ABP 34-36
“Aprendiendo del estudio clínico del TGN1412”
Grupo ACurso 09-10
Caso del TGN1412
• Marzo 2006 en “Parexel Clinical Pharmacology Research Unit”
• Ensayo de fármaco biotec TGN1412• Ac monoclonal humanizado superagonista de CD28 • Tratamiento de leucemia linfocítica y artritis reumatoide
• Estudio fase clínica I:6 afectados de fallo multiorgánico
Clínica Parexel. Londres
Respuesta inflamatoria
sistémica
Tormenta de citoquinas
Fallo multiorgánico
Requiere 2 señales
distintas
Activación de las células T
Requiere SÓLO
1 señal
MEDIANTE SUPERANTÍGENOS MEDIANTE ANTÍGENOS
Humanización del anticuerpo 5.11.A1
5.11.A1 – CD 28 Humano
TGN1412 – CD 28 Humano
Inmunoglobulinas
•Anticuerpo (Ig) = Fab (2 x (VL, CL, VH, CH1)) + Fc (CH2, CH3)
• VH y VL presentan subregiones hipervariables o CDR
(complementarity determining regions), cuya estructura
determina la especificidad por el Ag.
• De las dos regiones constantes (CH y CL), la CH es
esencial para las funciones efectoras de la Ig, que
dependen de la interacción con otras células del S.I. y con
moléculas del complemento.
ImnunoglobulinasDominio Ig
• Constan de 70-110 aa y se clasifican en diferentes tipos de acuerdo a su tamaño y función
• Sandwich de dos láminas β antiparalelas. Estabilizado por:
- Puentes de H
- Interacciones hidrofóbicas
- Puentes disulfuro
• Dominio Ig CONSTANTE:
una hoja de 3 cadenas beta y otra de 4
• Dominio Ig VARIABLE:
una hoja de 5 cadenas beta y otra de 4
• La superfamilia Ig está compuesta por proteínas
que presentan uno o más dominios Ig
• Implicadas en el reconocimiento, unión y
adhesión celular
• Se cree que todos los miembros de la
superfamilia derivan de un ancestro común
• Entre los miembros de la superfamilia:
- Inmunoglobulinas solubles
- Moléculas de coestimulación
ImnunoglobulinasSuperfamilia Ig
Tormenta citoquinas
Homólogos remotos
Diferente nivel de expresión CD28
Diferente CD28
Diferente CTLA-4Agregación de
TGN1412
Otras hipótesis
CD33
HIPÓTESIS
• Bases de datos• Experimentales• Computacionales
Métodos
Familias• Pfam• PROSITE
Secuencia•Swiss-Prot
Estructura• PDB• CATH• SCOP
Bases de datos de proteínas
• Baja resolución (análisis cualitativo)– Técnicas espectroscópicas
• Absorbancia UV-Vis• Fluorescencia
• Dicroísmo circular• Espectroscopía de infrarrojos• Resonancia paramagnética electrónica (EPR)• Resonancia magnética nuclear (RMN) de 1H (1D y 2D)
– Difusión traslacional• Ultracentrifugación analítica• Dispersión de la luz• Cromatografía de filtración en gel
• Resolución media– Criomicroscopía electrónica– RMN de estado sólido
• Alta resolución– Cristalografía de rayos X– RMN multinuclear y multidimensional
Técnicas experimentales de determinación estructural
Dicroísmo circular Se basa en el cambio de configuración electrónica molecular de un estado fundamental a un estado excitado, debido a la absorción de radiación electromagnética polarizada circular.
• Un haz de luz polarizado circularmente está formado por dos haces de luz de polaridad plana.
- Se obtiene girando el plano de polarización de forma continua y en un solo sentido alrededor del eje de propagación de la fase luminosa.
Dicroísmo circular
Absorción diferencial entre las ondas EREL
Fenómeno de dicroísmo circular
• Un haz de luz polarizado es aquel que tiene su vibración electromagnética en un solo plano.
ER
EL
RL AAA
Ley de Lambert-Beer
ClA RL )(
RL Absorción diferencial:
La interacción de la radiación con la muestra induce un desfase y un cambio de magnitud diferenciales en ambos componentes circularmente polarizados de la luz(ER y EL), y estos fenómenos provocan una rotación del plano de polarización en un ángulo a y la distorsión de este plano genera una elipse en vez de una circunferencia
Descomposición de luz linealmente polarizada en dos componentes depolarización circular
La absorción preferencialde un componente semide como un valor deelipticidad(dicroísmocircular), que puede ser + o -
Dicroísmo circular
Los espectros de dicroísmo circular se obtienen generalmente en las regiones del ultravioleta cercano (250 a 350 nm) y lejano (180 a 250 nm) de la radiación electromagnética.
Espectro de dicroísmo circular de estructurassecundariaspuras
Aplicaciones y usos del DC
Determinación de la estructura secundaria de proteínas que no se pueden cristalizar o que es difícil (proteínas de membrana o de dentro de vesículas lipídicas)
Cambios estructurales inducidos por el entorno (pH, Tª, solventes...)
Estudio de interacciones proteína-proteína y ác.nucleico-proteína
Ventajas
Simple, rápido, no destructivo
Requiere concentraciones menores que para RMN
Podemos usar moléculas de cualquier tamaño
Herramienta complemento para técnicas más detalladas (cristalografía y RMN)
Dicroísmo circular
•Sólo determina la estructura secundaria•Los espectros de estructuras secundarias puras NO son comparables con espectros que solamente tienen una fracción de esa estructura•No hay consenso en el límite de las bandas del espectro de UV cercano y el UV lejano
• Espectrometría de absorción que utiliza la región infrarroja del espectro electromagnético
• Las moléculas absorben frecuencias específicas determinadas por su estructura (frecuencias resonantes)
• Frecuencia absorción= frecuencia a la que el enlace o grupo vibra
Espectroscopía de infrarrojo
1. Un haz policromático se separa en dos en el separador
2. Uno de los haces hijo atraviesa la muestra y el otro una referencia
3. El detector registra la intensidad del haz transmitido: varia según la interferencia sea constructiva o destructiva
1
2 3Detector
Regilla oMonocromador
Blanco
Muestra
Divisor de as
CPU
Amplificador
ImpresoraTeclado
OPantalla
Fuente de radiacióninfrarroja: laser,Globar o Nernst
Espectroscopía de infrarrojo
• FTIR: Espectroscopía de infrarrojo con transformada de Fourier:
- Interferograma(intensidades vs tiempo)
- Espectro IR (intensidad vs frecuencia)
- Información estructural: estructura secundaria
Transformada de Fourier
Espectroscopía de infrarrojo
• Permite el estudio de moléculas identificando sus grupos funcionales
• El grupo más característico y numeroso de las proteínas es el amida
• Modos de vibración del grupo amida:
• Aplicaciones: mediciones, control de calidad, mediciones dinámicas, cambios en el carácter o la cantidad de un enlace particular…
- Vibración NH (amida A)- Vibración amida I (enlace C=O): Correlación frecuencia – estructura - Vibración amida II- Otros: vibraciones amida (III, IV, V, VI y VII), estiramientos (NC, CN y CC) y las deformaciones (CCN y CNC)
Espectroscopía de infrarrojo
• Sólo determina la estructura secundaria
•No hay consenso en el límite de las bandas
Funcionamiento de un microscopio electrònico:
1. Generación del haz de electrones por un cañón electrónico [2].
2. Los electrones [3] viajan en el vacío, y son acelerados por un alto voltaje y focalizado por medio de lentes magnéticas.
3. Los electrones atraviesan la muestra [7].4. Un conjunto de lentes magnéticas amplifican la señal
resultante y forman una imagen sobre una placa fotográfica o sobre una pantalla sensible al impacto de los electrones.
5. Captamos la imagen con un ordenador, con el que se le puede dar color (ya que la imagen obtenida es en blanco y negro).
La microscopía electrónica utiliza electrones en lugar de fotones o luz visible para formar imagenes microscópicas.
Microscopía electrónica
Tinción negativa Criomicroscopía
Proteína
Capa de carbón
Haz de electrones
Haz de electrones
Proteína
Imagen final
Imagen final
La proteína se congela en nitrógeno líquido
Soporte de carbono
Los electrones que inciden sobre la sal del átomo pesado sufren una mayor dispersión y generan un fondo oscuro, mientras que los que atraviesan la proteína generan una imagen brillante
Los electrones que inciden sobre la proteína sufren más dispersión y generan una imagen oscura
Microscopía electrónica
•Necesidad de software para reconstrucción tridimensional.
Cristalografía de Rayos X
El haz escinde en diferentes direcciones por la simetría de los átomos y por el fenómeno de difracción
Incidencia de un haz de rayos X a través de un cristal (contiene la proteína en estudio)
Los rayos X son difractados por los electrones de las moléculas de proteína cristalizada (patrón de difracción)
La posición e intensidad de cada punto está determinada por las fases de las ondas que forma cada punto (mapa de densidad electrónica)
Construcción de modelo de proteína
RMN
Basado en propiedades mecánico-cuánticas de protones o neutrones: Spin
Aplicación de un campo magnético alterno perturbación del spin
Desaparición del campo posición inicial de spins
Cambio de estados liberación energética captada por receptor
Análisis computacional
Imagen
CRISTALOGRAFÍA DE RAYOS X
RMN
Ventajas Alta resolución a nivel atómico ( estructura de la
proteína a partir de la densidad electrónica )
La proteína se estudia suspendida en su medio
natural
Sin límite de tamaño molecular
Permite obtener información dinámica:
unión de ligandos y cambios de estructura
Inconvenientes Se necesita un monocristal(la cristalización puede generar distorsiones )
Limitación de tamaño (límite de 40kDa)
La proteína se encuentra fuera de su medio natural
Estructura poco definida
Cristalografía Rayos X vs RMN
Métodos
Tormenta citoquinas
Diferente nivel de expresión CD28
HIPÓTESIS
Objetivo: Comparar la cantidad de CD28 en humanos y en macacos.
Numerosos estudios desmienten una concentración diferencial del receptor similar o igual
Hipótesis 1: Diferente concentración de CD28humano/macaco
Schraven B, Kalinke U. CD28 Superagonists: What Makes the Difference in Humans? Cell Press Immunity 2008.
Tormenta citoquinas
Diferente nivel de expresión CD28
HIPÓTESIS
Diferente CD28
ObjetivoSaber si TGN1412 se une a una región distinta del CD28 o con distinta afinidad en las dos especies.
Métodos1. Comparación secuencias CD28 humano/CD28 macaco: clustalW
Department of Medicine, Duke University Medical Center, Durham, North Carolina 27710, USA. The calm after the cytokine storm: lessons from the TGN1412 trial. J ClinInvest. 2008 Jun;118(6):2365.
Hipótesis 2: Diferencia entre CD28 humano/CD28 macaco
2. Localización y visualización en el modelo de las mutaciones en el receptor (VMD):- lugar de interacción?
3. Análisis de las energías de interacción: EBI-PISA
No Descartar hipótesis
Sí Modelaje CD28macaco - TGN1412
Comparación con CD28humano-TGN1412
Hipótesis 2: Diferencia entre CD28 humano/CD28 macaco
Secuencias distintas de CD28 de macaco en SwissProt y en el artículo estudiado
PROBLEMA!!!
Hipótesis 2: Diferencia entre CD28 humano/CD28 macaco
Hipótesis 2: Diferencia entre CD28 humano/CD28 macaco
Hipótesis 2: Diferencia entre CD28 humano/CD28 macaco
Mutaciones en la región transmembrana.
Tormenta citoquinas
Diferente nivel de expresión CD28
HIPÓTESIS
Diferente CD28
Diferente CTLA4
Búsqueda de proteínas homólogas de CD28 con PSI-BLAST.
• TGN1412 se podría unir a CTLA-4
• Miramos unión del TGN1412 a CTLA-4 de las diferentes especies
Hipótesis 3: Unión de TGN1412 a CTLA-4
¿Por qué es interesante mirar la unión a CTLA4?
• Es un inhibidor de la activación de
las células T
•Diferencias en la unión TGN1412-
CTLA-4 en diferentes especies podría
dar diferente nivel de inhibición
Hipótesis 3: Unión de TGN1412 a CTLA-4
Objetivos
1. Averiguar si el TGN1412 se puede unir al CTLA-4
Métodos
2. Generación del modelo TGN1412-CTLA4 a partir del modelo de TGN1412-CD28
3. Comparación de la unión TGN1412-CTLA4 en humano con la unión TGN1412-
CD28 en humano
4. Comparación de la unión TGN1412-CTLA4 en macaco con la unión TGN1412-
CTLA4 en humano
Hipótesis 3: Unión de TGN1412 a CTLA-4
ClustalW CD28humano – CTLA-4humano
CTLA-4 humanoCD28 humano
Hipótesis 3: Unión de TGN1412 a CTLA-4Comparación de CTLA-4 humano con CD28 humano
CD28h + 5.11A1 (molde)
CD28h + TGN1412
CD28h + TGN1412 (molde)
CTLA4h + TGN1412
CTLA-4 humano – TGN1412CD28 humano – TGN1412
Hipótesis 3: Unión de TGN1412 a CTLA-4Comparación de CTLA-4 humano con CD28 humano
Átomo cadena Ligera Distancia (A) Átomo
CD28
1 TRP 32 [NE1] 3.12 ASP 494 [O]
2 GLN 92 [NE2] 3.53 ASP 495 [O]
Átomo cadena Pesada Distancia (A) Átomo CD28
1 THR 244 [OG1] 3.82 MET 531 [O]
2 SER 245 [OG ] 3.46 GLU 464 [OE2]
3 TYR 315 [OH] 2.57 GLU 529 [OE1]
4 TYR 315 [OH] 3.86 TYR 536 [OH]
5 ASP 318 [N] 3.64 TYR 493 [OH]
6 TYR 315 [O] 3.27 ARG 466 [NE]
7 GLY 316 [O] 3.63 ARG 466 [NE]
8 GLY 316 [O] 2.62 TYR 493 [OH]
9 ASP 318 [O] 3.17 LYS 495 [NZ]
CD28 humano – TGN1412
Átomo cadena Pesada
Distancia (A)
Átomo CD28
1 SER 245[ OG ] 3.13 GLU 463 [OE1]
2 SER 245[ OG ] 3.14 GLU 463 [OE2]
3 HIS 314[ NE2] 3.71 GLU 463 [OE2]
4 TYR 315[ OH ] 2.60 GLU 527 [OE2]
5 THR 244 [OG1] 3.78 MET 529 [O]
6 GLY 316 [O] 2.73 ARG 465 [NE]
7 TYR 315 [O] 2.85 ARG 465 [NE]
Átomo cadena Ligera
Distancia(A)
ÁtomoCD28
1 TRP 32 [NE1] 3.18 ASP 494 [O]
CTLA-4 humano – TGN1412
Hipótesis 3: Unión de TGN1412 a CTLA-4Comparación de CTLA-4 humano con CD28 humano
Residuo cadena Pesada
1 GLY 268
2 GLY 316
3 LEU 317
4 TRP 319
ResiduoCD28
1 VAL 481
2 PRO 533
3 PRO 534
4 GLY 497
Residuo Cadena ligera
1 TRP 32
2 GLY 91
I. hidrofóbicas
CD28 humano – TGN1412
E.iónicos Átomo cadena pesada
Distancia(A)
ÁtomoCTLA4h
1 B:HIS 314[ NE2] 3.71 C:GLU 463[ OE2]
Residuo cadena Pesada
1 THR 242
2 THR 244
3 GLY 268
4 GLY 316
5 LEU 317
6 TRP 319
Átomo CTLA4h
1 MET 485
2 LEU 493
3 MET 529
4 PRO 532
5 ILE 497
Átomo cadena ligera
1 TRP 32
2 GLY 91
I. hidrofóbicas
CTLA-4 humano – TGN1412
Hipótesis 3: Unión de TGN1412 a CTLA-4Comparación de CTLA-4 humano con CD28 humano
CD28 humano – TGN1412 CTLA-4 humano – TGN1412
INTERACCIÓN Área de interacción (A2)
Energía (Kcal/mol)
Cadena pesada
CD28humano 449.3 -4.0
CadenaLigera
CD28 humano 180.1 -0.8
INTERACCIÓN Área de interacción (A2)
Energía (Kcal/mol)
Cadena pesada
CTLA-4 macaco 434,9 -5,5
CadenaLigera
CTLA-4 macaco 172,3 -1,3
cadenapesada
cadenaligera
Hipótesis 3: Unión de TGN1412 a CTLA-4Comparación de CTLA-4 humano con CD28 humano
CTLA-4 humano
ClustalW CTLA-4 humano – CTLA-4 macaco
Hipótesis 3: Unión de TGN1412 a CTLA-4Comparación de CTLA-4 humano con CTLA-4 macaco
CTLA-4 macaco
CTLA4h + TGN1412 (molde)
CTLA4m + TGN1412
CD28h + TGN1412 (molde)
CTLA4h + TGN1412
CTLA-4 humano – TGN1412 CTLA-4 macaco – TGN1412
Hipótesis 3: Unión de TGN1412 a CTLA-4Comparación de CTLA-4 humano con CTLA-4 macaco
Átomo cadena Pesada
Distancia (A)
Átomo CTLA-4
1 SER 245[ OG ] 3.13 GLU 463 [OE1]
2 SER 245[ OG ] 3.14 GLU 463 [OE2]
3 HIS 314[ NE2] 3.71 GLU 463 [OE2]
4 TYR 315[ OH ] 2.60 GLU 527 [OE2]
5 THR 244 [OG1] 3.78 MET 529 [O]
6 GLY 316 [O] 2.73 ARG 465 [NE]
7 TYR 315 [O] 2.85 ARG 465 [NE]
Átomo cadena Ligera
Distancia(A)
ÁtomoCTLA-4
1 TRP 32 [NE1] 3.18 ASP 494 [O]
Átomo cadena Pesada
Distancia (A)
Átomo CTLA-4
1 SER 245 [OG] 2.94 C:GLU 463[ OE1]
2 HIS 314 [NE2] 3.56 C:GLU 463[ OE2]
3 TYR 315 [OH] 3.03 C:GLU 527[ OE2]
4 THR 244[ OG1] 3.86 C:MET 529[ O ]
5 GLY 316[ O ] 3.36 C:ARG 465[ NH1]
6 TYR 247[ OH ] 3.62 C:ARG 465[ NH2]
Átomo cadenaligera
Distancia(A)
ÁtomoCTLA-4
1 TRP 32 [NE1] 3.12 ASP 494[O]
2 GLN 92 [ NE2 3.53 ASP 495[ O]
CTLA-4 humano – TGN1412 CTLA-4 macaco – TGN1412
Hipótesis 3: Unión de TGN1412 a CTLA-4Comparación de CTLA-4 humano con CTLA-4 macaco
Átomo cadena Pesada
Distancia (A)
Átomo CTLA-4
1 SER 245[ OG ] 3.13 GLU 463 [OE1]
2 SER 245[ OG ] 3.14 GLU 463 [OE2]
3 HIS 314[ NE2] 3.71 GLU 463 [OE2]
4 TYR 315[ OH ] 2.60 GLU 527 [OE2]
5 THR 244 [OG1] 3.78 MET 529 [O]
6 GLY 316 [O] 2.73 ARG 465 [NE]
7 TYR 315 [O] 2.85 ARG 465 [NE]
Átomo cadena Ligera
Distancia(A)
ÁtomoCTLA-4
1 TRP 32 [NE1] 3.18 ASP 494 [O]
Átomo cadena Pesada
Distancia (A)
Átomo CTLA-4
1 SER 245 [OG] 2.94 C:GLU 463[ OE1]
2 HIS 314 [NE2] 3.56 C:GLU 463[ OE2]
3 TYR 315 [OH] 3.03 C:GLU 527[ OE2]
4 THR 244[ OG1] 3.86 C:MET 529[ O ]
5 GLY 316[ O ] 3.36 C:ARG 465[ NH1]
6 TYR 247[ OH ] 3.62 C:ARG 465[ NH2]
Átomo cadenaligera
Distancia(A)
ÁtomoCTLA-4
1 TRP 32 [NE1] 3.12 ASP 494[O]
2 GLN 92 [ NE2 3.53 ASP 495[ O]
CTLA-4 humano – TGN1412 CTLA-4 macaco – TGN1412
Hipótesis 3: Unión de TGN1412 a CTLA-4Comparación de CTLA-4 humano con CTLA-4 macaco
CTLA-4 Humano – TGN1412
E.iónicos Átomo cadena pesada Distancia(A) ÁtomoCTLA4h
1 HIS 314[ NE2] 3.71 GLU 463[ OE2]
Átomo cadena pesada
1 THR 242
2 THR 244
3 GLY 268
4 GLY 316
5 LEU 317
6 TRP 319
Átomo CTLA4h
1 MET 485
2 LEU 493
3 MET 529
4 PRO 532
5 ILE 497 Átomo cadena ligera
1 TRP 32
2 GLY 91
Átomo cadena Pesada
1 GLY 268
2 GLY 316
3 TRP 319
Átomo CTLA4m
1 ALA 481
2 MET 485
3 LEU 493
4 ILE 497
5 MET 529
6 PRO 532
Átomo cadena ligera
1 TRP 32
2 GLY 91
E.iónicos Átomo cadena esada Distancia(A) ÁtomoCTLA4m
1 B:HIS 314[ NE2] 3.56 C:GLU 463[ OE2]
CTLA- 4- Macaco – TGN1412
Interacciones hidrofóbicas Interacciones hidrofóbicas
Hipótesis 3: Unión de TGN1412 a CTLA-4Comparación de CTLA-4 humano con CTLA-4 macaco
CTLA4humano – TGN1412 CTLA4 macaco – TGN1412
cadenaligera
cadenapesada
INTERACCIÓN Área de interacción (A2)
Energía (Kcal/mol)
Cadena pesada
CTLA-4 humano 433,4 -6,4
CadenaLigera
CTLA-4 humano 170,6 -1,6
INTERACCIÓN Área de interacción (A2)
Energía (Kcal/mol)
Cadena pesada
CTLA-4 macaco 434,9 -5,5
CadenaLigera
CTLA-4 macaco 172,3 -1,3
Hipótesis 3: Unión de TGN1412 a CTLA-4Comparación de CTLA-4 humano con CTLA-4 macaco
Tormenta citoquinas
Diferente nivel de expresión CD28
HIPÓTESIS
Diferente CD28
Diferente CTLA-4
Homólogos remotos
Mediante ModLink: búsqueda de homólogos remotos de TGN1412
Prot X
TGN1412
TGN1412 Diana Y Diana Y
Hipótesis 4: Homólogos remotos¿Se puede unir TGN1412 al factor IX de coagulación?
Interleuquinas Interleuquinas
10C12 - Factor de
coagulación IX humano
BO2C11 – Factor VIII de
Coagulación humano
Hipótesis 4: Homólogos remotos¿Se puede unir TGN1412 al factor IX de coagulación?
IL-2 IL-6 (Cytokine storm) 10C12Interactúa
TGN1412podría
interactuar
factor IX
??HIPÓTESIS
El TGN1412 podría activar la vía intrínseca de coagulación y
activar la trombina
Hipótesis 4: Homólogos remotos¿Se puede unir TGN1412 al factor IX de coagulación?
10C12 + factor IX (molde)
TGN1412 + factor IX
10C12 con Factor de coagulación IX humano TGN1412 con Factor de coagulación IX humano
Hipótesis 4: Homólogos remotos¿Se puede unir TGN1412 al factor IX de coagulación?
CDR del modelo TGN1412 con Factor de coagulación IX humano
CDR1
CDR2
CDR3
Hipótesis 4: Homólogos remotos¿Se puede unir TGN1412 al factor IX de coagulación?
Ligera
CDR110C12 S G S T S N I G N N Y V S
TGN14 H A S Q N I Y - - V W L N
CDR210C12 D V S K R P STGN14 K A S N L H T
CDR310C12 A A W D D S L S E F L
TGN1412 Q Q G - - Q T Y P Y T
Pesada
CDR110C12 T Y A M H
TGN14 S Y Y I H
CDR210C12 I I S Y D G S K K Y Y A D S V K G
TGN14 C I Y P G N V N T N Y N E K F K D
CDR3
10C12 A S I A A A R V L D Y
TGN14 S H Y G L D W N F D V
Hipótesis 4: Homólogos remotos¿Se puede unir TGN1412 al factor IX de coagulación?
IL-2 IL-6 (Cytokine storm)BO2C11Interactúa
TGN1412 podría interactuar
factor VIII
??HIPÓTESIS
El TGN1412 podría activar la vía extrínseca de coagulación y activar la trombina
Hipótesis 4: Homólogos remotos¿Se puede unir TGN1412 al factor VIII de coagulación HUMANO?
BO2C11 + factor VIIIh (molde)TGN1412 + factor VIIIh
BO2C11 – Factor de coagulación VIII humano
Hipótesis 4: Homólogos remotos¿Se puede unir TGN1412 al factor VIII de coagulación HUMANO?
TGN1412 -Factor de coagulación VIII humano
Hipótesis 4: Homólogos remotos¿Se puede unir TGN1412 al factor VIII de coagulación?
CDR del modelo TGN1412 con Factor de coagulación VIII humano
CDR1
CDR2
CDR3
Hipótesis 4: Homólogos remotos¿Se puede unir TGN1412 al factor VIII de coagulación HUMANO?
CDR1BO2C11 G Y T L T E L P V
TGN1412 G Y T F T S Y Y I
BO2C11 G S F D P E S G E S I Y A R E F Q G STGN1412 G C I Y P G N V N T N Y N E K F K D R
CDR2
BO2C11 C A V P D P - - D - A F D ITGN1412 C T R S H Y G L D W N F D V
CDR3
CDR1BO2C11 R A S Q S F S S S Y L
TGN1412 H A S Q N I Y - V W L
BO2C11 Y G A S T RTGN1412 Y K A S N L
CDR2
BO2C11 C Q K Y G T S ATGN1412 C Q Q G Q T Y P
CDR3
Cadena Pesada: Cadena Ligera:
Hipótesis 4: Homólogos remotos¿Se puede unir TGN1412 al factor VIII de coagulación HUMANO?
“Epitope mapping using fragments of the factor VIII C2 domain indicated that BO2C11 does not recognize a linear epitope corresponding to a single stretch of
amino acid residues.30 Rather, it interacts with a conformational epitope composed of side chains from various regions within the C2 sequence that are
adjacent to each other in the folded protein”.
ENLACES HIDRÓGENO
Átomo cadena Pesada
Distancia (A)
ÁtomoFactor VIII
TRP 319[ N ] 2.75 ASN 457[ OD1]
THR 244[ O ] 3.41 ARG 474[ NH2]
GLY 316[ O ] 2.65 ARG 479[ NH2]
ASP 318[ OD1] 3.26 ARG 479[ NH2]
TYR 315[ OH ] 3.49 GLN 575[ N ]
TYR 315[ OH ] 2.70 GLN 575[ NE2]
Átomo cadena Ligera
Distancia (A)
ÁtomoFactor VIII
THR 93[ OG1] 3.74 THR 456[ OG1]
TRP 32[ NE1] 3.78 THR 456[ O ]
THR 93[ OG1] 3.39 ASN 457[ O ]
Hipótesis 4: Homólogos remotos¿Se puede unir TGN1412 al factor VIII de coagulación HUMANO?
Átomo cadena Pesada
1 B:VAL 216
2 B:GLY 240
3 B:ILE 265
4 B:GLY 316
5 B:LEU 317
6 B:VAL 323
Átomo Factor VIII
1 C:PHE 455
2 C:MET 458
3 C:PHE 459
4 C:ALA 460
5 C:GLY 473
6 C:VAL 482
7 C:LEU 510
8 C:LEU 511
9 C:MET 514
Átomo cadena Ligera
1 A:VAL 31
2 A:LEU 54
3 A:GLY 91
4 A:PRO 95
HIDROFÓBICOS
Átomo cadena Pesada
Distancia (A)
ÁtomoFactor VIII
B:ASP 318[ OD1] 3.26 C:ARG 479[ NH2]
Hipótesis 4: Homólogos remotos¿Se puede unir TGN1412 al factor VIII de coagulación HUMANO?
IÓNICOS
CD28 humano – TGN1412
INTERACCIÓN Área de interacción (A2)
Energía (Kcal/mol)
Cadena pesada
CD28humano 449.3 -4.0
Cadena Ligera
CD28 humano 180.1 -0.8
INTERACCIÓN Área de interacción (A2)
Energía (Kcal/mol)
Cadena pesada
Factor VIIIhumano 786.5 -10.3
Cadena Ligera
Factor VIIIhumano 462.4 -2.7
Factor VIII humano – TGN1412
Hipótesis 4: Homólogos remotos¿Se puede unir TGN1412 al factor VIII de coagulación?
Cadena Pesada
Cadena Ligera
TGN1412 - Factor coagulación VIII humano
TGN1412+ factor VIII humano (molde)TGN1412 + factor VIII ratón
Hipótesis 4: Homólogos remotos¿Se puede unir TGN1412 al factor VIII de coagulación de RATÓN?
TGN1412 - Factor coagulación VIII ratón
Hipótesis 4: Homólogos remotos¿Se puede unir TGN1412 al factor VIII de coagulación de RATÓN?
ENLACES HIDRÓGENO
Átomo cadena Pesada
Distancia (A)
ÁtomoFactor VIII ratón
1 HIS 314[ ND1] 3.82 THR 512[ OG1]
2 TYR 247[ OH ] 3.58 ASN 457[ ND2]
3 TYR 266[ OH ] 2.98 ARG 474[ NE ]
4 SER 245[ O ] 3.02 ARG 474[ NH2]
5 GLY 316[ O ] 2.79 ARG 479[ NH1]
6 ASP 318[ OD1] 3.79 ARG 479[ NH2]
7 TYR 246[ OH ] 3.80 LEU 510[ N ]
8 TYR 315[ OH ] 3.47 GLN 575[ N ]
9 TYR 315[ OH ] 2.70 GLN 575[ NE2]
Átomo cadena ligera
Distancia (A)
ÁtomoFactor VIII ratón
1 LYS 50[ NZ ] 3.58 GLN 481[ O ]
Hipótesis 4: Homólogos remotos¿Se puede unir TGN1412 al factor VIII de coagulación de RATÓN?
Átomo cadena pesada
Distancia(A)
ÁtomoFactor VIII
1 B:ASP 318[ OD1] 3.79 C:ARG 479[ NH2]
Átomo cadena Pesada
1 TRP 261
2 ILE 265
3 GLY 316
4 LEU 317
5 TRP 319
ÁtomoFactor VIII
1 MET 485
2 TRP 572
3 PHE 455
4 MET 458
5 PHE 459
6 TRP 462
7 GLY 473
8 LEU 510
9 PHE 511
10 MET 514
Átomo cadena ligera
1 TRP 32
2 LEU 54
3 GLY 91
4 PRO 95
Factor VIII ratón – TGN1412
INTERACCIÓN Área de interacción (A2)
Energía (Kcal/mol)
Cadena pesada
Factor VIIIratón 763.1 -11.3
CadenaLigera
Factor VIIIratón 444.8 -3.2
INTERACCIÓN Área de interacción (A2)
Energía (Kcal/mol)
Cadena pesada
Factor VIIIhumano 786.5 -10.3
CadenaLigera
Factor VIIIhumano 462.4 -2.7
Factor VIII humano – TGN1412
Hipótesis 4: Homólogos remotos¿Se puede unir TGN1412 al factor VIII de coagulación de RATÓN?
Cadena Pesada
Cadena Ligera
Tormenta citoquinas
Diferente nivel de expresión CD28
HIPÓTESIS
Diferente CD28
Diferente CTLA-4
Homólogos remotos
CD33
CD33: lectina tipo inmunoglobulina receptora de ácido siálico (Siglec)
Inhibe activación celular mediante vías ITIM (Immunoreceptor Tyrosine-based Inhibition Motif)
– Células T macaco: alta cantidad de moléculas CD33
– Células T humanas: CD33 casi indetectable
ITIM
Hipótesis 5: Unión TGN1412 a CD33
ObjetivoEstudiar la posibilidad que TGN1412 se una a CD33 y se de una inhibición diferente enhumano y macaco.
Métodos
1. Estudio del docking de TGN1412 con CD33 con PyDock• Análisis de la zona de interacción• Análisis energético del docking
2. Estudio del docking de TGN1412 con CD28 con PyDock• Análisis de la zona de interacción• Análisis energético del docking
3. Comparación de ambas posibles uniones
Hipótesis 5: Unión TGN1412 a CD33
Conf Ele Desol VDW Total Rank371 -6.107 -10.038 48.160 -11.328 1123 -10.542 -10.308 103.232 -10.527 2
386 -25.431 -3.065 189.127 -9.583 3
96 -21.999 2.408 104.411 -9.150 4
410 -10.925 -3.009 58.017 -8.133 5
Conf Ele Desol VDW Total Rank
375 -21.334 -3.191 74.247 -17.101 1436 -12.536 -3.681 14.179 -14.799 2389 -13.415 -11.770 108.398 -14.345 3
48 -20.658 -6.228 135.418 -13.344 4307 -17.842 -5.347 100.475 -13.142 5
TGN1412
CD33
TGN1412CD28
Energía TGN1412 – CD28 Energía TGN1412 – CD33
Hipótesis 5: Unión TGN1412 a CD33
Tormenta citoquinas
Diferente nivel de expresión CD28
HIPÓTESIS
Diferente CD28
Diferente CTLA-4
Homólogos remotos
CD33
Agregación de TGN1412
ObjetivoEstudiar la posibilidad que TGN1412 forme agregados con él mismo y precipite
Métodos
Estudio del docking de las diferentes cadenas del TGN1412 con PyDock:
1. Cadenas ligera-ligera2. Cadenas pesada-pesada 3. Cadenas pesada-ligera
Hipótesis 6: Agregación de TGN1412
IL-12 IL-6IL- 1
IFN-γ IL-18
Hipótesis 6: Agregación de TGN1412Respuesta Inmunitaria: Papel de celulas T , citoquinas, macrogafo, interleuquinas
AGREGACIÓN
Activación de la respuesta Inmunitaria:
células T, neutrófilos, macrógafos
Hipótesis 6: Agregación de TGN1412Agregación ligera-ligera /pesada-pesada/Ligera-pesada
Ligera-ligera
Pesada-pesada
Conf Ele96 Desolv VdW TOTAL Rank
51 6.275 -46.954 133.023 -27.377 1
389 -20.828 -15.414 121.636 -24.078 2
44 -9.586 -18.478 76.122 -20.452 3
17 -35.099 9.155 60.731 -19.907 4
96 -16.472 -14.478 118.688 -19.082 5
Conf Ele96 Desolv VdW TOTAL Rank
157 -6.127 -47.607 113.992 -42.335 1
277 -4.600 -41.685 47.053 -41.580 2
129 -8.570 -43.797 164.117 -35.955 3
28 -12.446 -37.274 154.795 -34.241 4
49 -11.884 -39.551 194.001 -32.035 5
Ligera-pesada
Conf Ele Desolv VdW TOTAL RANK
5 -4.220 -66.309 130.396 -57.489 1
170 -22.762 -52.977 209.062 -54.832 2
149 -9.269 -47.714 101.505 -46.833 3
1 -7.15 -58.709 260.565 -40.368 4
20 -8.751 -39.969 83.969 -40.323 5
Hipótesis 6: Agregación de TGN1412STAMP de ligera - pesada/Fab cristalizada
Hipótesis 3: Agregación de IgGsSuperfície de interacción del TGN1412
Residuos HC
Gln 253
Leu 259
Phe 309
Asn 320
Phe 321
Trp 324
Gly 325
Val 384
Thr 386
Residuos LC
Gln 38
Pro 44
Tyr 87
Thr 97
Phe 98
Gly 99
Residuos HC
Leu 34
Gln 39
Gly 42
Ser 163
Residuos LC
His 168
Phe 170
TOTAL
-57.489
-54.832
-46.833
-40.368
-40.323
TOTAL
-27.377
-24.078
-20.452
-19.907
-19.082
TOTAL
-42.335
-41.580
-35.955
-34.241
-32.035
Ligera-pesadaLigera-ligera Pesada-pesada Ligera-pesada Fab orig.
TOTAL
-43.933
-33.541
-23.512
-21.604
-20.784
Hipótesis 6: Agregación de TGN1412Agregación ligera-ligera /pesada-pesada/Ligera-pesada/Fab cristalizada
Hipótesis 3: Agregación de IgGs
¿Como podemos justificarla tormenta de citoquinas en humanos a partir de la
precipitación de TGN1412?
TOTAL
-11.328
-10.527
-9.583
-9.150
-8.133
TOTAL
-57.489
-54.832
-46.833
-40.368
-40.323
TOTAL
-27.377
-24.078
-20.452
-19.907
-19.082
TOTAL
-42.335
-41.580
-35.955
-34.241
-32.035
Ligera-pesada
Ligera-ligera
Pesada-pesada
CD33
TGN1412
Hipótesis 6: Agregación de TGN1412Comparación de energías de agregación respecto a la interacción con CD33
Tormenta citoquinas
Diferente nivel de expresión CD28
HIPÓTESIS
Diferente CD28
Diferente CTLA-4
Homólogos remotos
CD33
Agregación de TGN1412
Otras hipótesis
Otras hipótesis
• Homólogos remotos 1FYH (IFNγ-Rc complex)– Literatura:
» El Rc del IFNγ tiene ↑% láminas β (como el CD28). » Enfermos de SARS que sufrieron tormenta de citoquinas tenían ↑[IFNγ ]» Hipótesis: el TGN1412 se une al Rc de IFNγ y simula la tormenta de
citoquinas
• Activación del complemento por la Fc del TGN1412– Visilizumab fármaco inmunosupresor con la región constante mutada para
evitar unión a FcR. Tratamiento de Colitis ulcerosa y enfermedad de Crohn.
Tormenta citoquinas
Diferente nivel de expresión CD28
HIPÓTESIS
Diferente CD28
Diferente CTLA-4
Homólogos remotos
CD33
Agregación de TGN1412
Otras hipótesis
1. Búsqueda de proteínas homólogas 1.1. source /cursos/BE/programari/bashrc_aules 1.2. Búsqueda en Swissprot con Psiblast proteínas homólogas (para generar PSSM): * blastpgp -i target.fa-d /cursos/BE/databases/blastdat/sprot.fas -j 10 –C target_pssm.sport -o target_sprot10.out 1.3. Aplicar la matriz de pesos obtenida para buscar en PDB: * blastpgp -i target.fa -d /cursos/BE/databases/blastdat/pdb_seq -j 1 -R target_pssm.sprot-o
target_pdb1.out
2. Escoger homólogos (en función E-value y resolución)3. Generar multifasta de homólogos incluyendo nuestra proteína * FetchFasta.pl -i homologos.dat -o homologos.fa -d /cursos/BE/databases/blastdat/sprot.fas * cat target.fa>>homologos.fa
BÚSQUEDA DE PROTEÍNAS HOMÓLOGAS: PSI - BLAST
* clustalw homologos.faALINEAMIENTOS POR SECUENCIA: CLUSTALW
* hmmbuild moldes.hmm moldes.aln * hmmcalibrate moldes.hmm * hmmalign moldes.hmm todas.fa> moldes_hmmer.aln
ALINEAMIENTOS POR ESTRUCTURA: HMMER
Programas y comandas utilizados
MODELLER MULTI-CHAIN
1. Separar las cadenas (PDBtoSplitChain)
2. Alinear cada una de las cadenas (clustalW)
3. Generar fichero .pir Una vez alineadas las cadenas, incluirlas en el .pir. Cada cadena debe estar separada con /. En la
cabecera hay que indicar: nº primer residuo: nombre primera cadena: número de último residuo de última cadena: nombre última cadena.
4. Generar fichero .faHay que generar un fichero fasta que incluya todas las cadenas que hay en el pdb
5. Generar fichero .pyPoner nombre de fichero .pir; poner nombre del pdb; poner nombre de la secuencia fasta
6. Ejecutar el modeller: mod9v7 prueba.py
Programas y comandas utilizados
Programas y comandas utilizados
STAMP
1. Crear archivo .domains (moldes.domains), donde pondremos las cadenas de los pdbs que nos interesan para el stamp.2. Hacer el stamp: stamp–l moldes.domains-rough -n 2 –prefix moldes >moldes.out
Se nos generan archivos moldes.1, moldes.2 .... Y el moldes.out, que nos explicará cómo ha agrupado los pdbs con sus RMSD correspondientes.
3. Convertimos el formato de alineamiento del archivo moldes.x que nos interese (1, 2, 3…) a un formato clustalW: aconvert-in b -out c <moldes.x>moldes_x.aln 4. Creamos un fichero .pdb a partir de nuestro alineamiento estructural:transform -f moldes.x -g -o moldes_stamp.pdb 5.Mirarlo con rasmol rasmolmoldes_stamp.pdb
PROSA
Shell prosaRead pdb ejemplo1.pdb obj1Read pdb ejemplo2.pdb obj2Analyse energy * plot
winsize * 30 Color * obj1 redColor * obj2 blue plot
Programas y comandas utilizados
Programas y comandas
PYDOCK
$ pydock T26 setup
Un fichero que contenga:
#!/bin/bash#$ -S /bin/bash#$ -q llicen.q#$ -o /homes/users/adminBE/test/work/send.o#$ -e /homes/users/adminBE/test/work/send.ecd /homes/users/adminBE/test/worksource /cursos/BE/programari/bashrc_lukepydock T26 zdockpydock T26 rotzdockpydock T26 dockserpydock T26 patch
$ qsub <fichero>$ qstat
adminBE@luke:~/test/work> pydockFor batch use: pydock -file <scriptfile> or pydock <dockname> <module>PyDock loaded... Now you can run pyDock commands interactively...>>> import pyDockMakePDB>>> pyDockMakePDB.main("T26",3,3)Reading pdb files...Conformation 3 done
Para crear PDB
Modlink http://sbi.imim.es/modlink/
Introducir la secuencia de la proteína problema
Analizar los resultados que nos da el programa
Programas y comandas utilizados
EBI PISA (http://www.ebi.ac.uk/msd-srv/prot_int/cgi-bin/piserver)
Introducir el código pdb.
Analizar las interacciones y la energía
1. Referente al pydock:
a) Funciona sin necesidad de introducir la comanda: $ pydock (fichero.ini) setupb) En el fichero .ene podemos ver las energías de dockingc) Las dos anteriores son correctasd) Resulta imposible generar un PDB del dockinge) Todas las anteriores son correctas
2. Referente a los aminoácidos:
f) La valina, la leucina i la alanina son aminoácidos hidrofóbicosg) La arginina y la lisina son aminoácidos cargadosh) Las dos anteriores son correctasi) La treonina i la serina son aminoácidos polaresj) Todas las anteriores son correctas
PEM
3. Respecto a los programas de visualización de proteínas:
a) Con Rasmolpodemos marcar enlaces de hidrógenob) Con VMD podemos marcar un aminoácido concretoc) Las dos anteriores son correctasd) Con VMD calculamos energías de dockinge) Todas las anteriores son falsas
4. El TGN1412:
f) Es un fármaco diseñado para el tratamiento de la artritis reumatoideg) Es una molécula con plegamiento de tipo todo-betah) Las dos anteriores son correctasi) Es un fármaco que ya está en el mercadoj) Todas las anteriores son correctas
PEM
5. Marca las afirmaciones correctas:
1. La RMN te permite determinar la estructura terciaria de la proteína2. La microscopía electrónica te genera imágenes en tres dimensiones3. El dicroísmo circular sólo te permite ver la estructura secundaria de la molécula
4. Los rayos X te permiten determinar la estructura de la proteína en solución
a) 1, 2 y 3b) 2 y 4c) 1 y 3d) 1, 2, 3, 4e) 4
6. Señala la opción correcta:
f) STAMP nos permite hacer alineamiento por estructurag) Con ClustalW podemos hacer alineamientos por secuenciah) Las dos anteriores son correctasi) Modeller necesita un alineamiento tipo.pir para actuarj) Todas las anteriores son correctas
PEM
7. Señala la respuesta correcta con respecto al Modlink:
a. Se usa para encontrar los homólogos más cercanos de una proteínab. El mejor resultado es el que tiene E-value de mayor valorc. Se usa para encontrar homologías lejanasd. Es útil para visualizar proteínase. Se usa para unir (link) varios modelos (Mod) en un solo PDB
8. Señala las respuestas correctas:
f. La ley de Lambert-Beer sirve para determinar la energía de enlaceg. En el interior de una proteína predominan los residuos hidrofóbicosh. El efecto hidrofóbico se rige por la ley de Coulombi. La energía de Van der Waals favorece que se superpongan los átomosj. Todas las anteriores son falsas
PEM
9. Señala las moléculas que pertenecen a la superfamilia de las inmunoglobulinas:
a. TGN1412b. CTLA4c. Las dos anterioresd. CD28e. Todas las anteriores
10. Sobre las bases de datos:
f. Swissprot contiene secuencias de proteínasg. Con PDB podemos obtener estructuras 3D de proteínash. Las dos anteriores son correctasi. Con SCOP no podemos obtener información estructural sobre familias proteicasj. Todas las anteriores son ciertas
PEM