthritis & rheumatism 2000; 2025:2033

- La medida seria de los niveles de ANCA ayudan a predecir recaídas en pacientes con GW.

• Controversia: Finkielman JD et al. Ann Inter Med 2007; 147:611.

- ↑ PR3 se relacionan con actividad en < del 10 % de los casos

- Solo un 40% de recaídas al año siguiente de ↑PR3

• El análisis seriado de ANCA resulta útil porque:

– Su desaparición se asocia con remisión y menor riesgo de recaída.

– El incremento + empeoramiento clínico se asocia a recaída. Pacientes con PR3 positivo presentan 1,9 veces más probabilidad de recaídas que los pacientes con MPO. Hogan SL et at. Ann Intern Med 2005.

– La persistencia de ANCA se asocia a recaída cuando se retira el tratamiento.

• La monitorización de ANCA no es suficiente para predecir una recaída o definir actividad de la enfermedad.

INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS

• J.C. Drooger. Anca-Positive patients: the influence of PR3 and MPO antibodies on survival rate and the association with clinical and laboratory characteristics. The Open Rheumatology Journal. 2009, 3, 14-17

INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS

• Un resultado negativo no debe excluir un dx de vasculitis:

– Hasta un 40% de GW limitada pueden ser ANCA negativos

– Hasta un 30% de PAM y hasta el 50% de SCS pueden ser ANCA negativos.

– Pueden ser positivos más tarde con el desarrollo de la enfermedad

INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS

OTROS ANTICUERPOS PRESENTES EN VASCULITIS ASOCIADAS A ANCA

• Anticuerpos anticélulas endoletiales

• Anticuerpos antimembrana basal

glomerular

• Anticuerpos anti-α-enolasa

• Anticuerpos antilaminina

• Anticuerpos antifosfolípido

Mod Rheumatol. 2009 Sep 3. Clinical and pathophysiological significance of anti-neutrophil cytoplasmicautoantibodies in vasculitis syndromes. Wiik A.

ANTICUERPO ANTI-MEMBRANA BASAL GLOMERULAR (anti-MBG)

• Presente en Sd. Goodpasture (ANCA +/-)� Implica una IR rápidamente progresiva junto

con enfermedad pulmonar.

� Incidencia : 1/millón hab

� Igual afectación por sexo

� Distribución bimodal: pico a los 30 años y a los 60

• IgG frente a la cadena α3 de colágeno tipo IV de la membrana basal (riñón, pulmón)

• Métodos de determinación : IFI /ELISA

ANTICUERPO ANTI-MEMBRANA BASAL GLOMERULAR (anti-MBG)

• 30% pacientes con anti-MBG+ presentan ANCA+ ( p-ANCA/anti-MPO)

• Pacientes con ANCA+ y anti-MBG+: peor respuesta clínica y recuperación de la función renal tras tto.

• Relación patogénica de ambos anticuerpos desconocida “¿antígenos ocultos?”

• Realizar cribado para ANCA y anti-MBG en pacientes con GN rápidamente progresiva.

¿CUANDO DEBEN SOLICITARSE LOS ANCA?

• Ante sospecha de vasculitis sistémica

• En el seguimiento de pacientes diagnosticados de vasculitis.

• En el paciente crítico, con hemorragia alveolar, mononeuritis múltiple o fallo renal agudo.

García-Catro, M. ¿Cuándo solicitar los anticuerpos anticitoplasma de neutrófilo? Semin Fund Esp Reumatol. 2008;09:235-9, vol.09 núm 04

En resumen….

ANCA:

•Marcador serológico de vasculitis sistémicas.

•Utilidad clínica: prueba diagnóstica.

•Determinación : IFI y EIA (PR3 y MPO).

•VAAs: GW, PAM y SCS

•ANCA-IFI + en otras enfermedades no vasculiticas (PR3 y MPO negativos)

En resumen….

• La detección de ANCA es útil al inicio de la enfermedad y en la indicación de tto inmunosupresor.

• Determinación de ANCA seriada: predecir recaidas.

• Un ANCA negativo no descarta vasculitis.

• Confirmar dx con examen histológico.