ESCUELA PROFESIONAL DE BIOLOGÍA

Curva de crecimiento para bacteriófagos

ASIGNATURA :

Virología

DOCENTE :

Dra. Graciela Albino Cornejo.

ALUMNO :

Rómulo Aycachi Inga.

CICLO :

2007 - I

Lambayeque, Agosto del 2007.

Curva de Crecimiento para Fagos

I. INTRODUCCIÓN :Prácticamente la totalidad de las células procariotas (bacterias) pueden

servir de huésped a virus denominados bacteriófagos o “fagos”. Como todos los virus, contienen un solo tipo de ácido nucleico, que generalmente es DNA de doble hélice, aunque también existen fagos RNA. Casi todos los bacteriófagos poseen una cápsida poliédrica que contiene el material genético y en muchos casos una estructura helicoidal proteica denominada cola o tallo, que actúa como órgano de adsorción e inyección del material genético a la bacteria.

Los bacteriófagos al penetrar en la bacteria huésped se multiplican activamente, liberándose posteriormente al exterior mediante lisis bacteriana para infectar a otras bacterias (ciclo lítico).

Algunos bacteriófagos son capaces de una conducta alternativa; tras inyectar su genoma a la bacteria, éste no se replica sino que permanece en el citoplasma o integrado al genoma bacteriano, dividiéndose sincrónicamente con la bacteria. Ese estado se denomina lisogénico y el genoma vírico existente en el interior de la célula se denomina prófago, fago latente o atemperado.

Las bacterias lisogénicas pueden expresar caracteres fenotípicos nuevos codificados por el fago, como funciones metabólicas, estructuras antigénicas y toxinas bacterianas. Este fenómeno se denomina conversión lisogénica. El interés de los fagos estriba en varios hechos. En primer lugar, constituyen unos modelos útiles para el estudio de la biología de los virus en particular y aspectos generales de la biología, con la replicación de los ácidos nucleicos y la síntesis proteica.

Desde el punto de vista médico los fagos atemperados (profagos) poseen interés, como ya se ha señalado, por poder codificar exotoxinas como la diftérica, la botulínica y otras que permiten a las bacterias lisogenizadas causar enfermedades graves que de otra manera no causarían.

También poseen interés porque se han utilizado como marcadores epidemiológicos de infecciones bacterianas (fagotipia o lisotipia). En una misma especie bacteriana, existen capas sensibles a la lisis por un determinado fago y otras resistentes. La identidad o deferencia de dos bacterias de la misma especie puede determinarse por la identidad o diferencia de sus patrones de sensibilidad a la lisis por los fagos.

La formación de las placas de lisis se ha descrito como el resultado de varios ciclos de crecimiento del fago (Idea D’Hérelle). La demostración concurrente de que la progenie aparece abruptamente, una vez transcurrido cierto tiempo después de la adsorción de las partículas infecciosas, se debe a Ellis – M. del Bruck en 1939.

Debido a que las condiciones del experimento impiden la iniciación a un nuevo ciclo, el titulo alcanzado, se mantiene por un largo tiempo. El lapso de tiempo inicial durante el cual el titulo se mantiene constante se denomina, periodo latente y el tiempo que me dio después de la adsorción y el momento de la lisis de las primeras células infectadas. La razón entre el titulo y el titulo inicial de bacterias infectadas se denomina taza de eclosión, que corresponde al número promedio de fago producido por bacteria infectada.

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II. Objetivo:

Determinar la Curva de Crecimiento de Fagos. Calcular las relacione porcentuales de crecimiento bacterofágico.

III. Materiales:

Material Biológico: Cepa bacteriana Suspensión vírica (fago).

Material de Laboratorio: Tubos de ensayo. Pipetas. Placas Petri. Agar Agua. Agar Triptosa. Caldo Triptosa. Baño María. Nefelómetro de Mc. Farland. Cloroformo Gradillas

IV. Procedimiento:

Primero, formamos 4 grupos de tubos (cada grupo con 6 tubos) en cada tubo agregar 2.7 ml. de Caldo Triptosa. Luego, tomamos un tubo de dilución y colocamos 1 ml del fago a título conocido y luego agregar 1 ml de la suspensión bacteriana (también estandarizada). Llevar a baño María por 8 min. a 37 ºC Pasado el tiempo, retirar y marcarlo con la letra A (Fago Adsorbido) Luego, tomar 1 ml del tubo A y colocar en otro tubo con 2 ml de cloroformo y marcar con las letras FNA (Fagos No Adsorbidos). Luego, del tubo A tomar 0.3 ml y llevar al primer grupo de tubos. Hecho esto, titular: pasar 0.1 ml a otro tubo con agar agua y agregar 3 a 4 gotas de bacteria y luego sembrar en placa (marcar como FA) Luego el tubo 10-6 lo llevamos a baño María por 4 min. a 37 ºC y luego a placa (titular, placa 2). Luego, de ese mismo tubo, otra vez a baño María por 5 min. a 37 ºC. Luego, con otro tubo diluir 10-7 y de este tubo a placa (titular, placa 3). Del tubo 10-7 llevar a baño María por 20 min. a 37 ºC y pasar a otra dilución (tubo 10-8). De este tubo (10-8) pasamos a placa (titular), y lo marcamos como FNP. Del virus a título conocido tomamos 1 ml a un tubo y lo marcamos como FI y agregamos 2 ml de cloroformo.

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Luego, tomamos los tubo FI y FNA, diluir, 2º grupo de tubos es FNA y 3º grupo de tubos para FI y luego realizar la titulación, del ultimo tubo de dilución 10-6 (placa FNA y placa FI). De las bacterias (tubo Nº 3 nefelómetro) tomar 0.3 y diluir (hasta 10 -6, grupo IV de tubos). Luego tomar 0.1 ml a la placa y esparcir con asa. Luego se hace el recuento de las calvas obtenidas en cada placa y se hacen los siguientes cálculos :

IV. Resultados:

- Aunque se llegó a realizar la práctica de curva de crecimiento para fagos, no obtuvimos resultados.- Se quiso volver a repetir la práctica, pensando una mala manipulación en el momento de desarrollarla, pero antes de eso se probó los fagos, al hacerlo, se pudo ver que los fagos habían perdido infectividad, ya que al sembrarlo sobre un césped bacteriano no se desarrollaron las calvas características, por lo tanto, no se pudo volver a repetir la práctica.

V. Conclusiones:

FA = FI – FNA

%FA =FA

FI x 100

Multiplicación de infección

=FAFI

Incremento de fagos durante el ciclo de

multiplicación=

FNP

FI – FNA

Magnitud de lisis =FNP – FNAFI – FNA

Fagos producidos al final del ciclo

= FNP - FNA

A = Adsorbidos

FNA = Fagos no adsorbidos

FNP = Fagos de nueva producción

FI = Fagos inoculados

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No se puedo realizar la práctica ya que los fagos aislados perdieron infectividad (ya no forman calvas).

VI. Referencias:- Artículos varios. Los virus. 2005. PDF.

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