Vectores YACS,BACs y PACs.

Propósito de YACs,BACs y PACs• Las técnicas convencionales de ADN recombiante

plásmidos, cósmidos o cromosomas virales tienen la capacidad de integrar ADN exógeno de hasta unas 100 kb,permitiendo así el análisis y manipulación de un organismo cuya información genética es compacta.

• Existe una serie de fenómenos moleculares que implican fragmentos de ADN aún más grandes, como, por ejemplo, progresión de procesos tumorales malignos.

• Por otra parte, el interés creciente en la construcción de mapas físicos de cromosomas en el camino hacia la secuenciación de genomas complejos.

YACs

YAC: Cromosoma Artificial de Levadura

• Descrito por primera vez en 1983 por Murray y Szostak.• Fue el primer sistema de clonaje de fragmentos grandes

de ADN.• Se utilizan por su capacidad de albergar grandes

fragmentos de ADN de 100 kb-1 Mb.• Ventajas esperadas: -Menor número de clones suponiendo rapidez en análisis y manipulación.-Mayor número de secuencias representadas y menor número de errores y discontinuidades en un mapa físico.

YAC: Cromosoma Artificial de Levadura

• Los plásmidos bacterianos no son buenos vectores para hospedadores eucariontes como las levaduras, porque las secuencias de ADN procariontes y eucariontes utilizan diferentes orígenes de replicación.

• ¿Qué es YAC? -Son grandes pedazos de ADN que contienen los componentes necesarios que permiten propagarse junto con los otros cromosomas de célula de levadura en la levadura.-Estos cromosomas artificiales llevan a cabo normalmente la replicación de ADN eucarionte y la expresión de genes en las células de levadura.

• Para que un segmento de ADN pueda funcionar como un cromosoma eucariótico éste debe contener un origen de replicación, una secuencia centromérica y dos secuencias teloméricas.

• Construcción-CEN4, como centrómero de levadura (procedente del cromosoma 4 de Saccharomyces cerevisiae) que permite la correcta segregación cromosómica.-TEL,como secuencia telomérica (procedente de Tetrahymena) capaz de ser convertida en telómeros funcionales por la telomerasa de S.cerevisiae que permite la independiencia del cromosoma.-ARS1,como origen de replicación (secuencia de replicación autónoma 1 de S.cerevisiae)

11463 BP

Puede ser propagado en E.coli o en Sacharomyces cerevisiae

VentajasMás de 10,000 pb-1,000,000 pbSon vectores de gran capacidad a la hora de generar genotecas de organismos complejos y preparar la secuenciación

Para generar el ADN recombinate se usa el mínimo de enzimas de restricción y ADN ligasa Los YAC se comportan como cromosomas de levadura normales Resultaron útiles en la fase temprana del Proyecto

del Genoma Humano donde se usaron para construir mapas físicos completos de todos los cromosomas humanos.

Se utiliza para el análisis de la estructura de la heterocromatina.

La mayor parte del ADN de las zonas heterocromáticas se encuentran en grandes bloques de secuencias repetidas y es difícil de clonar debido a su inestabilidad en E.coli. Tienen una ventaja sobre los cromosomas

artificiales bacterianos en la que puedan ser usados para expresar proteínas eucarióticas que requieren modificación postraduccional

El clonaje en YACs permitirá aislar regiones cromosómicas completas de distintas especies o distintos individuos de la misma especie,de forma que pueda ser posible el análisis comparativos.

DESVENTAJAS

INESTABILIDAD: Manipulación recombinante de YACS esta generada en levadura por laboriosos y usualmente requieres YACs ser transferidos a E.coli para su subsecuente manipulación.

QUIMERISMO: La secuencia del ADN clonado no corresponde a una sola región genómica sino a múltiples que sucede debido a la recombinación de dos o más YAC. Además puede haber supresión de segmentos o reordenación de segmentos genómicos .La incidendia del quimerismo es alta de 50%.

El ADN del YAC es difícil de purificar intacto.

La recombinación de levadura es muy potente y siempre activo, y por lo tanto puede generar delecciones y otros reordenamientos en un YAC

La manipulación de los YAC recombinantes que se generan en la levadura es laborioso y por lo general requiere YAC para ser transferidos a E. coli para la manipulación posterior.

BAC: Cromosoma Artificial BacterianoUn cromosoma artificial bacteriano; es un sistema de clonación para aislar ADN genómico basado en el plásmido F-factor usando bacterias Escherichia coli.

BAC: Cromosoma Artificial Bacteriano

• Se desarrollaron en 1992 por Shizuya et al.• vector usado para clonar fragmentos de ADN (de 100 a 300

kb de tamaño; media de 150 kb)• BAC integra las características del factor F. El factor F es el

único factor de fertilidad de la E. coli, también tiene la capacidad de integrarse en el cromosoma bacteriano y de liberarse.

• Su gran utilización se debe a su notable capacidad, su gran estabilidad y su bajo porcentaje de quimerismo.

• Son muy utilizados como vectores de clonación para la construcción de genotecas genómicas

• Un BAC típico consta de:*OriS: origen de replicación del factor F*repE: control de la replicación del plásmido*parA, B, C: control de la replicación, mantienen el número de copias limitado a 1 ó 2 por célula. Reduce la posiblidad de recombinación entre los fragmentos de ADN insertados en el plásmido. *CMr: cloranfenicol acetil-transferasa (CAT) (gen de resistencia a cloranfenicol)

• Dos sitios de clonación con HindIII y Bam HI• Varios sitios de restricción G+C por ejemplo Notl,Sfil

Ventajas DesventajasEstosvectores permiten inserciones genómicas de hasta 300 kb de tamañoque se mantenga de forma estable

Menor capacidad de inserción de ADN.

Desprovistos de una alta proporción de clones quiméricos o reordenados durante varias generaciones.

Debido a que el ADN insertado se mantiene en el genoma bacteriano durante los ciclos repetidos de replicación, la información no se pierde.

los clones parecen ser estables a lo largomuchas generaciones; Sin embargo, esto no ha sido probado para diferentes regiones del genoma.

Estas moléculas de ADN circular son fácilmente aislados del ADN del hospedero mediante una lisis alcalina (Birnboim y Doly, 1979)

Falta de la selección positiva de los clones que contienen insertos.

La transformación de E.coli es por electroporación Número bajo de copias, unmuy bajo rendimiento de ADN en comparación con YACs.

Aplicaciones: Se utilizan con éxito en la cartografía física y

proyectos de clonación posicional. Vector ideal para la elaboración de genotecas

eucarióticas

Carece de genes reporteros relevantes y la ausencia de los genes cuya expresión puede ser seleccionada para células eucariotas .

PAC: Cromosoma Artificial derivado del fago P1.

Es un sistema de clonación para aislar ADN genómico basado en el plásmido F-factor,como en BACs,pero

también contiene algunos elementos del sistema de clonación del bacteriofago P1

PAC: Cromosoma Artificial derivado del fago P1.

• Desarrollado por Ioannou et al. en 1994• Sistema de clonación en E.coli• Los clones de PAC se generan por

electroporación.• vector usado para clonar fragmentos de ADN

(100-300 kb, promedio 150 kb)

• P1 replicon-es el origen de replicación usado para propagación de una sola copia,

• Lytic replicon-ofrece replicon multicopia cuando, es una característica útil para la amplificación de ADN. está regulada por el promotor del operón de la lactosa y se apaga si la célula huésped lleva un represor lacI.

• pUC19-confiere resistencia a penicilina • LoxP-secuencia corta de nucleotidos usado por

recombinanción homologa LoxP-Cre• KanR- selección bacterias que incorporaron y

recircularizaron el vector• SACBII- levansucrasa: selección de bacterias con

vector+inserto (levansucrasa en medio con 5% sacarosa: levan : letal para E. coli)

• pUC19 es útil para la multiplicación preparativa del vector vacío por la E. coli, ella protege la bacteria contra la expresión del gen sacB

En la ausencia de un inserto clonado, el promotor de E. coli conduce el gen SacB11 que convierte la sacarosa exógeno a levan, que es tóxico para E. coli. Esta característica proporciona una selección positiva para insertos clonados.

Procedimiento• La clonación de insertos en el

vector pCYPAC-2 comienza con la escisión por ScaI,que destruye el inserto de pUC19

• La digestión con BamHI genera el unico sitio de clonación y después del tratamiento con fosfatasa (para reducir la autoligación del vector)

• Se eliminan los pequeños fragmentos ScaI/BamHI.

• El ADN genómico se digirió parcialmente con Sau3A o Mbol, se selecciona el fragmento a clonar del

gel de electroforesis.

VENTAJASRaramente quiméricoTienen inserciones muy estables y no borran secuencias

La modificación se produce directamente en E.coli,eliminando la necesisas de la transferencia de ADN

Aplicaciones cartografía física proyectos de clonación posicional Estudio de terapia de fagos Estudios científicos centrándose en como los antibióticos

actúan sobre bacterias particulares.

Las moléculas de ADN circulares son fácilmente aislados de lasede de fondo genómico en una lisis alcalina clásicapreparación de plásmido (Birnboim y Doly, 1979)

su origen de una sola copia de replicación yla selección positiva de los transformantes que contiene insertos que utilizan el SacBIIgen. El origen de una sola copia de replicación asegura estable y fielpropagación de plásmidos grandes, con comparativamente bajas frecuencias de delecionesu otros reordenamientos

Desventajas

Origen de replicación en copia única, por lo que es difícil de obtener ADN

YAC BAC PAC

Hospedero Saccharomyces cerevisiae

Escherichia coli DH10B Escherichia coli DH10B

Método de transformación

Transformación de esferoplastos

Electroporación Electroporación

AND Lineal Circular,superenrrollado Circular,superenrrollado

Tamaño maximo del inseto

1 Mb ~300 kb ~300 kb

Selección del vetor Falta de Triptofano o uracilo en el medio de crecimiento.

Cloramfenicol Kanamicina

Enzima de restricción EcoRI HindIII Mbol o Sau3A

Purificación intacta del insert

Relativamente difícil Fácil Fácil

Apareamiento del clon Si No No

Secuenciación directa del insert

Difícil Relativamente fácil Relativamente fácil

Grado de quimerismo Varía de librería a librería pero puede ser tan alto como 50%.

Muy bajo Muy bajo