UNIVERSIDAD AUTÓNOMADE CHIAPAS

FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICAS EXTENSIÓN OCOZOCOAUTLA

PRÁCTICA 2. ESTUDIO DEL BOMBEO DE PROTONES POR LEVADURAS.

BIOQUIMICA

LICENCIATURA: QUÍMICO FARMACOBIOLOGO.

Catedrático: Dra. Ana Olivia cañas Urbina.Integrantes del equipo:

Claudia Beatriz Gómez Núñez.Erika Estrella Pérez Sántiz.Yeseli Yanin Morales Díaz.

Norma Berenice Pérez Gómez.Yadira Trujillo Cruz.

Carlos Rousell Vázquez Chame.

SEMESTRE: 4°

INTRODUCCIÓN

OCOZOCOAUTLA DE ESPINOSA; CHIAPAS a 26 de AGOSTO del 2015.

Las levaduras son hongos unicelulares no filamentos con una forma esférica u

oval típica (Tortora, 2007). Las levaduras se encuentran ampliamente distribuidas

en la naturaleza, localizada en el suelo, en la superficie de las frutas, en el néctar

de las flores y en ambientes acuáticos (García, 2005). La estructura de una

levadura es la de una célula eucariota. Las cuales se reproducen por gemación

(Arenas, 2011)

Las levaduras son organismos heterótrofos, por lo tanto, para poder obtener su

energía requieren de carbono orgánico y utilizan el carbono para la síntesis de sus

componentes celulares. El mejor requerimiento energético de las levaduras están

constituidas de azucares. Muchas pueden catabolizar la glucosa de forma aerobia

o anaeróbia; el proceso de la catabolización de forma anaerobia es comúnmente

conocida como la fermentación alcohólica, el cual da como resultado etanol y

dióxido de carbono. En condiciones aerobias, las levaduras pueden oxidar la

glucosa al utilizar el oxígeno del aire hasta convertir la glucosa hasta dióxido de

carbono y agua (García, 2005).

Las levaduras Saccharomyces cerevisiae, en común con otras células

eucariontes, las levaduras tienen un núcleo en donde reside la información

genética de la célula, mitocondrias en donde se lleva a cabo la síntesis de ATP y

un retículo endoplásmico y aparato de Golgi que se encargan de la síntesis de

proteínas cuya localización final es la membrana plasmática o el exterior.

Las levaduras no poseen bombas de Na+ -K+ en sus membranas plasmáticas, por

lo que el transporte de solutos hacia el interior de la célula depende de un

gradiente electroquímico de H+. Las levaduras tienen un sistema para bombear

protones o H+ al exterior lo cual es resultado de la generación de un potencial

eléctrico (Peña, 2011).

Este gradiente electroquímico es generado por H+ presentes en la membrana

plasmática que expulsa H+ de la célula y de ese modo genera un gradiente

electroquímico de protones, con una mayor concentración de H+ en el medio

extracelular que en comparación del medio intracelular, durante el proceso la

bomba de H+ crea u pH ácidos en el medio extracelular de la célula.

Las levaduras generan el gradiente de H+ mediante ATPasas de la membrana

plasmáticas que utilizan la energía de la hidrólisis del ATP para expulsar H+

hacías el exterior de la célula (Bruce & Bray, 2016), es decir, un gradiente de

protones a través de membranas sirve como fuente de energía para bombear

cationes de metales alcalinos en contra de sus gradientes.

La H+ -ATPasa de la membrana plasmática responsable del gradiente de pH de la

membrana plasmática de la célula, es la proteína más abundante de la membrana

plasmática, muy estable y consume al menos el 20% del ATP celular.

La ATPasa de H+ en la levadura, impulsa el transporte de nutrientes al interior de

la célula, proceso catalizado por sistemas de transporte llamados simportadores o

uniportadores, donde se da el transporte al interior de la célula de K+ y azucares,

aminoácidos, purinas, así como la salida de calcio, succinato, lactato (Cabedo,

2010).

Además de esta ATPasa de H+ de la membrana plasmática, las levaduras tienen

otra bomba de protones en la membrana interna de las mitocondrias, la ATP

sintasa, cataliza la síntesis de ATP aprovechando la energía del gradiente de

protones, mediante la fosforilación oxidativa El flujo de protones proporciona la

energía para la síntesis de ATP en estos organismos mediante el gradiente

electroquímico desde el espacio intermembranal positivo a la matriz negativa

(Devlin, 2006)

Pero la interrupción de este gradiente inhibe la generación de energía por lo tanto

detiene la síntesis de ATP, lo cual podría ser posible mediante agentes químicos”

desacoplantes”. El desacoplante alteran el gradiente se insertan en la membrana

mitocondrial interna, donde actúan como transportadora de H+, y proveen una vía

para el flujo de H+ que evitan la acción de ATP sintasa. De esta manera

desacoplan el transporte de electrones y ya no pueden producirse más ATP

(Bruce & Bray, 2016). Uno de los inhibidores más efectivos de esta enzima es la

oligomicina.

El ATP en levaduras por una lado es sintetizada en la mitocondria por medio de la

ATP sintasa y en la membrana plasmática, la ATPasa de H+ lo hidroliza para

bombear protones al exterior de la célula, pero siempre hablamos de flujo de

electrones los cuales se dan a través de la membrana.

Para poder entender mejor es necesario comprender las siguientes preguntas:

1.- ¿Cuáles son las fuentes de carbono que usa la levadura?

Las fuentes de carbono utilizadas por las levaduras como la Saccharomyces

Cerevisiae, varían desde los carbohidratos, aminoácidos y algunos péptidos .

Entre los azúcares que puede utilizar están monosacáridos como la glucosa,

fructosa, manosa y galactosa, entre otros.

¿Cuáles son las vías metabólicas que catabolizan a los carbohidratos?

La glucolisis y la fosforilación oxidativa.

OBJETIVO:

Poder identificar los cambios de pH por las levaduras y las causas de estas, y por

lo tanto poder interpretar como ocurre el bombeo de protones.

MATERIALES Y MÉTODO:

Se realizaron los cálculos necesarios para preparar una solución de glucosa al

10%, la cual se preparó con 0.512 gramos de glucosa pesados en la balanza

granataria, diluyéndola en 4.5 ml de agua destilada, obteniendo la solución 1 de

glucosa al 10% con un volumen total de 5 ml.

Se realizaron los cálculos para obtener una solución 2 de levadura con un

volumen final de 5ml, para lo cual se pesaron 1000 mg= 1g de levadura

diluyéndolo en 4 ml de agua destilada para alcanzar el volumen total antes

mencionado.

A la solución 2 de levadura se le adicionaron 40 ml de agua destilada para obtener

una solución con un volumen de 45 ml, esta solución se colocó en una parrilla

electromagnética agregándole una mosca a la solución para que estuviera en

constante movimiento. Después procedió a medir el PH 2 veces cada 3 minutos.

Una vez finalizado la medición del PH, se le agrego la solución 1 de glucosa al 10

%, se colocó en la parrilla electromagnética nuevamente y se midió el PH 4 veces

cada 5 minutos, después una vez más se midió el PH 2 veces cada 10 minutos. El

PH fue medido con tiras reactivas.

RESULTADOS:

Solución 1

Soluto= 1 gramo de levadura

Solvente= 4 ml de agua destilada

Solución 2

Soluto= 0.5 gramos de glucosa

Solvente= 4.5 ml de agua destilada

Solución 3

Tomar 5 ml de solución 1

Solvente= 40 ml de agua destilada

Solución 4

Tomar 5 ml de la solución 2

Solvente= solución 3

Tiempo Tiras reactivas

pH

Solución de levadura con agua destilada(solución 1)

Primera vez 11:29

horas

1 5

+3 11:32

horas

2 5

+3 11:35

horas

3 5

Solución de levadura con la glucosa(solución 3)

Primera vez 11:37

horas

4 5

+5 11:42

horas

5 4.6

+5 11:47

horas

6 4.5

+5 11:52

horas

7 4.3

+5 11:57 8 4.2

horas

+10 12:07

horas

9 4.1

+10 12:17

horas

10 4

Solución de levadura con

agua destilada

Solución de levadura con

la glucosa

Solución de levadura con

la glucosa

Cada 3 minutos

Cada5 minutos

Cada10 minutos

DISCUSIÓN DE RESULTADOS

Las levaduras tienen estructura, constitución y funciones semejantes a las de otras

células. Su membrana juega un papel importante en la regulación del flujo de

todos los materiales tanto hacia el interior como hacia el exterior de la célula

(Pompa, 2015). Según Mora (2007), la proteína ATPasa presente en la membrana

plasmática de la levadura, consume aproximadamente del 10 al 15% del ATP que

produce la levadura durante su crecimiento, por cada molecula de ATP que

degrada a ADP, se transporta al medio externo un protón (H+), lo que genera un

gradiente electroquímico. Por lo que dado el ingreso del NADH y FADH2 además

del paso de electrones por la cadena respiratoria; se producen moléculas de ATP

altamente energéticas y en algunos puntos, la energía generada es utilizada para

el transporte de protones de la matriz hacia el espacio intermembranal de la

mitocondria, lo que genera una diferencia de pH entre estos dos espacios. Por

consiguiente la adición de glucosa a las levaduras produjo el incremento de la

actividad de la ATPasa en la membrana plasmática que consigue al paso del

tiempo la disminución del pH del medio extracelular.

El cambio de pH fue notorio en el uso de tiras reactivas, pero debido a este

método analítico no se pudieron estimar parámetros con valores fraccionarios, si

no con una escala de números enteros del 1 al 14, estimados según la coloración

establecida por el fabricante del material, aun con esto se dedujo la reducción de

0.1 en la escala de pH con cada valoración en los diferentes intervalos de tiempo,

no llegando a ser menor de 4, pues como señala García (s.f.), la levadura es un

ser vivo, tiene requerimientos biológicos como cualquier otro y mismo

mantenimiento, por lo tanto su nivel de acidez no varía entre 3.8 a 8.

CONCLUSIÓN:

En la práctica realizada se observo como los microorganismos hacen un

intercambio de protones, tal y como lo fue en esta práctica, en el caso de la

levadura al estar en un entorno diferente con respecto a su gradiente de

concentración.

Al hacer un intercambio de protones este hace que el medio cada vez poco

a poco se vaya haciendo más acido.

Llega el momento en el que, tanto el interior como el exterior se saturan y

ya no haya ese intercambio de protones, lo cual hace que el medio se

estabilize en un pH.

REFERENCIAS:

Arenas, R. (2011). Micología Médica Ilustrada. México: Mc Graw Hill.Bruce, A., & Bray, D. (2016). Introducción a la biología celular. Buenos Aires:

Panamericana.Cabedo, M. (2010). Caracterización de la regulación de la protón ATPasa.

Valencia. Obtenido de https://riunet.upv.es/bitstream/handle/10251/18485/TFC%20Marc%20cabedo.pdf?sequence=1

Devlin, T. (2006). Bioquímica:libro de texto con aplicaciones clínicas. España: REVERTÉ.

García, V. (2005). Introducción a la microbiología. EUNED.Peña, A. (2011). Las membranas de las células . México: Fondo de Cultura

Economica .Tortora, G. (2007). Introducción a la Microbiología. Buenos Aires: Panamericana.Garcia, V. (s.f. ). Introduccion a la Microbiologia . EUNED .Mora, S. Q. (2007). Manual de experimentos de laboratorio para bioquímica. Costa

Rica : EUNED.

Pompa, A. G. (19 de Agosto de 2015). Biología. Obtenido de http://laslevaduras.mex.tl/788048_MORFOLOG-A.html

Fornaguera, J. & Gómez, G. (2006) Bioquímica: la ciencia de la vida. Estados Unidos: EUNED

Koolma & Rohm. (2004) (3ª Ed) Bioquímica. Madrid: Médica Panamericana

Manual de practicas de laboratorio. Bioquímica. Facultad de medicina.UNAM. URL:

http://www.facmed.unam.mx/fm/pa/2010/practicas/practicas bioquimica. Pdf