Virus del Papiloma Humano tipo 16 variantes genéticas: Filogenia y Clasificación basada en E6 y LCR

De origen natural las variantes genéticas de papiloma humano tipo 16 (HPV16) son comunes y previamente han sido clasificadas en 4 grandes linajes; europeo-asiáticas (EAS), incluyendo el europeo sublineages (EUR) y de Asia (As), africanos 1 (AFR1), African 2 (AFR2), y North-American/Asian-American (NA / AA). Weaimed para mejorar la clasificación de HPV16 distintas especies mediante el uso de un gran recurso de HPV16-positivas las muestras cervicales recogidas de poblaciones geográficamente diversas de estudios onHPVand / o cáncer cervical llevada a cabo por la Agencia Internacional para la Investigación sobre el Cáncer. En total, se secuenciaron los genes E6 enteras y regiones largas de control (LCR) de 953 HPV16 aislados procedentes de 27 países diferentes. Los análisis filogenéticos confirmado variante descrita anteriormente linajes y subclasificaciones. Wecharacterized dos sublinajes nuevas dentro de cada uno de los linajes AFR1 y AFR2 que son fuertemente clasificados de E6 y / o LCR. Comoparapoder diferenciar AA1 previamente identificados, AA2, y sublineages NA, aunque podrían no se distinguen por E6 solo, que requiere la LCR para la clasificación filogenética correcta. Wethus proporcionar un sistema de clasificación para los HPV16 genomas basados en 13 y 32 filogenéticamente posiciones distintivas en E6 y la LCR, respectivamente, que distinguir nueve HPV16 sublineages variantes (EUR, As, AFR1a, AFR1b, AFR2a, AFR2b, NA, AA1, y AA2). El noventa y siete por ciento de los 953 muestras provistas esta clasificación perfectamente. Otras posiciones eran frecuentemente polimórficos dentro de uno o más linajes pero no definió filogenético subgrupos. Esta clasificación estandarizada de HPV16 variantes es importante para futuros estudios epidemiológicos y biológicos de el potencial carcinogénico de HPV16 distintas especies.

Los virus del papiloma humano (VPH) son circulares de doble cadena Virus de ADN que son altamente prevalentes en la población general. Los VPH se pueden dividir en dos grupos, la mucosa y cutánea, de acuerdo con el tropismo tisular. Varios tipos de VPH mucosales han sido identificados como los agentes etiológicos para el cáncer cervical y se denominan tipos de VPH de alto riesgo (HR) (17). El VPH tipo 16 (HPV16) es el más frecuente de recursos humanos en todo el mundo y es de tipo de VPH encontrado en la mayoría de los casos de cáncer cervical (7, 21).

El genoma de HPV16 es de aproximadamente 7.900 pb de longitud y consta de 8 codificación de proteínas-genes (L1, L2, E1, E2, E4, E5, E6, y E7) y 2 regiones no codificantes (la región no codificante [NCR] y el largo región de control [LCR]) (20). E6 y E7 son los principales oncoproteínas, que están implicados en la tumorigénesis y son altamente expresado en tumores. La LCR, adyacente a E6 rio abajo, contiene principios de los años promotor y elementos reguladores implicados en la replicación del ADN viral y la transcripción. El NCR es una región localizada entre corto E5 y L2.

El genoma de referencia HPV16 se secuenció por primera Seedorf et al. en 1985 (19) y se revisó por Myers et al. en 1995 (18). Muchas variantes de origen natural han encontrado desde entonces. El primer estudio mundial de HPV16 en variantes se hizo en 1993 por Ho et al. (11), quien informó que las variantes HPV16 LCR segregar robustamente en un árbol filogenético con cinco linajes variantes principales: Europea (EUR), Asiático (As), Asian-American (AA), y dos linajes africanos, Africano y afro-1-2 (AFR1 y AFR2) (11, 12). Linaje Los nombres se derivan de la procedencia geográfica de las poblaciones en que son los más frecuentes (11, 12). Yamada et al. con posterioridad secuenciado varios genes y describe un linaje adicional, América del Norte (NA) (23, 26, 27).

Los VPH mutan muy lentamente, ya que son de doble cadena Virus de ADN que utilizan la DNA polimerasa excelente corrección de pruebas capacidad de su huésped. Sin embargo, los polimorfismos de nucleótidos puede ocurrir a través de la mutación aleatoria y puede establecerse en una población. Esta deriva genética se ha observado entre HPV16 variantes, lo que sugiere su coevolución con la humanidad (4, 11).

Una variante de HPV es un genoma definido por una combinación única de polimorfismos de nucleótido único (SNPs). Una reciente propuesta definiría linajes principales variantes por una diferencia de aproximadamente el 1,0% entre los genomas completos del mismo tipo de HPV, con diferencias de 0,5 a 0,9% que definen sublinajes (3, 5, 6).

Varios estudios, basados principalmente en la secuenciación de E6 y / o la LCR en estudios realizados en Europa y América, han sugerido que el VPH 16 variantes pueden influir en la persistencia viral y el desarrollo del cáncer cervical (9, 24, 25, 28, 30). Sin embargo, para los futuros estudios a gran escala epidemiológicos, es importante contar con una clasificación completa y estandarizada de HPV16 sublinajes variantes en todo el mundo. Por lo tanto, hemos secuenciado los genes E6 y todo LCRs de 953 pacientes procedentes de 27 países diferentes, entre ellos un mayor enfoque en HPV16 aislados procedentes de África y Asia, con el fin de examinar la clasificación práctica de HPV16 sublinajes variantes mediante el uso de una región frecuentemente analizados.

Resultados

El gen E6 y la LCR fueron secuenciados en un total de 985 HPV16-positivas las muestras cervicales. Siete muestras coinfectadas con más de una variante de HPV16 y 25 muestras con deleciones en el LCR fueron excluidos, dejando 953 muestras en el análisis posterior. Las muestras se incluyeron desde el norte de África (n= 221), África subsahariana (n= 191), las Américas (n= 116), Asia Occidental (n= 137), Asia oriental (n= 175) y Europa (n= 113) (Tabla 1).

En total, se identificaron 49 variables en E6 nucleótidos (nt de 104 a nt 559), que ocurrieron en 68 combinaciones únicas, y 169 nucleótidos variables en el LCR (de 7157 a nt nt 83), que se producen

en 288 combinaciones únicas. Para E6 y el combinado LCR, había 353 variantes únicas. Estos incluyeron 99 variantes se encuentran por lo menos dos veces (que constituyen el 73% de todas las muestras), los cuales fueron incluidos en el análisis del árbol de capital filogenético (Fig. 1). El árbol filogenético separados en cuatro ramas principales (es decir, los linajes) que podrían ser reconocidos por la nomenclatura de los estudios previos: (i) EAS, incluyendo los sublineages Europeas (EUR) y asiáticos (As), (ii) africana 1 (AFR1) , incluyendo dos sublineages que tentativamente definidas como AFR1a y AFR1b, (iii) africanos 2 (AFR2), incluyendo dos sublineages que tentativamente definidas como AFR2a y AFR2b, y (iv), AA / NA, incluyendo América del Norte (NA) Asian-American-1 (AA1), y de origen asiático-2 (AA2) sublinages.

Un segundo, más grande, árbol filogenético fue generado incluyendo todas las 353 variantes E6/LCR únicas del presente estudio, así como nuevos adicional publicado secuencias E6/LCR recuperados de la obra de Kammer et al. (2002) (n= 9), Bhattacharjee et al. (2008) (n= 18), y Smith et al. (2011) (n= 46) (1, 15, 20) (Fig. 2). Este árbol más grande tenía una estructura similar, con los mismos nueve sublineages (EUR, As, AFR1a, AFR1b, AFR2a, AFR2b, NA, AA1, AA2), incluso si la distinción entre AA1 y AA2 se volvió menos clara, lo que demuestra la robustez de la árbol.

Secuencias de la agrupación en cada uno de estos nueve sublineages mostró un específico "núcleo" patrón de SNPs. La Tabla 2 muestra una clasificación basada en SNPs (13 y 32 en E6 y LCR, respectivamente) que distinguen al menos dos de los nueve sublineages una de la otra. Algunos SNP eran "diagnóstico" para un sublinaje dado (véase a continuación), lo que significa que eran exclusivas de un sublinaje específico. No SNPs de diagnóstico tales estaban disponibles para NA o AFR2b (Tabla 2). Equivalente a las designaciones nuestros sublinaje nomenclatura, basada en la secuenciación del genoma completo (RD Burk, comunicación personal), también se da.

Del total de 953 muestras, 96,5% perfectamente equipado la clasificación indicada anteriormente (Tabla 3). De las 33 muestras que no encajaban perfectamente, 30 de diferencia de sólo un SNP de una de las variantes sublineages (todos cayeron claramente en una de las ramas principales del árbol filogenético en la fig. 2). Clasificaciones variante sublinaje basado en E6 altamente correlacionados con los basados en el LCR (Tabla 3). Las únicas excepciones fueron dos cepas que se clasificaron como Como en el LCR, pero que faltaban T178G / C, dando lugar a la clasificación errónea de estos dos aislamientos como EUR, sobre la base de E6, y un aislamiento que fue clasificado como AFR2b en el LCR, pero tenía G132C , dando lugar a una clasificación errónea como AFR1a, basado en E6.

Europa y Asia linaje. El principal euroasiático rama puede ser específicamente diagnosticados por tres posiciones de nucleótidos en E6 (145G, 286T, y 289A) y tres en el LCR (7489G, 7764C, 7786C y) (Tabla 2).

El sublinaje EUR no puede ser específicamente diagnosticada por cualquier posición de nucleótidos. Varias posiciones de nucleótidos que distinguen filogenéticamente otros HPV16 sublineages, sin embargo, puede ser polimórficos dentro de la sublinaje Europea (posiciones 109, 131, 178, 335, y 350 en E6; posiciones 7233, 7507, 7730, y 24 en el LCR), de las cuales la más

frecuentemente observada SNP se T350G (54,5%), dando lugar al cambio L83V ácido amino. Estos análisis SNP se encuentra solo o en combinación unos con otros. Sin embargo, no parecen definir las ramas filogenéticas dentro del sublinaje EUR. En la LCR, T7193G y G7521A están presentes en 77,6% y 80,5% de los aislados EUR (comparado con el 100% de los aislados de todos los otros linajes). El único otro SNP común (> 10%) en aislados EUR era T7450C en el LCR (25,8%).

El sublinaje Como se diagnostica específicamente por dos SNPs en 178 nucleótidos en E6: T178G, que da lugar a la D25E ácido cambio amino, y T178C, un silencioso SNP. El sublinaje Como muestra una combinación específica de 8SNPsin la LCR, de los cuales seis son de diagnóstico (T7177C, T7201C, C7270T, A7287C, G7842A / T, y C24T).

Curiosamente, el SNP T178A (n= 4), que previamente ha sido mal clasificados en la medida sublinaje sobre la base de E6 solo, se muestra claramente que es específica para la sublinaje EUR cuando el LCR se tiene en cuenta.

El sublinaje Como se diagnostica específicamente por dos SNPs en 178 nucleótidos en E6: T178G, que da lugar a la D25E ácido cambio amino, y T178C, un silencioso SNP. El sublinaje Como muestra una combinación específica de 8SNPsin la LCR, de los cuales seis son de diagnóstico (T7177C, T7201C, C7270T, A7287C, G7842A / T, y C24T).

Linajes africanos. La rama principal AFR puede ser específicamente diagnosticada por la presencia de C143G en E6 y C31T en el LCR (Tabla 2). Todos los aislamientos AFR muestran un patrón común de cinco SNPs en E6, a saber, C143G, G145T, T286A, A289G, y C335T, que dan lugar a dos cambios de aminoácidos, Q14D y H78Y.

Los dos linajes africanos anteriormente descritas, AFR1 y AFR2, se confirmaron y se podían distinguir específicamente entre sí sobre la base de 4 posiciones de nucleótidos en el LCR (posiciones 7485, 7669, 7826, y 7837). No SNPs en E6 podía distinguir AFR1 de AFR2. AFR2 podría ser específicamente diagnosticada por la presencia de G7826A y A7837C en el LCR. No podía diagnosticar específicamente SNPs AFR1.

Los AFR1 y AFR2 sucursales cada uno mostró una división adicional en dos sublineages, que tentativamente llamado Afro-1a, 1b-africano, African-2a, 2b y africanos. Aunque estas divisiones fueron menos estables que otros linajes en el árbol filogenético (Fig. 1 y 2), la clasificación basada en los SNP distintivo en la E6 y la LCR se correlacionó muy bien (Tabla 3). Estos cuatro sublineages africanos podían distinguirse unas de otras por la combinación de los seis SNPs en E6 (en las posiciones 109, 131, 132, 295, 350, y 403) y 11 en el LCR (en las posiciones 7232, 7233, 7435, 7485, 7669, 7826, 7837, 7839, 7876, 25, y 83). SNPs diagnóstico parecen existir en la E6 y LCR para AFR1a (G132C y A83C), AFR1b (T295G, A7232C, A7438C, y T25C), y AFR2a (G132T, A403G, G7435A, y A7839G) pero no para AFR2b.

Además, dentro de la rama AFR2a del árbol filogenético, una ramificación adicional se puede observar (pero no está incluida en la clasificación en la Tabla 2). Esto es debido a dos SNPs en el LCR, T7282G y A7372C, que están siempre presentes en una, pero siempre ausentes en el otro.

Otro SNPs común (> 10% de cualquier sublinaje) en aislados AFR se T7293G (12,3%), A7611G (17,3%), y T7714A (43,2%) en AFR1a; G7868A (37,5%) en AFR1b; T7282G (45,9%), G7372C (46,6%), G7387C (45,6%), y G7868A (35,6%) en AFR2a, y T7282G (10,4%), A7348G (10,4%), T7450G (17,2%), T7643G (24,1%), A7688T (24,1%), y A7688G (13,8%) en AFR2b

Linajes norteamericanos y asiáticos-americanos. Los linajes NA / AA se agrupan en una rama principal del árbol filogenético (Fig. 1 y 2). Sin embargo, ningún SNP en E6 o la LCR puede reconocer específicamente la mayor NA / AA rama (Tabla 2). Todas las cepas NA / AA muestran un patrón común de cinco SNPs en E6, a saber G145T, T286A, A289G, C335T y T350G (que dan lugar a tres cambios de aminoácidos, Q14H, H78Y, y L83V), y 7 SNPs en el LCR, a saber, A7233C, A7485C, G7489A, C7669T, C7689A, C7764T y C7786T.

El linaje NA / AA se divide en dos ramas, una para los dos sublineages AA y otro para el sublinaje NA (Fig. 1 y 2). La NA, AA1, AA2 y sublineages se pueden distinguir sobre la base de la combinación de los seis SNPs en el LCR (en las posiciones 7339, 7394, 7507, 7743, 7834, y 7886). De estos, A7507C y T7743G son diagnósticos para las sublineages y AA2 AA1, respectivamente. Sin embargo, los sublineages NA, AA1, AA2 y no podía distinguirse sobre la base de E6 solo. Mientras A532G estaba siempre presente en AA1 y siempre ausente en NA, podría estar ausente o presente en AA2.

De nota, en nuestras muestras, 100% de los aislados AA2 contenida A7894C. Sin embargo, como esto parece no suele ser el caso en otros conjuntos de muestras publicados (20), no incluimos esta posición en nuestra clasificación. Otro SNPs común (? 10% de cualquier sublinaje) ocurrió sólo inNAisolates: T183G (78,6%) (que resulta en el cambio de aminoácidos I27R), T271C (21,4%) (un silencioso SNP), G7359A (70,0%), G7360A (70,0 %), T7441G (70,0%), y C7784T (70,0%).

Distribución geográfica de HPV16 sublineages. La Figura 3 muestra la distribución de los HPV16 sublineages por región geográfica. Las muestras con theEURlineage fueron bien distribuidos entre las distintas regiones geográficas. Las distintas especies As y AFR predominaron en las muestras procedentes del Este de Asia y África, respectivamente. Sin embargo, el linaje AFR1a se encuentra principalmente en el África subsahariana y el linaje AFR1b en el norte de África (sin diferencias para los AFR2 linajes). Los linajes AA1 y AA2 fueron comúnmente visto en las muestras de Sur / América Central, pero el linaje AA1 era más probable que se encontraron en las muestras de Asia. Por último, el linaje NA fue encontrado que es particularmente frecuente en muestras procedentes de África del Norte.

DISCUSIONES

Esta actualización HPV16 análisis filogenético confirmó previamente reportados distintas especies (4, 11, 12, 23, 26, 27) y fue capaz de identificar niveles adicionales de estratificación filogenético HPV16. Sobre la base de un total de 953 secuencias E6/LCR aislados en todo el mundo, con una alta proporción de los aislamientos procedentes de África y Asia, hemos sido capaces de producir

un árbol filogenético actualizado que claramente identificado nueve sublineages: EUR, As, AA1, AA2, NA, AFR1a , AFR1b, AFR2a, y AFR2b. Esta estructura de árbol era robusto, con independencia de si todas las secuencias únicas, o sólo los encontrados en al menos dos muestras se consideraron.

Análisis ThiOur era particularmente informativo con respecto a la elaboración de las ramas africanos del árbol filogenético, desde África HPV16 aislados estuvieron mejor representadas que en estudios anteriores. Hemos identificado dos nuevas sucursales, en tanto AFR1 y AFR2, que tentativamente identificados como afro-1a, 1b-africana, afro-2a, 2b y africanos. Cada uno de estos cuatro sublineages mostró una combinación específica de SNPs en tanto E6 y la LCR. La caracterización de estos sublineages muestra que no hay un único SNP en E6 que puede distinguir AFR1 de AFR2, como se había sugerido previamente. Es de destacar que la fuerte representación de AFR1b (y NA) en el presente análisis actualizado se debió principalmente a la inclusión de las muestras del norte de África (Argelia y Marruecos), lo que sugiere que esta región geográfica representa una rama poco estudiada previamente de HPV16 evolución.

Este análisis actualizado también reveló que solo E6 no permite la distinción entre el AA1 tres sublineages estrechamente relacionados, AA2, y NA, como se había sugerido previamente (13). Aunque el SNP A532G está siempre presente en AA1 y siempre ausente en NA , puede estar ausente o presente en AA2. La incapacidad de E6 para distinguir estos sublineages es importante para los estudios epidemiológicos, ya que es particularmente el sublinaje AA1 que se ha sugerido que se asocia con neoplasia intraepitelial cervical grado 3 o peor (CIN3?) Del riesgo basada en el análisis de genoma completo (20).

Clasificaciones anteriores basados en E6 solo han situado aislados que contenían T178A en el Como linaje (debido a la presencia común de la T178G similares SNP en la medida linaje) (13). Sin embargo, los cuatro aislamientos tales presentes en nuestro análisis se clasificaron como claramente EUR sobre la base de la LCR.

La LCR se confirmó que contienen mucha más información filogenética de E6 y distinguir los nueve sublineages propuestos, sin el requisito de E6. Ciertas partes de la LCR eran más densas en información filogenética que otros. El fragmento más corto de la LCR que permitió la distinción de los nueve sublineages era la región desde el nt 7743 al nucleótido 25 (~300 pb).

Para los estudios epidemiológicos basados en la detección de SNPs en E6 y / o la LCR, es por lo tanto proponer una clasificación práctica de distintas especies utilizando 45 posiciones de nucleótidos (13 y 32 posiciones en E6 y la LCR, respectivamente) que se pueden distinguir cada uno al menos dos de las nueve descritas anteriormente sublineages el uno del otro. Sin embargo, hay una redundancia tanto en esta clasificación, por lo que no todas las 45 posiciones en E6 y la LCR son necesarios para la clasificación en una de las nueve sublineages. De hecho, existe un menor número de SNPs de diagnóstico que son específicos para un sublinaje dado. Sin embargo, no existen en SNPs diagnóstico E6/LCR para EUR, NA, o AFR2b. Además, muchos E6/LCR SNPs diagnóstico previamente propuesto por Smith et al. (20) (basado en 62 genomas completos

HPV16) demostró no ser verdaderamente sublinaje en concreto de nuestro análisis más amplio. En E6, por ejemplo, C335T no es diagnóstico para no EAS linajes, y T109C, G132T, y A403G no son diagnósticas para AFR2 (20). Esto indica que con una expansión de muestras de todo el mundo, tales como los presentados en este estudio, el número de serie único de diagnóstico de SNPs para linajes específicos o sublinajes disminuirá.

La robustez de la clasificación fue confirmada por la correlación casi perfecta del patrón de SNPs en E6 y la LCR, lo que confirma los hallazgos previos de que los patrones de SNPs correlación a lo largo de la totalidad del genoma HPV16 (6, 20). Dada esta correlación, análisis epidemiológicos de la historia natural y el potencial carcinogénico de HPV16 variantes genéticas no podrán para distinguir causal linaje específico de SNPs no causal de linaje específico de SNPs (20) y por lo tanto, debe centrarse en determinar robustos riesgos relativos al nivel de HPV16 sublineages.

También se identificó un gran número de no-linaje específico de SNPs, principalmente en el LCR. Sólo unos pocos no linaje específico de SNPs se produjo en E6 en? 10% de las muestras en cualquier sublinaje uno, a saber, la bien caracterizada T350G SNP en el linaje EUR (ver más abajo), así como T183G, T271C, y A532G en el linaje AA2. Sin embargo, estos SNPs no mostró evidencia de definir subgrupos filogenéticos.

Así, los estudios epidemiológicos deberían comparar estos SNPs no de linaje específico dentro de un determinado linaje único, siguiendo el ejemplo de los estudios que han sugerido que los sublineages EUR-350G y EUR-350T difieren en sus riesgos para la persistencia viral (9) y / o cáncer cervical (9, 10, 22, 28). Sin embargo, este enfoque es poco probable que sea posible estadísticamente para SNPs más rara, y la atención también se debe procurar no sobreinterpretar su importancia (13).

Nuestra clasificación utilizado recientemente E6/LCR es consistente con las definiciones de linaje previos basados en la secuenciación completa del genoma HPV16, además de destacar algunas estratificaciones finas (6, 20). De hecho, se ha incluido la traducción al equivalente nomenclatura más reciente basado en la secuenciación del genoma completo (R. Burk, comunicación personal) en la Tabla 2. Sin embargo, mientras que los últimos de todo el genoma análisis incluyeron aislados muy pocos representan la NA, AFR1b, y sublineages AFR2b, nuestro análisis (mientras que sobre la base de E6 y el LCR solamente) incluye aproximadamente 30 aislados de cada uno de estos sublineages (20). Por lo tanto, una selección de las cepas más informativos E6/LCR-characterized justificaría la secuenciación a través de sus genomas completos a fin de reforzar la imagen completa de HPV16 evolución genética.

En resumen, hemos hecho uso de la amplia representación geográfica de la muestra cervical IARC biobanco para proporcionar la clasificación más completa y práctica para HPV16 sublineages variantes hasta la fecha. Este trabajo puede ayudar a la normalización de los futuros estudios epidemiológicos de la historia natural y la carcinogenicidad de HPV16 variantes genéticas, además de permitir la puesta en común de los datos de diferentes estudios para superar los problemas de limitaciones de tamaño de la muestra de los estudios individuales.

La figura 1 HPV16 árbol filogenético basado en secuencias de 99 E6/LCR únicas encontradas en al menos 2 muestras. Este es un bootstrap (100 repeticiones) árbol UPGMA consenso.

La figura 2 HPV16 árbol filogenético basado en 353 secuencias únicas E6/LCR del presente estudio más secuencias adicionales E6/LCR del trabajo de Smith et al. (20), Bhattacharjee et al. (1), y Kammer et al. (15). Este es un bootstrapped (100 repeticiones) consenso árbol UPGMA.