ESCUELA PROFESIONAL DE BIOLOGÍA

Aislamiento de Bacteriófagos

ASIGNATURA :

Virología

DOCENTE :

Dra. Graciela Albino Cornejo.

ALUMNO :

Rómulo Aycachi Inga.

CICLO :

2007 - I

Lambayeque, Agosto del 2007.

PRÁCTICA Nº 02: Aislamiento de

Bacteriófagos

I. Introducción :

Bacteriófago, también llamado virus bacteriano o, abreviadamente, fago, virus capaz de infectar las bacterias. Los bacteriófagos están presentes en los desechos humanos, en el suelo y en las aguas residuales. Fueron descubiertos en 1915 por el investigador inglés Frederick W. Twort, y también de forma independiente, por el científico franco-canadiense Félix H. D'Hérelle en 1917. La mayor parte de los virus bacterianos que se han estudiado infectan principalmente bacterias como Escherichia coli o Salmonella typhimurium, aunque se conocen virus que infectan tanto eubacterias como arqueobacterias. El material genético de este tipo de virus puede ser tanto ARN como ADN. Unos cuantos poseen una envoltura de lípidos, pero la mayoría carecen de ella. Muchos bacteriófagos presentan estructuras complejas con cabeza y cola. En este último caso la infección de la bacteria se produce por la penetración del ácido nucleico, ya que la cabeza y la cola se quedan en la superficie de la bacteria, y las partículas víricas se forman en el interior de ésta hasta producir el “estallido” o lisis de la misma.

Al infectar un virus o una bacteria ocurre lo siguiente : adsorción del virus y penetración en las células, dilución o lisis de la bacteria con liberación del virus. Esta fase de lisis se pone de manifiesto por el aclaramiento de los cultivos bacterianos en medios líquidos o por la formación de calvas o placas en cultivos en medios sólidos. Esta lisis se puede inhibir por medio de sueros antibacteriófago.

Los bacteriófagos han servido para estudiar muchos conceptos básicos en virología que luego se aplicaron a virus de organismos superiores. En la década de 1960, las investigaciones pioneras de los sistemas huésped-parásito en los fagos fueron dirigidas por los fisiólogos estadounidenses Max Delbrück, Alfred Hershey y Salvador Luria, gracias a las cuales compartieron el Premio Nobel de Fisiología y Medicina en 1969. En 1980, estas investigaciones permitieron conocer el modo de penetración de los fagos en el interior de las bacterias, así como la existencia de recombinación genética entre virus o el fenómeno de restricción-modificación de las células bacterianas para hacer frente a la infección. En general, supusieron un apoyo importante a la hipótesis de que el ADN constituía el material genético de los seres vivos.

Al estudiar las propiedades físicas y químicas así es necesario preparar un gran lote del mismo purificado, libre de material celular (huésped) y esto se considera como el medio del aislamiento de fagos.

Los bacteriófagos se emplean actualmente como vectores de clonación en el campo de la ingeniería genética y su estudio tiene implicaciones importantes en la medicina y la genética, en concreto en la comprensión de las infecciones virales, defectos genéticos, problemas de desarrollo, causas del cáncer y la resistencia de las bacterias a los antibióticos.

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II. Objetivo:

Aislar virus bacterianos utilizando técnicas adecuadas.

III. Materiales:

Material Biológico:

Cepa bacteriana (Escherichia coli o Pseudomona sp.), para nuestro grupo

se utilizó E.coli.

Agua residual o servida (en nuestro caso se uso aguas residuales del Dren

de Pimentel).

Material de Laboratorio:

Medio de cultivo: Caldo Doble Concentrado

Caldo triptosa

Caldo Triptosa o Caldo Nutritivo.

Agar triptosa

Filtro de porcelana.

Frascos y botellas estériles.

Viales, placas, pipetas, papel filtro, tubo para centrifugar, anzas

bacteriológicas (en anillo y en punta).

Centrífuga refrigerada.

Estufa

Bomba de vacío

Matraz

IV. Procedimiento:

En una botella estéril colocamos 50 ml. de caldo doble concentrado

(CDC).

Luego, sembramos la cepa problema en el CDC (1 azada si la cepa

está en medio líquido o 4 colonias si está en placa). En este caso,

sembró E. coli de cepa pura (vial).

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Incubamos por 4 a 5 horas en el caso de E. coli.

Luego, agregagamos el agua servida a la botella (previamente se lo

pasa por papel filtro), 50 ml.

Luego, incubar a 37°C por 18 a 24 horas.

Pasado el tiempo, volvemos a filtrar en papel filtro, para luego

centrifugar ese filtrado a 1500 rpm por 5 a 10 min., de esta manera

libramos a la muestra de macroimpurezas.

Luego el sobrenadante lo filtramos con el filtro bacteriológico de

porcelana (aquí se usa el un matraz estéril y la bomba de vacío).

Luego, el filtrado obtenido, de manera aséptica, lo pasamos a viales

(estériles), luego taponamos y lo guardamos en refrigeración.

Comprobación de fagos:

En una placa con agar triptosa sembramos con hisopo la cepa

problema (en este caso E. coli), luego incubamos de (4 a 6 horas).

Pasado el tiempo, con el asa añadimos 1 gota de filtrado sobre la

placa.

Por último, incubamos a 37°C por 18 a 24 horas (observar la

formación de calvas o placas).

V. Resultados:

- En el caso del grupo de la segunda mesa, primer turno, no se logró aislar

de las muestras los bacteriófagos necesarios para la práctica.

- En la práctica, nuestro grupo repitió los procedimientos por cuatro

oportunidades (las dos últimas en el tiempo que duró la huelga de

profesores universitarios), no obteniéndose ningún resultado.

- Se trató aguas residuales del dren de Pimentel, dren de Santa Rosa, dren

Ferreñafe y posa de oxidación de Nuevo Mocce (Lambayeque).

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- Aunque se contaba con cepas de E. coli de muestras clínicas y cepas

aisladas de las mismas aguas residuales, se obtuvo resultados negativos

para la obtención de fagos.

- Pueden haber muchas explicaciones para los resultados obtenidos, por

ejemplo, que las cepas obtenidas (cepas problema) no hayan sido

específicas para los fagos a aislar, que las aguas hayan sido pobres en

concentración de fagos, fallas de manejo y desarrollo de la práctica,

problemas de filtración, medios de cultivo mal formulados, falta de tiempo

de incubación de las cepas, tiempo de reserva de la muestra de agua

residual (en algunos casos 24h en refrigeración) y otros.

VI. Referencias:

ACTON, J. (1967) Virología. Edit. Interamericana. Mexico D.F.

MADIGAN, M. y J. PARKER (1997) Brock Microbiología de los

Microorganismos. 8º Edic. Edit. Mc Graw Hill. Mexico D.F.

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