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Facultad de Ciencias Naturales Y Matemática
“OBTENCIÓN DE UN INDICADOR NATURAL ÁCIDO-BASE A PARTIR DEL FRUTO PUNICA GRANATUM L.: UN APORTE
PARA LA SUSTITUCIÓN DE LOS INDICADORES SINTÉTICOS”
Tesis para optar el Título Profesional de Licenciada en Química
AUTOR
Huarote Garcia, Emily Guissel
ASESOR Q.F. Herrera Hernández, Nora Gabriela
JURADO Dra. Salvador Salazar, Martha
Mg. Lezama Vigo, Helmer Q.F. Fernández Arroyo, Carmen
Qco. Pumachagua Huertas, Rodolfo
LIMA – PERU
2018
Vicerrectorado de INVESTIGACIÓN
DEDICATORIA
A mi familia, conformada por mi madre, mi madrina, mi tío, mi primo y mi
abuela.
A la Químico Farmacéutica Nora Herrera, quién me apoyo, me tuvo paciencia y
confianza, lo cual me permitió crecer personal y profesionalmente.
A la señora Hilda Rojas, técnica de laboratorio, amiga, madre, vecina, maestra
y esposa, a quien gracias a todo su apoyo concluí con este trabajo, y le
agradezco por cada consejo y gran disposición. Gracias.
A todos los profesores y compañeros que tuve la oportunidad de conocer
durante el trayecto de mi presente trabajo.
A mi compañero y colega Nelson V., por cada apoyo durante el transcurso de
este proyecto, desde un inicio hasta el final.
A mis tres amigas (Elizabeth H., Camila M. y Mayra R.) por cada apoyo,
paciencia y sobre todo por la motivación permanente para continuar.
-17
AGRADECIMIENTOS
A la Universidad Nacional Federico Villarreal, por el apoyo en el “Concurso de
proyectos de investigación formativa” como parte del curso de Seminario de
Tesis y permitirme alcanzar este importante logro en mi vida estudiantil.
A mi asesora interna Q.F. Nora Herrera por su apoyo, comprensión y
orientación, durante la realización del presente trabajo.
A mi asesor externo, Dr. Jorge Borquez, por su colaboración, orientación,
apoyo y gran hospitalidad durante la pasantía que realicé en la Universidad
Antofagasta, Chile para culminar la investigación.
A mi maestra de la vida, compañera para algunos, madre para pocos, pero
gran persona para todos, Sra. Hilda; esté es uno de los muchos trabajos,
finalizados por su gran apoyo. Gracias por sus comentarios, su dedicación y
por el gran ejemplo que nos dio, cada día al ingresar por la puerta del
Laboratorio de Analítica, el cual no volverá a ser nunca como antes.
A las personas que tuve la oportunidad de conocer, durante el proceso del
desarrollo de mi Tesis y mi pasantía en Chile, por mostrarme una nueva visión
del área de Productos Naturales.
A mi familia, que siempre creyó en mí en todo momento, anhelo no solo una
dedicatoria, sino un agradecimiento eterno.
INDICE
Índice de tablas
Índice de figuras
Resumen
Abstracts
Introducción
Capítulo I: Planteamiento del problema ............................................................................... 1
1.1 Descripción del problema ........................................................................................ 1
1.2 Formulación del Problema ....................................................................................... 2
1.3 Objetivos ..................................................................................................................... 2
1.3.1 Objetivo General ......................................................................................... 2
1.3.2 Objetivos Específicos ................................................................................. 2
1.4 Justificación e importancia de la investigación .................................................. 3
Capítulo II: Marco Teórico ..................................................................................................... 5
2.1 Estado del arte y antecedentes ............................................................................... 5
2.2 Bases Teóricas ......................................................................................................... 22
2.3 Formulación de hipótesis y variables .................................................................. 27
Capítulo III: Método .............................................................................................................. 28
3.1 Materiales – Reactivos ............................................................................................ 28
Equipos ............................................................................................................................ 28
3.2 Desarrollo Experimental ......................................................................................... 29
3.3 Material Biológico .................................................................................................... 30
3.3.1 Obtención del extracto crudo del fruto Punica Granatum L. ................. 30
3.4 Identificación preliminar de antocianinas ........................................................... 32
3.5 Análisis por UHPLC‑ESI-Q-Orbitrap-MS/MS ....................................................... 32
3.6 Elaboración de Escala de pH ................................................................................. 33
3.6.1 Análisis por espectrofotometría UV- Vis de las soluciones en el rango de 3.5 a 10 unidades de pH. ............................................................................................... 34
3.6.2 Estabilidad del extracto Punica granatum L. como indicador en presencia de luz ................................................................................................. 34
3.7 Valoraciones potenciométricas utilizando el extracto Punica granatum L.
como indicador de pH. .................................................................................................. 35
Capítulo 4: Resultados ........................................................................................................ 37
4.1 Identificación preliminar de antocianinas ........................................................... 37
4.2. Análisis por UHPLC‑ESI-Q-Orbitrap-MS/MS...................................................... 37
4.3 Elaboración de escala de pH ................................................................................. 38
4.3.1 Análisis por Espectrofotometría UV-Vis de las soluciones del indicador de Punica granatum L. en el rango 3.5 a 10 unidades de pH ......................... 39
4.3.2 Estabilidad del extracto Punica granatum L. en presencia de la luz. ... 41
4.4 Uso del extracto Punica granatum L como indicador de pH en valoraciones potenciométricas............................................................................................................ 51
4.4.1. Ácido fuerte monoprótico (HCl) – base fuerte (NaOH) .......................... 51
4.4.2. Ácido débil (CH3COOH) – base fuerte (NaOH) ....................................... 55
4.4.3. Ácido fuerte diprótico (H2SO4) – base fuerte (NaOH)............................. 61
4.4.4. Ácido fuerte triprótico (H3PO4) – base fuerte (NaOH) ............................ 66
4.5 Determinación del pKIndicador- ................................................................................. 71
4.6 Estabilidad en presencia de oxígeno y luz del extracto Punica granatum L.
........................................................................................................................................... 71
4.6.1. Estadístico T-Student para muestras independientes .......................... 73
Discusión de resultados ...................................................................................................... 77
Conclusiones ........................................................................................................................ 79
Recomendaciones ............................................................................................................... 80
Fuentes de Información ....................................................................................................... 81
Anexos .................................................................................................................................. 89
INDICE DE TABLAS
Tabla 1 Principales compuestos funcionales en las diferentes partes de la granada
20
Tabla 2 Fase móvil para el análisis del extracto del fruto Punica granatum L. en el UHPLC-ESI-Q-Orbitrap-MS-MS
33
Tabla 3 Preparación de la escala de pH con soluciones amortiguadoras
34
Tabla 4 Compuestos antocianidinicos, obtenidos del análisis en el equipo UHPLC-ESI-Q-Orbitrap-MS/MS
38
Tabla 5 pH Experimental – pH Teórico para el análisis colorimétrico del extracto Punica granatum L
38
Tabla 6 Absorbancia de la escala de pH (3.5 – 10), con el extracto del fruto Punica granatum L.
41
Tabla 7 Absorbancia de la escala de pH (3.5 – 10), después de 5 minutos de haber añadido el extracto del fruto Punica granatum L.
42
Tabla 8 Absorbancia de la escala de pH (3.5 – 8.0), después de 10 minutos de haber añadido el extracto del fruto Punica granatum L
42
Tabla 9 Absorbancia de la escala de pH (3.5 – 8.0), después de 15 minutos de haber añadido el extracto del fruto Punica granatum L.
43
Tabla 10 Resultados para elaborar la gráfica de la segunda derivada ácido fuerte monoprótico (HCl) vs base fuerte (NaOH) utilizando como indicador extracto de Punica granatum L
51
Tabla 11 Resultados para elaborar la gráfica de la segunda derivada ácido débil (CH3COOH) vs base fuertel (NaOH) utilizando como indicador extracto de Punica granatum L. .
56
Tabla 12 Resultados para elaborar la gráfica de la segunda derivada Ácido fuerte diprótico (H2SO4) vs idróxido de sodio (NaOH) utilizando como indicador extracto de Punica granatum L.
61
Tabla 13 Resultados para elaborar la gráfica de la segunda derivada ácido fuerte triprótico H3PO4 vs hidróxido de sodio (NaOH) utilizando como indicador extracto de Punica granatum L
66
Tabla 14 Valores de pK1 en función del pH
70
Tabla 15 Datos de pKInd a diferentes pH
70
Tabla 16 Estabilidad en presencia de oxígeno y luz en función de la absorbancia de los dos frascos de vidrio (Transparente y ámbar)
71
Tabla 17 Media, varianza (S) desviación estándar (S2) de los tipos de frascos (ámbar y transparente), para determinar la homogeneidad de las varianzas
72
Tabla 18 Media, desviación estándar y error de la desviación estándar de los tipos de frascos de vidrio (ámbar y transparente), para determinar la diferencia significativa entre ambos.
75
INDICE DE FIGURAS
Figura 1. Estructura química de los antocianos
3
Figura 2 Clasificación de los Colorantes
6
Figura 3 Rango de color visible de las antocianinas
7
Figura 4 Estructura de los monosacáridos más comunes
encontrados en las estructuras de antocianinas
8
Figura 5 Biosíntesis de Flavonona
9
Figura 6 Biosíntesis de Flavonona 10
Figura 7 Interacciones π-π de apilamiento en
antocianinas y sus complejos
11
Figura 8 Tipos de Copigmentación
12
Figura 9 Comportamiento cinético del proceso de degradación del EC, en diferentes condiciones de almacenamiento (PA; presencia de aire, PL; presencia de luz, AL; ausencia de luz, AA; ausencia de aire)
13
Figura 10 Cinética de primer orden de degradación 45°C, 60°C y 75°C, lineación de la concentración de antocianinas en función del tiempo.
14
Figura 11 Transformaciones estructurales de las antocianinas en solución ácida a neutra.
15
Figura 12 Equilibrio de las antocianinas, durante la variación de pH
16
Figura 13 Centro de Origen y diversidad de las plantas cultivadas
18
Figura 14 Partes del granado, a) Hojas, b) flores, c) fruto, d) corte longitudinal del fruto, e) arilo, f) cortes
19
longitudinal y transversal del arilo.
Figura 15
Porción comestible: Arilo y Semilla. 20
Figura 16 Espectros UV-Vis de las antocianinas aciladas y 3,5 –diglucósido (línea continua); no aciladas y 3-glucosiladas (línea discontinua)
23
Figura 17 a) Esquema que incluye los componentes básicos de un sistema de HPLC b) Esquema de un espectrófotometro de masas ESi-IT.
25
Figura 18 Ultra High Performance Liquid Chromatography- Electrospray ionization-Quadrupole-Orbitrap-Mass Spectrometry (UHPLC-ESI-Q-Orbitrap-MS/MS)
25
Figura 19 Fruto Punica granatum L
30
Figura 20 Obtención de los arilos del Fruto Punica granatum L.
30
Figura 21 a) Proceso de filtración de los arilos del fruto Punica granatum L. (granada) b) Extracto crudo del fruto Punica granatum L
31
Figura 22 a) Columna de Amberlita XAD -7 b) Extracto de Punica granatum L., recogido de la columna Amberlita XAD-7
31
Figura 23 Multi-Step de la fase móvil del UHPLC-ESI-Q-Orbitrap-MS-MS para el fruto Punica granatum L. .
33
Figura 24 Ácido Clorhídrico 0.1N (Izquierda) e Hidróxido de Sodio 0.1N (Derecha) con el extracto del fruto Punica granatum L
37
Figura 25 Escala de pH, con el extracto del fruto Punica granatum L.
39
Figura 26 Variación de la longitud de onda en función de la variación de pH.
40
Figura 27 Escala de buffer de pH, con el extracto del fruto Punica granatum L., después de 5 minutos.
40
Figura 28 Escala de buffer de pH, con el extracto del fruto Punica granatum L., después de 10 minutos
41
Figura 29 Escala de buffer de pH, con el extracto del fruto Punica granatum L., después de quince minutos.
42
Figura 30 Absorbancia en función de la variación del tiempo (0, 5, 10 y 15 minutos), a pH 3.5
43
Figura 31 Absorbancia en función de la variación del tiempo (0, 5, 10 y 15 minutos), a pH 4.0.
44
Figura 32 Absorbancia en función de la variación del tiempo (0, 5, 10 y 15 minutos), a pH 4.5.
44
Figura 33 Aumento absorbancia en función de la variación del tiempo (0, 5, 10 y 15 minutos), a pH 5.0
45
Figura 34 Aumento de absorbancia en función de la variación del tiempo (0, 5, 10 y 15 minutos), a pH 5.5
45
Figura 35 Aumento de absorbancia en función de la variación del tiempo (0, 5, 10 y 15 minutos), a pH 6.0
46
Figura 36 Aumento de absorbancia en función de la variación del tiempo (0, 5, 10 y 15 minutos), a pH 6.5
46
Figura 37 Aumento de absorbancia en función de la variación del tiempo (0, 5, 10 y 15 minutos), a pH 7.0
47
Figura 38 Aumento de absorbancia en función de la variación del tiempo (0, 5, 10 y 15 minutos), a pH 7.5
47
Figura 39 Aumento de absorbancia en función de la variación del tiempo (0, 5, 10 y 15 minutos), a pH 8.0
48
Figura 40 Aumento de absorbancia en función de la variación del tiempo (0, 5, 10 y 15 minutos), a pH 9
48
Figura 41 Aumento de absorbancia en función de la variación del tiempo (0, 5, 10 y 15 minutos), a pH 10
49
Figura 42 Absorbancia de diferentes valores de la escala 49
de pH, en diferentes fracciones de tiempo (0, 5, 10 y 15 minutos)
Figura 43 Titulación de Ácido Clorhídrico vs. Hidróxido de Sodio indicador fenolftaleína. Antes de la titulación (a) – Punto final (b).
50
Figura 44 Variación de color en la titulación de ácido clorhídrico (HCl) e Hidróxido de Sodio (NaOH) con el extracto Punica granatum L. como indicador., pH = 6,43 (a); 7,12 (b) y 8,27 (c).
50
Figura 45 Curva de titulación ácido fuerte monoprótico (HCl) vs base fuerte (NaOH), utilizando como indicador el extracto de Punica granatum L. Punto de equivalencia (Punto rojo) – Punto final (Punto verde).
52
Figura 46 Curva de la primera derivada de ácido fuerte monoprótico (HCl) vs base fuerte (NaOH), utilizando como indicador el extracto de Punica granatum L. Punto de equivalencia (Punto rojo) – Punto final (Punto verde).
53
Figura 47 Curva de la segunda derivada de ácido fuerte monoprótico (HCl) vs base fuerte (NaOH), utilizando como indicador el extracto de Punica granatum L., Punto de equivalencia (Punto rojo) – Punto final (Punto verde)
54
Figura 48 Titulación de Ácido Acético (CH3COOH) con Hidróxido de sodio (NaOH) indicador el extracto Punica granatum L., pH = 8.36(a), 9.70 (b) y 10.29(c)
56
Figura 49 Curva de titulación ácido débil (CH3COOH) vs base fuerte (NaOH), utilizando como indicador el extracto de Punica granatum L. Punto de equivalencia (Punto rojo) – Punto final (Punto verde)
57
Figura 50 Curva de la primera derivada de ácido débil (CH3COOH) vs base fuerte (NaOH), utilizando como indicador el extracto de Punica granatum L. Punto de equivalencia (Punto rojo) – Punto final (Punto verde)
58
Figura 51 Curva de la segunda derivada de ácido débil 59
(CH3COOH) vs base fuerte (NaOH), utilizando como indicador el extracto de Punica granatum L. Punto de equivalencia (Punto rojo) – Punto final (Punto verde)
Figura 52 Titulación de Ácido Sulfúrico (H2SO4) con Hidróxido de sodio (NaOH), indicador el extracto Punica granatum L., pH = 6.48 (a), 7.20 (b) y 8.91 (c)
56
Figura 53 Curva de titulación ácido fuerte diprótico (H2SO4 0.1N) vs base fuerte (NaOH 0.095 N), utilizando como indicador el extracto de Punica granatum L. Punto de equivalencia (Punto rojo) – Punto final (Punto verde)
62
Figura 54 Curva de la primera derivada de ácido fuerte (H2SO4 0.1N) vs base fuerte (NaOH 0.095 N), utilizando como indicador el extracto de Punica granatum L. Punto de equivalencia (Punto rojo) – Punto final (Punto verde)
63
Figura 55 Curva de la segunda derivada de ácido fuerte (H2SO4 0.1N) vs base fuerte (NaOH 0.095 N), utilizando como indicador el extracto de Punica granatum L. Punto de equivalencia (Punto rojo) – Punto final (Punto verde)
64
Figura 56 Titulación de Ácido fuerte triprótico (H3PO4) con Hidróxido de sodio (NaOH), indicador el extracto Punica granatum L., pH = 6.40 (a), 7.18 (b) y 8.39 (c)
59
Figura 57 Curva de titulación ácido fuerte triprótico (H3PO4) vs base fuerte (NaOH), utilizando como indicador el extracto de Punica granatum L. Punto de equivalencia (Punto rojo) – Punto final (Punto verde)
67
Figura 58 Curva de la primera derivada de ácido fuerte (H3PO4 0.1N) vs base fuerte (NaOH 0.095 N), utilizando como indicador el extracto de Punica granatum L Punto de equivalencia (Punto rojo) – Punto final (Punto verde)
68
Figura 59 Curva de la segunda derivada de ácido fuerte (H3PO4 0.1N) vs base fuerte (NaOH 0.095 N), utilizando como indicador el extracto de Punica
69
granatum L Punto de equivalencia (Punto rojo) – Punto final (Punto verde)
Figura 60 Comparación de Absorbancia entre dos frascos de almacenamiento vidrio incoloro (Serie 1) y ámbar (Serie 2), durante un lapso de 7 días, pH 2.
71
Figura 61 Función de distribución acumulada inversa
73
Figura 62 Función de la distribución de T de Student 74
ABREVIATURAS
BGG Vd Verde de Bromo-cresol
FDA Administración de Alimentos, Medicamentos y Cosméticos de Estados Unidos
ANS Antocianidina sintasa
UHPLC - ESI - Q - Orbitrap – MS - MS
Ultra High Performance Liquid Chromatography- Electrospray ionization – Quadrupole -Orbitrap - Mass Spectrometry
n.d No determinado
Resumen
La investigación propone obtener un indicador natural ácido-base a partir del
extracto de los arilos del fruto Punica granatum L. (granada) como opción de
reemplazo a los indicadores sintéticos (Fenolftaleína). La acción indicadora del
extracto del fruto Punica granatum L. se debe a la presencia de sustancias
fitoquímicas, entre ellas las antocianinas, debido a su inestabilidad a diferentes
valores de pH, temperatura y luz solar. La identificación de algunas de las
antocianinas presentes se realizó por un análisis en el equipo UHPLC-ESI-
MS/MS, de Fase Reversa C-18. Las pruebas preliminares para la evidencia de
antocianinas, fueron medir el viraje de color del extracto frente a una solución
ácida (HCl 0,1M) y una solución básica (NaOH 0,1M), así mismo se realizó una
curva de escala de pH y se midió su estabilidad a la luz solar en diferente
lapsos de tiempo (5, 10 y 15 min), que a su vez fueron analizadas en el
Espectrofotómetro UV-Vis, las valoraciones potenciométricas ácido-base (ácido
fuerte – base fuerte, ácido débil – base fuerte), determinaron los valores de la
primera y segunda derivada, obteniendo el intervalo de pH y el pKInd del
extracto del fruto Punica granatum L. Finalmente, se confirmó que la variación
del pH es uno de los factores que afectó de forma significativa el color del
extracto del fruto Punica granatum L. (Granada), mientras que el efecto de la
luz y el oxígeno a diferentes lapsos de tiempo oxidó el extracto, observándose
una decoloración.
Esta investigación promueve el uso de indicadores naturales en la realización
de titulaciones ácido-base.
Palabras clave: Antocianina, Indicadores Ácido-Base, pH, Flavonoides
Abstracts
The research proposes to obtain a natural acid-base indicator from the extract
of the arils of the fruit Punica granatum L. (granada) as a replacement option for
synthetic indicators (Phenolphthalein). The indicative action of the extract of the
fruit Punica granatum L., is due to the presence of phytochemical substances,
among them anthocyanins, due to their instability at different values of pH,
temperature and sunlight. The identification of some of the anthocyanins
present in the extract was performed by the UHPLC-ESI-MS / MS, Reverse
Phase C-18 team. Preliminary tests for anthocyanin evidence were to measure
the color change of the extract against an acidic solution (0.1M HCl) and a basic
solution (0.1M NaOH), and a pH and (5, 10 and 15 min), which in turn were
analyzed in the UV-Vis Spectrophotometer, acid-base potentiometric titrations
(strong acid - strong base, weak acid - strong base), determined the values of
the first and second derivatives, obtaining the pH range and the pKInd of the
extract of the fruit Punica granatum L. Finally, it was confirmed that the pH
variation is one of the factors that significantly affected the color of the extract of
the fruit Punica granatum L. (granada), while the effect of light at different time
periods oxidized the extract, observing a discoloration.
This research promotes the use of natural indicators in the realization of acid-
base titrations.
Key words: Anthocyanin, Acid-Base Indicators, pH, Flavonoids
Introducción
Los indicadores son sustancias que cambian de color en diferentes rangos de
pH, por lo general son ácido o bases débiles, que presentan diferentes colores
por sus espectros de absorción (Pokharna et al., 2010).
En 1664, Robert Boyle, realizó el primer reporte del uso de colorantes naturales
como indicadores de pH en la colección de sus ensayos "Experimental History
of Colors” (Suva., 2014).
Existen muchas flores, frutas y verduras que contienen sustancias químicas
(antocianinas) que cambian de color en presencia del pH, actuando así, como
indicadores naturales ácidos – base (Vankas et., 2015).
Algunos de los residuos líquidos generados por los laboratorios de análisis son
muchas veces descartados sin ningún tratamiento previo, lo cual fue motivo de
la búsqueda de un nuevo indicador amigable con el medio ambiente. La
presente investigación está basada en los diferentes estudios de escala de pH,
titulación potencio métrica y estabilidad a la luz solar en el extracto crudo del
fruto Punica granatum L. caracterizados por el espectrofotómetro UV-Vis.
La descripción problemática del estudio se desarrolla en el primer capítulo,
detallando los objetivos, justificación e importancia de la investigación.
El segundo capítulo describe el marco teórico, dando a conocer el estado del
arte de los indicadores naturales, mencionando los trabajos realizados con
este fruto y sus características, se describe además las bases teóricas que
incluyen los temas de: Indicador ácido – base, determinación de pKind y el
fundamento de las técnicas espectroscópicas (UV-Vis y UHPLC Ms/Ms) para
la caracterización.
La descripción de la metodología utilizada, indicando los reactivos, materiales y
equipos se detalla en el tercer capítulo, describiendo los ensayos preliminares
de identificación, el método de extracción y caracterización del fruto Punica
granatum L.
En el cuarto, quinto y sexto capítulo se detallan los resultados, discusiones y
conclusiones, respectivamente obtenidos en los análisis preliminares, titulación
potencio métrica, estabilidad a la luz solar.
1
Capítulo I: Planteamiento del problema
1.1 Descripción del problema La contaminación del agua aumenta considerablemente debido al desarrollo de
las industrias en el mundo (Kun L. et al., 2016). Pavan et al., (2007) hace
mención que la liberación de las aguas de colores en el ecosistema es una
fuente de contaminación estética, causando la perturbación en la vida acuática.
Debido a su estructura química, los tintes resisten el desvanecimiento de la
exposición al agua, el calor y reactivos químicos, originando riesgo a la salud
entre ellos dificultad para respirar, vómitos, diarreas y náuseas (Mokhtari et al.,
2016), asimismo causan problemas en el ecosistema marino, dependiendo de
la concentración del colorante y del tiempo de exposición (El Qada E. et al,
2006).
Los indicadores sintéticos de pH más usados son la fenolftaleína y el
anaranjado de metilo. La toxicidad de la fenolftaleína no evidencia actividad
cancerígena, pero si proporciona variedad de enfermedades en ratones
machos y hembras. Mientras que los colorantes azoicos con el componente
arilamínica (Ejemplo.-Anaranjado de metilo), se clasifican como potencialmente
cancerígenos (Mera, 2008), debido a que se descompone en aminas
aromáticas (Baeissa, 2016), además retrasa el proceso de fotosíntesis
inhibiendo así, el crecimiento de los organismos acuáticos (Kun L et al., 2016).
El verde de bromocresol (BGG), es otro indicador de pH que proviene de la
familia del tri-fenil metano, está familia es una de las principales fuentes donde
derivan los colorantes, y la solución acuosa de cristal violeta; al 5% es útil en
infecciones de la piel y las mucosas; sin embargo, posee actividad cancerígena
(Negroni, 2009). La síntesis de algunos indicadores de pH (por ejemplo:
fenolftaleína y anaranjado de metilo) requieren un sistema de bajas
temperaturas o el uso de reactivos de alta toxicidad entre ellos el fenol (Calvo-
Flores y Dobado, 2007), la cual está relacionada con la formación de radicales
libres y su hidrofobicidad, afectando la solubilidad del fenol en la fracción
2
celular y, por tanto, la posibilidad de interacción del compuesto con las células
(Pardo-Díaz et al., 2017).
La química analítica emplea estos indicadores sintéticos con el fin de verificar
los cambios de pH según la variación de color, actualmente estos procesos de
valoración no emplean indicadores naturales, generando inconvenientes en la
contaminación que producen los procesos de descarte y proporcionando un
impacto negativo en el medio ambiente (Alas y Salazar, 2010).
El aumento del interés y desarrollo de los indicadores naturales se debe a su
solubilidad en el agua, mientras que los indicadores sintéticos representan
riesgos químicos y elevados costo para su elaboración (Kavitha G. et al., 2014).
1.2 Formulación del Problema
¿Los procesos de valoración analítica que utilizan indicadores sintéticos
podrían ser reemplazados por indicadores naturales obteniendo así la misma
eficiencia?
1.3 Objetivos
1.3.1 Objetivo General
Obtener un indicador natural ácido-base del extracto de los arilos del
fruto Punica granatum L.
1.3.2 Objetivos Específicos
Obtener una variación de color en un rango de unidad de pH (3.5-10).
Evaluar el indicador natural Punica granatum L. en valoraciones ácido-
base.
Estudiar la estabilidad del indicador natural por acción del oxígeno y la
luz, en un periodo de tiempo caracterizándolo mediante la técnica de
Espectroscopia UV-Vis.
3
1.4 Justificación e importancia de la investigación
Los laboratorios de análisis químico, generan residuos líquidos que contienen
indicadores sintéticos (Fenolftaleína) y son descartados con residuos, muchas
veces sin ningún tratamiento previo, desechando sustancias potencialmente
nocivas para los seres humanos y el medio ambiente (Mera, 2008). El uso de
nuevas fuentes de indicadores naturales, permitirá reducir la contaminación
ambiental y toxicidad que producen los indicadores sintéticos, protegiendo el
medio ambiente (Pavan, 2007).
Las antocianinas poseen un rango de escala de colores que abarca desde el
azul (incrementos en la hidroxilación) hasta el rojo (incrementos en la
metoxilación) (Garzón, 2008), el color de las antocianinas se hace más
resistente a las variaciones de pH cuando se encuentra como productos de
condensación con catequinas en presencia de aldehídos (Fuentes, 2005),
presentando 4 diferentes estructuras estables: ión flavilo, chalcona, quinoidal y
pseudobase.
Las estructuras más comunes de antocianidinas son: pelargonidina, cianidina,
delfinidina, peonidina, malvidina y petunidina (Castillo et al., 2010). Siendo la
cianidina, la más común y responsable del color magenta, los colores rojo-
naranja se deben a la pelargonidina (Figura 1), mientras que los colores violeta
y azul a la delfinidina
Figura 1. Estructura química de las
antocianidinas más comunes.
Fuente: Salinas et al., 2013
4
No obstante, las frutas y hortalizas rojas tales como la uva, pitahaya, rábanos,
cebolla roja y chile de árbol; comparten características en común, los
flavonoides, entro los que se destacan las antocianinas, que son un grupo de
pigmentos ( Castañeda-Sánchez A. & Guerrer-Beltrán J., 2015), los extractos
de flores y de frijol negro fueron utilizados de forma didáctica en la Universidad
Federal de São Carlos para la determinación del punto final en titulaciones de
neutralización, mientras que el extracto de repollo púrpura fue aplicado en
actividades educativas para la determinación de la acidez de diversas
sustancias (Lopes D. & Vitorino A., 2001).
El extracto de los arilos del fruto Punica granatum L. (Granada), presenta un
elevado contenido de antocianinas, que son sustancias orgánicas básicas y
poseen una versión protonada; entre las principales propiedades se encuentran
su diversidad de colores, lo que los hace posibles indicadores de pH
(Marcondes et al.,2014); a las cuales se les atribuye la alta capacidad
antioxidante del jugo de granada, que es asociado con la prevención de
enfermedades cardiovasculares, obesidad, diabetes y cáncer (Díaz, 2014).
Actualmente, los indicadores naturales vienen siendo usados en forma
didáctica para explicar la variación de pH observándose la variación de color,
sin embargo, el impacto ambiental que producen es menor a comparación de
los indicadores sintéticos (Fenolftaleína).
Es por ello que mediante la presente investigación se propone la obtención de
un Indicador ácido-base de origen natural, ya que de esta manera se está
proponiendo una alternativa con el fin de reducir el impacto económico y
ambiental que se da en el uso excesivo de reactivos químicos sintéticos.
5
Capítulo II: Marco Teórico
2.1 Estado del arte y antecedentes
Un colorante es cualquier pigmento o cualquier otra sustancia obtenida por
síntesis o artificio similar o extraída, aislada y derivada con o sin intermediarios
de cambio final de identidad a partir de un vegetal, animal o mineral u otra
fuente que cuando es añadida o aplicada a los alimentos, medicamentos,
cosméticos, al cuerpo humano o a cualquier otra parte, por sí misma es capaz
de impartir color, de acuerdo con la FDA (Administración de Alimentos,
Medicamentos y Cosméticos de Estados Unidos).
Existen varios criterios de clasificación de los colorantes, estos grupos se
basan en su procedencia, fuente de origen o por su grupo cromóforo; de
acuerdo con su procedencia, los colorantes pueden ser clasificados en dos
grandes grupos: naturales y sintéticos o artificiales; como se observa en la
Figura 2 (Fuentes, 2005).
Actualmente, existe una fuente importante de colorantes naturales presentes
en frutas rojas tales como cerezas, ciruelas, fresas, frambuesas, zarzamoras,
uvas, pasas rojas y negras (Aguilera Ortiz, Alanis Guzmán, & Carmen, 2005),
esta tendencia a utilizar colorantes naturales en lugar de los sintéticos o
artificiales se debe a la creciente preocupación por la toxicidad de los
colorantes sintéticos (Rojo 2 y 40) usados en alimentos, cosméticos y
productos farmacéuticos; estos son indicios suficientes para disminuir la
demanda de colorantes artificiales a favor del consumo generalizado de
colorantes naturales como las antocianinas (Garzón, 2008), que se cree que
son inocuos y, por tanto, sin riesgo para la salud humana (Castillo, 2006).
6
El color de las flores es una de las más importantes características en algunas
plantas e influenciado por muchos factores internos y externos (temperatura,
pH del suelo, minerales y etc.) (Zhao et al., 2016).
Varias especies vegetales disponibles en la naturaleza, contienen compuestos
orgánicos coloridos, tales como flavonoides, taninos, carotenoides, entre otros.
La reactividad de los compuestos polifenólicos (flavonoides) presentes, se debe
a la acidez de sus grupos hidroxilo fenólicos, y a la resonancia entre el par de
electrones libres en el oxígeno fenólico y el anillo de benceno, aumentando así
la deslocalización de electrones (Andersen O. y Markham K., 2006)
Dentro de estas clases de polifenoles, las antocianinas destacan debido a sus
diversas e innumerables actividades; en el vegetal, los antocianósidos
(antocianinas) se acumulan en las vacuolas y el pH del medio puede
determinar la coloración de los tejidos. (Barahona & Rivera Bonilla, 2006),
proporcionando estabilidad y solubilidad en agua (Pascual-Teresa et al., 2010),
este grupo de componentes son asociados con plantas coloridas.(Bertini, n.d.).
Se consideran además que las antocianinas tienen como función en la planta el
ser atractores de insectos para los procesos de polinización y diseminación de
las semillas (Fuentes, 2005).
Figura 2. Clasificación de los colorantes. Fuente: Fuentes, 2005
Colorantes
Naturales
Orgánicos
Minerales
Vegetales
Inorgánicos
Animales
Antocianinas
Clorofila
Carotenoides
Sintéticos Orgánicos Azo
Antraquinonas
7
Este grupo está presente en diferentes partes de la planta entre ellos: la fruta,
el tallo, la hoja, la flor, el tubérculo y los colores de la raíz (naranja, rojo,
púrpura y azul). Entre algunas propiedades se incluyen principalmente
radicales libres, actividad protectora contra irradiación UV Vis (He et al., 2012),
y actividad anticancerígena; la cual está relacionada con su capacidad
antioxidante (Aza-González & Ochoa-Alejo, 2012).
Las antocianinas, al igual que otras sustancias polifenólicas, se encuentran en
la naturaleza en forma de glicósidos, siendo conocidas sus agliconas como las
antocianidinas (Figura 3), si bien existen seis antocianidinas comunes, se han
identificado en la naturaleza más de 540 pigmentos antociánicos, siendo la
mayor parte de la variación estructural procedente de la sustitución glicosídica
en las posiciones 3 y 5 por medio de un enlace β-glicosídico (Andersen O. &
Markham K., 2006). Su fórmula básica está compuesta por dos anillos
aromáticos unidos por una estructura de tres carbonos. Cuando el residuo de
azúcar es un hidrolizado de la antocianina, el resultado es la aglicona, conocida
como antocianidina.
Figura 3. Rango de color visible de las antocianinas comunes Fuente: Ananga et al., 2013
Pelargonidina Cianidina Peonidina Delfinidina Petunidina Malvinidina
8
2.1.1 Biosíntesis de las Antocianinas
La ruta bio-sintética de las antocianinas es parecida al de los compuestos
flavonoides debido a que poseen el esqueleto carbonado característico C6C3C6
y el mismo origen bio-sintético como otros flavonoides naturales (Garzón,
2008), siendo estos productos de una unidad de arranque de cinamoil-CoA,
con extensión de cadena utilizando tres moléculas de malonil-CoA como se
observa en la Figura 5, permitiendo de esta manera que se pueda enlazar en
dos maneras diferentes, por reacción aldólica o Claisen, las enzimas estilbeno
sintasa y chalcona sintasa acoplan una unidad cinamoil-CoA con tres unidades
de malonil-CoA dando estilbenos, resveratrol, chalconas o naringenina-
chalcona respectivamente (Dewick P.,2002, p150).
Figura 4. Estructura de los monosacáridos más comunes encontrados en las estructuras de antocianinas.
Fuente: Santacruz, 2011
9
Este compuesto intermedio de 15 C es transformado en una flavanona a partir
de reacción catalizada por una chalcona isomerasa, para la posterior
transformación correspondiente de la flavona en antocianidina por una reacción
de hidroxilación en el carbono 3 seguida de una deshidratación como se
observa en la Figura 6.
La función presente de la antocianidina sintasa (ANS) en la ruta biosintética es
catalizar la reducción de las leucoantocianidinas (Andersen O. & Markham K.,
2006).
Figura 5. Biosíntesis de flavonona. Fuente Dewick P.,2002, p 150
10
2.1.2 Estabilidad de antocianinas
Las antocianinas como pigmentos naturales inocuos tienen considerable
potencial en la industria alimentaria, pero varios factores afectan la estabilidad
y producen la degradación de estos, entre ellos se encuentran la pérdida de
color, seguida de la aparición de color amarillento y formación de productos
insolubles; la estabilización del color es dependiente de la estructura y la
concentración de los pigmentos, y otros factores como el pH, la temperatura, la
presencia de oxígeno (Lopes et al., 2007), luz y presencia de otros compuestos
como flavonoides, proteínas y minerales (Leyva, 2009).
Figura 6. Biosíntesis de antocianinas Fuente Dewick P.,2002
11
2.1.2.1 Copigmentación.
La Copigmentación es una interacción molecular que se produce entre
antocianinas y copigmentos (Gris et al.,2005) entre ellos: aminoácidos, ácidos
orgánicos, flavonoides y alcaloides; a partir de la interacción electrónica planar
(Cuevas et al., 2008), produciendo un aumento de intensidad de color y un
cambio en la longitud de absorción máxima (efecto bato-crómico) (Lopes et al.,
2007); que se da a través del desplazamiento del equilibrio de hidratación-
deshidratación hacia los cromóforos, de esta manera la intensifica el color y
mejora la utilización de las antocianinas como colorantes naturales (Santacruz,
2011).
Las antocianinas forman complejos débiles con proteínas, taninos, otros
flavonoides y polisacáridos esta interacción se conoce como copigmentación
intermolecular (Figura 7), la cual pareciera ser menos eficiente en la
estabilización de los cromóforos de las antocianinas que la co-pigmentación
intra-molecular, que es la acilación, aun así las características de ambos
fenómenos son similares; este efecto ha sido considerado principalmente
responsable de la coloración de tejidos de flores y frutas (Ortiz, 2009).
“ (A) Copigmentación intermolecular, (B) auto-asociación, (C) copigmentación intramolecular en antocianinas
aciladas, (D) auto-asociación de antocianinas aciladas, (E) intercalación en copigmentación intermolecular, y
(F) copigmentación en complejos metal-antocianina”
Figura 7. Interacciones π-π de apilamiento en antocianinas y sus complejos Fuente: Trouillas et al., 2016
Pigmento(antocianina)
Copigmento
Enlace Acilo
Ion Metal
12
Las estructuras anteriores se mantienen por la interacción hidrófoba (π-π
apilamiento) de los núcleos planares polarizables del anillo B de la antocianina
(tanto del catión de flavilo como de la base quinoidal) con el residuo aromático
del mismo pigmento (He et al., 2012). Mientras que la forma hemicetal tiene
dos anillos aromáticos sin conjugar y un anillo central el cual no es planar,
porque tiene un carbono tetraédrico, por lo tanto el ión flavilio es la única
especie capaz de co-pigmentar (Cuevas et al., 2008). Por el contrario las
energías de asociación de copigmentanción intramolecular son menos
susceptibles de determinar experimental porque posee un equilibrio
conformacional (Trouillas et al., 2016).
2.1.2.2 Luz
Según Lopes et al., 2007 indican que el efecto de la luz ataca a las
antocianinas presente en la hierba, con una intensidad considerable, pero este
efecto está íntimamente ligado al efecto del pH (Figura 10) sin embargo las
Figura 8. Tipos de copigmentación Fuente: Trouillas et al., 2016
“(A) Asociación no covalente de un pigmento prototípico de antocianina y un copigmento prototípico de flavonoides
(copigmentación intermolecular). (B) Derivados acilados prototípicos que permiten la copigmentación entre el resto antocianina y dos ácidos fenólicos unidos covalentemente (copigmentación intramolecular)”
Pigmento
Copigmento
R y R3 = H o Azúcar
13
antocianinas que presentan sustituyentes en el hidroxilo del carbono 5 son más
susceptibles a la degradación de la luz (Castañeda-Sanchez et al., 2015), su
descomposición es principalmente foto-oxidativa debido a que el ácido p-
hidroxi-benzoico ha sido identificado como un producto de degradación menor
(Ortiz, 2009). Mientras que las antocianinas di-glicosiladas son más estables a la
decoloración durante la exposición a la luz que los mono-glicósidos (Márquez,
2011).
Figura 9. Comportamiento cinético del proceso de degradación del EC, en diferentes condiciones de almacenamiento (PA; presencia de aire, PL; presencia
de luz, AL; ausencia de luz, AA; ausencia de aire) Fuente: Trouillas et al., 2016
14
2.1.2.3 Temperatura La estabilidad térmica de las antocianinas varía según su estructura, presencia
de oxígeno e interacciones con otros componentes. En general, la estabilidad
del pH conduce a su estabilidad térmica, por ejemplo, la hidroxilación de la
aglicona decrece la estabilidad, mientras que la metoxilación, glucosilación y
acilación tienen el efecto opuesto (Ortiz, 2009).
Las antocianinas se degradan fácilmente a temperaturas superiores a los
40°C. El efecto de la temperatura ocurre por dos mecanismos: por la hidrólisis
del enlace glucosídico (pérdida del azúcar glicosilante en la posición 3 de la
molécula que da lugar a la formación de la aglicona) (Marquez., 2011) o la
ruptura hidrolítica (formación de chalconas) (Castañeda – Sánchez et al.,
2015).
2.1.2.4 Variación de pH
En medios acuosos las antocianinas sufren transformaciones estructurales
dependiendo del pH (Ortiz., 2009).
Se han encontrado cuatro formas de antocianinas que existen en equilibrio: el
catión flavilio, la base azul quinonoidal, la pseudobase incolora carbinol y la
Figura 10. Cinética de primer orden de degradación 45°C, 60°C y 75°C;
lineación de la concentración de antocianinas en función del tiempo. Fuente: Mendoza E. et al., 2016)
15
chalcona (Figura 11). En soluciones ácidas, la antocianina es de color rojo,
debido al catión flavilium, pero al aumentar el pH la intensidad de color
disminuye, por el efecto de conjugación del catión flavilio o hidratación del C2,
incrementando la forma carbinol que es incolora (Peguero, 2007) este cambio
es debido a la formación de un carbinol, por ataque nucleófilo del agua, sobre
el ión flavilio.
A valores de pH ligeramente ácidos o neutros el carbinol y las formas de base
quinoidal dominan al catión flavilio, así el color destiñe y cambia de rojo a azul
(Lopes et al., 2007), por la pérdida de un protón en el C7; un aumento del pH
conduce, seguidamente, a una chalcona (Morales et al., 2005).
Figura 11. Transformaciones estructurales de las antocianinas en solución
ácida a neutra. Fuente: Trouillas et al., 2016
16
La formación de cis-chalcona de base quinoidal anhidra ocurre por dos
maneras diferentes: el resultado de un aumento de pH, o la formación de
especies base quinoidal anhidra ionizadas (A-), debido a un aumento gradual
entre los valores de pH 6,5 y 9. En medio altamente alcalino se observa un
equilibrio entre las formas ionizadas de chalconas: cis y trans, que muestra un
color amarillento (Henrique Marco et al., 2007).
Aunque en muchos casos debido al pH existente, el carbinol incoloro es el
mayoritario, lo que implica que las coloraciones observadas, estén ligadas a
una copigmentación base anhidra con flavonoides o a un complejo metálico
(Morales et al., 2005).
Según se hace mención, tres equilibrios importantes ocurren al elevar el pH de
una solución ácida que contiene una antocianina (Boldarini., 1998); la primera
reacción es el equilibrio rápido ácido-base de la protonación de catión flavilio,
luego la formación de una pseudo-base carbinol, a través de un equilibrio
rápido con constante Kb y finalmente un equilibrio tautomérico lento, formando
un pseudobase chalcona incolora con una constante de equilibrio KT.
Figura 12. Equilibrio de las antocianinas, durante la variación de pH Fuente: Boldarini., 1998
17
2.1.2.5 Oxigeno
Las antocianinas son inestables en presencia de oxígeno, son termolábiles y
los cambios en el pH provocan su transformación estructural, incluso en
ausencia de luz.
Se produce dos tipos de degradación, oxidación directa o indirecta de los
componentes del medio que reaccionan con antocianinas.
Oxidación directa: Formación de precipitados y el desarrollo de
turbidez en zumos de fruta (Lopes, 2007).
Oxidación indirecta: Oxidación de constituyentes que reaccionan con
las antocianinas resultando producto descolorido u oscuro. (Ortiz
Aguilera, 2009)
En presencia de oxigeno la máxima estabilidad térmica de las antocianidina – 3
glicosidadas es a pH 1.8 a 2.0, mientras que para las antocianidinas -3,5
diglicosidadas lo es a pH 4.0 – 5.0 (Fuentes, 2005).
2.1.3 Punica granatum L.-
El estudio de las antocianinas en frutas tropicales, ha tomado fuerza la última
década no solo por la capacidad de pigmentación, sino también por su
capacidad antioxidante (Santacruz, 2011).
La granada (Punica granatum L.) es un fruto cuyo cultivo se conoce desde la
antigüedad, pertenece al Centro Oriente Próximo (Asia Menor, la
Transcaucásica, Irán y las tierras altas de Turkmenistán), centro al que
también pertenecen otros frutales como la higuera, manzano, peral,
membrillero, cerezo, almendro, avellano, castaño, etc. El cultivo del granado se
extendió desde estas zonas al resto de países del área mediterránea, India y
China. Los españoles lo llevaron a América y aquí está adquiriendo gran
importancia, especialmente durante los últimos 15 años (Melgarejo et al., n.d)
18
Figura 13. Centro de origen y diversidad de las plantas cultivadas. Fuente: Melgarejo et al., n.d
El árbol llega a medir entre 3 a 6 m de altura, posee el tronco retorcido, madera
dura y corteza escamosa de color grisáceo, algunas de las ramas son
espinosas, tiene ramillas angulosas, copa extendida y mucho ramaje
Su clasificación sistemática es la siguiente (Calín & Carbonell, n.d.):
División: Fanerógamas
Clase: Dicotiledóneas
Subclase: Arquiclamídeas
Orden: Myrtales.
Familia: Punicaceae
Género: Punica
Especie: Punica granatum L.
19
Figura 14. Partes de Punica granatum L. a) hojas, b) flores, c) fruto, d) corte longitudinal del
fruto, e) arilo, f) cortes longitudinal y transversal del arilo. Fuente: Díaz., 2014
La granada posee numerosos compuestos químicos de alto valor biológico en
sus diferentes partes: corteza, membranas carpelares, arilos y semillas; entre
ellos se encuentran: polifenoles, flavonoides; elagitaninos, proantocianidinas y
minerales (potasio, nitrógeno, calcio, fósforo, magnesio y sodio). La parte
comestible de la granada representa alrededor del 50% del peso total de una
granada y consiste en un 80% de arilo (parte carnosa) y un 20% de semilla
(Calín A. et al n.d).
20
Figura 15. Porción comestible: arilo y semilla.
Fuente: Calín & Carbonell, n.d
Diversos estudios indican que los arilos de la granada presentan un elevado
contenido de antocianinas, a las cuales se les atribuye la alta capacidad
antioxidante de los jugos de granada (Díaz, 2014). Además, análisis químicos
han reportado que la Punica granatum L. contiene un nivel significativamente
alto de taninos hidrolizables, así como antocianinas; como se observa en la
Figura 16, los cuales han sido asociados con diversas propiedades benéficas a
la salud (Tzulker R., 2007)
Tabla 1: Principales compuestos funcionales en las diferentes partes de la granada. Fuente: Díaz, 2014
Parte de la Planta Constituyentes
Jugo Antocianinas, ácidos gálico, elágico y cafeico,
catequina, elagitaninos, quercetina, rutina.
Aceite de Semilla Ácido linoleico conjugado, ácido linoleico, ácido oleico,
ácido esteárico, ácido eleosteárico, ácido catálpico
Cáscara y albedo Punicalagina, punicalina, pedunculagina, ácido elágico y
galágico, luteolin, quercetina, kaempferol
2.1.3.1 Propiedades del zumo de granada (Punica granatum L.)
El ácido púnico tiene efectos anti-aterogénicos, que pueden ser transformados
en urolatinas (Larrosa et al, 2010). Las punicalaginas son los compuestos que
presentan mayor capacidad antioxidante o captadora de radicales libres y son
21
responsables de aproximadamente el 50% de esta actividad en el zumo de la
granada (Díaz, 2014).
El zumo de granada posee sustancias con actividad antibacteriana, antiviral,
anticancerígena, antiinflamatoria, para el control del colesterol y prevención de
problemas cardiovasculares, etc. Son las punicalaginas los compuestos que
presentan mayor capacidad antioxidante o captadora de radicales libres y son
responsables de aproximadamente el 50% de esta actividad en el zumo de
granada, desarrollando así una capacidad antioxidante tres veces superior a la
del vino tinto y a la del té verde (Melgarejo et al., n.d).
2.1.3.2 Extracción de zumo de granada (Punica granatum L.)
El producto más estudiado e importante del derivado de la granada es el zumo.
La composición del arilo de la granada es la siguientes: agua (85%); azúcares
(10%), principalmente fructuosa y glucosa; ácidos orgánicos (1,5%),
principalmente ácido ascórbico, cítrico y málico; compuestos bio-activos tales
como poli-fenoles y flavonoides (principalmente antocianinas) (Calín &
Carbonell, n.d)
Existen diversos métodos de extracción de jugo de granada, los más utilizados
son: método manual, donde se separan los arilos de la cáscara y albedo para
prensarlos a través de una malla; y exprimidor, en donde se utiliza una prensa
donde se comprime la fruta entera, por lo que se extrae jugo tanto de los arilos
como del albedo. A diferencia del contenido de fenoles solubles totales y
taninos hidrolizables, la concentración de antocianinas es menor en extractos
elaborados a partir del exprimidor y del procesador que en los elaborados a
partir del método manual (Díaz, 2014).
22
2.2 Bases Teóricas
2.2.1 Análisis de Antocianinas por espectrofotometría UV-Vis
Las antocianinas son compuestos cromóforos al igual que los carotenos y las
xantófilas. Tales compuestos al tener estructuras resonantes tienen
conjugación electrónica, por sus 8 dobles enlaces (Ortiz, 2009), lo cual
aumenta a medida que la molécula tiene grupos sustituyentes con pares de
electrones no compartidos. A partir de esto se generan alteraciones en la
configuración electrónica que provocan cambios en la forma de la molécula y
por ende un desplazamiento de la máxima absorbancia en el espectro (λmáx)
(Peguero, 2007).
Debido a su estructura, las antocianinas presentan máximos de absorción tanto
en la región visible como en la ultravioleta lo que resulta muy importante para la
caracterización estructural de dichos compuestos. De hecho, la espectro-
fotometria UV/Vis, constituye una herramienta muy útil para el estudio de
pigmentos y colorantes, determinando la longitud de onda de absorción del
grupo cromofórico que da lugar a la coloración específica (Contreras R., 2007)
Sus espectros de absorción se caracterizan por tener dos bandas separadas
una el UV alrededor de 275 nm. y otra en la región visible entre 465 y 550 nm,
esta última banda de absorción varía con el pH del medio. (Castillo et al.,
2010). Esto sugiere que el anillo A absorbe en el rango UV, mientras que la
absorción visible es debido al anillo B. La región visible permite observar el
efecto de la co-pigmentación, muestra un efecto hiper-cromico (el aumento de
la intensidad de la máxima observada) resultando en muestras con mayor
presencia de color; y un desplazamiento bato-crómico de la absorbancia
máxima de la posición de la longitud de onda más pequeño, causada por el
efecto de solvatación (Lopes, 2007).
Algunos factores que influyen en el desplazamiento de la absorbancia o la
longitud de onda, son la glicosilación y grupos acilo.
23
Glicosilación.- Se produce un desplazamiento del máximo de absorción
en la región visible de unos 10 nm hacia longitudes de onda más bajas, en
relación con el aglicón correspondiente. Las antocianinas de di-glucósido
presentan máximos de absorción hacia longitudes de onda más bajas que los
mono-glucósidos correspondientes.
Grupos acilo.- Puede causar la aparición de un máximo adicional (o
hombro) en el espectro UV. Un ejemplo, la esterificación con el ácido p-
cumárico aumenta la absorción aproximadamente a 308-313 nm y con ácido
cafeico a 326-329 nm (Escribano – Bailon et al.,2004).
2.2.2 Análisis por UHPLC-ESI-Q-Orbitrap-MS-MS
La cromatografía liquida en fase reversa C18 se basa en el principio de las
interacciones hidrofóbicas, debido a las fuerzas de repulsión entre un
disolvente relativamente polar, y una fase estacionaria apolar. Debido a que las
antocianinas son compuestos polares, este tipo de columnas se usa para el
análisis cualitativo y cuantitativo de mezclas de estos pigmentos, usualmente el
tiempo de retención de las agliconas se da en el siguiente orden: delfinidina <
cianidina < pelargonidina < petunidina < peonidina < malvidina. Las
Figura 16. Espectros UV-Vis de las antocianinas aciladas y 3,5 –diglucósido
(línea continua); no aciladas y 3-glucosiladas (línea discontinua) Fuente: Santacruz., 2011
24
antocianinas glucosiladas eluyen en el siguiente orden: 3,7 diglucósidos < 3,5
diglucósidos < 3-sophorósidos < 3-rutinósidos < 3 ramnósidos (Santacruz,
2011).
El Espectrofotómetro de Masas Q Exactive Focus, presenta algunas
herramientas en particulares:
- Electro-Spray: La fuente de ionización, que es el punto de partida
donde se forma la nube y el flujo de iones.
- Tubo de Transferencia o Ion transfer: Es el túnel de entrada donde la
muestra se mueve por el vacío que aplican las bombas internas.
- Lentes “S”: Se encargan de colimar (ajuste de trayectoria) mediante
la aplicación de voltajes.
- Skimmer: Puerta posterior que poseen los lentes S.
- Flatopolo de Inyección o Flatopolo Curvo: Las únicas vías de
aceleración del haz de iones, debido a que solo aplican un radio de
radiofrecuencia que hace moverse a cualquier particula con carga,
sin discriminar ni filtrar por masa.
- El cuadrupolo: Separación y filtración por masas, adicionalmente
aplican un campo eléctrico variable que permite a las masas
separarse y filtrarse.
- La celda C o Celda de Confinamiento (C trap): Caja de
almacenamiento de iones, pueden pasar de forma directa al detector
Orbitrap (Celda de colisiones HCD).
El sistema fue totalmente automatizado y controlado por el software Thermo
Scientific SIEVE, que fue usado para la recopilación y análisis de datos. La
temperatura del Vaporizador fue 500°C, el ion de trasferencia de temperatura
del tubo en 400°C, y el voltaje del Spray utilizada fue en +3000 V, mientras el
flujo del líquido 1000uL/min.
25
Figura 18. Ultra High Performance Liquid Chromatography- Electrospray ionization-
Quadrupole-Orbitrap-Mass Spectrometry (UHPLC-ESI-Q-Orbitrap-MS/MS) Fuente: Foto tomada del Laboratorio de Productos Naturales – Universidad de Antofagasta
a)
b)
Figura 17. a) Esquema que incluye los componentes básicos de un sistema de
HPLC b) Esquema de un espectrófotometro de masas ESi-IT. Fuente: Gómez., 2010
26
2.2.3 Indicadores Ácido – Base
Los indicadores ácido-base y los indicadores de pH son sustancias orgánicas
débilmente ácidas (indicadores ácidos o indicadores básicos) que tienen
diferentes colores para sus formas protonadas y des-protonadas (cambian de
color en función del pH). Se clasifican comúnmente de acuerdo con los
mecanismos de modificación de sus colores, para ser aplicados como
indicadores (Marcondes et al., 2014).
En el análisis químico se estudia los métodos y las técnicas para determinar la
composición de la materia en forma cualitativa y cuantitativa. Ambos
procedimientos se asemejan en el hecho de que se utiliza para su
determinación cualquiera de las propiedades de la sustancia de interés, ya
sean químicas y físicas que puedan proporcionar la información deseada, para
detección o cuantificación.
La química analítica ha empleado indicadores sintéticos con el fin de verificar
cambios de pH por la variación de color, no obstante se determinó que el
extracto coloreado de ciertos frutos, vegetales, flores también cambia de color
en soluciones ya sean ácidas o básicas (Barahona et al., 2006).
Un estudio con extractos de etanol de flores quaresmeria (Granulosa
tibouchina) entre otras, se utilizaron como indicadores en el proceso de
normalización del NaOH usando biftalato de sodio como patrón, demostrando
su eficacia (Suarez, et al 2001, citado por Brilhante et al.,n.d).
2.2.4 Determinación de pKInd
La determinación del pKInd, se realizó a partir de las diferentes absorbancias
emitidas en diferentes valores de pH, utilizando la ecuación de:
= + log ( )
27
Deducida de la Ecuación de Lambert – Beer “Ley del equilibrio HInd H+ + Ind-”
Una misma alternativa de intervalo de pH con transición de color para el
indicador fue dado por pH = pKind +/- 1. (Guimaráes et al., 2012)
2.3 Formulación de hipótesis y variables
2.3.1 Hipótesis
2.3.1.1. Hipótesis general
El indicador natural del extracto Punica granatum L, puede reemplazar un
indicador sintético (Fenolftaleína)
2.3.1.2 Hipótesis especificas
El indicador natural del extracto de Punica granatum L. cambia de color en un
rango de pH 3.5 – 10.
El extracto de Punica granatum L. puede usarse como indicador natural en
valoraciones potenciométricas ácido – base.
El extracto de Punica granatum L. es estable frente al oxígeno y luz, durante
un periodo de tiempo (5, 10 y 15 minutos).
2.3.2 Variables
Variables Independientes. -
- La estructura química de la antocianina que presenta el fruto Punica
granatum L en el extracto de los arilos.
Variable Dependiente. -
28
- La capacidad del extracto Punica granatum L. de ser un indicador
natural.
Capítulo III: Método
El desarrollo experimental se dividió en dos partes:
- Extracción, purificación y ensayos preliminares se desarrollaron en los
laboratorios de Química Analítica y Química Experimental de la Universidad
Nacional Federico Villarreal.
- Los estudios de identificación y curvas potencio-métricas se realizaron en el
Laboratorio de Productos Naturales de la Universidad de Antofagasta – Chile
3.1 Materiales – Reactivos - Acetato de
sodio (Anhidro)
- Ácido acético (Glacial)
- Ácido bórico (Sólido)
- Agua ultrapura (<2µScm-1)
- Buretas (25 mL)
- Cloruro de potasio (Sólido)
- Embaces Ámbar (100,150, 200
y 250 mL)
- Embudo
- Erlenmeyer (250 mL)
- Espátula
- Fenolftaleína
- Fiolas (100 y 250 mL )
- Fosfato de sodio di-básico
(Anhidro)
- Fosfato de sodio mono-
básico (Di-hidratado)
- Hidróxido de sodio (Sólido)
- Luna de reloj
- Naranja de metilo
- Papel filtro (Watman 40)
- Pipetas graduadas (10 y 25
mL)
- Pro-pipetas
- Rota-vapor
- Tela de gasa
- Tubos de ensayos
Equipos - Espectrofotómetro Uv-Vis (Spectroquant Pharo 300)
29
- Ultra High Performance Liquid Chromatography- Electrospray
ionization - Quadrupole - Orbitrap - Mass Spectrometry
(UHPLC-ESI-Q-Orbitrap-MS-MS)
- pH metro. HI 2221 Calibration Check pH/ORP Meter-HANN 3.2 Desarrollo Experimental La metodología de análisis para el fruto Punica granatum L, se resume en el
siguiente esquema. -
Ácido (3.5-6)* Ácido fuerte mono-
prótico (HCl)– base
fuerte (NaOH)
Obtención de Reactivos y Materiales
2- Elaboración de escala de
pH
4- Valoraciones potencio-métricas
Extracto Crudo
Caracterización del extracto
en función de la variación
de pH
Centrifugación, filtración y almacenamiento *
3- Pruebas de estabilidad del extracto
Punica granatum L. en presencia de
oxígeno y luz durante el
almacenamiento. Caracterización por
Espectrofotómetro UV-Vis
Pruebas de estabilidad del extracto a
diferentes valores de pH en
presencia de luz (5, 10, 15 minutos)
por Espectrofotómetro UV-Vis.
Separación de azúcares por columna de
Amberlita XAD-7, Fase móvil metanol
(Fracción libre de azúcares)
Análisis por UHPLC-
ESI- Q-Orbitrap-
MS/MS
Metanol +
Sonicado
(Ultrasonido)
Neutro 7*
Ácido fuerte di-
prótico (H2SO4) –
base fuerte (NaOH)
Ácido débil
(CH3COOH) – base
fuerte (NaOH)
Ácido fuerte tri-
prótico (H3PO4) –
base fuerte (NaOH)
1- Identificación
preliminar de
antocianinas
Básico (8-10)
30
3.3 Material Biológico El fruto de Punica granatum L. (granada) se seleccionó a partir del color y la
textura de la cáscara.
Figura 19. Fruto Punica granatum L.
Foto Propia
3.3.1 Obtención del extracto crudo del fruto Punica Granatum L. Para la obtención de los arilos de la granada, se trabajó con de 6 kg de material
vegetal del cual se seleccionaron los arilos que fueron desinfectados con una
solución de Hipoclorito de sodio 10 ppm, lavándose al final con abundate agua,
eliminando las impurezas restantes.
La elaboración del extracto crudo de la granada se basó en la metodología de
Díaz, 2014; que consistió en el método manual, para la obtención de arilos,
luego fue prensado a través de una malla de nylon parar obtener el extracto.
Espectrofotómetro UV-VIS
*Elaboración de diagrama de flujo con el aporte de Azebedo, 2011, Heras et al., 2013) y Texeira R. et al., 2014
31
Figura 20. Obtención de los arilos del fruto Punica granatum L.
Foto Propia
Una vez obtenido el extracto crudo (250 mL), fue concentrado a baño maría, a
una temperatura menor de 40°C. El extracto concentrado fue llevado a la
centrifugadora (Janitzio T30) durante cinco minutos a 3000 rpm, posteriormente
filtrándose en papel 40 (Whatman), para ser almacenados a una temperatura
de -4°C hasta su análisis.
Figura 21. a) Proceso de filtración de los arilos del fruto Punica granatum L. (granada) b)
Extracto crudo del fruto Punica granatum L. Foto Propia
El extracto almacenado, fue llevado a una columna para la separación de los
azúcares, utilizando la Amberlita XAD-7 y metanol destilado como fase móvil,
luego se concentró en el equipo de rotavapor a una temperatura de 40 ° C, y
la fracción libre de azúcares se almacenó a -4°C.
a) b)
a) b)
32
Figura 22 a) Columna de amberlita XAD -7 b) Extracto de Punica granatum L., recogido de la
columna amberlita XAD-7 Foto Propia
3.4 Identificación preliminar de antocianinas Para la identificación de la presencia de las antocianinas, se realizó una prueba
preliminar, para evaluar el cambio de color del extracto en diferentes medios
ácido fuerte – base fuerte.
a) Medio ácido
En un tubo de ensayo se colocó 5 mL de HCl 0.1 N, pH = 0.15 y se añadió 1
mL del extracto de Punica granatum L. (Granada).
b) Medio básico
En un tubo de ensayo se colocó 5 mL de NaOH 0.1 N, pH= 12.84 y se añadió 1
mL del extracto de Punica granatum L. (Granada).
3.5 Análisis por UHPLC-ESI-Q-Orbitrap-MS/MS
La fracción libre de azúcares del extracto Punica granatum L., fue disuelta en
metanol (HPLC), llevado al equipo de Ultra Sonido y finalmente filtrada, para
posteriormente ser analizada en el equipo Ultra High Performance Liquid
Chromatography- Electrospray ionization – Quadrupole -Orbitrap - Mass
Spectrometry (UHPLC-ESI-Q-Orbitrap-MS-MS), de Fase reversa C-18,
acoplado a un Espectrofotómetro Masas (THERMO Q-Exactive) con precursor
de cuadrupolo, operado en modo de Electro-Spray con ionización positiva
(ES+).
La separación cromatográfica fue en gradiente con las siguientes condiciones:
caudal de la fase móvil - 1mL/min y el tiempo de carrera para el extracto del
fruto Punica granatum L. fue de 47 min, siendo el volumen de la muestra
inyectada de 10 μL.
33
La composición de la fase móvil (agua y acetonitrilo) fue en gradiente y se
muestra en la Tabla 1.
Tabla 2: Fase móvil para el análisis del extracto del fruto Punica granatum L. en UHPLC-ESI-Q-Orbitrap-
MS-MS.
Figura 23. Multi-Step de la fase móvil del UHPLC-ESI-Q-Orbitrap-MS-MS para el f ruto
Punica granatum L. Fuente: Datos obtenidos en el Laboratorio de Productos Naturales – Universidad de Antofagasta
3.6 Elaboración de Escala de pH
Se prepararon buffers de ácido acético 0.2M - acetato de sodio 0.2M entre 3.5 -
5.5 unidades de pH, buffers de fosfato de sodio mono-básico 0,2M – fosfato de
sodio di-básico 0.2M entre 6 - 8 unidades de pH y buffers de ácido bórico
0.1M – cloruro de potasio 0.1M – hidróxido de sodio 0.1M entre 9 – 10
unidades de pH, según se observa en la Tabla N°2 se transfirió 5 mL de cada
buffer a tubos de ensayo rotulados, se adicionó 0.5 mL del extracto Punica
COMPOSICIÓN VOLUMÉTRICA DE FASE MÓVIL (PUNICA GRANATUM L.) Retención(min) Flujo (mL/min) Agua (%) Acetonitrilo(%)
1 -12 1 95% 5% 2 5 1 95% 5% 3 10 1 70% 30% 4 15 1 70% 30% 5 20 1 30% 70% 6 25 1 30% 70% 7 35 1 95% 5%
34
granatum L., se homogenizó y dejó en reposo por un lapso de 10 segundos,
observándose el viraje de color en cada uno de los tubos.
Tabla 3: Preparación de la escala de pH con soluciones amortiguadoras
3.6.1 Análisis por espectrofotometría UV- Vis de las soluciones en el rango de 3.5 a 10 unidades de pH.
En el Espectrofotómetro UV-Vis (Spectroquant Pharo 300) se analizó el
desplazamiento de la longitud de onda en función de la variación de pH de las
soluciones buffers anteriormente discutidas
3.6.2 Estabilidad del extracto Punica granatum L. como indicador en presencia de luz
La estabilidad del extracto Punica granatum L., a diferentes pH (3.5 – 10) en
presencia de la luz, se evaluó a los 5, 10 y 15 minutos, en el Espectrofotómetro
UV-Vis. (Spectroquant Pharo 300)
35
3.7 Valoraciones potenciométricas utilizando el extracto Punica granatum L. como indicador de pH.
El extracto de Punica granatum L., libre de azúcares se evaluó como indicador
de pH natural en las siguientes valoraciones potenciométricas.
3.7.1 Ácido fuerte mono-prótico (HCl) y base fuerte (NaOH)
Se realizó la valoración potenciométrica de la neutralización del HCl con
NaOH utilizando como indicador fenolftaleína y también el extracto libre de
azúcares del fruto Punica granatum L. como se describe.
- Se añadió 30 mL de ácido clorhídrico en un matraz erlenmeyer de 250
mL; en una bureta se añadió 50 mL de hidróxido de sodio. El viraje de
color se observó al adicionar 3 gotas del indicador (fenolftaleína o
extracto libre de azúcares del fruto Punica granatum L.)
3.7.2 Ácido débil (CH3COOH) y base fuerte (NaOH)
Se realizó la valoración potenciométrica de un ácido débil (CH3COOH) con
una base fuerte (NaOH).
- Se añadió 30 mL de ácido acético en un matraz Erlenmeyer de 250 mL y
50 mL de hidróxido de sodio en una bureta de 50 mL. El viraje de color
se observó al adicionar 3 gotas del indicador con una agitación
constante.
* Como indicador el extracto de Punica granatum L.
3.7.3 Ácido fuerte diprótico (H2SO4) y base fuerte (NaOH) La valoración potenciométrica de la neutralización de un ácido fuerte
diprótico y una base fuerte se realizó con H2SO4 y NaOH.
36
- Se añadió 30 mL de ácido sulfúrico en un matraz erlenmeyer de 250
mL; 50 mL de hidróxido de sodio en una buret. El viraje de color se
observó al adicionar 3 gotas del extracto Punica granatum L. con una
agitación constante durante el proceso.
3.7.4 Ácido fuerte triprótico (H3PO4) y base fuerte (NaOH)
La valoración potenciométrica de la neutralización de un ácido fuerte triprótico
y una base fuerte se realizó con H3PO4 y NaOH.
- Se añadió 30 mL de ácido fosfórico en un matraz erlenmeyer de 250 mL;
en una bureta se añadió 50 mL de hidróxido de sodio 0.095M. El viraje
de color se observó al adicionar 3 gotas del extracto Punica granatum L.
con una agitación constante durante el proceso.
3.8 Determinación del pKindicador
Para la determinación del pKIndicador se realizó un análisis en el
espectrofotómetro UV-Vis, en la escala de buffer 6.5 a 8.5 de pH con
aproximadamente 10 gotas de extracto libre de azúcar.
3.9 Evaluación del extracto Punica granatu L. en presencia de oxígeno.
La estabilidad en presencia de oxígeno del extracto libre de azúcares, se
analizó durante un periodo de 7 días, siendo almacenada una fracción de 10
mL en un frasco de vidrio ámbar y otra fracción de 10 mL en un frasco de vidrio
incoloro - transparente, para luego ser evaluados en el Espectrófotometro UV-
Vis.
3.9.1 Prueba estadística T-Student para calcular la significancia para los datos obtenidos
37
La prueba t-Student permite comparar muestras, N ≤ 30 y/o establece la
diferencia entre las medias de las muestras (Sánchez R. 2015).
Existen dos versiones de la prueba t-Student: una que supone que las
varianzas muestrales son iguales y otra versión que no asume esto último.
Para decidir si se puede suponer o no la igualdad de varianza en las dos
muestras, se debe realizar previamente la prueba F-Snedecor de comparación
de dos varianzas.
Capítulo 4: Resultados
4.1 Identificación preliminar de antocianinas La fracción libre de azúcar de Punica granatum L. presentó dos cambios
colorimétricos, el primero en el medio ácido - HCl (rojo) y segundo en el medio
básico - NaOH (amarillo), como se observa en la Fig 25.
Figura 24. Ácido Clorhídrico 0.1N (a) Extracto de Punica granatum L. en medio ácido (color
rojo) (b) Extracto de Punica granatum L. en medio násico. (color amarillo) Foto Propia
4.2. Análisis por UHPLC-ESI-Q-Orbitrap-MS/MS
El análisis en el equipo UHPLC-ESI-Q-Orbitrap-MS/MS proporcionó el peso
molecular de las estructuras presentes en el extracto del fruto Punica granatum
L., debido a que se encuentran en forma ionizada en la solución.
a b
38
A partir del fraccionamiento MS/MS, se obtuvieron los pesos moleculares de las
antocianidinas y algunos residuos de azúcares presentes o grupos acilos, que
pueda obtener el extracto.
Tabla 4: Compuestos antocianidicos, obtenidos del análisis en el equipo UHPLC-ESI-Q-ORBITRAP-
MS/MS
En los anexos 1, 2 y 3 se observan
los cromatogramas del UHPLC y
espectros MS y MS/MS de las
antocianinas, presentes en el extracto del fruto Punica granatum L.
4.3 Elaboración de escala de pH
Nombre De Compuesto
Peso Del Fragmento
(m/z)
Fórmula Condensada
Tiempo Retención
(Min)
Cianidina - Diglúcosida 611.18 m/z C27H31O16+ 19.1 min Cianidina – Monoglucósida 433.11 m/z C21H21O11+ 20.2 min Pelargonidina – Diglúcosida 595.18 m/z C27H31O15+ 19.5 min
Cianidina 287.06 m/z C15H11O6+ 19.1 min Pelargonidina 271.06 m/z C15H11O5+ 19.5 min
pH Teórico pH Experimental 3.5 3.49 4 3.85
4.5 4.58 5 5.02
5.5 5.6 6 6.05
Tabla 5: Escala de pH teórico – experimental para el análisis colorimétrico del extracto Punica granatum L
39
4.3.1 Análisis por Espectrofotometría UV-Vis de las soluciones del indicador de Punica granatum L. en el rango 3.5 a 10 unidades de pH
6.5 6.60 7 7.13
7.5 7.66 8 7.92 9 9.04 10 10.01
pH
Longitud De Onda (nm)
Absorbancia
40
En la escala
de pH (3.5 -10)
con el extracto
del fruto Punica
granatum L., se distingue fácilmente la variación del valor presente en el rango
3.5 – 5 el cual presenta un rosado claro, mientras que al aumento de pH 5.5 – 7
se distingue un color morado claro, un tercer color se denota en el rango de pH
7.5 - 8 presentando una tonalidad violeta-azulado y para finalizar en el medio
básico, pH 9-10 se observa la degradación de la antocianina por el color
amarillo oscuro.
3.5 512 nm 0.15 4 511 nm 0.141
4.5 514 nm 0.081 5 514 nm 0.094
5.5 523 nm 0.183 6 531 nm 0.455
6.5 539 nm 0.461 7 559 nm 0.473
7.5 582 nm 0.55 8 585 nm 0.578 9 555 nm 0.515
10 556 nm 0.305
Tabla 6: Absorbancia de la escala de pH (3.5 – 10), con el extracto del fruto Punica granatum L.,
Figura 25. Escala de pH (3.5 – 10), con el extracto del fruto Punica granatum L. Fuente: Elaboración propia
41
4.3.2 Estabilidad del extracto Punica granatum L. en presencia de la luz.
La escala de pH (3.5 - 10) fue analizada en el Espectrofotómetro UV-Vis
(Spectroquant Pharo 300), después de cada lapso de tiempo (0, 5, 10 y 15
minutos) para comparar y evaluar el efecto hipercrómico de la absorbancia.
Figura 27. Escala de buffer de pH, con el extracto del fruto Punica granatum L., después de 5
minutos. Foto Propia
500510520530540550560570580590600
0 2 4 6 8 10 12
Long
itud
de O
nda
(nm
)
pH
pH vs Longitud de onda
Series1
Figura 26. Variación de la longitud de onda en función de la variación de pH. Fuente: Elaboración propia
42
Tabla 7. Absorbancia de la escala de pH (3.5 – 10), después de 5 minutos de haber añadido el extracto del fruto Punica granatum L.
pH Longitud de Onda (nm) Absorbancia 3.5 515 nm 0.169 4 516 nm 0.101
4.5 515 nm 0.068 5 522 nm 0.067
5.5 522 nm 0.068 6 527 nm 0.134
6.5 541 nm 0.26 7 565 nm 0.382
7.5 583 nm 0.478 8 587 nm 0.645 9 557 nm 0.369
10 561 nm 0.277
Figura 28. Escala de buffer de pH, con el extracto del fruto Punica granatum L., después de 10
minutos. Foto Propia
43
Figura 29. Escala de buffer de pH, con el extracto del fruto Punica granatum L., después de
quince minutos. Foto Propia
pH Longitud de Onda (nm) Absorbancia
3.5 514 nm 0.167 4 515 nm 0.091
4.5 516 nm 0.055 5 518 nm 0.067
5.5 523 nm 0.057 6 526 nm 0.101
6.5 541 nm 0.202 7 568 nm 0.282
7.5 584 nm 0.415 8 584 nm 0.45 9 557 nm 0.355
10 562 nm 0.267
Tabla 8: Absorbancia de la escala de pH (3.5 – 10.0), después de 10 minutos de haber añadido el
extracto del fruto Punica granatum L.
44
Tabla 9: Absorbancia de la escala de pH (3.5 – 10.0), después de 15 minutos de haber añadido el extracto del fruto Punica granatum L.
pH Longitud de Onda (nm) Absorbancia
3.5 513 nm 0.16 4 511 nm 0.06
4.5 515 nm 0.055 5 521 nm 0.054
5.5 520 nm 0.05 6 527 nm 0.109
6.5 539 nm 0.164 7 563 nm 0.277
7.5 583 nm 0.384 8 585 nm 0.476 9 557 nm 0.333 10 565 nm 0.235
A continuación se muestran la estabilidad en cada escala de pH, según el
tiempo de expuesto a luz.
0.145
0.15
0.155
0.16
0.165
0.17
0.175
0 2 4 6 8 10 12 14 16
Abso
rban
cia
Tiempo (minutos)
Absorbancia vs Tiempo
Series1
45
Figura 30. Absorbancia en función de la variación del tiempo (0, 5, 10 y 15 minutos), a pH
3.5. Fuente: Elaboración propia
Figura 31. Absorbancia en función de la variación del tiempo (0, 5, 10 y 15 minutos), a pH
4.0. Fuente: Elaboración propia
Figura 32. Absorbancia en función de la variación del tiempo (0, 5, 10 y 15 minutos), a pH
4.5. Fuente: Elaboración propia
00.020.040.060.08
0.10.120.140.16
0 2 4 6 8 10 12 14 16
Abso
rban
cia
Tiempo (minutos)
Absorbancia vs Tiempo
Series1
00.010.020.030.040.050.060.070.080.09
0 2 4 6 8 10 12 14 16
Abso
rban
cia
Tiempo (minnutos)
Absorbancia vs Tiempo
Series1
46
Figura 33. Absorbancia en función de la variación del tiempo (0, 5, 10 y 15 minutos), a pH 5.0 Fuente: Elaboración propia
Figura 34. Absorbancia en función de la variación del tiempo (0, 5, 10 y 15 minutos), a pH
5.5. Fuente: Elaboración propia
0
0.05
0.1
0.15
0.2
0 2 4 6 8 10 12 14 16
Abso
rban
cia
Tiempo (minutos)
Absorbancia vs Tiempo
Series1
00.010.020.030.040.050.060.070.080.09
0.1
0 2 4 6 8 10 12 14 16
Abso
rban
cia
TIempo (minutos)
Absorbancia vs Tiempo
Series1
47
Figura 35. Absorbancia en función de la variación del tiempo (0, 5, 10 y 15 minutos), a pH
6.0 Fuente: Elaboración propia
Figura 36. Absorbancia en función de la variación del tiempo (0, 5, 10 y 15 minutos), a pH
6.5 Fuente: Elaboración propia
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0 2 4 6 8 10 12 14 16
Abso
rban
cia
Tiempo (Minutos)
Absorbancia vs Tiempo
Series1
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0 2 4 6 8 10 12 14 16
Abso
rban
cia
Tiempo (minutos)
Absorbancia vs Tiempo
Series1
48
Figura 37. Absorbancia en función de la variación del tiempo (0, 5, 10 y 15 minutos), a pH 7.0
Fuente: Elaboración propia
Figura 38. Absorbancia en función de la variación del tiempo (0, 5, 10 y 15 minutos), a pH
7.5 Fuente: Elaboración propia
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0 2 4 6 8 10 12 14 16
Abso
rban
cia
Tiempo ( Minutos)
Absorbancia vs Tiempo
Series1
00.05
0.10.15
0.20.25
0.30.35
0.40.45
0.5
0 2 4 6 8 10 12 14 16
Abso
rban
cia
Tiempo (Minutos)
Absorbancia vs Tiempo
Series1
49
Figura 39. Absorbancia en función de la variación del tiempo (0, 5, 10 y 15 minutos), a pH
8.0 Fuente: Elaboración propia
Figura 40. Absorbancia en función de la variación del tiempo (0, 5, 10 y 15 minutos), a pH 9 Fuente: Elaboración propia
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0 2 4 6 8 10 12 14 16
Abso
rban
cia
Tiempo (Minutos)
Absorbancia vs Tiempo
Series1
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0 2 4 6 8 10 12 14 16
Abso
rban
cia
Tiempo (Minutos)
Absorbancia vs Tiempo
Series1
50
Figura 41. Absorbancia en función de la variación del tiempo (0, 5, 10 y 15 minutos), a pH
10 Fuente: Elaboración propia
Figura 42. Absorbancia de diferentes valores de la escala de pH, en diferentes fracciones
de tiempo (0, 5, 10 y 15 minutos) Fuente: Elaboración propia
00.10.20.30.40.50.60.7
3.5 4 4.5 5 5.5 6 6.5 7 7.5 8 9 10
Abso
rban
cia
pH
Absorbancia de pH en diferentes fracciones de tiempo
0
5
10
15
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0 2 4 6 8 10 12 14 16
Abso
rban
cia
Tiempo (Minutos)
Absorbancia vs Tiempo
Series1
51
4.4 Uso del extracto Punica granatum L como indicador de pH en valoraciones potenciométricas.
Reacciones de neutralización de carácter ácido-base, mediante el método
potenciométrico.
4.4.1. Ácido fuerte monoprótico (HCl) – base fuerte (NaOH)
4.4.1.1. Utilizando como indicador fenolftaleína.
Figura 43. Titulación de Ácido clorhídrico vs. Hidróxido de sodio indicador fenolftaleína.
Antes de la titulación (a) – Punto final (b). Foto Propia
4.4.1.2. Utilizando como indicador extracto de Punica granatum L.
En la titulación HCl vs NaOH, inicialmente presenta un color rojo escarlata, que
al llegar al punto final a neutro (Punto verde) se observa un color amarillo, con
un volumen de gasto de 30mL a un pH 8.27, adicional a ellos los obtenidos
muestran un punto de equivalencia a 29,7 mL (punto rojo). (Figura 46) F
ig
u
r
a
4
4. Variación de color en la titulación de ácido clorhídrico (HCl) e Hidróxido de Sodio (NaOH) con el extracto Punica granatum L. como indicador., pH = 6,43 (a); 7,12 (b) y
8,27 (c).
(a) (b)
(a) (b) (c)
52
Foto Propia
Tabla 10: Resultados para elaborar la gráfica de la segunda derivada ácido fuerte monoprótico (HCl) vs
base fuerte (NaOH) utilizando como indicador extracto de Punica granatum L.
Volumen NaOH 0.095 N (mL)
pH dpH/dV d2pH/d2V
0 0.9 0 0 5 1.05 0.03 0.006
10 1.24 0.03 0.0016 15 1.47 0.04 -0.03 16 1.53 0.06 0.02 17 1.57 0.04 -0.02 18 1.63 0.06 0.02 19 1.7 0.07 0.01 20 1.77 0.07 0 21 1.88 0.11 0.04 22 2 0.12 0.01 23 2.17 0.17 0.05
23.5 2.27 0.2 0.06 24 2.39 0.24 0.08
24.5 2.52 0.26 0.04 25 2.65 0.26 0
25.5 2.84 0.38 0.24 26 3.05 0.42 0.08
26.5 3.26 0.42 0 27 3.48 0.44 0.04
27.5 3.73 0.5 0.12 28 3.96 0.46 -0.08
28.5 4.39 0.86 0.8 28.7 4.61 1.1 1.2 29 5.04 1.43 1.1
29.2 5.33 1.45 0.083 29.4 5.82 2.45 5 29.6 6.63 4.05 8 29.8 7.12 2.45 -8 30 8.27 6.15 18.5
30.5 9.89 3.08 -6.14 31 10.5 1.22 -3.72
53
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55
4.4.2. Ácido débil (CH3COOH) – base fuerte (NaOH)
En la titulación CH3COOH vs NaOH, inicialmente presenta un color rosado, que
al llegar al punto final o neutro (Punto verde) se observa un color amarillo, el
cual se dio a un volumen de 35,4 mL a un pH 8.36. Con los resultados
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(a) (b) (c)
56
anteriores se obtuvo el punto de equivalencia, siendo 35 mL,(Punto rojo).
(Figura 48)
Figura 48. Titulación de Ácido Acético (CH3COOH) con Hidróxido de sodio (NaOH) indicador el extracto Punica granatum L., pH = 8.36 (a), 9.70 (b) y 10.29(c)
Foto Propia
Tabla 11: Resultados para elaborar la gráfica de la segunda derivada ácido débil (CH3COOH) vs base
fuerte (NaOH) utilizando como indicador extracto de Punica granatum L.
Volumen NaOH 0.095 N (mL)
pH dpH/dV d2pH/d2V
57
0 2,69 0 0 2 3,17 0,24 0,12 4 3,53 0,18 -0,03 6 3,77 0,12 -0,03 8 3,97 0,1 -0,01
10 4,14 0,085 -0,0075 11 4,21 0,07 -0,015 12 4,28 0,07 0 13 4,35 0,07 -8,9E-16 14 4,42 0,07 8,88E-16 15 4,48 0,06 -0,01 16 4,54 0,06 -8,9E-16 17 4,6 0,06 0 18 4,66 0,06 8,88E-16 19 4,72 0,06 -8,9E-16 20 4,79 0,07 0,01 21 4,85 0,06 -0,01 22 4,91 0,06 8,88E-16 23 4,98 0,07 0,01 24 5,06 0,08 0,01 25 5,13 0,07 -0,01 26 5,21 0,08 0,01 27 5,31 0,1 0,02 28 5,41 0,1 8,88E-16 29 5,52 0,11 0,01 30 5,66 0,14 0,03 31 5,82 0,16 0,02 32 6,04 0,22 0,06 33 6,36 0,32 0,1 34 6,92 0,56 0,24 35 8,36 1,45 0,89 36 9,7 1,33 -0,12 37 10,29 0,59 -0,74
58
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60
61
4.4.3. Ácido fuerte diprótico (H2SO4) – base fuerte (NaOH)
En la titulación ácido sulfúrico (H2SO4) vs hidróxido de sodio (NaOH),
inicialmente presenta un color rojo escarlata, que al llegar al punto final o
neutro (Punto verde) se observa un color amarillo, el cual se dio a un volumen
de 34 mL a un pH 8.91. Con los resultados anteriores se obtuvo el punto de
equivalencia, siendo 33 mL, (Punto rojo). Figura 52.
Figura 52. Titulación de Ácido Sulfúrico (H2SO4) con Hidróxido de sodio (NaOH), indicador el extracto Punica granatum L., pH = 6.48 (a), 7.20 (b) y 8.91 (c)
Foto Propia
(a) (b) (c)
62
Tabla 12: Resultados para elaborar la gráfica de la segunda derivada Ácido fuerte diprótico (H2SO4) vs
idróxido de sodio (NaOH) utilizando como indicador extracto de Punica granatum L.
Volumen NaOH
0.095 N (mL) pH dpH/dV d2pH/d2V
0 1.17 0 0 2 1.21 0.02 0.01 4 1.26 0.025 0.0025 6 1.32 0.03 0.0025 8 1.4 0.04 0.005
10 1.47 0.035 -0.0025 12 1.56 0.045 0.005 14 1.65 0.045 -5.6E-17 16 1.75 0.05 0.0025 18 1.86 0.055 0.0025 20 2 0.07 0.0075 22 2.2 0.1 0.015 24 2.45 0.125 0.0125 26 2.9 0.225 0.05 28 3.6 0.35 0.0625 29 4.05 0.45 0.1 30 4.81 0.76 0.31 31 5.84 1.03 0.27 32 6.48 0.64 -0.39 33 7.2 0.72 0.08 34 8.9 1.7 0.98 35 9.73 0.83 -0.87 36 10.09 0.36 -0.47
63
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66
4.4.4. Ácido fuerte triprótico (H3PO4) – base fuerte (NaOH)
En la titulación ácido fosfórico vs NaOH, inicialmente presenta un color rojo
escarlata, que al llegar al primer punto final o neutro (Punto verde) se observa
el punto final un color amarillo el cual se dio a un volumen de 26 mL y un pH
8.39. Con los resultados anteriores se obtuvo el punto de equivalencia, siendo
20 mL. (Punto rojo). (Figura 54)
Figura 56. Titulación de Ácido fuerte triprótico (H3PO4) con Hidróxido de sodio (NaOH),
indicador el extracto Punica granatum L., pH = 6.40 (a), 7.18 (b) y 8.39 (c) Foto Propia
(a) (b) (c)
67
Tabla 13: Resultados para elaborar la gráfica de la segunda derivada ácido fuerte triprótico H3PO4 vs
hidróxido de sodio (NaOH) utilizando como indicador extracto de Punica granatum L.
Volumen NaOH
0.095 N (mL) pH dpH/dV d2pH/d2V
0 1.81 0 0 2 1.97 0.08 0.04 4 2.16 0.095 0.0075 6 2.39 0.115 0.01 8 2.74 0.175 0.03
10 3.29 0.28 0.0525 12 4.03 0.39 0.05 14 5.7 0.96 0.25 16 6.4 0.27 -0.16 18 6.77 0.18 -0.01 20 7.05 0.13 -0.02 22 7.33 0.15 0.02 24 7.69 0.2 0.04 25 7.94 0.25 0.05 26 8.39 0.45 0.2 27 9.25 0.86 0.41 28 9.88 0.63 -0.23 29 10.24 0.36 -0.27 30 10.51 0.27 -0.09 31 10.79 0.28 0.01 32 10.98 0.19 -0.09 33 11.16 0.18 -0.01 34 11.27 0.11 -0.07 35 11.37 0.1 -0.01 36 11.47 0.1 1.78E-15 37 11.54 0.07 -0.03 38 11.61 0.07 1.78E-15 39 11.67 0.06 -0.01 40 11.72 0.05 -0.01 41 11.77 0.05 -1.8E-15 42 11.81 0.04 -0.01 43 11.85 0.04 -1.8E-15 44 11.88 0.03 -0.01 45 11.92 0.04 0.01 46 11.95 0.03 -0.01 47 11.98 0.03 1.78E-15 48 12 0.02 -0.01 49 12.03 0.03 0.01 50 12.05 0.02 -0.01
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71
4.5 Determinación del pKIndicador- A partir del estudio espectrofotométrico del indicador, fue necesario seleccionar
una región de la escala donde ocurre un cambio nítido y rápido de la coloración
asociada a la variación brusca de pH, el cual ocurre cerca al pH 7, debido a
que se realizó un análisis en función a la escala de buffer de pH,
Tabla 14: Valores de pK1 en función del pH
Tabla 15: Datos de pKInd a diferentes pH
4.6 Estabilidad en presencia de oxígeno y luz del extracto Punica granatum L.
El estudio de la estabilidad del extracto del fruto Punica granatum L., en
presencia de oxígeno, se realizó durante 7 días y se realizó la caracterización
en el Espectrofotómetro UV-Vis.
Número pH Absorbancia
1 6 0.455 2 6.5 0.461 3 7 0.473 4 7.5 0.55 5 8 0.578 6 1.5 1.018 a = Ain 7 10 0.305 b=Hin-
Numero pK1 1 6.455 2 6.961 3 7.473 4 8.05 5 8.578
Promedio de pK1 7.5034
pH =pK1 -/+ 1 (6,5 - 8,5)
72
Tabla 16. Estabilidad en presencia de oxígeno y luz en función de la absorbancia de los dos frascos de
vidrio (Transparente y ámbar)
Frasco de vidrio
transparente
Frasco de vidrio ámbar
Días Fechas Absorbancia Absorbancia
0 15-May-2017 0.77 0.77 1 16-May-2017 0.593 0.366 2 17-May-2017 0.495 0.439 3 18-May-2017 0.496 0.452 4 19-May-2017 0.565 0.452 5 20-May-2017 0.533 0.416 6 23-May-2017 0.497 0.371 7 24-May-2017 0.417 0.389
Figura 60. Comparación de Absorbancia entre dos frascos de almacenamiento vidrio
incoloro (Serie 1) y ámbar (Serie 2), durante un lapso de 7 días, pH 2.5
Fuente: Elaboración propia
Para evaluar el nivel de significancia que existe entre ambos frascos de
almacenamiento (transparente y ámbar) se realizó la prueba estadística
T-Student.
00.10.20.30.40.50.60.70.80.9
0 1 2 3 4 5 6 7 8
Abso
rban
cia
TIempo (Días)
Absorbancia vs Tiempo (Días)
Series1 Series2 Power (Series1)
73
4.6.1. Estadístico T-Student para muestras independientes Prueba F para determinar la homogeneidad de las varianzas en cada una de las muestras.
Fcalculado: . …(1)
- H0: Existe una homogeneidad entre las varianzas de las muestras
(σ21 = σ22)
- H1: No existe una homogeneidad entre las varianzas de las
muestras (σ21 ≠ σ22)
Tabla 17. Media, desviación estándar (S) y varianza (S2) de los tipos de frascos (ámbar y transparente),
para determinar la homogeneidad de las varianzas
Frascos de vidrio color
ámbar
Frascos de vidrio color
transparentes Media 0.4568 0.5457
S 0.1311 0.1049 S2 0.0171 0.0110
Grados de libertad (GL):
n-1, n-1
Si: n= 8
G.L = 7.7
Se desarrolló la prueba F, con el software MiniTab 17.0, en donde:
Distribución F con 7 grados de libertad, en el numerador y 7 GL en el denominador, P( X ≤ x ) x 0.025 0.200204
74
Distribución F con 7 GL en el numerador y 7 GL en el denominador P( X ≤ x ) x 0.975 4.99491
Por lo tanto:
α = 0,05
Figura 61. Función de distribución acumulada inversa
Elaboración propia
Dando, como resultado que:
- Se acepta H0: 0.2002 <Fcalculado< 4.99491
- Se rechaza H0: Fcalculado> 4.99491 ó : Fcalculado< 0.200204
Si:
- Fcalculado: . =
.
. = 1.5545
Por lo tanto se acepta H0, existe una homogeneidad entre las varianzas de las
muestras (σ21 = σ22)
75
Distribución de T-Student varianzas desconocidas y homogéneas
T = ( ) ( )
- H0: No existe diferencia significativa entre ambos frascos de
almacenamiento (ámbar y transparente)
- H1: Si existe diferencia significativa entre ambos frascos de
almacenamiento (ámbar y transparente)
Número de grados de libertad (G.L): n + n -2
Donde:
n = 8
Por lo tanto G.L = 14
- Distribución t de Student con 14 GL
P( X ≤ x ) x 0.025 -2.14479 - Distribución t de Student con 14 GL
P( X ≤ x ) x 0.975 2.14479
Figura 62. Función de la distribución de T de Student
Elaboración propia
76
Se acepta H0: -2.14479 <Tcalculado< 2.14479
Se rechaza H1: Tcalculado> 2.14479 ó Tcalculado< -2.14479
Tabla 18. Media, desviación estándar y error de la desviación estándar de los tipos de frascos de vidrio (ámbar y transparente), para determinar la diferencia significativa entre ambos.
Muestra Número Media Desviación estándar
Ámbar 8 0.457 0.131 Transparente 8 0.546 0.105
Se desarrolló la prueba T-Student con el software MiniTab 17.0. Diferencia = μ (ámbar) - μ (transparente) Estimación de la diferencia: -0.0889 IC de 95% para la diferencia: (-0.2162, 0.0385) Prueba T de diferencia = 0 (vs. ≠): Valor T = -1.50 Valor p = 0.157 GL = 14 Ambos utilizan Desviación Estándar agrupada = 0.1187
Por lo tanto el valor T, se encuentra en el rango aceptable y se acepta H0
dando a conocer que no existe una diferencia significativa, entre ambas
envases
77
Discusión de resultados
Las titulaciones ácido – base (ácido fuerte monoprótico – base fuerte y
ácido fuerte diprótico – base fuerte) con el extracto de la granada (Punica
granatum L.) presentaron un rápido cambio de color en el rango de pH 4.00 -
6.00, debido a la inestabilidad presente de las antocianinas, por el efecto de
conjugación del catión flavilio o hidratación del C2 dando una estructura
chalcona (irreversible), mientras que en la valoración de H3PO4 (ácido fuerte) –
NaOH (base fuerte) con el extracto de la granada (Punica granatum L.),
identifica el punto de equilibrio del pk2 (pH = 7.22) por la variación de color
transparente – amarillo (base quinoidal en forma chalcona), en el pK1 (pH =
2.15) no se observa un cambio de color significativo, manteniéndose constante
un color rojo; debido a la estabilidad de la estructura ion flavilium de la
antocianina en pH ácido, y según Cuevas et al., 2008 hace mención que el ión
flavilium es la única especie capaz de copigmentar lo que permite un aumento
de intensidad de color.
La variación de colores en la escala buffer de pH (3.5 – 10) con el
extracto de la granada (Punica granatum L.), se debió al catión Flavilio (rojo),
chalcona (amarillo), pseudo-base (incoloro) y base quinoidal (azul), que
presentó un desplazamiento batocrómico (aumento de longitud de onda), por la
conjugación de dobles enlaces en su estructura, que según Marcondes et al.,
2014 es por los elevados contenidos de antocianinas lo que los hace posible
indicadores de pH.
La oxidación en presencia de la luz en diferentes lapsos de tiempo (5, 10
y 15 minutos), en la escala de buffer de pH (3.5-10), presentó un efecto
hipsocrómico (disminución de la banda de absorbancia), debido a la
sensibilidad que presenta la estructura según el pH, como en función de la luz.
Sin embargo; por el efecto de copigmentación la fracción con mayor estabilidad
fue a pH ácido (3.5) en las diferentes fracciones de tiempo, en donde el ión
flavilium se encuentra más estable y dando una estabilidad del color en el
extracto, según Márquez, 2011 las antocianinas diglicosidas que son menos
78
susceptibles a la luz que las antocianinas monoglúcosidas, permitiendo una
menor degradación del color, pero este factor se encuentra íntimamente ligado
al efecto del pH como hace mención Lopes et al., 2007.
La estabilidad del extracto del fruto Punica granatum L., en presencia de
oxígeno y luz no presentó una diferencia significativa entre ambos envases de
almacenamiento (frasco incoloro – frasco ámbar), según Fuentes (2005) las
antocianinas diglicósidos presentan una mayor estabilidad ante el oxígeno a pH
ácido (2.5), evitando el efecto de degradación del color en el extracto, siendo
aún variable esta absorbancia en los días, por las presencia de antocianinas
monoglicosidadas, que son susceptibles a la presencia de oxígeno.
Estudios de Wesson et al. (2011); permitieron determinar que la
pigmentación se debe a la presencia de antocianas por la comparación de los
pesos moleculares de las estructuras, con un porcentaje de error menor al
0.5%, sin embargo aunque se usó fases móviles diferentes; estos datos fueron
corroborados por la presencia característica de una absorbancia de
antocianinas en el rango 490 – 550 nm del Espectrofotometro UV-Vis.
79
Conclusiones
Se identificó mediante UHPLC-ESI-MS y MS/MS los pigmentos
antocianidicos característicos: cianidina-3-monoglúcosido, cianidina-3,5-
diglúcosido, pelargonidina-3,5-diglúcosido, cianidina y pelargonidina en el
extracto de granada (Punica granatum L.), a partir de los diferentes picos de
fraccionamiento más polares.
El extracto de los arilos del fruto de Punica granatum L. es buen
indicador natural en el rango de 4 a 8 unidades de pH debido a su cambio de
color, pasando de un color rojo a pH 4, incoloro a pH 6 y color amarillo a pH 8,
pudiendo utilizarse para demostrar niveles débilmente ácidos, neutros y
débilmente básicos de una solución mediante la titulación.
El extracto del fruto Punica granatum L. presenta mejor estabilidad a pH
ácido (3.5), durante los intervalos de 5, 10 y 15 min en la escala de buffer,
siendo el de menor estabilidad el medio débilmente ácido (4 - 5) donde se
observó una decoloración en los diferentes intervalos de tiempo, obteniéndose
de esta manera que el pKInd está en el rango de 6,5 – 8,5.
Según el estadístico de la prueba T-Student a un 95 % de confianza, no
existe diferencia estadística entre los valores obtenidos de la prueba de
estabilidad del indicador natural por acción del oxígeno y luz (almacenado en
frasco de vidrio transparente o ámbar), ambos bajo las mismas condiciones (-4
°C), por lo que dichos almacenamientos son ideales para el indicador natural
en un periodo de 7 días
80
Recomendaciones
1. Desarrollar un análisis de degradación cinética del extracto mayor a 7
días, con el fin de evaluar su eficiencia y el tiempo utilidad del extracto
como indicador natural..
2. Realizar un ensayo de titulación con bases fuertes y débiles, con el
propósito de obtener información relacionado a la estabilidad del
extracto la cual se propone en esta investigación.
81
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Anexos
90
Anex
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