Visualización y análisis de biopelículas mediante ...

Visualización y análisis de biopelículas mediante microscopía

electrónica de barrido (MEB) en redes de distribución de agua

potable.

Carlos Andrés Zambrano Ovalle

Universidad de los Andes

Facultad de Ingeniería

Departamento de Ingeniería Civil y Ambiental

Bogotá D.C., Colombia

Junio de 2012

Visualización y análisis de biopelículas mediante microscopía

electrónica de barrido (MEB) en una red de distribución de

agua potable.

Carlos Andrés Zambrano Ovalle.

Proyecto de grado presentado para optar al título de Ingeniero Ambiental

Asesora del Proyecto

Liliana Reyes Valderrama, Microbióloga

M.Sc. Dirección Universitaria. Universidad de los Andes M.Sc. Evaluación en Educación. Universidad Santo Tomás de

Aquino

Co-Asesor del Proyecto

Manuel S. Rodríguez Susa,

Ingeniero Químico

M.Sc. Ingeniería Civil Universidad de los Andes

PhD. Génie des Procédés Institut National Des Sciences

Appliquées

Universidad de los Andes

Facultad de Ingeniería Departamento de Ingeniería Civil y Ambiental

Bogotá D.C., Colombia Junio de 2012

Agradecimientos

A mis padres por su apoyo incondicional en todos y cada uno de los momentos de mi

existencia, a los profesores del Departamento de Ingeniería Civil y Ambiental de la

Universidad de los Andes por su dedicación y compromiso con la educación del país,

específicamente agradezco a los asesores de este proyecto de grado, a las personas

que trabajan en el Centro de Investigaciones de Ingeniería Ambiental CIIA y a las

personas del laboratorio de microscopía electrónica de la Universidad de los Andes

por sus recomendaciones y sugerencias para que este trabajo fuese terminado

satisfactoriamente.

A María Fernanda Díaz por proporcionar las biopelículas utilizadas en este estudio y

sus análisis microbiológicos previos.

Tabla de contenido

1. Introducción .............................................................................................................. 1

2. Objetivos ................................................................................................................... 3

2.1. Objetivo General ................................................................................................ 3

2.2. Objetivos Específicos ......................................................................................... 3

3. Marco teórico ............................................................................................................ 4

3.1. Microscopia Electrónica de Barrido (MEB) ......................................................... 4

3.1.1. Historia ........................................................................................................................ 4

3.1.2. Fundamento ................................................................................................................ 7

3.1.3. Ventajas y limitaciones del MEB ................................................................................. 8

3.1.4. MEB en biopelículas ................................................................................................... 9

3.2. Analizador EDS ................................................................................................ 14

3.2.1. Análisis EDS en biopelículas ...................................................................................... 15

3.3. Biopelículas ...................................................................................................... 16

3.3.1. Definición de biopelícula ........................................................................................... 16

3.3.2. Formación de biopelículas en tuberías de distribución de agua potable ................. 16

3.3.3. Materiales de la tubería influyentes en la formación de biopelículas ...................... 19

3.3.4. Composición microbiana de biopelículas en tuberías de agua potable .................... 21

4. Metodología ............................................................................................................ 28

4.1. Toma de muestras ........................................................................................... 28

4.1.1. Sogamoso (Boyacá) ................................................................................................... 28

4.1.2. Bogotá (Cundinamarca) ............................................................................................. 30

4.1.3. Duitama (Boyacá) ...................................................................................................... 31

4.2. Ensayos preliminares ....................................................................................... 32

4.2.1. Cultivo de microorganismos de biopelículas en medio R2A ..................................... 32

4.2.2 Tinciones de Gram y láminas en fresco ...................................................................... 33

4.3. Preparación de las muestras para análisis MEB y EDS .................................... 34

4.3.1. Muestras de biopelícula ............................................................................................ 34

4.4. Microscopia electrónica de barrido y EDS ........................................................ 39

5. Resultados y análisis .............................................................................................. 43

5.1. Cultivo de microorganismos de biopelículas en medio R2A.............................. 43

5.1.1. Sogamoso (Boyacá) ................................................................................................... 43

5.1.2. Duitama (Boyacá) ...................................................................................................... 44

5.1.3. Bogotá D.C. (Cundinamarca) ..................................................................................... 44

5.2. Laminas en fresco y tinciones de Gram de biopelículas ................................... 46

5.2.1. Tinciones de Gram ..................................................................................................... 46

5.2.2. Láminas en fresco ...................................................................................................... 49

5.3 Imágenes de microscopia electrónica de barrido (MEB) en biopelículas ........... 52

5.3.1. Sogamoso (Boyacá) ................................................................................................... 53

5.3.2. Bogotá D.C. (Cundinamarca) ..................................................................................... 55

5.3.3. Duitama (Boyacá) ...................................................................................................... 57

5.4. Análisis composicional EDS ............................................................................. 59

5.4.1. Sogamoso (Boyacá) ................................................................................................... 59

5.4.2. Duitama (Boyacá) ...................................................................................................... 66

5.4.3. Bogotá (Cundinamarca) ............................................................................................. 72

6. Conclusiones y Recomendaciones ......................................................................... 75

6.1. Conclusiones .................................................................................................... 75

6.2. Recomendaciones ............................................................................................ 76

7. Referencias Bibliográficas ....................................................................................... 76

Universidad de los Andes IAMB 201210 34


Centro de Investigaciones en Ingeniería ambiental – CIIA

Visualización y análisis de biopelículas mediante microscopia electrónica de barrido (MEB) en redes de

distribución de agua potable.

1

1. Introducción

Los sistemas de distribución de agua potable tienen como objetivo transportar agua

bebible a los consumidores, la cual ha sido tratada mediante procesos físicos y

químicos en una planta de potabilización de agua. Este proceso permite que el agua

tenga unas características físicas, químicas y biológicas que cumplan con condiciones

mínimas de calidad para su consumo. Sin embargo, ésta es susceptible a

contaminación microbiana en el proceso de transmisión y distribución. Los

microorganismos presentes en el sistema de distribución son nutricionalmente

deficientes (es decir que requieren nutrientes para su crecimiento) y pueden tomar

ventaja de una gran variedad de sustratos para formar biopelículas oligotróficas que

ponen en peligro la limpieza del agua potable y por lo tanto de los consumidores. (Yi-

mei, Yan-wei, & Hui-na, 2010).

Una biopelícula se define como una comunidad microbiana que crece adherida a un

sustrato o a una interface, y que se encuentra embebida en una matriz de polímeros

extracelulares que las bacterias producen. (Donlan & Costerton, 2002). Estos

microorganismos se ven afectados principalmente por la temperatura, la disponibilidad

de nutrientes, los materiales de la tubería, la presión hidráulica y el desinfectante. (Yi-

mei, Yan-wei, & Hui-na, 2010).

En diferentes investigaciones se ha encontrado que las biopelículas pueden causar

problemas en la red de distribución de agua potable, tales como: corrosión en las

tuberías, cambios en la presión de la red, obstrucción de los filtros de purificación de

agua y el transporte de microorganismos patógenos que pueden ser perjudiciales para

la salud humana (Vargas & Saldarriaga, 2005). Por esta razón las biopelículas en

tuberías de agua potable han sido objeto de estudio a lo largo de los últimos años.

El presente trabajo pretende estudiar biopelículas en redes de distribución de agua

potable de distintos materiales, mediante microscopia electrónica de barrido y

microanálisis químico por espectroscopia de energía dispersiva, además de métodos

microbiológicos tradicionales, con el fin de encontrar y diferenciar morfotipos






2

microbianos y la composición química de la biopelícula adherida a la tubería de la red

de distribución de agua potable.

Para ello, se tomaron 8 muestras de diferentes biopelículas de los municipios de

Sogamoso (Boyacá), Duitama (Boyacá) y Bogotá D.C. (Cundinamarca) que fueron

utilizadas para su visualización y análisis EDS en el microscopio electrónico de la

Universidad de los Andes.






3

2. Objetivos

2.1. Objetivo General

Estudiar mediante la técnica de microscopía electrónica de barrido y análisis

de EDS, biopelículas de diferentes redes de distribución de agua potable, con

el fin de detectar morfotipos microbianos presentes, además de su

composición química.

2.2. Objetivos Específicos

Realizar una revisión de la literatura referente a biopelículas presentes en los

sistemas de distribución de agua potable incluyendo la aplicabilidad de la

técnica de microscopia electrónica para su estudio.

Aplicar la metodología de microscopia electrónica de barrido de muestras

biológicas en biopelículas de agua potable.

Realizar análisis composicionales de biopelículas de agua potable mediante

espectroscopia de energía dispersiva.






4

3. Marco teórico

3.1. Microscopia Electrónica de Barrido (MEB)

3.1.1. Historia

El microscopio electrónico de barrido fue introducido por Ernst Ruska en 1931, y de

inmediato se constituyó en una herramienta fundamental en el trabajo científico, por lo

que actualmente es utilizado en múltiples investigaciones alrededor del mundo. Sin

embargo, transcurrieron dos décadas antes de lograr avances significativos en la

obtención de preparaciones adecuadas, y de poder observar las primeras imágenes

de ultraestructura celular.

Hacia 1960 se había avanzado en la tecnología y en el procesamiento de los órganos

y tejidos para su observación por microscopia electrónica de transmisión, superando

grandes dificultades en los métodos de preservación, infiltración, corte y coloración de

los tejidos, e iniciándose entonces una etapa de estudio de su ultraestructura. En los

siguientes 15 años se desarrolló una gran actividad en laboratorios y centros de

investigación, especialmente en Estados Unidos y Europa, aportando conocimientos

valiosos sobre la organización celular y subcelular, así como la complejidad y

participación en los procesos celulares de los organelos. En esta etapa descriptiva de

la microscopía electrónica se generaron las bases de la biología celular. Su

aplicabilidad se extendió a todas las áreas de la biomedicina y los resultados de esta

profusa actividad fueron acogidos en diferentes revistas, al tiempo que surgieron

nuevas publicaciones periódicas que se consolidaron como revistas especializadas en

microscopía electrónica. Paralelamente, se continuó con el estudio de los factores

físicos y químicos implicados en el procesamiento de los materiales biológicos,

tendiente a dilucidar el efecto sobre éstos. Si bien la utilización de la microscopía

electrónica ha sido asimilada por algunos al concepto de técnica, un seguimiento de

las fuentes primarias sobre su desarrollo y aplicaciones en biología, la revelan como

una ciencia y no como una simple técnica. La búsqueda de métodos confiables en la






5

preservación de los materiales biológicos hasta su observación al microscopio

electrónico, ha significado el estudio minucioso del efecto de esos factores sobre las

macromoléculas biológicas. Su utilización en todas las áreas del conocimiento ha

derivado en un enorme conocimiento del funcionamiento de las células. Bozzola y

Russell (1999) definen la microscopía electrónica como “un campo especializado de la

ciencia que emplea el microscopio electrónico como herramienta”.

La combinación de la microscopía electrónica con otros métodos (de autorradiografía,

bioquímicos, inmunocitoquímicos, congelación – fractura, microscopía cuantitativa,

entre otros) en especial desde la década de 1970, con la introducción del método de

oro coloidal por Faulk y Taylor, abrió posibilidades insospechadas de interpretación y

análisis de la función celular, enriquecida con el conocimiento sobre las

macromoléculas, su génesis y tránsito por los distintos compartimientos celulares,

dando paso a la biología molecular. (Romero, 2003)

Fechas importantes en el desarrollo de la microscopía electrónica de barrido.

1931: Knoll y Ruska construyen el primer microscopio electrónico de barrido.

1939: Siemens en Alemania construye el primer microscopio electrónico

comercial.

1939-1943: Investigadores de diferentes países realizan sin éxito esfuerzos

para lograr la obtención de secciones menores de 1 µ.

1945: Porter, Claude y Fullman observan por primera vez al microscopio

electrónico células en cultivo fijadas en tetróxido de osmio.

1946: Claude y Fullman logran las primeras electromicrografías.

1948: Pease y Beaker obtienen por primera vez secciones de tejido de 0.1-0.2

µ de espesor.

1949: Newman y colaboradores introducen el butil metacrilato como medio de

imbibición.

1950: Gettner y Hillier demuestran la ventaja de hacer flotar las secciones en

agua, idea desarrollada previamente por Claude en 1948.






6

1949-1958: Durante este periodo se identificaron las limitaciones del

metacrilato como medio de imbibición.

1950: Latta y Hartman introducen las cuchillas de vidrio.

1952: Palade, Porte y Sjöstrand desarrollan métodos de fijación y corte

ultrafino, y realizan la primera observación de estructuras intracelulares al

microscopio electrónico.

1953: Fernández Moran demuestra que los diamantes recientemente

fracturados tienen un borde excepcional para el seccionamiento ultradelgado.

1953: Porte y Blum introducen el primer ultramicrótomo comercial (Sorvall MT-

2).

1956: Maale y Birch Andersen en su trabajo con resinas epoxi revelan las

limitaciones del metacrilato.

1956: Glauert introduce la resina epoxi Araldita, posteriormente mejorada por

Glauert en 1958.

1957: Brenner y Home introducen el método de “coloración negativa”.

1958: Watson introduce los colorantes electrónicos.

1960-1961: Fink y Luft exploran el uso de Epon.

1959: Singer utiliza anticuerpos marcados con ferritina para localización

ultraestructural.

1963: Sabatini y colaboradores introducen aldehídos como fijadores primarios.

1971: Faulk y Taylor desarrollan el método de inmunolocalización con oro

coloidal.1

1 (Romero, 2003)






7

3.1.2. Fundamento

La microscopía electrónica de barrido (MEB) es una técnica de análisis superficial, que

consiste en enfocar sobre una muestra electrodensa (opaca a los electrones) un fino

haz de electrones acelerado con energías de excitación desde 0.1kV hasta 50kV.

El haz de electrones se desplaza sobre la superficie de la muestra realizando un

barrido que obedece a una trayectoria de líneas paralelas. La variación morfológica de

la muestra entrega diversas señales (electrones secundarios, electrones

retrodispersados, emisión de rayos X, etc.) que son recogidas por distintos detectores;

los cuales permiten la observación, caracterización y microanálisis superficial de

materiales tanto orgánicos como inorgánicos (Langebaek & Gutierrez, 2012).

La técnica de microscopía electrónica de barrido (MEB) es novedosa en caracterización

de biopelículas en una red de distribución de agua potable. Esta técnica permite hacer

una caracterización morfológica, topográfica y composicional de la biopelícula de la red

de agua potable. Además, usando MEB es posible observar microorganismos que por

métodos tradicionales de cultivo no serían detectados.

Para esto el MEB utiliza un haz de electrones que es emitido desde un cañón termoiónico

o un “Field Emission Gun” (FEG). Al cañón se le aplica un potencial eléctrico que acelera

el haz de electrones hacia la columna, siendo éste focalizado por medio de lentes

electromagnéticas sobre la muestra (toda la trayectoria de los electrones debe estar en

vacío, de lo contrario, los electrones colisionarían con las moléculas de aire y serán

absorbidos). Los electrones chocan e interactúan con la muestra produciendo varias

señales que podrán ser recogidas de acuerdo a los detectores presentes. La

amplificación de la imagen se produce por un conjunto de lentes electromagnéticas que

mediante un tratamiento adecuado de las señales electrónicas son proyectadas en un

tubo de rayos catódicos (CRT) (Langebaek & Gutierrez, 2012).

Usando la interacción de los electrones con la superficie y la muestra, y los fenómenos

que se producen, la MEB suministra la información necesaria para una mejor






8

caracterización de la biopelícula. Esta técnica permite capturar el detalle de la biopelícula

con ampliaciones hasta de 300.000X e imágenes de alta resolución, hasta los 3nm, y con

apariencia tridimensional (Langebaek & Gutierrez, 2012).

El MEB está compuesto por tres detectores que se clasifican en imágenes de electrones

secundarios, imágenes de electrones de retrodispersión y analizador EDS de rayos X, los

cuales están instalados dentro de la cámara de vacío. La muestra se coloca en el

portamuestras de la cámara de vacío del microscopio, en donde es escaneada,

convirtiendo las señales eléctricas en una imagen tridimensional que se observa en el

monitor de las computadoras (Adabache, Silva, & Galvan).

3.1.3. Ventajas y limitaciones del MEB

Ventajas del MEB (Langebaek & Gutierrez, 2012):

Gran profundidad de campo, que le da apariencia tridimensional a las imágenes

permitiendo enfocar y observar amplias zonas de la muestra al mismo tiempo.

Imágenes de alta resolución (de hasta 3 nm). Detalles muy cercanos en la muestra

pueden ser observados separadamente a alta magnificación.

Preparación relativamente sencilla de las muestras.

Observación de muestras de tamaños desde centímetros hasta muestras del

orden de nanómetros.

Limitaciones del MEB (Langebaek & Gutierrez, 2012):

Las muestras deben ser conductoras.

Las muestras deben estar libres de humedad.

No es posible observar la estructura interna y detalles ultraestructurales de las

muestras (para esto se requiere un Microscopio Electrónico de Transmisión MET).






9

3.1.4. MEB en biopelículas

Debido a la gran versatilidad de muestras que pueden analizarse mediante la técnica

de microscopia electrónica de barrido ha sido posible estudiar biopelículas. Estudios

recientes muestran imágenes de biopelículas adheridas a tuberías de agua potable y

han permitido estudiar una gran cantidad de variables. Entre éstas últimas se

encuentran la corrosión de las tuberías, los efectos de los desinfectantes usados en la

red de distribución de agua potable, la diversidad microbiológica presente y fenómenos

de colonización.

Así por ejemplo, el estudio realizado por Haibo, Chun, Xuexiang, Min, & Jiuhui, 2012

consistió en el estudio de biopelículas con diversas técnicas, entre ellas microscopía

electrónica de barrido para evaluar el efecto de los desinfectantes en la corrosión de

tuberías.






10

Figura 3.1.4.A. Imágenes de biopelículas en redes de distribución de agua potable mediante MEB

evaluando desinfectantes.2

La Figura 3.1.4.A., muestra el resultado del análisis mediante MEB donde se

encontraron principalmente bacterias de los phyla Proteobacteria, Bacteroidetes y

bacterias no cultivables.

El estudio de Qing, Xin-hua, & Ya-nan, 2009, consistió en hacer crecer biopelículas en

un montaje de distribución de agua potable e identificar las bacterias presentes.

Figura 3.1.4.B. Imágenes de biopelículas mediante MEB en identificación de bacterias.3

La Figura 3.1.4.B., muestra las imágenes obtenidas mediante MEB. Los géneros

bacterianos identificados en este estudio incluyen: Pseudomonas, Chryseobacterium,

Stenotrophomonas, Vibrio, Chromobacterium, Stomatococcus y Burkholderia. Estos

resultados muestran que muchos de los géneros identificados son patógenos

potenciales, lo cual indica que podría existir riesgo bacteriano en los sistemas de


Un estudio de análisis de biopelículas mediante MEB realizado por Pei-Ying, Chiachi,

Fangqiong, Gary L., Mark W., & Wen-Tso en 2010, mostró la caracterización de

comunidades bacterianas en biopelículas en un caso de estudio en Estados Unidos.

La Figura 3.1.4.C., muestra los resultados de las bacterias encontradas. Mediante

análisis posteriores de secuenciación se identificaron principalmente los siguientes

2 (Haibo, Chun, Xuexiang, Min, & Jiuhui, 2012)

3 (Qing, Xin-hua, & Ya-nan, 2009)






11

phyla de bacterias: Firmicutes, Deinococcus-Thermus, Bacteroidetes, Actinobacteria, y

Proteobacteria.

Figura 3.1.4.C. Imágenes de biopelículas obtenidas por MEB. A) Matriz extracelular de la biopelícula. B)

Bacterias en la tubería4.

Otros estudios como el presentado por Yi-mei, Yan-wei, & Hui-na en 2010, confirman

la necesidad de complementar el análisis de microscopia electrónica de barrido con

técnicas microbiológicas tradicionales, además de estudios moleculares, para poder

identificar los microorganismos presentes en la biopelícula. Esto ocurre por la dificultad

de visualizar morfotipos en este tipo de muestras y a que la matriz de polímeros

extracelulares que las bacterias producen para su estabilización impide observar

claramente sus comunidades.

La Figura 3.1.4.D. muestra una imagen de biopelículas en tuberías de polietileno

donde los autores del estudio cultivaron en cajas de Petri para poder ampliar la

información de la imagen, donde no pueden observarse claramente los

microorganismos presentes. Se observan precipitados y los materiales constituyentes

de la matriz de exopolímeros que producen las bacterias.

4 (Pei-Ying, Chiachi, Fangqiong, Gary L., Mark W., & Wen-Tso, 2010)






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Figura 3.1.4.D. Biopelícula en tubería de Polietileno.5

Para una mejor visualización de los microorganismos, Yu, Kim, & Lee en 2010

tomaron muestras de biopelícula de distintos materiales de tubería e incubaron los

microorganismos comparando las imágenes de MEB obtenidas antes y después de

dicha incubación.

5 (Yi-mei, Yan-wei, & Hui-na, 2010)






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Figura 3.1.4.E. Imágenes de biopelícula en distintos materiales de tubería realizando comparación en

incubaciones.6

En la Figura 3.1.4.E., se observa cómo puede potenciarse la visualización de

microorganismos mediante la técnica de MEB por incubación de las muestras. Antes

de la incubación no pueden apreciarse los microorganismos en la biopelícula, debido

principalmente a la baja diversidad, pero después de una incubación de 90 días la

diversidad aumenta y la visualización de las imágenes mejora sustancialmente.

Posteriores análisis moleculares permitieron identificar los phyla: Proteobacteria,

Bacteroidetes y Actinobacteria.

6 (Yu, Kim, & Lee, 2010)






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3.2. Analizador EDS

El analizador EDS es una herramienta muy útil porque además de la visualización de las

imágenes en la biopelícula, permite conocer su composición química y obtener

información sobre posibles cambios generados por microorganismos presentes en ella.

El funcionamiento del analizador EDS consiste en identificar la distribución cuantitativa y

cualitativa de elementos químicos que se encuentran presentes en la muestra, mostrando

gráficas e imágenes relacionadas con esa distribución. El analizador EDS de rayos X

identifica y evalúa el contenido de elementos químicos desde el carbono al uranio, en

superficies planas o secciones finas de las muestras en todo tipo de material biológico e

inerte (Adabache, Silva, & Galvan).

En el analizador EDS de rayos X del MEB se realizan diversos análisis representados con

histogramas e imágenes de distribución de los elementos químicos presentes en la

muestra. La formación de un espectro EDS de rayos X se obtiene mediante un software

(INCA) que recoge durante un determinado tiempo (minutos) los fotones emitidos por la

muestra, clasificándolos según su energía. El espectro se presenta como un histograma

en donde el eje de las X tiene unidades de energía (Kiloelectrovolts) y el eje de las Y el

número de cuentas o intensidad. En el espectro se realiza de forma automática la

identificación, el análisis cualitativo y cuantitativo de los diferentes elementos a través de

picos en la campana de Gauss observados en el histograma.

Una vez obtenido el espectro, se identifican los elementos en los picos de un histograma

espectral de un punto elegido de la muestra. El gran poder de resolución (3 nm) y la

profundidad de campo (1000 nm) permiten la aplicación del microscopio electrónico de

barrido en diversas disciplinas del ámbito científico (ciencias biológicas, médicas,

geológicas, metalúrgicas, biotecnología y ciencia de los materiales) (Adabache, Silva, &

Galvan).






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3.2.1. Análisis EDS en biopelículas

El análisis mediante EDS se realiza en conjunto de la técnica MEB como un complemento

de información que se puede obtener en muestras biológicas. Estudios de composición

química se han realizado en redes de distribución de agua potable con el fin de cuantificar

la corrosión de las tuberías en el sistema, debido a la acción del desinfectante y a la

acción metabólica de las biopelículas.

Haibo, Chun, Xuexiang, Min, & Jiuhui, 2012 encontraron en su estudio, que

principalmente las biopelículas en tuberías de hierro contenían elementos químicos como:

carbono, oxígeno y fósforo (inherentes al metabolismo de las biopelículas) y calcio y

hierro (sedimentos producto de procesos corrosivos). (Ver Tabla 3.2.1.)

Tabla 3.2.1. Composición química de biopelículas mediante SEM/EDS en comparación con la aplicación del

desinfectante.7

7 (Haibo, Chun, Xuexiang, Min, & Jiuhui, 2012)






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3.3. Biopelículas

3.3.1. Definición de biopelícula

Las biopelículas son agrupaciones de microorganismos que se forman y persisten en

los límites de fase de un sustrato, causadas por el crecimiento heterogéneo de

bacterias, hongos, algas y otros organismos superiores (Wang, Xu, Sun, & Kong,

2010).

Este tipo de asociaciones puede presentarse en cualquier lugar en el que una

superficie esté en contacto permanente con el agua. En el caso específico de las

tuberías de agua potable, la formación y estabilidad de las biopelículas depende de la

interacción entre la calidad del agua, tipo de material de la red, condiciones hidráulicas

y operativas. Dentro del sistema de distribución, las áreas de corrosión y el flujo lento

proporcionan los sitios más atractivos para el desarrollo de estos agregados. De igual

manera, los reservorios y las paredes laterales de tubos verticales son sitios

atrayentes (Rodriguez, Lemus, & Moreno, 2011). Las biopelículas se adhieren a algún

tipo de superficie, formando una película gracias a la excreción de exopolímeros o

sustancias poliméricas extracelulares (EPS). La película formada por los EPS les

confiere propiedades a los conglomerados celulares, como la obtención de nutrientes

de la tubería y del agua, además de resistencia a los desinfectantes (Diaz, 2011).

3.3.2. Formación de biopelículas en tuberías de distribución de agua potable

El proceso de formación de biopelículas en tuberías de agua potable puede

observarse en la Figura 3.3.2.A. En un principio, con el paso del agua por la tubería

se da lugar a la formación de una capa de depósitos orgánicos e inorgánicos en la

superficie causados por partículas y sedimentos, los cuales sirve de nutrientes para las

bacterias. Posteriormente, la adhesión de los primeros microorganismos colonizadores

ocurre en las paredes de la tubería, donde la velocidad del flujo del agua tiende a cero,

debido a la subcapa laminar viscosa. Allí son adsorbidos por la tubería, quedándose






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algunas veces ahí por tiempo ilimitado y en otros casos saliendo al flujo normal de

agua; este proceso recibe el nombre de adsorción reversible (Vargas & Saldarriaga,

2005).

Figura 3.3.2.A. Etapas de formación de biopelículas.8

Esta primera etapa está gobernada por la atracción electrostática y por las fuerzas

físicas. Las reacciones químicas aún no tienen efecto en el desarrollo de la biopelícula.

En este momento aparecen las primeras microcolonias como puede observarse en la

imagen Figura 3.3.2.A.

Según Vargas & Saldarriaga, 2005, las bacterias de las biopelículas secretan una serie

de sustancias poliméricas que la sostienen y evitan que ésta se disuelva, la mantienen

unida entre sí y la adhieren a la pared de la tubería dándole estabilidad mecánica. La

8 (Vargas & Saldarriaga, 2005)






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estructura química de estas sustancias depende del tipo de microorganismo que las

secrete y de las condiciones ambientales en las que sean producidas.

El material polimérico, está formado por polisacáridos con carga eléctrica neutra, que

no sólo facilitan la unión de las bacterias con la pared de la tubería, sino que

adicionalmente actúan como un sistema de intercambio iónico en el que se atrapan

nutrientes del agua que pasa por la superficie. Por otro lado, se ha podido establecer

en diversos estudios que el limo mitiga los efectos de los antibióticos y desinfectantes

que se encuentran en la columna de agua, actuando como protección para los

microorganismos. La matriz de limo no sólo sirve para atrapar moléculas de nutrientes,

sino que atrae diferentes tipos de células microbianas. Estas nuevas integrantes de la

población están encargadas de metabolizar los residuos de las colonizadoras

primarias. Se crea así sucesivamente una cadena de microorganismos que se

relacionan en una comunidad (Donoso & Saldarriaga, 2009).

Figura 3.3.2.B. Biopelícula madura en tuberías de agua potable.9

Finalmente una biopelícula madura se forma (ver Figura 3.3.2.B.), ésta consiste en

una comunidad compleja, metabólicamente cooperativa, formada por diversas

especies que viven en un micronicho. Las microcolonias se relacionan de diferentes

formas estableciendo una gran estructura que cubre la mayoría del sustrato, la cual es

9 (Donoso & Saldarriaga, 2009)






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atravesada por una serie de canales por los cuales pasan agua, residuos bacteriales,

nutrientes, enzimas y oxígeno. Adicionalmente, la biopelícula posee componentes

tanto orgánicos como inorgánicos que obtiene de fuentes externas. Las partículas

inorgánicas pueden ser el resultado de la absorción de minerales, la sedimentación y

la precipitación de sales o productos de la corrosión (Vargas & Saldarriaga, 2005).

3.3.3. Materiales de la tubería influyentes en la formación de biopelículas

Entre los factores que en mayor medida afectan la aparición y formación de

biopelículas en redes de distribución de agua potable, el material de la tubería es uno

de los aspectos a tener en cuenta debido a que dependiendo del tipo de material del

cual este constituida la red los microorganismos en la biopelícula pueden obtener sus

nutrientes.

Existen estudios que comprueban diferencias en la composición de biopelículas para

distintos materiales de tubería, según Rogers, Dowsett, Dennos, Lee, & Keevil, 1994

en un estudio donde se evaluó la formación de biopelículas para diferentes tipos de

materiales. Las bacterias pioneras, que son las encargadas de la colonización, fueron

diferentes en cada caso por lo que las biopelículas fueron diferentes en diversidad,

abundancia y morfología.

Los principales materiales en la fabricación de tuberías se muestran a continuación:

Metales:

Hierro: Se ha demostrado que las tuberías de hierro estimulan el crecimiento de

biopelículas. Factores como la corrosión, la formación de tubérculos y de huecos,

ayudan a crear una atmósfera favorable para el crecimiento de las biopelículas,

especialmente en aguas pobres de nutrientes. El hierro también interfiere en la acción

del cloro haciendo aún más favorable el ambiente para los microorganismos. Por otro

lado, se ha observado un crecimiento más rápido y una mayor densidad en las

biopelículas que se forman en este material (Vargas Gamarra, 2004).






20

Comparando las tuberías de hierro con las de PVC se ha encontrado que en las

primeras, el número de bacterias, la velocidad de formación y la diversidad de las

biopelículas es mucho mayor en todos los casos (EPA, 1992).

Cementos:

En diferentes estudios se ha comprobado que los materiales de cemento tienen menor

capacidad de albergar biopelículas que los materiales metálicos (Vargas Gamarra,

2004).

Concreto: Durante varios años se han relacionado los microorganismos con el

deterioro del concreto. Se cree que es un proceso complejo en el que se ven

involucrados diferentes tipos de microorganismos tales como las bacterias reductoras

de azufre (Vargas Gamarra, 2004).

Materiales plásticos:

(PVCu, PVCc, MDPE): Se han hecho algunas comparaciones en las que se han

encontrado que la cantidad de biopelícula que se forma en estos nuevos materiales es

considerablemente menor que la que se forma, por ejemplo, en tuberías de hierro.

En el estudio realizado por Rogers, Dowsett, Dennos, Lee, & Keevil, 1994, se encontró

un número reducido de colonizadores de crecimiento rápido, pero una gran cantidad

de colonizadores de crecimiento lento. Así, la biopelícula que se forma es de

crecimiento lento, pero de una gran diversidad y una gran densidad.

Se ha planteado que los plastificantes y demás componentes del material, pueden

llegar a ser directamente utilizados por algunas comunidades de microorganismos,

creando una relación directa entre el material y la biopelícula (Vargas Gamarra, 2004).

Los materiales plásticos son capaces de proveer ciertos nutrientes a los

microorganismos; sin embargo, se cree que es más relevante la contribución de

nutrientes debido al flujo del agua. Por otro lado, se ha encontrado que en la superficie

de estos materiales pueden existir ciertos huecos e imperfectos causados en el






21

proceso de manufactura, los cuales se convierten en los principales nichos y los

lugares que son colonizados en primer lugar por los microorganismos. Este fenómeno

colabora con la formación de las biopelículas en los materiales plásticos, ya que estos

lugares protegen a los microorganismos de las fuerzas cortantes, porque actúan como

barreras protectoras permitiendo el libre desarrollo de los colonizadores (Donoso &

Saldarriaga, 2009).

3.3.4. Composición microbiana de biopelículas en tuberías de agua potable

La composición microbiana de biopelículas en tuberías de agua potable es muy

diversa, entre los microorganismos más comunes se encuentran: diatomeas, algas,

bacterias heterotróficas, coliformes, bacterias oportunistas, arqueobacterias y hongos.

Dicha composición varía en biopelículas y aún no se conocen todos los tipos de

microorganismos que existen en las tuberías, ni la distribución de los mismos por

varias razones entre ellas se incluyen la imposibilidad de recuperación de muchos

microorganismos (Diaz, 2011).

Salud humana

Los microorganismos que comprometen la salud humana han captado la mayor

atención e interés en investigación, ya que bacterias patógenas responsables de

enfermedades gastrointestinales han sido identificadas en biopelículas de tuberías de

distribución de agua potable. La disentería, gastroenteritis y fiebre tifoidea son

producidas por las siguientes especies que se han encontrado presentes en los

sistemas de distribución de agua potable: Shigella spp, Yersinia enterocolitica,

Campylobacter jejuni, Salmonella spp, Escherichia coli y Helicobacter pylori. Esto

implica un riesgo importante para los consumidores que debe minimizarse.

Los organismos predominantes en las biopelículas de redes de distribución de agua

potable son en su mayoría patógenos potenciales de los géneros Pseudomonas y

Flavobacterium. También pueden estar presentes otros organismos patógenos como






22

es el caso de Legionella pneumophila, que es causante de neumonía y se ha aislado

de tuberías de látex, etileno, polipropileno, polietileno, PVC y acero.

Las micobacterias también pueden estar presentes, puesto que tienen gran

importancia en la salud humana porque las especies Mycobacterium avium y P.

aeruginosa son causantes de enfermedades pulmonares, y afectan en mayor medida

a pacientes con diabetes (Donoso & Saldarriaga, 2009).

Las bacterias oportunistas, organismos que pueden causar enfermedades

comprometiendo el sistema inmune, también se han encontrado en tuberías de agua

potable. Entre ellas se encuentran: Legionella spp, Pseudomonas aeruginosa, y

algunas especies del género Klebsiella, entre otras. Entre los coliformes (totales y

fecales), se encuentran unos de los microorganismos importantes a nivel de salud

pública por su causalidad en enfermedades gastrointestinales, tal como Escherichia

coli (EPA, 1992).

Algunos estudios han podido identificar también otros organismos presentes en

biopelículas tales como hongos y protozoos, entre otros. A continuación se realizara

una revisión bibliográfica de los microorganismos encontrados en biopelículas.

Bacterias

En las biopelículas que se forman en las redes de distribución, la mayoría de las

bacterias son Gram negativas, mientras que la mayoría de las bacterias que se

encuentran libres en el agua son Gram positivas. Esta diferencia de distribución

posiblemente se debe a la protección extra que tienen las bacterias al vivir en la

biopelícula. Debido a las condiciones ambientales y a la acción de los desinfectantes

una bacteria Gram negativa tiene mayores dificultades para vivir libre en el agua de la

tubería y por esta razón se encuentran en comunidades microbianas incrustadas en

las paredes del material de la tubería realizando relaciones simbióticas.

La Aeromonas hydrophila es una bacteria gram negativa y patógena oportunista para

los humanos. Normalmente se encuentra en aguas superficiales y en los sistemas de






23

distribución de agua potable. Tiene capacidad de adherirse y formar biopelículas en

tuberías de acero inoxidable, cobre y polibutileno (Donoso & Saldarriaga, 2009).

La Figura 3.3.4.A. muestra bacterias en biopelículas identificadas en el estudio de

Qing, Xin-hua, & Ya-nan, 2009. Fueron identificados los géneros Pseudomonas,

Chryseobacterium, Stomatococcus y Escherichia.

Figura 3.3.4.A. Bacterias en biopelículas mediante microscopía óptica.10

Bacterias anaerobias, que utilizan el sulfato o sulfuro como aceptor de electrones para

metabolizar compuestos orgánicos, han sido encontradas comúnmente en la parte

interna de biopelículas y son causantes de corrosión en las tuberías metálicas; existen

aproximadamente dieciocho géneros de estos organismos y están divididos en dos

grandes grupos: las que utilizan acetato como fuente de energía (Desulfovibrio,

Desulfomonas, Desulfomaculum, Desulfobulbus), y las que utilizan otros compuestos

(Desulfobacter, Desulfococcus, Desulfosarcina y Desulfonema) (Diaz, 2011).

Hongos

Para que los hongos puedan desarrollarse en los sistemas de distribución de agua

potable, se requiere la presencia de otros microorganismos. En biopelículas se han

10 (Qing, Xin-hua, & Ya-nan, 2009)






24

encontrado hongos que se relacionan con bacterias y conforman relaciones

mutualistas que los ayudan a sobrevivir. Estas biopelículas tienen una gran diversidad

y características especiales en la flora microbiana. La gran mayoría de los hongos se

encuentran incrustados en la biopelícula y en forma de esporas.

El estudio realizado por Siqueira, Oliveira, Santos, & R. Russell M. en 2011, encontró

hongos filamentosos en biopelículas de redes de distribución de agua potable en un

caso de estudio en Brasil. Principalmente se encontraron los hongos de géneros:

Aspergillus, Cladosporium, Epicoccum, Penicillium, Trichoderma, Acremonium,

Exophiala y Phialophora. Dicho estudio utilizó técnicas moleculares para la

identificación de los hongos como FISH, en conjunto con técnicas tradicionales de

cultivo y microscopia óptica.

Las Figuras 3.3.4.B. y 3.3.4.C. muestran hongos encontrados en el sistema de

distribución de agua potable mediante microscopía óptica y crecimiento en cajas de

Petri en medios selectivos para hongos, respectivamente.

Figura 3.3.4.B. Penicillium brevicompacum y Trichoderma spp. identificados en agua potable mediante

microscopía óptica en azul de lactofenol.11

11 (Siqueira, Oliveira, Santos, & R. Russell M., 2011)






25

Figura 3.3.4.C. Penicillium brevicompacum y Penicillium aurantiogriseum en cajas de Petri de medio

MEA.12

La Figura 3.3.4.D. muestra el crecimiento de hongos en una tubería de hierro en una

red de distribución de agua potable.

Figura 3.3.4.D. Crecimiento de hongos en cajas de Petri en medio NGRBA.13

12 y 13 (Siqueira, Oliveira, Santos, & R. Russell M., 2011)






26

Protozoos

Gracias a su diversidad, es muy probable encontrar microorganismos de este tipo

presentes en las biopelículas de las redes de distribución de agua potable; algunos de

estos podrían ser patógenos, por lo que es importante conocer su funcionamiento y

sus características para poder controlarlos. Los principales protozoos patógenos

encontrados en las redes de distribución pertenecen a los géneros: Cryptosporidium,

Giardia, Acanthamoeba, Toxoplasma y Cyclospora (Donoso & Saldarriaga, 2009).

A pesar de que los protozoos se encuentren en las biopelículas, en muchos casos no

se pueden desarrollar en estas, ya que necesitan un huésped para desarrollarse, por

ejemplo la Acanthamoeba es común en los sistemas de distribución y es la causante

de diferentes infecciones de ojos y de encefalitis crónica.

Por otro lado, los protozoos pueden servir de huéspedes a bacterias y virus que se

encuentran en el agua, aumentando la posibilidad de contaminación y de transmisión

de enfermedades.

También los protozoos son consumidores de bacterias, por lo que juegan un papel

importante en el equilibrio de la biopelícula. Se han encontrado protozoos por

momentos cortos sobre la superficie, lo que sugiere que llegan a la superficie de la

biopelícula, se alimentan y luego se desprenden, pero también se han encontrado

diferentes protozoos completamente adheridos e inmersos en la biopelícula. Es

importante tener en cuenta esta dinámica para entender el comportamiento de la

biopelícula, ya que afecta el equilibrio de los nutrientes y la cantidad de

microorganismos, la cual está directamente relacionada con la densidad de bacterias

que haya en el sistema (Donoso & Saldarriaga, 2009).

La presencia de protozoos en las biopelículas puede servir como indicador de la

presencia de otros microorganismos, por ejemplo se conoce que varios protozoos

están asociados con bacterias patógenas como Legionella spp.






27

Otros microorganismos presentes en biopelículas

Los virus necesitan un huésped específico para poder desarrollarse, y por lo tanto

estos se pueden acumular en las biopelículas, pero no crecer directamente en ellas.

Las biopelículas pueden protegerlos de la acción de los desinfectantes y así ayudar a

que estos sobrevivan por más tiempo.

Algunos virus importantes relacionados con la fuente de agua potable son: Poliovirus

(poliomelitis), el virus de la hepatitis A y el virus de la hepatitis B (Donoso &

Saldarriaga, 2009).

Diferentes macroinvertebrados pueden colonizar los sistemas de distribución:

nematodos, gusanos, larvas de insectos, rotíferos y pequeños crustáceos. Estos

organismos tienen necesidades nutricionales bastante específicas, por lo que su

supervivencia en los sistemas de distribución no es fácil. Algunos se alimentan de

bacterias que encuentran en la red. Al entrar en los sistemas de distribución y

alimentarse de las bacterias que habitan en este lugar, los invertebrados sirven de

protectores para las bacterias y pueden servir como transporte para que las bacterias

puedan ir de una zona de la tubería a otra.

Algunas algas también pueden ser encontradas en los sistemas de distribución de

agua potable. Las cianobacterias pueden desarrollarse en agua potable y producir

toxinas supremamente peligrosas. En diferentes estudios se han encontrado diferentes

algas o restos de ellas con las biopelículas (Donoso & Saldarriaga, 2009).






28

4. Metodología

4.1. Toma de muestras

Las muestras de biopelícula fueron suministradas por el laboratorio del Centro de

Investigaciones en Ingeniería Ambiental de la Universidad de los Andes (CIIA).

La estudiante de posgrado María Fernanda Díaz tomó las muestras de biopelículas de

tuberías de distribución de agua potable de los municipios de Sogamoso (Boyacá),

Duitama (Boyacá) y Bogotá D.C. (Cundinamarca).

Para la toma de muestras se siguió un procedimiento que garantizó el manejo óptimo

de la biopelícula. El protocolo de muestreo a seguir es el propuesto por (Pérez, 2010):

1. Programación para toma de muestras

2. En campo, se tomó el material de la tubería o accesorio, diámetro, planta que

abastece el sector, dirección de flujo, dirección del lugar y apariencia física de

la muestra a tomar.

3. Se realizó el raspado directo sobre la tubería y accesorios en la parte de abajo,

en los lados y arriba, para obtener una muestra compuesta.

4. Las muestras se tomaron con espátulas y bajalenguas que fueron esterilizados

previamente con el fin de evitar cualquier interferencia en los ensayos. De igual

manera, se almacenaron en bolsas Ziploc® y botellas ámbar completamente

estériles que, posteriormente fueron guardadas en nevera de laboratorio.14

4.1.1. Sogamoso (Boyacá)

El municipio de Sogamoso cuenta con un sistema de acueducto, que se abastece de

tres fuentes naturales de captación de agua, el río Tejar y el pozo profundo La

Esperanza que surten la planta de tratamiento El Mode, y el lago de Tota que surte las

14 (Diaz, 2011)






29

plantas de tratamiento del Sur y Chacón, siendo esta última la más importante del

municipio. La red de distribución está conformada por diferentes tipos de materiales

tales como PVC, Asbesto-Cemento, ACCP (Tubos de concreto tipo cilindro de acero

con refuerzo de varilla), Hierro Galvanizado y Acero, con diámetros que varían de 2 a

16 pulgadas (Rodriguez, Lemus, & Moreno, 2011). La biopelícula utilizada en este

estudio fue obtenida de tubería de hierro galvanizado de 2.5 pulgadas, el 26 de

Septiembre de 2011. Esta tubería tiene una edad aproximada de 25 a 30 años.

La Figura 4.1.1. muestra la tubería de la cual se extrajo la biopelícula y un

acercamiento donde se observa la biopelícula adherida al tubo de Hierro Galvanizado.

Figura 4.1.1. Biopelícula en tubería de Hierro Galvanizado. Sogamoso (Boyacá)15

15 Fotografías de María Fernanda Díaz.






30

4.1.2. Bogotá (Cundinamarca)

El Acueducto de Bogotá realiza la gestión integral del recurso hídrico, la cual inicia

desde la captación de las fuentes de agua superficial utilizadas en los diferentes

sistemas de abastecimiento, pasando luego, por los sistemas matrices de acueducto y

de distribución, garantizando el suministro de agua en las viviendas, industrias e

instituciones existentes en el entorno urbano de la capital, para ser posteriormente

recogida, después de ser utilizada, y ser transportada hasta la planta de tratamiento de

aguas residuales PTAR Salitre para su posterior vertimiento al Río Bogotá (Acueducto

de Bogotá ). La zona 1 del sistema matriz de distribución comprende la parte norte de

la ciudad, en las localidades de Suba y Usaquén. De esta zona fue obtenida la

biopelícula para este estudio en una tubería de asbesto cemento de 4 pulgadas el 5 de

Diciembre de 2011 en la Cra 6 # 127 B – 23. La Figura 4.1.2. muestra la biopelícula

adherida a la tubería.

Figura 4.1.2. Biopelícula en tubería de asbesto cemento. Bogotá (Cundinamarca)16

16 Fotografías de María Fernanda Díaz






31

4.1.3. Duitama (Boyacá)

Las tres plantas de tratamiento de agua potable que abastecen la zona urbana son:

Planta del Surba, La Milagrosa y Boyacogua, cuentan con tuberías de asbesto

cemento en la red matriz de 6 a 8 pulgadas de diámetro. El sistema de abastecimiento

utiliza un sistema de bombeo desde el Río Chicamocha con cota 2485 msnm hasta la

Planta de La Milagrosa, ubicada en el Cerro del mismo nombre, desde cuatro pozos

profundos a este mismo cerro, y desde el pozo profundo Rafael Reyes ubicado en el

Colegio Rafael Reyes hasta el Cerro La Alacranera, donde se efectúa un tratamiento

de aireación. Existe una línea de 8” de diámetro para bombeo desde el pozo El Mirto

ubicado en el Barrio Simón Bolívar hasta la Planta de Tratamiento del Surba para

reforzar el sistema en época de verano, con un caudal de 30 lps (Empoduitama, 2009).

La biopelícula obtenida en esta red se encontraba adherida a una tubería de asbesto

cemento de 2 pulgadas de diámetro y fue recuperada el 3 de Noviembre de 2012.

La Figura 4.1.3. muestra la excavación para obtener la biopelícula y el interior de la

tubería con la biopelícula adherida.

Figura 4.1.3. Biopelícula en tubería de Asbesto Cemento. Duitama (Boyacá)17

17 Fotografías tomadas por María Fernanda Díaz






32

4.2. Ensayos preliminares

Con el fin de complementar la información obtenida mediante las imágenes de

microscopia electrónica de barrido, se decidió realizar ensayos microbiológicos

preliminares. Por un lado, se utilizaron los resultados del crecimiento de biopelículas

en cajas de Petri con medio R2A de la estudiante de maestría en ingeniería ambiental

de la Universidad de los Andes, María Fernanda Díaz, y adicionalmente se realizaron

láminas en fresco y tinciones de Gram de muestras de las biopelículas utilizadas en

este estudio, que posteriormente se analizaron mediante microscopia óptica.

4.2.1. Cultivo de microorganismos de biopelículas en medio R2A

El agar R2A es un medio de cultivo desarrollado para cultivar bacterias que

normalmente habitan en agua potable, estas bacterias tienden a ser de crecimiento

lento y por esta razón se desarrolló este medio de cultivo, que es nutritivamente pobre

para que especies de crecimiento más rápido no supriman o desplacen el crecimiento

de estas bacterias. Su composición principal consta de agar, piruvato de sodio, sulfato

de magnesio, fosfato dipotásico, almidón soluble, dextrosa, extracto de levadura, ácido

de casamino y proteosa peptona (Acumedia , 2009).

Se realizaron siembras de las diferentes biopelículas en cajas de Petri con medio R2A

para verificar la existencia de microorganismos en la biopelícula. La Figura 4.2.1.

muestra las diluciones que se realizaron a las biopelículas para su posterior cultivo.






33

Figura 4.2.1. Biopelículas en tubos de ensayo para sembrar en cajas de Petri.18

Estas siembras se incubaron a una temperatura de 30-35°C durante 72 horas y en

condiciones anaerobias y aerobias para observar el crecimiento.

4.2.2 Tinciones de Gram y láminas en fresco

Tinciones de Gram

Las tinciones de Gram se realizaron conforme el protocolo formulado por Alfaro, 2009

que consiste en los siguientes pasos:

1. Preparar el frotis de biopelícula y fijar a la lámina por medio de calor.

2. Colocar la preparación de biopelícula con la solución de cristal violeta

sumergirla durante 1 minuto.

3. Cubrir el frotis durante el lavado con solución lugol durante 1 minuto.

4. Escurrir y decolorar con alcohol hasta que no arrastre más cristal violeta.

5. Lavar con agua destilada.

6. Contrastar con la solución safranina.

7. Lavar con agua destilada y secar a temperatura ambiente.

8. Observar con el microscopio óptico a una magnificación de 40x y

posteriormente, con una gota de aceite de inmersión en objetivo 100x.







34

Láminas en fresco

Para realizar la visualización de las láminas de biopelícula en fresco, se siguieron los

siguientes pasos:

1. Preparar el frotis de biopelícula adicionar una gota de agua destilada.

2. Observar con el microscopio óptico a una magnificación de 40x y

posteriormente, con una gota de aceite de inmersión en objetivo 100x.

4.3. Preparación de las muestras para análisis MEB y EDS

El protocolo de preparación de las muestras fue el presentado por Romero, 2003 que

consiste en los siguientes pasos:

4.3.1. Muestras de biopelícula

Fijación: El proceso de fijación busca estabilizar y mantener las estructuras y el

contenido químico de las células, de tal forma que sus componentes celulares

mantengan las mismas características que cuando dicho tejido estaba vivo. Para evitar

la acción ácida de los fijadores, se introduce la solución amortiguadora que equilibró la

presencia de sustancias ácidas o básicas para que mantuviese el pH dentro de los

límites fisiológicos.

Deshidratación: Las muestras de tejidos o estructuras blandas que se analizaron

mediante MEB, debieron ser deshidratadas antes de su introducción al microscopio

para evitar cambios morfológicos causados por una deshidratación repentina, razón

por la cual, se realizaron lavados progresivos, con una serie de alcohol etílico de

graduación creciente (50%, 70%...100%), dejando actuar el alcohol por períodos de

15 minutos y lavando entre las aplicaciones de alcohol con agua destilada para evitar

la formación de sales que impedirían la visualización en el microscopio electrónico.






35

Secado de punto crítico: La baja presión en la cámara se utilizó para que cualquier

líquido volátil se evaporara y emigrara súbitamente; esto unido a las fuerzas de

tensión superficial asociadas a la salida del agua de la muestra pudieron alterar,

deformar y/o destruir su estructura. Una solución a este inconveniente es que durante

el proceso de secado se pasó el límite entre la fase "líquido-gas". Esto se logró

mediante el secado de punto crítico, en el cual el líquido pasó directamente a la fase

gaseosa. De este modo las fuerzas de deformación se obviaron, ya que el proceso de

secado tiene lugar por encima del punto crítico del líquido, donde el límite entre la

fase líquida y la fase gas no existe. Pero, según los valores de presión y temperatura

crítica del agua (228.5 bar y 373.95 ºC) una muestra que contiene agua no puede ser

secada por el método de punto crítico ya que valores tan altos de presión y

temperatura la destruirán; por lo tanto, la muestra fue tratada con un fluido transicional

(dióxido de carbono) cuyos valores de punto crítico son más favorables durante el

proceso de extracción de humedad, 73.8 bar y 31 ºC.

Montaje de la muestra sobre los portamuestras: Se realizó el montaje sobre

monedas para mejorar la conducción de la muestra.

Recubrimiento con oro: Consistió en el depósito de una película fina de material

conductor (oro) sobre un substrato (muestra de biopelícula) en condiciones de baja

presión (10-4 Torr). Gracias a la baja presión, las moléculas de metal se mueven

desde la fuente de evaporación (blanco de oro) hasta la superficie a revestir, sin

encontrar resistencia del aire u otras partículas gaseosas.

Esta técnica se empleó para la obtención de imágenes de electrones secundarios, ya

que el oro es uno de los materiales que origina mayor emisión, conduciendo a

mejores resultados.

Luego de esta preparación se pudo llevar las muestras de biopelícula al microscopio

de barrido electrónico para la producción de imágenes y análisis composicionales.

La Figura 4.3.1.A. Muestra el proceso anteriormente descrito mediante un diagrama

de flujo.






36

Figura 4.3.1.A. Diagrama de flujo empleado para el análisis de biopelículas en MEB.

La Figura 4.3.1.B. muestra las biopelículas del laboratorio del Centro de

Investigaciones en Ingeniería Ambiental (CIIA) luego de ser extraídas de la tubería de

agua potable y almacenadas en bolsas Ziploc® en un refrigerador a 4°C.

Para cada muestra llevada al microscopio electrónico de barrido fue requerido 1 gr de

biopelícula.






37

Figura 4.3.1.B. Biopelículas almacenadas en el laboratorio del CIIA. Almacenamiento de biopelículas en

bolsas Ziploc® (izq.) y acercamiento al interior de la bolsa Ziploc® (der.) Biopelícula de Sogamoso,

Bogotá D.C. y Duitama respectivamente.

Posteriormente se realizó la preparación de la solución amortiguadora y la solución

fijadora mediante los reactivos mostrados en la Figura 4.3.1.C.






38

Figura 4.3.1.C. Reactivos utilizados en la preparación de las muestras. Sacarosa, CaCl2, NaOH2PO4 y

NaOH respectivamente.

Al finalizar las deshidrataciones las 8 muestras de biopelícula fueron llevadas al

microscopio electrónico de barrido de la Universidad de los Andes.

La Figura 4.3.1.D. muestra las biopelículas deshidratadas listas para llevar al

laboratorio de microscopia electrónica.

Figura 4.3.1.D. Biopelículas en tubos Eppendorf después de la fijación y deshidratación.






39

4.4. Microscopia electrónica de barrido y EDS

El secado de punto crítico se realizó mediante el equipo SAMDRI®-795 del laboratorio

de microscopia electrónica de la Universidad de los Andes (ver Figura 4.4.A.). Este es

un equipo que mediante una serie de etapas de procesamiento, logró estabilizar y

preservar la delicada estructura tridimensional de las muestras de biopelículas.

Figura 4.4.A. Secador de punto crítico SAMDRI®-795. Universidad de los Andes.19

Posteriormente, las muestras fueron llevadas al metalizador para su recubrimiento con

oro, ya que uno de los requisitos para observar muestras en el MEB (en alto vacío) es

que sean conductoras de corriente eléctrica, para que no se carguen causando la

desviación del haz de electrones. Entonces, sí la muestra no es conductora se le debe

aplicar un recubrimiento con un material conductor, como el carbono o el oro. El

metalizador Desk® IV proporciona un recubrimiento de grano fino (100Å) uniforme y

conductor, en un solo ciclo de revestimiento. Así este procedimiento consistió en

depositar de una película fina de oro sobre la muestra de biopelícula, en condiciones

de baja presión (10-4 Torr). Esta técnica se emplea para la obtención de imágenes de

electrones secundarios, ya que el oro es el material que origina una mayor emisión,

conduciendo a mejores resultados (Langebaek & Gutierrez, 2012).

19 (Langebaek & Gutierrez, 2012)






40

Para esto se utilizó un metalizador Dentom Vacuum Desk IV propiedad de la

Universidad de los Andes (ver Figura 4.4.B.)

Figura 4.4.B. Metalizador Dentom Vacuum Desk IV. Universidad de los Andes.20

Las muestras de biopelícula al finalizar la metalización (ver Figura 4.4.C.) deben

posicionarse sobre monedas para que la superficie sea conductora.

Figura 4.4.C. Muestras de biopelículas sobre monedas para visualización en el microscopio electrónico

de barrido.







41

El microscopio electrónico de barrido utilizado en este estudio es un JSM-6490LV (ver

Figura 4.4.D.) perteneciente al laboratorio de microscopia electrónica de la

Universidad de los Andes. Es un microscopio versátil y de alta resolución: de 3.0 nm

en el modo de alto vacío y 4.0 nm en el modo de bajo vacío. El modo de bajo vacío

permite la observación y análisis de muestras no conductivas, húmedas o no

compatibles con el alto vacío.

Figura 4.4.D. Microscopio electrónico de barrido JSM-6490LV. Universidad de los Andes.21

El microscopio tiene integrado un sistema de microanálisis por espectroscopía de

dispersión de energía de rayos X, EDS (Energy Dispersive X-ray Spectroscopy).

Modelo Inca Energy 250 EDS System LK-IE250 de Oxford (ver Figura 4.4.E.), con un

detector de silicio para elementos ligeros y resolución de 138eV que obtiene

resultados cuando el haz de electrones incide sobre la superficie de la muestra, se

produce la ionización (pérdida de electrones internos) de los átomos presentes. En

este estado un electrón de una capa más externa salta a ocupar el hueco originado.

Este salto produce una liberación de energía, equivalente a la diferencia entre las

energías que tenía cada electrón en su orbital correspondiente. Esta energía de rayos

X es única para cada elemento. Al representar la intensidad de esta radiación

electromagnética frente a su energía, se adquiere un espectro de rayos X, compuesto







42

por una serie de picos, denominados líneas de intensidad variable, que se conocen

como rayos X característicos (Langebaek & Gutierrez, 2012).

Figura 4.4.E. Sistema de microanálisis por espectroscopía de dispersión de energía de rayos X modelo

Inca Energy 250 EDS System LK-IE250 de Oxford. Universidad de los Andes.22

El análisis EDS se realizó durante 2 minutos a diferentes magnificaciones para

identificar diferencias en los resultados del análisis químico en la biopelícula.







43

5. Resultados y análisis

5.1. Cultivo de microorganismos de biopelículas en medio R2A


La Figura 5.1.1. muestra el crecimiento microbiano que presentó la biopelícula del

municipio de Sogamoso. Debido a la forma de crecimiento de las bacterias no fue

posible contabilizar el número de colonias. Esto pudo deberse a malas prácticas de

siembras y diluciones. Por esta razón la única información que se puede obtener de

estos cultivos es que efectivamente hay un crecimiento microbiano en las biopelículas.

Este tipo de crecimiento podría indicar la presencia del género Bacillus.

Figura 5.1.1. Crecimiento de microorganismos de biopelículas de Sogamoso en cajas de Petri.23

22 y 23 Fotografías tomadas por María Fernanda Díaz






44


La Figura 5.1.2. muestra el crecimiento microbiano que presentó la biopelícula del

municipio de Duitama.

Figura 5.1.2. Crecimiento de microorganismos de biopelículas de Duitama en cajas de Petri.23

Se puede observar la parte frontal de la caja de Petri y la parte posterior donde se

observa crecimiento de bacterias. En este crecimiento microbiano tampoco es posible

contabilizar colonias y la información que se obtiene de ellas es que efectivamente hay

bacterias presentes en la biopelícula, nuevamente con probabilidad de que se trate de

Bacillus sp.

5.1.3. Bogotá D.C. (Cundinamarca)

La Figura 5.1.3.A. muestra el crecimiento que presentó la biopelícula obtenida en la

tubería de Bogotá D.C. donde se observa la parte frontal y posterior de las cajas de

Petri. En este crecimiento microbiano no es posible contabilizar el número de unidades

formadoras de colonias (UFC), aunque se evidencia una posible presencia de

bacterias en la biopelícula.






45

Figura 5.1.3.A. Crecimiento de microorganismos de biopelículas de Bogotá D.C. en cajas de Petri24

.

Sin embargo, estos resultados podrían no ser concluyentes respecto a la presencia de

bacterias en las biopelículas, debido a contaminación. En la Figura 5.1.3.B. se

observa una caja de Petri donde no se cultivaron microorganismos (control negativo)

de la biopelícula, y aun así se observa crecimiento de bacterias. Esto pudo ocurrir por

contaminación de la caja de Petri o malas prácticas al sembrar las diluciones.







46

Figura 5.1.3.B. Control negativo de crecimiento microbiano en biopelículas.25

5.2. Laminas en fresco y tinciones de Gram de biopelículas

5.2.1. Tinciones de Gram

Sogamoso (Boyacá)

La Figura 5.2.1.A. muestra láminas teñidas mediante tinción de Gram en microscopia

óptica para la biopelícula de Sogamoso para ampliaciones de 40x (arriba) y 100x

(abajo). Debido a la gran cantidad de sedimentos y precipitados minerales que tiene la

biopelícula por el material del cual está compuesta la tubería (hierro galvanizado), no

fue posible observar una buena tinción masiva de la lámina. Sin embargo algunos

pequeños lugares se tiñeron de color fucsia lo que podría indicar presencia de

bacterias Gram negativas.







47

Figura 5.2.1.A. Tinción de Gram en biopelículas de Sogamoso (Boyacá) observadas en microscopia

óptica.

Bogotá D.C. (Cundinamarca)

La Figura 5.2.1.B. muestra la tinción de Gram realizada a la biopelícula de Bogotá

D.C. se puede observar que la lámina se tiñó de color fucsia y pueden observarse

estructuras similares a bacterias Gram negativas en forma de cocos. La magnificación

fue de 40x en las imágenes de arriba y 100x en las de abajo.






48

Figura 5.2.1.B. Tinción de Gram en biopelículas de Bogotá D.C. (Cundinamarca) observadas en

microscopia óptica.

Duitama (Boyacá)

La Figura 5.2.1.C. muestra la tinción de Gram realizada a la biopelícula de Duitama

(Boyacá), en donde nuevamente se pueden observar partes teñidas de color fucsia,

aunque se evidencian también gran cantidad de precipitados inorgánicos que no se

tiñeron. Las imágenes de arriba tienen una magnificación de 100x mientras las de

abajo tienen magnificación 40x.






49

Figura 5.2.1.C. Tinción de Gram en biopelículas de Duitama (Boyacá) observadas en microscopia óptica.

Aunque no de manera concluyente, se podría inferir que hay presencia de bacterias

tanto Gram negativas como Gram positivas en las tres muestras de biopelícula, lo cual

además estaría en concordancia con lo revisado en el marco teórico de este trabajo y

algunas de las observaciones en el análisis de las imágenes de MEB.

5.2.2. Láminas en fresco

Bogotá (Cundinamarca)

La Figura 5.2.2.A. muestra imágenes mediante microscopia óptica de la biopelícula

obtenida de la red de distribución de agua potable de Bogotá D.C. donde pueden

observarse en su mayoría sedimentos de color café compuestos de minerales.






50

Figura 5.2.2.A. Láminas en fresco de biopelícula de Bogotá (Cundinamarca) observadas en microscopia

óptica.

Duitama (Boyacá)

La Figura 5.2.2.B. muestra imágenes mediante microscopia óptica de biopelícula

obtenida de la red de distribución de agua potable de Duitama (Boyacá), donde se

observan sedimentos. En la tercera imagen se observa una fibra de asbesto, debido al

material de la tubería (asbesto cemento).






51

Figura 5.2.2.B. Láminas en fresco de biopelícula de Duitama (Boyacá) observadas en microscopia óptica.

Sogamoso (Boyacá)

La Figura 5.2.2.C. muestra imágenes mediante microscopia óptica de biopelícula

obtenida de la red de distribución de agua potable de Sogamoso (Boyacá). donde se

observan sedimentos. Se pueden observar algunas zonas teñidas de color morado lo

que podría indicar quizá la presencia de bacterias Gram positivas.






52

Figura 5.2.2.C. Láminas en fresco de biopelícula de Sogamoso (Boyacá) observadas en microscopia

óptica.

5.3 Imágenes de microscopia electrónica de barrido (MEB) en biopelículas

Específicamente, un MEB suministra información morfológica, topográfica y

composicional de las muestras, gracias a la interacción de los electrones con la

superficie de la muestra y a los fenómenos que allí se producen, a continuación se

muestran algunas de las imágenes obtenidas mediante esta técnica.






53


La Figura 5.3.1.A. muestra 2 imágenes de biopelícula a una magnificación de 20000x

y 10000x respectivamente, el acercamiento que se realizó en esta muestra se hizo con

el objetivo de resaltar la comunidad de microorganismos agrupados. En la imagen de

la izquierda se pueden observar lo que parecen ser cocos bacterianos unidos, como

se ha reportado en diversos estudios, para optimizar el desarrollo de la biopelícula. A

la derecha pueden observarse además otras estructuras de la biopelícula como lo son

precipitados y partículas provenientes del material de la tubería.

Figura 5.3.1.A. Imagen de biopelícula de Sogamoso (Boyacá) mediante MEB.

En la Figura 5.3.1.B. pueden observarse nuevamente imágenes de la biopelícula

obtenida en el municipio de Sogamoso (Boyacá), en este caso la magnificación fue de

2500x y 10000x respectivamente. En la imagen de la izquierda puede observarse lo

que parece ser la matriz extracelular de la cual se valen los microorganismos para

persistir en la biopelícula, con pequeños orificios que las bacterias utilizan para

ayudarles a protegerse de la acción desinfectante de los químicos utilizados en la

potabilización del agua. La imagen de la derecha muestra la magnificación de dichos

orificios de la matriz extracelular donde se pueden identificar lo que probablemente

sean bacterias de estructura cocal y precipitados de hierro inorgánicos provenientes

de la tubería de hierro galvanizado.






54

Figura 5.3.1.B. Imagen de biopelícula de Sogamoso (Boyacá) mediante MEB.

La Figura 5.3.1.C. muestra imágenes de microscopia electrónica de barrido en

biopelículas del municipio de Sogamoso (Boyacá) donde se aprecian dos imágenes de

22000x de magnificación en las que se observan posibles comunidades de bacterias

en forma de cocos aglomeradas, conformando la biopelículas, y estructuras que

parecen ser precipitados y partículas inorgánicas.

Figura 5.3.1.B. Imagen de biopelícula de Sogamoso (Boyacá) mediante MEB.

Se puede concluir que al parecer los microorganismos más abundantes en esta

biopelícula son las bacterias en forma de cocos, que se identificaron en todas las

imágenes. Como se puede apreciar la observación de microorganismos con esta






55

técnica es compleja, puesto que las imágenes obtenidas muestran una gran cantidad

de estructuras que no se pueden reconocer, impidiendo una mejor visualización de los

microorganismos.

5.3.2. Bogotá D.C. (Cundinamarca)

La Figura 5.3.2.A. muestra 2 imágenes de microscopía electrónica de barrido en

biopelículas de Bogotá D.C. a una magnificación de 22000x y 300x respectivamente.

En la imagen de la izquierda se observan fibras de asbesto provenientes de la tubería

de asbesto cemento y algunos precipitados inorgánicos donde no se logran observar

claramente los microorganismos. A la derecha se observa una toma general de la

biopelícula donde se logran observar algunos microorganismos que posiblemente

sean bacterias de estructura tanto bacilos como cocos. Estas conclusiones se apoyan

en lo obtenido en las imágenes de microscopia óptica en las láminas en fresco y las

tinciones de Gram como también en lo reportado en la literatura para biopelículas de

tuberías de agua potable.

Figura 5.3.2.A. Imagen de biopelícula de Bogotá (Cundinamarca) mediante MEB.

En el caso de la Figura 5.3.2.B. pueden observarse dos imágenes de microscopia

óptica en la biopelícula extraída de la red secundaria de agua potable de la ciudad de

Bogotá D.C. (Cundinamarca) de una magnificación de 10000x y 22000x, en donde en






56

la imagen de la derecha se observan nuevamente fibras de asbesto y precipitados

inorgánicos y en la imagen de la izquierda se pueden identificar posibles bacterias de

estructura cocal aglomeradas conformando la biopelícula.

Figura 5.3.2.B. Imagen de biopelícula de Bogotá (Cundinamarca) mediante MEB.

En su mayoría se encontraron precipitados y partículas inorgánicas en las imágenes

de microscopia electrónica de barrido para esta biopelícula en tubería de asbesto

cemento. Se encontraron además una gran cantidad de fibras de asbesto lo cual

sugiere un riesgo adicional en la formación de biopelículas de este tipo de tuberías

debido a que las fibras de asbesto son tóxicas y podrían ser ingeridas por los

consumidores de agua potable en la ciudad. Adicional a esto se pudieron observar

algunos microorganismos de la biopelícula, aunque en menor medida a los

encontrados en la biopelícula de Sogamoso (Boyacá).

Similar a lo ocurrido en las imágenes de la biopelículas anteriores se presentó la

imposibilidad de detectar completamente morfotipos microbianos en la biopelícula,

debido principalmente a la gran cantidad de precipitados y polímero que las bacterias

producen. Esto podría influir en gran medida en su búsqueda y determinación.






57


Figura 5.3.3.A. Imagen de biopelícula de Duitama (Boyacá) mediante MEB.

En la Figura 5.3.3.A. se observan dos imágenes de la biopelícula obtenida de la red

secundaria de agua potable del municipio de Duitama (Boyacá). El material al cual

está adherida la biopelícula es asbesto cemento y por esta razón se observan fibras

de asbesto al igual que en las imágenes de la biopelícula anterior. La imagen de arriba

muestra la biopelícula a una magnificación de 100x donde se muestra una toma






58

general de la biopelícula con fibras de asbesto y algunos precipitados minerales. En la

imagen de abajo se observan en detalle dichas fibras a una magnificación de 22000x.

Debido a que la biopelícula está compuesta por fibras de asbesto principalmente esto

impide que se puedan identificar microorganismos. De acuerdo con la microscopia

óptica, esta biopelícula tendría una cantidad baja de bacterias.

Figura 5.3.3.B. Imagen de biopelícula de Duitama (Boyacá) mediante MEB.

Como puede observarse en la Figura 5.3.3.B. las fibras de asbesto ocupan una gran

cantidad de lugares en la biopelícula. Este desprendimiento de fibras de asbesto

puede deberse a muchos factores; entre ellos puede estar la corrosión del cemento de

la tubería liberando las fibras o la manera en que fue tomada la muestra pudo permitir

el arrastre de fibras. La imagen de la izquierda muestra la biopelícula a una

magnificación de 22000x donde se aprecian fibras de asbesto y algunos precipitados y

partículas. En la imagen de la derecha se observa en detalle una fibra de asbesto a

una magnificación de 200x rodeada por fracciones inorgánicas.






59

Figura 5.3.3.C. Imagen de biopelícula de Duitama (Boyacá) mediante MEB.

La Figura 5.3.3.C. señala la imposibilidad de detectar microorganismos en este tipo de

muestra, compuesta principalmente por fibras de asbesto y partículas minerales. En la

imagen de la derecha se muestra una magnificación de la biopelícula a 22000x donde

se observan fibras de asbesto unidas a la matriz donde se adhieren los

microorganismos y en la imagen de la izquierda, se observa la biopelícula en otro lugar

de la muestra a su vez a una magnificación de 22000x donde también se observan

fibras de asbesto y precipitados inorgánicos impidiendo la visibilidad de la microbiota

que compone la biopelícula.

En la muestra de biopelícula se eligieron varios sitios de interés para ver si toda la

muestra contenía los mismos elementos o existía variación de estos en un cm2. Pero

pudo comprobarse que la composición de la biopelícula es homogénea, principalmente

por la gran cantidad de precipitados y fibras de asbesto que contiene.

5.4. Análisis composicional EDS


La Figura 5.4.1.A. muestra el análisis composicional realizado a la muestra de

biopelícula de Sogamoso (Boyacá). En la parte izquierda de la figura se observa por

medio de una ilustración los lugares donde el software encontró trazas de los químicos






60

(análisis cualitativo). Para el caso de esta biopelícula se observaron varios elementos:

carbono, debido probablemente a la parte orgánica que compone los

microorganismos, así como oxígeno, presente posiblemente por el metabolismo que

estos microorganismos llevan a cabo, hierro debido tal vez a los sedimentos y

precipitados provenientes del material de la tubería, aluminio y cobre provenientes de

la moneda que se utilizó en el montaje para la visualización en el microscopio, y oro,

debido al recubrimiento que se realiza a la muestra para mejorar su conductividad. En

la parte derecha de la imagen puede observarse el lugar de la biopelícula donde se

tomaron los análisis químicos, lo cual concuerda con la ilustración a la izquierda.

Figura 5.4.1.A. Análisis cualitativo EDS de biopelícula de Sogamoso (Boyacá).

Muestra de biopelícula Sogamoso (Boyacá) 09/05/2012 14:34:07

Análisis EDS de biopelícula proveniente de Sogamoso (Boyacá)






61

Figura 5.4.1.B. Histograma espectral de EDS en biopelícula de Sogamoso (Boyacá)

El histograma de la Figura 5.4.1.B. muestra los picos de los elementos químicos

encontrados en la muestra de biopelícula. Se observa que los picos más altos

corresponden al oxígeno y al hierro respectivamente. La gran cantidad de oxígeno

encontrada puede deberse a la respiración aerobia que realizan los microorganismos

presentes en la biopelícula, el hierro se puede explicar probablemente por el material

del cual está compuesta esta tubería (hierro galvanizado) y a algunos de los

sedimentos y precipitados que ocurren por corrosión. Se observan también un pico

importante de carbono sugiriendo la presencia de materia orgánica en la biopelícula.

Finalmente los distintos picos de metales como aluminio y cobre se deben a las

monedas utilizadas en el montaje y oro a la preparación de las muestras.

Muestra de biopelícula de Sogamoso (Boyacá) 09/05/2012 14:34:26

Histograma espectral EDS en biopelícula de Sogamoso (Boyacá)






62

Tabla 5.4.1.A. Tabla del análisis químico EDS en biopelícula Sogamoso (Boyacá)

Elemento App Intensidad Peso % Peso % Atómico %

Conc. Corrn. Sigma

C K 10.73 0.6519 26.10 0.58 43.87

O K 19.01 0.8637 34.90 0.53 44.03

Al K 0.10 0.6777 0.24 0.07 0.18

Fe K 16.19 0.8676 29.59 0.42 10.70

Cu K 0.69 0.8057 1.35 0.19 0.43

Au M 3.80 0.7699 7.82 0.41 0.80

Totales 100.00

La Tabla 5.4.1.A. muestra los resultados cuantitativos anteriormente mencionados en

la muestra de biopelícula, se muestra el porcentaje en peso del elemento químico, el

porcentaje de su peso atómico y la intensidad de kV que reflejaba para cada elemento

la muestra. Se observa que el elemento que presentó mayor cantidad en la muestra es

el oxígeno con un total de 34.90 de % en peso de la muestra, seguido del hierro con

29.59 de % en peso de la muestra y finalmente el carbono con 26.10 de % en peso de

la muestra. Los demás elementos encontrados son despreciables debido a que la

explicación de su presencia es ajena a la naturaleza de la biopelícula.

La composición química de la muestra es relativamente limpia, ya que no se encontró

una gran cantidad de elementos químicos, y los elementos encontrados corresponden

a los encontrados por Haibo, Chun, Xuexiang, Min, & Jiuhui, 2012, en su estudio para

las tuberías de hierro galvanizado.

La Figura 5.4.1.C. muestra el análisis composicional de la muestra de biopelícula de

Sogamoso (Boyacá), en la imagen de la izquierda se muestra una ilustración






63

cualitativa de los elementos químicos encontrados en la muestra, en la que se

encontró principalmente carbono, oxígeno, calcio, silicio, hierro, níquel, cobre y oro.

Como ocurrió en la muestra anterior se observa la presencia de carbono y oxígeno

causados probablemente por la acción metabólica de los microorganismos. El calcio,

el silicio y el hierro se deben probablemente a los minerales que tiene el material de la

tubería de hierro galvanizado, producto de procesos corrosivos. Los metales níquel,

cobre y oro provendrían de la preparación de la muestra para aumentar su

conductividad, por lo cual no se consideran en el análisis. En la imagen de la derecha

se observa el lugar exacto donde se realizó la prueba en la biopelícula, y en el caso

del diagrama cualitativo mostrado por el oxígeno es posible ver la correspondencia de

la imagen. La magnificación utilizada en este análisis es de 2 µm.

Figura 5.4.1.C. Análisis cualitativo EDS de biopelícula de Sogamoso (Boyacá).

Muestra de biopelícula Sogamoso (Boyacá)

09/05/2012 14:39:12

Análisis EDS de biopelícula proveniente de Sogamoso (Boyacá)






64

Figura 5.4.1.D. Histograma espectral de EDS en biopelícula de Sogamoso (Boyacá)

El histograma mostrado en la Figura 5.4.1.D. muestra los picos de los elementos

químicos encontrados en la muestra de biopelícula de Sogamoso (Boyacá). En este

lugar aparecen nuevos elementos que no se encontraron en la anterior muestra, como

por ejemplo el calcio que podría provenir del carbonato de calcio (CaCO3) proveniente

de eventos corrosivos en tuberías de hierro antiguas como lo reportan Haibo, Chun,

Xuexiang, Min, & Jiuhui, 2012. También se encontraron trazas de silicio lo que está de

acuerdo con lo encontrado en el estudio de Teng a, Guan, & Zhu, de 2008, que al

parecer provienen de minerales en incrustaciones en la tubería.

Muestra de biopelícula Sogamoso (Boyacá) 09/05/2012 14:39:22

Histograma espectral EDS en biopelícula de Sogamoso (Boyacá)






65

Tabla 5.4.1.B. Tabla del análisis químico EDS en biopelícula Sogamoso (Boyacá)


Conc. Corrn. Sigma

C K 1.43 0.5102 5.34 0.50 13.24

O K 19.19 1.1822 30.91 0.51 57.50

Si K 0.20 0.7448 0.52 0.10 0.55

Ca K 0.22 1.0330 0.40 0.08 0.30

Fe K 23.28 0.9268 47.84 0.58 25.49

Ni K 0.24 0.8811 0.53 0.18 0.27

Cu K 0.66 0.8515 1.47 0.24 0.69

Au M 5.08 0.7455 12.99 0.58 1.96

Totales 100.00

La Tabla 5.4.1.B. muestra los resultados cuantitativos en porcentaje en peso de cada

elemento encontrado en el análisis químico con EDS, el elemento de mayor

abundancia es el hierro con 47.84 de porcentaje en peso en la biopelícula, seguido del

oxígeno con 30.91 en porcentaje en peso. Estos resultados confirman lo revisado en la

literatura, ya que en esta muestra se encuentra además una pequeña cantidad de

calcio correspondiente a 0.40 porcentaje en peso de la biopelícula proveniente

posiblemente de incrustaciones de calcita.






66


Figura 5.4.2.A. Análisis cualitativo EDS de biopelícula de Duitama (Boyacá).

La Figura 5.4.2.A. muestra el análisis cualitativo EDS de biopelícula obtenida de la red

secundaria de distribución de agua potable del municipio de Duitama (Boyacá). En la

imagen de la derecha se puede observar la presencia de carbono y oxígeno

producidos posiblemente por los microorganismos adheridos a la biopelícula. Se

encontraron también silicio y cloro, el silicio se ha reportado en estudios como el

realizado por Sarin, Snoeyinc, Bebee, Kriven, & A., en 2001 donde estos provienen

Muestra de biopelícula Duitama (Boyacá)

09/05/2012 15:02:14

Análisis EDS de biopelícula proveniente de Duitama (Boyacá)






67

principalmente del agua transportada por la tubería, al igual que el cloro el cual se

debe al desinfectante utilizado en la red.

Se encontró a su vez sodio, lo que puede explicarse por la utilización de la solución

amortiguadora en la preparación de la muestra, que ocasiona la formación de sales

que no se pudieron retirar con los lavados de agua destilada. El estudio realizado por

de Victorica en 1992, sostiene que la matriz producida por los microorganismos para

su sustento constituye una superficie altamente adsorsiva para cationes,

especialmente polivalentes como calcio, zinc, hierro o manganeso, para material

particulado (sedimentos). La imagen de la derecha muestra el lugar donde se realizó el

análisis químico, donde pueden identificarse fibras de asbesto y algunos sedimentos

que los rodean.

Figura 5.4.2.B. Histograma espectral de EDS en biopelícula de Duitama (Boyacá)






68

Tabla 5.4.2.A. Tabla del análisis químico EDS en biopelícula Duitama (Boyacá)


Conc. Corrn. Sigma

C K 1.08 0.4044 9.13 0.96 20.79

O K 6.30 0.7934 27.25 0.78 46.61

Na K 0.21 0.7953 0.91 0.18 1.08

Al K 3.87 0.8523 15.57 0.37 15.79

Si K 0.94 0.8118 3.97 0.20 3.87

Cl K 0.08 0.6765 0.41 0.12 0.31

Ca K 0.30 0.9390 1.10 0.13 0.75

Mn K 2.63 0.8773 10.28 0.37 5.12

Fe K 0.99 0.9051 3.73 0.29 1.83

Au M 6.04 0.7498 27.65 0.84 3.84

Totales 100.00

La Tabla 5.4.2.A. muestra los resultados cuantitativos de composición química de la

biopelícula. Se puede observar que el elemento de mayor abundancia en esta muestra

es el oxígeno con 27.25 de porcentaje en peso, y luego el manganeso y el carbono

con 10.28 y 9.13 de porcentaje en peso, respectivamente. Esta distribución de

abundancia es típica en esta tubería, acorde con lo encontrado en la literatura como

en el estudio de Haibo, Chun, Xuexiang, Min, & Jiuhui en 2012.






69

Figura 5.4.2.C. Análisis cualitativo EDS de biopelícula de Duitama (Boyacá).

Se realizó un análisis adicional de EDS para encontrar la composición química de una

fibra de asbesto. La Figura 5.4.2.C. muestra el análisis cualitativo de los elementos

encontrados, la imagen de la izquierda muestra los diagramas de presencia de su

composición. Adicional a los elementos encontrados en el análisis anterior se encontró

magnesio que podría corresponder a la composición propia de dicha fibra. La imagen

de la derecha muestra en detalle la fibra de asbesto analizada.

Muestra de biopelícula Duitama (Boyacá)

09/05/2012 15:08:35

Análisis EDS de biopelícula proveniente de Duitama (Boyacá)






70

Figura 5.4.2.D. Análisis cualitativo EDS de biopelícula de Duitama (Boyacá).

La Figura 5.4.2.D. muestra el histograma espectral de EDS en una sección de

biopelícula de la red secundaria de distribución de agua potable de tubería de asbesto

cemento en el municipio de Duitama (Boyacá). Se observa que los picos más altos

corresponden a metales como aluminio y oro utilizados en la preparación de las

muestras, la distribución de los demás elementos encontrados corresponde con los

análisis presentados anteriormente.






71

Tabla 5.4.2.B. Tabla del análisis químico EDS en biopelícula Duitama (Boyacá)


Conc. Corrn. Sigma

C K 1.86 0.4399 15.54 0.95 28.08

O K 8.22 0.8131 37.21 0.87 50.48

Na K 0.28 0.7504 1.39 0.19 1.31

Mg K 0.09 0.6963 0.49 0.14 0.43

Al K 2.11 0.8094 9.56 0.29 7.69

Si K 1.37 0.8182 6.17 0.23 4.77

Ca K 0.34 0.9552 1.30 0.14 0.70

Mn K 0.91 0.8440 3.97 0.27 1.57

Fe K 1.93 0.8655 8.20 0.37 3.19

Au M 3.23 0.7349 16.17 0.80 1.78

Totales 100.00

El análisis químico cuantitativo presentado en la Tabla 5.4.2.B. muestra la cantidad de

los elementos encontrados en porcentaje en peso de la muestra, para esta muestra en

particular se analizó una fibra de asbesto en la biopelícula con la siguiente distribución:

el elemento de mayor abundancia encontrado es el oxígeno con 37.21 porcentaje en

peso, seguido del carbono con 15.54 lo que sugeriría una importante actividad

microbiana en esta muestra, seguida por los elementos constitutivos de dicha fibra

como sílice, magnesio, sodio y aluminio.






72

5.4.3. Bogotá (Cundinamarca)

Figura 5.4.3.A. Análisis cualitativo EDS de biopelícula de Bogotá D.C. (Boyacá).

La Figura 5.4.3.A. muestra el análisis cualitativo EDS de biopelícula de la red

secundaria de distribución de agua potable en tubería de asbesto cemento de Bogotá

D.C. (Cundinamarca). Se puede observar en la imagen izquierda la distribución

esquemática de cada elemento en la biopelícula, el análisis detecto carbono, oxígeno,

aluminio, sílice, calcio, hierro y oro. Esta composición se encontró en las muestras

anteriores de manera repetitiva sugiriendo que los análisis son correctos y están

acordes a lo encontrado en la literatura. En la parte izquierda de la imagen se observa

el lugar al cual se le realizó el análisis EDS, donde se pueden observar algunas fibras

Muestra de biopelícula Bogotá D.C. (Cundinamarca)

09/05/2012 15:40:09

Análisis EDS de biopelícula proveniente de Bogotá (Cundinamarca)






73

de asbesto, algunos precipitados inorgánicos y pequeñas colonias de

microorganismos.

Figura 5.4.3.B. Análisis cualitativo EDS de biopelícula de Bogotá (Cundinamarca).

La Figura 5.4.3.B. muestra el histograma espectral del análisis EDS realizado a la

muestra de biopelícula de la ciudad de Bogotá D.C. (Cundinamarca), como se puede

observar se encontró muy poca cantidad de elementos en la muestra esto pudo

haberse debido al poco tiempo al que se sometió el análisis. Los picos más altos los

muestran el oro y sílice producto de la preparación de la muestra y los contenidos del

elemento en el agua respectivamente.

Muestra de biopelícula Bogotá (Cundinamarca) 09/05/2012 15:40:15

Histograma espectral EDS en biopelícula de Bogotá (Cundinamarca)






74

Tabla 5.4.2.A. Tabla del análisis químico EDS en biopelícula Duitama (Boyacá)


Conc. Corrn. Sigma

C K 0.56 0.3001 6.95 1.08 15.89

O K 5.03 0.6931 26.96 0.83 46.25

Al K 0.66 0.9600 2.56 0.15 2.61

Si K 8.36 1.0174 30.47 0.63 29.78

Ca K 0.14 0.8915 0.60 0.13 0.41

Fe K 0.36 0.8887 1.50 0.24 0.74

Au M 5.71 0.6840 30.95 0.89 4.31

Totales 100.00

La Tabla 5.4.2.A. muestra los resultados cuantitativos del análisis EDS de la muestra

de biopelícula de Bogotá (Cundinamarca). Esta cantidad se expresa en porcentaje en

peso y los valores más abundantes corresponden al sílice y oro, seguido del oxígeno y

carbono confirmando que existe actividad microbiológica en la biopelícula.






75

6. Conclusiones y Recomendaciones

6.1. Conclusiones

La técnica de MEB en el análisis de biopelículas es una herramienta útil en el análisis

de este tipo de comunidades, pero se pudo comprobar que no es suficiente para la

caracterización de la misma, debido a que en muchas ocasiones la complejidad en su

composición dificulta la detección de especies microbianas. Es conveniente por lo

tanto realizar determinaciones moleculares y tradicionales en conjunto, para darle una

mayor profundidad y precisión al estudio.

Sin embargo, la técnica es válida para realizar un análisis general de la biopelícula, y

se pudo comprobar según lo revisado en la literatura que la composición microbiana y

la estructura química de las biopelículas en este estudio es común en este tipo de

tuberías. Este método es muy interesante en el estudio de biopelículas porque bien es

sabido que existen microorganismos que son de difícil recuperación y de esta manera

se pueden visualizar, a diferencia de las metodologías tradicionales.

Además, la utilización de esta tecnología en la caracterización de biopelículas es de

gran utilidad porque permite visualizar los mecanismos microscópicos de adhesión de

dicha comunidad microbiana, permitiendo realizar experimentos posteriores en

materiales de tubería para evitar la adhesión de biopelículas.

En estudios posteriores sería útil también, en cuanto a la validación de métodos de

desinfección de biopelículas, caracterizando mediante MEB la biopelícula antes de la

aplicación del método de desinfección y después de la aplicación, para realizar una

comparación de especies resistentes. De esta manera, es posible hacer un mejor

diagnóstico de la red de agua potable (e.g. el tipo de materiales de la tubería para

evitar adhesión de biopelículas), lo que permite tomar una decisión informada sobre si

es necesario remover la biopelícula, y la manera más eficiente de removerla.






76

Los beneficios que tendría este método empleado en la red de agua potable serían: la

mejora en la salubridad para la población, la validación de métodos de desinfección, y

el hallazgo de especies nuevas o de difícil cultivo encontradas, que usando

metodologías tradicionales de cultivo no podrían ser detectadas, además de la

viabilidad técnica y económica del uso de MEB en cuanto a caracterización de

biopelículas.

6.2. Recomendaciones prácticas a la metodología empleada

Se recomienda según lo experimentado en esta tesis realizar lavados con agua

destilada en el proceso de deshidratación de las muestras para evitar la formación de

sales en la biopelícula y así mejorar la visualización de la biopelícula en el

microscopio.

En cuanto al análisis EDS se recomienda realizar este análisis por un tiempo mayor a

2 minutos debido a que es posible algunos elementos no puedan encontrarse en este

lapso de tiempo tan corto.

7. Referencias Bibliográficas

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