ESCUELA PROFESIONAL DE BIOLOGÍA

Titulación de Virus

ASIGNATURA :

Virología

DOCENTE :

Dra. Graciela Albino Cornejo.

ALUMNO :

Rómulo Aycachi Inga.

CICLO :

2007 - I

Lambayeque, Agosto del 2007.

Titulación de Virus

II. Introducción:

Las técnicas de titulación viral son en muchos casos un paso previo y necesario para desarrollar otros tipos de estudios tales como: ensayos de neutralización, determinación de actividad antiviral de un extracto dado, ensayos de identificación viral como en el caso de virus influenza (ensayo de inhibición de la hemoaglutinación), etc.

La cantidad de virus presente en una muestra se calcula por diversos métodos: los métodos donde no se mide la capacidad infecciosa de las partículas virales (por ejemplo la Microscopía Electrónica y la Hemoaglutinación) y los Métodos donde se mide capacidad infecciosa de las partículas virales, entre estos están los que se relacionan a ensayos donde no se cuenta el número de partículas infecciosas presentes en el inóculo pero en su lugar se obtiene un valor para el titulo de ese virus donde la medida esta basada en el principio de todo o nada: hay efecto citopático o no?, esta el animal vivo o muerto? (Dosis Infectante 50%, Dosis Infectante en Cultivo de Tejidos 50%, Dosis Infectante 50%, Dosis Letal 50%). Aquí el título viral es definido como aquella dilución de virus que infecta (o mata) el 50% de la población inoculada. También están los ensayos donde el número de partículas virales infecciosas presentes en la suspensión original es cuantificada, son los más comunes y entre estos están el ensayo de plaqueo (formación de placas en monocapas de células susceptibles), la formación de pústulas o lesiones en la membrana corioalantoidea de embriones de pollo, la formación de focos de crecimiento en monocapas celulares (se utiliza para virus tumorales que no destruyen las células en las cuales se multiplican y por ende no producen placas, pero sin embargo hacen que la morfología celular cambie y que las células se multipliquen más rápidamente que las células no infectadas, formando focos de células transformadas que pueden ser visibles a simple vista).

III. Objetivo:

Determinar el número de partículas víricas de una suspensión conteniendo fago ante Pseudomonas sp. (esta fue la cepa con la que se pudo aislar fagos).

III. Materiales:

Material Biológico: Suspensión vírica. Cepa problema.

Material de Laboratorio:

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Agar Triptosa. Caldo Triptosa. Agar Agua Pipetas Placas de Petri Tubos de ensayo Anzas bacteriológicas. Gradilla

IV. Procedimiento:

A. Método sobre Capa de Agar :

- En una gradilla colocar de 8 a 9 tubos de dilución (los marcarmos de 1 a 8 y el 9º como tubo control).- Luego, a cada tubo agregamos 2.7 ml. de caldo triptosa.- Con una pipeta estéril agregamos al 1º tubo 0.3 ml. del filtrado (el fago).- Luego, mezclamos y otra vez retiramos 0.3 ml para el tubo Nº 2 y así repetir hasta el tubo N° 08 (diluciones hasta 10-8); al tubo control no se le agrega nada.- Para cada tubo hacer corresponder un tubo con Agar Agua (1 ml) diluido. Esto a baño María (45º C) y hacer corresponder una placa por tubo (agar triptosa para las placas).- De cada tubo de dilución (p.ej. 10-1) se coloca 0.1 ml al tubo con agar agua y se le agrega también de 3 a 4 gotas de la cepa problema (ésta de 3 a 4 horas de desarrollo), así debe hacerse en todos los tubos hasta el tubo 10-8.- Verter el contenido de los tubos 10-1 a 10-8 en las placas de Agar Nutritivo, previamente marcados a 10-1 hasta 10-8. - Luego incubar a 37° C por 18 a 24 horas.- Luego se anota el número de calvas o placas (espacios libres de bacteria por dilución), se observa también la morfología de las calvas.- Luego se calcula el título:

TÍTULO =Nº de calvas de la última dilución en la que aparecen calvas

Dilución x Inóculo

B. Método del Tubo :

- Se trabaja con las 8 diluciones más el tubo control.- Colocar en todos los tubos de 3 a 4 gotas de la cepa problema (ésta debe haber estado en incubación de 4 a 6 horas).- Se observa el grado de turbidez.- Se incuba a 37º C de 18 a 24 horas.- Se observa cualitativamente (grado de turbidez), o sea, “más” turbio, “menos” turbio.- En el control se verá sólo bacterias para hacer el contraste.

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IV. Resultados:

- Al realizar la titulación se obtuvo los siguientes resultados:

- Luego, haciendo los cálculos se obtiene:

2= 2 x 106

10-5 x 0.1

- Entonces el título del fago es 2 x 106 UFP

V. Conclusiones:

Entre los métodos que se utilizan para la titulación de partículas virales los

más usados son el Método sobre capa de Agar y el Método del Tubo.

El número de partículas de la suspensión vírica corresponde a 2 x 10 -6 que

corresponde al bacteriófago específico.

VI. Referencias:

- MADIGAN, M. y J. PARKER (1997) Brock Microbiología de los

Microorganismos. 8º Edic. Edit. Mc Graw Hill. Mexico D.F.

- PRESCOTT L., J. HARLEY, D. KLEIN (1999). Microbiologia. 4º edic. Edit.

Mc Graw Hill México D.F.

10-1 = Incontables10-2 = Incontables10-3 = Incontables10-4 = 37 calvas10-5 = 2 calvas10-6 = No calvas10.7 = No calvas10-8 = No calvas

Control = No calvas

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