Visualización y Manipulación de Moléculas Individuales

Daniel Guerra Giraldez

La Célula como una bolsa de La Célula como una bolsa de reaccionesreacciones

Rutas o redes metabólicas: pueden ser descritas por ecuaciones diferenciales parciales, donde las concentraciones cambian en el tiempo siguiendo un modelo de reacción y difusión.

Ejemplo: modelo de Ejemplo: modelo de Trypanosoma Trypanosoma bruceibrucei

100%

3% 82%

8%

Cuando la célula no es una Cuando la célula no es una bolsa de reaccionesbolsa de reacciones

•Compartametalización•No existe una difusión ideal: concentraciones locales.•Limitaciones técnicas en la determinación de constantes cinéticas.•Efectos de fuerzas, tensiones y torques presentes en la célula pero ausentes en el tubo de ensayo.

Trabajo coordinado de muchas Trabajo coordinado de muchas máquinasmáquinas Hasta los biólogos más serios Hasta los biólogos más serios 

antropomorfizan la maquinaria celularantropomorfizan la maquinaria celular

Cuando la célula no es una Cuando la célula no es una bolsa de reaccionesbolsa de reacciones

El DNA está compactado, pero necesitamos que sea organizado y dinámico!

Tecnología para estudiar Tecnología para estudiar nanomáquinasnanomáquinas VERVER

MEDIRMEDIR

• MANIPULARMANIPULAR

• MEDIRMEDIR

Tecnología para estudiar Tecnología para estudiar nanomáquinasnanomáquinas

VisualizaciónVisualización Cristalografía Cristalografía  NMRNMR Microscopía electrónicaMicroscopía electrónica Microscopía de fuerza Microscopía de fuerza 

atómicaatómica

AFM: sobre una superficie de grafito

2 nm

AFM: el ensanchamiento

AFM: límite de resolución

Tipos de puntaPirámide de nitruro de silicón

Deposición electrónica

Nanotubo de carbono

Deposición en mica

nf  número de moléculas en superficie

n0  número de moléculas en solución 

D   Coeficiente de difusión

t tiempo

CONDICIONES:

•La adsorción es irreversible.

•No hay corrientes convectivas que influyan en el transporte de las moléculas.

•La cantidad de moléculas en solución no llega a ser limitante y la superficie no se satura.

Tipos (modos) de escaneo

Tipos (modos) de escaneo

Tapping

Contact

Tapping

Contact

2 µ m

• ManipulaciónManipulación

Tecnología para estudiar Tecnología para estudiar nanomáquinasnanomáquinas

Manipulación con pinzas láserManipulación con pinzas láser Principio de la detección de fuerza.Principio de la detección de fuerza.  

La aplicación de una fuerza externa provocará un desplazamiento fuera La aplicación de una fuerza externa provocará un desplazamiento fuera del centro de la trampa.  del centro de la trampa.  

La desviación del rayo difractado es medida por un fotodetector y usada La desviación del rayo difractado es medida por un fotodetector y usada para calcular el valor de la fuerza aplicada sobre la microesfera atrapada.para calcular el valor de la fuerza aplicada sobre la microesfera atrapada.

strep anti­dig

Succión viapipeta de vidrio Trampa óptica

biotinadigoxigenina

DNA, 3­15 Kbp

strep

Succión viapipeta de vidrio Trampa óptica

DNA, 3­15 Kbp

anti­dig

strep

Succión viapipeta de vidrio

Trampa óptica

DNA, 3­15 Kbp

anti­dig

Tecnología para estudiar Tecnología para estudiar nanomáquinasnanomáquinas VERVER

MEDIRMEDIR

• MANIPULARMANIPULAR

• MEDIRMEDIR

La longitud de extremo a extremo (R2) depende de la longitud de contornocontorno (L) y la longitud de persistencia persistencia (P)(P)

P, longitud con la que decae la orientación inicial de un polímero. Es una medida de rigidez.

WLC, modelo de la cadena vermiforme

Se comprueba equilibrio en 2D

DNA LENGTH (bp)

N° molecules Theoretical Contour 

length (nm)

Experimental Contour 

Length (nm)

Standard deviation

Theorical R2

Experimental R2

278 64 94 83.6 6.2 5533 4312

731 101 247.1 213.5 23.2 26110 24727

1450 110 490.1 397.2 36.4 63010 67332

Se reproduce comportamien­to WLC.

rLc

Medición de ángulos

Para un polímero al que se le introduce un ángulo β  en cualquier parte de su longitud, la longitud R2 está dada por:

Casetes de AAAAAA como estándar de ángulos y curvaturas introducidas

J Mol Biol. 1998 Jul 3;280(1):41­59.Polymer chain statistics and 

conformational analysis of DNA molecules with bends or sections of different 

flexibility.Rivetti C, Walker C, Bustamante C.

EJEMPLO

ARN­polimerasa bacteriana.Protagonista en la expresión genética y resistencia antibiótica

ARN­polimerasaSintetiza cadenas de ARN siguiendo un 

ADN molde.

ARN­polimerasaSintetiza cadenas de ARN siguiendo un 

ADN molde.

Enzima esencialLas bacterias poseen 

una única versión de esta enzima.

RNAp transcribe todos los genes

RibosomalesARNtMensajeros

Blanco de antibióticos inhibidoresLa ARNp bacteriana es blanco de varios 

compuestos antibióticos.

Mecanismo en etapasE +DNA   [E ∙DNA]c   [E ∙DNA]o   {[RNA∙E ∙DNA]   [RNA∙E∙DNA]}σ ↔ σ ↔ σ → σ →

RPE

Heat shock

Stationary Phase

Extreme Temperature

Nitrogen regulation

Flagellar genes

Iron Transport

Housekeeping

Escerichia coli: 7 factores sigma

INICIACION

Observando complejos DNA+RNAP

Un acercamiento

¡Compactamiento!

Son diferentes, p <0.0001  Compactamiento de 32 nm

  CL (nm) N° of molecules

Free DNA 444 ± 22 110

DNA:RNAp 412 ± 18 54

El ADN promotor envuelve a RNAp

El enrollamiento es asimétrico

Theoretical S/L arm ratio

Experimental S/L ratio 

0.422 0.383 ± 0.022

Short to Long arms ratio compared to the theoretical ratio. The theoretical S/L ratio is calculated with respect to the site of initiation of transcription as in figure 1: 430nm / 1020 nm.

El enrollamiento es asimétrico

El enrollamiento es asimétrico

Theoretical S/L arm ratio

Experimental S/L ratio 

0.422 0.383 ± 0.022

Total  cell  fractions  of  recombinant  Eco  bearing  plamids  for  the expression  of  Mtb  RNAP  subunits:  α ,  β ’,  σ  and β ;  M,  molecular weight marker: 200, 110, 97, 66, 45, 31 KD; n, non­induced culture; +1, aliquot  from  a  1ml  of  induced  mini­culture;  +50,  concentrated  aliquot from a 50 ml induced culture

DNA:Proteína      1:0                     1:1       1:6       1:9      1:20

MTB­RNAP + promotor ribosomal

MTB­RNAP + promotor ribosomal

MTB­RNAP + promotor ribosomal

P R I M I C I AP R I M I C I A

x1

Observando transcripción en tiempo real

Estudiando actividad catalítica de RNAp

tiempo

x1

x2

Observando transcripción en tiempo real

Estudiando actividad catalítica de RNAp

tiempo

x1

x2

x3

Observando transcripción en tiempo real

Estudiando actividad catalítica de RNAp

tiempo

x1

x2

x3

Observando transcripción en tiempo real

Estudiando actividad catalítica de RNAp

Two mutants selected with a point mutation in the TL (G­loop). ­ G1136S (Fast) : Renders fast, irresponsive to pause signals, error prone, resistant to termination ­ I1134V (Slow) : Renders slow, over­responsive to pauses, greater fidelity, more efficient in termination

FAST Mutant

n= 17

SLOW Mutant

n= 12

Pause­free velocity = 17.6  ± 1 nt/s  Pause­free velocity = 7.7 ± 1.6 

Velocity

Estudiando actividad catalítica de RNAp

Bulk assays

RNAP + DNA

Escherichia coli

Mycobacterium tuberculosis

Average velocity

ICo Stability

Bulk assays

Pause Frequency

Pause Length

Backtracking

Processivity

Stall Force

Instantaneous vel.

RNAP + DNA

Optical Tweezers

Enzyme Dynamics

Escherichia coli

Mycobacterium tuberculosis

Average velocity

ELONGATION

ICo Stability

Bulk assays

Pause Frequency

Pause Length

Backtracking

Processivity

Stall Force

Instantaneous vel.

RNAP + DNA

RNAP mutations

Optical Tweezers

Enzyme Dynamics

Escherichia coli

Mycobacterium tuberculosis

Average velocity

ELONGATION

ICo Stability

Bulk assays

Pause Frequency

Pause Length

Backtracking

Processivity

Stall Force

Instantaneous vel.

RNAP + DNA

RNAP mutations

Optical Tweezers

Enzyme Dynamics

Escherichia coli

Mycobacterium tuberculosis

Average velocity

ELONGATION

AFM

Angles

Lengths

Sigma Release

ICo Stability

Structure:Function

INITIATION

AFM

Bulk assays

Angles

Lengths

Sigma Release

Pause Frequency

Pause Length

Backtracking

Processivity

Stall Force

Instantaneous vel.

RNAP + DNA

Constitutive Promoters

Stringent­controlled  Promoters

RNAP mutations

ppGpp

Optical Tweezers

ICo Stability

Structure:Function

Enzyme Dynamics

Escherichia coli

Mycobacterium tuberculosis

Average velocity

INITIATION

ELONGATION

AFM

Bulk assays

Angles

Lengths

Sigma Release

Pause Frequency

Pause Length

Backtracking

Processivity

Stall Force

Instantaneous vel.

RNAP + DNA

Constitutive Promoters

Stringent­controlled  Promoters

RNAP mutations

ppGpp

Optical Tweezers

ICo Stability

Structure:Function

Enzyme Dynamics

Escherichia coli

Mycobacterium tuberculosis

Average velocity

INITIATION

ELONGATION

Promoter mutations

¡GRACIAS!

¡GRACIAS!

Piere Daniel

Omar

SergeiJ°Miguel

Sofía

Alvaro Antonio

Pamela

PATRICIA SHEEN

CARLOS BUSTAMANTE