UNIVERSIDAD AGRARIA DEL ECUADOR FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS
CARRERA DE INGENIERÍA AGRÍCOLA MENCIÓN AGROINDUSTRIAL
ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA DEL ACEITE
ESENCIAL DE TRES ESPECIES DE Citrus limon CONTRA Escherichia coli Y Staphylococcus aureus
TRABAJO EXPERIMENTAL
Trabajo de titulación presentado como requisito para la obtención del título de
INGENIERA AGRÍCOLA MENCIÓN AGROINDUSTRIAL
AUTOR
ESPINEL OBREGOSO ANDREA JUDITH
TUTOR
Ing. MORAN BAJAÑA JOAQUIN TEODORO, M.Sc
MILAGRO – ECUADOR
2020
PORTADA
2
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4
Dedicatoria
Quiero dedicar mi trabajo a Dios por ser el motor
fundamental en mi vida. A mis padres Francisco
Espinel y Paola Obregoso, mi abuelita Norma
Guadalupe, tías y hermano, quienes han sido mi
apoyo para poder seguir adelante en cada etapa
de mi vida.
En el cielo hay dos ángeles quienes me querían
mucho, me brindaron su apoyo y quienes confiaron
en mí, aunque no alcanzaron a verme desarrollada
en esta etapa de mi vida quiero dedicarles mi tesis
porque sé que desde el cielo me guian y cuidan, a
mi abuelito Emiro Espinel y mi tía Karola Obregoso.
5
Agradecimiento
Agradezco a Dios por las fuerzas y sabiduría
que me ha brindado para poderme desarrollar
en la vida cotidiana y lograr culminar esta etapa.
Agradezo a mi Universidad Agraria del Ecuador,
por haberme brindado enseñanzas y darme
unas hermosas experiencia para poder
desarrollarme en mi vida cotidiana y laboral.
Un agradecimiento especial para quien fue mi
guía en la elaboración de mi tesis a mi Tutor el
Ing. Joaquín Moran Bajaña, estoy muy
agradecida por su apoyo y por brindarme sus
conocimientos para poder tener un resultado
exitoso en mi trabajo experimental.
A mis amigos Cecilia, Cinthya, Andres, Paul,
Carlos, Renata y Judith quienes han sido una
ayuda fundamental en estos años de amistad,
ellos confiaron en mí y me motivaron a no
rendirme nunca.
A los profesores que de una u otra manera me
han brindado sus conocimientos y apoyo
durante esta etapa universitaria.
6
7
Índice general
PORTADA ......................................................................................................... 1
APROBACIÓN DEL TUTOR ................. ¡ERROR! MARCADOR NO DEFINIDO.
APROBACIÓN DEL TRIBUNAL DE SUSTENTACIÓN . ¡ERROR! MARCADOR
NO DEFINIDO.
Dedicatoria ........................................................................................................ 4
Agradecimiento ................................................................................................ 5
Autorización de Autoría Intelectual ..................... ¡Error! Marcador no definido.
Índice general ................................................................................................... 7
Índice de tablas ................................................................................................ 9
Indice de figuras ............................................................................................. 10
Resumen ......................................................................................................... 11
Abstract ........................................................................................................... 12
1. Introducción ............................................................................................... 13
1.1 Antecedentes del problema ..................................................................... 13
1.2 Planteamiento y formulación del problema ............................................ 14
1.3 Justificación de la investigación ............................................................. 15
1.4 Delimitación de la investigación .............................................................. 16
1.5 Objetivo general ........................................................................................ 16
1.6 Objetivos específicos ............................................................................... 16
1.7 Hipótesis .................................................................................................... 16
2. Marco teórico .............................................................................................. 17
2.1 Estado del arte........................................................................................... 17
2.2 Bases teóricas ........................................................................................... 19
2.3 Marco legal ................................................................................................ 32
8
3. Materiales y métodos ................................................................................. 34
3.1 Enfoque de la investigación ..................................................................... 34
3.2 Metodología ............................................................................................... 34
4. Resultados .................................................................................................. 41
4.1 Extracción de los aceites esenciales ...................................................... 41
4.2 Evaluar el efecto antibacteriano del aceite esencial extraído de la
especies de C. limón sobre Escherichia coli y Staphylococcus ................ 41
4.3 Comparar el efecto antibacteriano de los aceites esenciales frente a los
antibióticos comerciales ................................................................................ 42
5. Discusión .................................................................................................... 45
6. Conclusiones .............................................................................................. 47
7. Recomendaciones ...................................................................................... 48
8. Bibliografía .................................................................................................. 49
9. Anexos ........................................................................................................ 57
9.1 Anexos Analisis de varianza ................................................................... 64
9
Índice de tablas
Tabla 1: Tratamientos de evaluación de la actividad antimicrobiana del aceite
esencial de tres especies de Citrus limon contra Escherichia coli y
Staphylococcus aureus ................................................................................ 35
Tabla 2. Tabla de dosificación de los aceites esenciales ............................. 36
Tabla 3. Esquema de análisis de Varianza .................................................. 40
Tabla 4. Resultados de los análisis fisicoquímico de los aceites esenciales 41
Tabla 5. Medición del halo bacteriano de Staphylococcus aureus en muestras
con aceites esenciales de C. limon y antibioticos. ....................................... 41
Tabla 6. Medición del halo bacteriano de Escherichia coli en muestras con
aceites esenciales de C. limon y antibioticos. .............................................. 42
Tabla 7. Medición del halo ........................................................................... 42
Tabla 8. Conteo bacteriano en muestras con aceites esenciales de C. limon y
antibioticos. .................................................................................................. 43
Tabla 9. Conteo bacteriano en muestras con aceites esenciales de C. limon y
antibioticos ................................................................................................... 43
Tabla 10. Contaje microbiano ...................................................................... 43
10
Indice de figuras
Figura 1. Diagrama de flujo de la extracción de aciete esencial de la cáscara
de limón (Citrus aurantifolia) ........................................................................ 37
Figura 2. Extraccion de los aceites esenciales ............................................ 57
Figura 3. Calibracion del peachimetro.......................................................... 57
Figura 4. Limpieza ....................................................................................... 58
Figura 5. Agar MacConkey y Agar Baird Parker .......................................... 58
Figura 6. Pesado del medio del Agar MacConkey ....................................... 59
Figura 7. Mezcla y medición de pH del Agar MacConkey ............................ 59
Figura 8. Sacando del autoclave el Agar ..................................................... 60
Figura 9. Agar MacConkey en la caja petric ................................................ 60
Figura 10. Cajas Petri en fundas ziploc y almcenadas en refrigeración. ...... 61
Figura 11. Medicón de pH del Agar Baird Parker ......................................... 61
Figura 12. Agar Baird Parker con EYT ......................................................... 62
Figura 13. Cajas Petri en las fundas Ziploc y congelación durante 24 horas 62
Figura 14. Materiales, utensilios y equipos a utilizar, para la siembre de las
bacterias (E. coli y S. aureus) ...................................................................... 63
Figura 15. Siembra de las cepas bacterianas, colocación de discos de
antibióticos y de los aceite esencial de variedades C. limon ........................ 63
file:///C:/Users/cecilia/Downloads/TESIS-ANDREA-ESPINEL-1.docx%23_Toc44953624file:///C:/Users/cecilia/Downloads/TESIS-ANDREA-ESPINEL-1.docx%23_Toc44953624file:///C:/Users/cecilia/Downloads/TESIS-ANDREA-ESPINEL-1.docx%23_Toc44953625file:///C:/Users/cecilia/Downloads/TESIS-ANDREA-ESPINEL-1.docx%23_Toc44953626file:///C:/Users/cecilia/Downloads/TESIS-ANDREA-ESPINEL-1.docx%23_Toc44953627file:///C:/Users/cecilia/Downloads/TESIS-ANDREA-ESPINEL-1.docx%23_Toc44953630
11
Resumen
Los aceites esenciales son líquidos aromáticos de aspecto fluido o espeso y de
color variable dependiendo de las plantas de las que estos son extraídos. Poseen
compuestos con efectos microbicidas, medicinales, aromatizantes y antisépticos,
los cuales son inocuos para el medio ambiente. Se planteó una investigación
cuyos objetivos fueron: Evaluar el efecto de la actividad antibacteriana de los
aceites esenciales del limón contra Escherichia coli y Staphylococcus aureus.
Extraer aceite esencial de las tres variedades de Citrus limon. Evaluar el efecto
antibacteriano del aceite esencial extraído de la especie de C. limón sobre
Escherichia coli y Staphylococcus aureus. Comparar el efecto antibacteriano de
los aceites esenciales frente a los antibióticos comerciales. Se aplicó un diseño
Completamente al Azar DCA con arreglo factorial A (tres especies de limón) x B
(tres dosis de aceites esenciales) (32) + 3 testigos (total 12 tratamientos). La
comparación de medias se realizó mediante el test de Tukey (p
12
Abstract
The essential oils are aromatic liquids of fluid or thick appearance and of variable
color depending on the plants from which they are extracted have compounds
with microbicidal, medicinal, flavoring and antiseptic effects, which are harmless
to the environment. An investigation was proposed whose objectives were: To
evaluate the effect of the antibacterial activity of the essential oils of lemon
against Escherichia coli and Staphylococcus aureus. Extract essential oil from
the three varieties of Citrus lemon. To evaluate the antibacterial effect of the
essential oil extracted from the species of C. lemon on Escherichia coli and
Staphylococcus aureus. Compare the antibacterial effect of essential oils against
commercial antibiotics. A Randomly DCA design with factorial arrangement A
(three species of lemon) x B (three doses of essential oils) (32) + 3 controls (total
12 treatments) was applied. The comparison of means was performed using the
Tukey test (p
13
1. Introducción
1.1 Antecedentes del problema
Diversas fuentes han reportado que el hombre primitivo tuvo que desarrollar
su capacidad sensorial e intuitiva para lograr la supervivencia. Es así como se
aprendió a emplear las hierbas, frutos y raíces comestibles disponibles en su
entorno.
Algunos descubrimientos arqueológicos, tal como reportan Saz y Ortiz, (2018)
que datan del año 3500 A.C. sostienen que se realizaban destilaciones primitivas
en ollas de barro, para la obtención de los aceites esenciales, los cuales eran
utilizados para tratamientos medicinales y cosmetológicos.
Esta misma fuente acota que estos aceites contienen moléculas lipofílicas,
con un peso molecular bajo, que se sintetizan como producto del metabolismo
secundario de las plantas. La composición química de los aceites esenciales no
es siempre igual, aunque sí se mantiene una composición química similar entre
plantas de una misma especie.
Como aceites esenciales se conoce al líquido oleoso volátil, que es
insaponificable, mismos que se obtienen de las diferentes partes de una planta:
hojas, raíces, flores, semillas y frutas, por extracción de métodos físicos. Cerutti
y Neumayer (2004) refieren que la cáscara del limón (Citrus limon) contiene 0,4
% de aceite; se encuentra en sacos de forma ovalada en el pericarpio o en la
porción coloreada de la cáscara, y actúa como barrera tóxica natural contra
varios microorganismos e insectos.
Se informa que hace mucho años atrás, se descubrieron las propiedades
antifúngicos de los aceites esenciales, pero no han sido muy utilizados en el
desarrollo de productos comerciales por el motivo de que a la industria se le hace
14
más complicado encontrar, patentar y proteger productos naturales diferente a
como pasa con los productos sintéticos (Perez y otros, 2015).
En los últimos años, se han observado que los fungicidas botánicos se han
ido intensificando, desde que ha sido mostrado que puede mitigar el impacto
negativo de los fungicidas sintéticos, evitándose los residuos sobre los alimentos,
la contaminación ambiental y la resistencia de los patógenos.
1.2 Planteamiento y formulación del problema
1.2.1 Planteamiento del problema
En la actualidad se utilizan muchos productos químicos sintéticos (aditivos
alimentarios, abonos, hormonas, etc.) utilizados en la agricultura y en la industria
alimenticia. Son productos que se han empleado incontroladamente
amenazando el equilibrio del ecosistema. Los mismos, aplicados correctamente
con reglamentos, mejoran la calidad y seguridad de los productos, sin embargo,
con el pasar del tiempo afectan a la salud del ser humano.
Con el pasar del tiempo el ser humano ha convivido con los microorganismos
por lo que la relación humano-bacteria desprende consecuencias importantes
como las que causan enfermedades infecciosas (Vidal, 2014).
Ciertos autores aseguran que un gran porcentaje de enfermedades
transmitidas por alimentos (ETA´s), son transmitidas por alimentos
contaminados, mismas que provocan efectos nocivos para la salud humana,
convirtiéndose en uno de los principales problemas de salubridad en el mundo
(Guerra y otros, 2014).
Los antibióticos son una gran ayuda para prevenir la proliferación bacteriana,
el cual ha salvado muchas vidas pero con el pasar del tiempo ha ido creciendo
un nuevo problema, la resistencia bacteriana, un hecho oculto hasta ese
15
momento a los seres humanos, pero existente en el mundo microbiológico. Los
aceites esenciales tienen propiedades antibacterianas contra microorganismos
patógenos para el ser humano, así como para lo aquellos presentes en los
alimentos, bien por su implicación en toxiinfección bacteriana y también por su
capacidad para alterar las propiedades organolépticas de conservación
alimentaria (Zekaria, 2014).
1.2.2 Formulación del problema
¿Pueden los aceites esenciales del limón inhibir el crecimiento de E. coli y S.
aureus?
1.3 Justificación de la investigación
Citrus limon posee propiedades beneficiosas para la salud humana y es un
fruto abundante en el Ecuador lo cual le confiere una posición ventajosa para su
utilización. La producción de limón se concentra en las provincias del Guayas y
Manabí.
Varios reportes señalan que el aceite esencial del limón tiene características
de conservación en algunos alimentos inclusive se ha sugerido su capacidad
antimicrobiana. Precisamente esta última propiedad requiere estudios para
evaluar su efectividad como agente antagónico de los microorganismos
contaminantes en los alimentos principalmente.
La información obtenida del presente trabajo investigativo coadyuvará a
conocer el alcance de los aceites esenciales del limón en el control de bacterias
patógenas relacionadas con productos de consumo. Los productores de
alimentos, a nivel artesanal como industrial, podrán contar con estas sustancias
químicas así como entender el procedimiento tecnológico para obtenerlas y
reconocer su eficiencia inhibitoria de microorganismos patógenos.
16
1.4 Delimitación de la investigación
Espacio: Se realizó la investigación en Laboratorio de Microbiología de la
Ciudad Universitaria Milagro de la Universidad Agraria del Ecuador (CUM)
Tiempo: Se ejecutó en un tiempo de 8 meses.
Población: El producto está dirigido a personas que requiera usar aceites
esenciales como inhibidores bacterianos.
1.5 Objetivo general
Evaluar el efecto de la actividad antibacteriana de los aceites esenciales del
limón contra Escherichia coli y Staphylococcus aureus.
1.6 Objetivos específicos
• Extraer aceite esencial de tres variedades de Citrus limon
• Evaluar el efecto antibacteriano del aceite esencial extraído de la especies
de C. limón sobre Escherichia coli y Staphylococcus.
• Comparar el efecto antibacteriano de los aceites esenciales frente a los
antibióticos comerciales.
1.7 Hipótesis
Los aceites esenciales del limón poseen actividad antibacteriana.
17
2. Marco teórico
2.1 Estado del arte
(Argote (2017) evaluó la capacidad antibacteriana de aceites esenciales de
eucalipto, limón y mandarina frente a bacterias ATCC Staphylococcus aureus y
Escherichia coli , tratamientos en los que se observó que los mejores fueron el
de eucalipto y limón frente a la bacteria Gram positiva y para la Gram negativa
el aceite esencial de cáscara de mandarina.
Black, Ventura, Barrera y Bautista (2017) desarrollaron aceites obtenidos por
hidrodestilación para ser usados como antimicrobianos, los aceites de mayor
connotación fueron el aceite de canela que inhibió el crecimiento micelial de A.
alternata, mientras que, la germinación se inhibió 100 % con la presencia de
aceites de limón y epazote (0.25 y 0.5 μL∙ mL-1).
Scalvenzi (2016) evaluó dos tipos de aceites esenciales, Citrus limon y
Cymbopogon citratus, sobre el crecimiento in vitro de los hongos fitopatógenos
Rhizopus stolonifer, Aspergillus oryzae, Cladosporium cladosporioides, donde se
mostró una actividad antifúngica del aceite C. citratus fue de (p
18
antiinflamatoria, antidiarreica y antimicótica según los resultados afirma que dan
mejor sabor a los alimentos, al igual que su conservación y estimulación de las
enzimas digestivas. En diferentes especies pecuarias han mostrado sus
beneficios para mejorar la digestibilidad, conversión alimenticia y productividad
de los animales, como su efecto antiparasitario y antioxidante.
Rivas, Rivas, y Gamboa (2015) obtuvieron el aceite esencial del Ocimum
basilicum por hidrodestilación, en el mismo que se determinó la composición
química por medio de Cromatografía de Gases y Espectrometría de Masas, se
evaluó la actividad antibacteriana que contiene este aceite para las cepas de
Bacillus subtilis, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella
enteritidis y Staphylococcus aureus. La acción antibacteriana se cuantificó
midiendo el diámetro del halo de inhibición del crecimiento bacteriano alrededor
de discos Whatman dando como resultado que las bacterias Gram positivas (B.
subtilis y S. aureus), fueron las más susceptibles al aceite esencial
Hilvay (2015) evaluó el efecto de aplicación de los aceites esenciales del
Limón, Albahaca y orégano como agente antimicrobiano en la carne de cuy,
donde se observó que no se detectó salmonella logrando mantener un color,
olor, sabor, aceptabilidad y una vida útil de 40 días.
Ruiz, Díaz, y Rojas (2015) desarrollaron repelentes antimicrobianos para una
plaga que afecta el espárrago (Thrips tabaci) con aceites esenciales de 10
plantas aromáticas en el cual el tratamiento con mayor porcentaje de aceite
esencial de paniculata ("matico de la sierra"), resultó más eficaz contra las plagas
debido a que logro erradicar en un 75 % dicha plaga.
Elizari (2013) utilizó aceites esenciales de orégano y tomillo como agente
antimicrobiano. Se observó que la inhibición del crecimiento bacteriano aumentó
19
con la concentración de los dos aceites esenciales. No hubo mucha diferencia
en la inhibición bacteriana, aplicándole los aceites en soluciones formadoras de
films, ni tampoco entre los aceites de orégano y tomillo, su inhibición fue alta
mientras la concentración de bacterias fue inferior a 108 log ufc/mL
2.2 Bases teóricas
2.2.1 Aceites Esenciales
Un aceite esencial es un líquido aromático de aspecto fluido o espeso y de
color variable según las plantas de las que estos son extraídos, son producidas
por células especiales que se encuentran en las hojas, como en las flores, la
madera, las raíces o semillas. Los aceites esenciales tienen compuestos con
efectos fungicidas, medicinal, aromatizantes, etc., los cuales son inocuos para el
medio ambiente, los consumidores y para el control de poscosecha (Barrera y
Garcia, 2008).
Los aceites esenciales son producidos por las plantas con la intención de ser
protegidas de plagas, enfermedades e inclusive de la invasión de otras plantas
y atraen insectos y aves (polinizantes). Su protección y atracción, se ven
reflejadas en propiedades antisépticas, antiinflamatorias, antidepresivas,
afrodisíacas y otras, presentes en mayor o menor grado en la totalidad de los
aceites (León, Osorio y Martinez, 2015).
Espinoza (2014) dice que se han analizado en la actualidad más de 300
aceites esenciales de una gran variedad de especies vegetales, se utilizan en
diferentes áreas de la industria como 200 aceites, los cuales han tenido un valor
comercial muy elevado.
Los aceites esenciales en especial de frutos cítricos tienen un poder
antimicrobiano siendo alternativas efectivas contra infecciones producidas por
20
microorganismos patógenos los que causan enfermedades y se vuelven
resistentes a los antibióticos. Los aceites son sacados de la corteza de la naranja
realizada con el método de hidrodestilación para determinar su actividad
antimicrobiana con los organismos Gram negativo y Gram positivo. Con el aceite
puro, las cepas Gram positivas fueron muy resistentes y las cepas Gram negativo
tuvieron una sensibilidad a partir con el 10 % (Guerra y otros, 2014).
2.2.1.1 Clasificación de los aceites esenciales
Los aceites esenciales se pueden clasificar con base en diferentes criterios:
consistencia, origen y naturaleza química de los componentes mayoritarios.
Consistencia
De acuerdo con su consistencia los aceites esenciales se clasifican en:
esencias, bálsamos, resinas.
Las esencias, son líquidos volátiles a temperatura ambiente.
Los bálsamos, son extractos naturales obtenidos de un arbusto o un árbol. Se
caracterizan por tener un alto contenido de ácido benzoico y cinámico, así como
sus correspondientes ésteres. Son de consistencia más espesa, son poco
volátiles y propensos a sufrir reacciones de polimerización, son ejemplos el
bálsamo de copaiba, etc (Salomé y otros, 2014).
Dentro del grupo de las resinas podemos encontrar a su vez una serie de
posibles combinaciones o mezclas: Resinas, son productos amorfos sólidos o
semisólidos de naturaleza química compleja. Pueden ser de origen fisiológico o
fisiopatológico. Por ejemplo, la colofonia, obtenida por separación de la
oleorresina trementina. Contiene ácido abiético y derivados.
Oleorresinas, son mezclas homogéneas de resinas y aceites esenciales. Por
ejemplo, la trementina, obtenida por incisión en los troncos de diversas especies
21
de Pinus. Contiene resina (colofonia) y aceite esencial (esencia de trementina)
que se separa por destilación por arrastre de vapor. También se utiliza el término
oleorresina para nombrar los extractos vegetales obtenidos mediante el uso de
solventes, los cuales deben estar virtualmente libres de dichos solventes. Se
utilizan extensamente para la sustitución de especias de uso alimenticio y
farmacéutico por sus ventajas (estabilidad y uniformidad química y
microbiológica, facilidad de incorporar al producto terminado). Éstos tienen el
aroma de las plantas en forma concentrada y son líquidos muy viscosos o
sustancias semisólidas (oleorresina de pimentón, clavo, etc.) (Pizarro, 2015).
2.2.1.2 Origen de los aceites esenciales
Los aceites esenciales naturales se obtienen directamente de la planta y no
sufren modificaciones físicas ni químicas posteriores, debido a su rendimiento
tan bajo son muy costosos.
Los artificiales se obtienen a través de procesos de enriquecimiento de la
misma esencia con uno o varios de sus componentes, por ejemplo, la mezcla de
esencias de rosa, geranio y jazmín, enriquecida con linalol, o la esencia de anís
enriquecida con anetol. Montoya (2010), dice que los aceites esenciales
sintéticos, como su nombre lo indica, son los producidos por la combinación de
sus componentes los cuales son la mayoría de las veces producidos por
procesos de síntesis química. Estos son más económicos y por lo tanto son
mucho más utilizados como aromatizantes y saborizantes (esencias de vainilla,
limón, fresa, etc.)
2.2.1.3 Naturaleza química de los aceites esenciales
El contenido total en aceites esenciales de una planta es en general bajo
(inferior al 1 %) pero mediante extracción se obtiene en una forma muy
22
concentrada que se emplea en los diversos usos industriales. La mayoría de
ellos, son mezclas muy complejas de sustancias químicas. El término quimiotipo
alude a la variación en la composición del aceite esencial, incluso dentro de la
misma especie. Un quimiotipo es una entidad químicamente distinta, que se
diferencia en los metabolitos secundarios (Salomé y otros, 2007).
2.2.2. Características de los aceites esenciales
Los aceites esenciales son volátiles y líquidos a temperatura ambiente.
Recién destilados son incoloros o ligeramente amarillos. Su densidad es inferior
a la del agua (la esencia de sasafrás o de clavo constituyen excepciones). Casi
siempre dotados de poder rotatorio, tienen un índice de refracción elevado. Son
solubles en disolventes orgánicos habituales, como éter o cloroformo, y alcohol
de alta gradación. Son liposolubles y muy poco solubles en agua, pero son
arrastrables por el vapor de agua (Padrini y Lucheroni, 2015).
2.2.2.1 Acción antimicrobiana del aceite esencial
La acción antimicrobiana puede ser lograda mediante algunos compuestos
químicos naturalmente presentes en los alimentos, y en cantidades suficientes,
como la lisozima presente en el huevo y algunos ácidos orgánicos en frutas. En
algunos casos se pueden formar durante el procesamiento, como el ácido láctico
durante la fermentación de la leche para la producción del yogur (Pitarch, 2000).
Existe una amplia variedad de alimentos que contiene antimicrobianos naturales
o biocomponentes que pueden actuar como antimicrobianos, que abarcan desde
la sal común, pasando por alimentos como la zanahoria, rábanos picantes, ajo,
cebolla, entre muchos otros. Se encuentran especias y hierbas con acción contra
bacterias y mohos como: tomillo, clavo, orégano, romero, o canela, entre otras.
Los aceites esenciales de plantas y frutas también tienen una acción
23
antimicrobiana, los cuales también pueden ser agregados como antimicrobianos
naturales a los alimentos (Reyes y otros, 2014).
Los aceites esenciales son efectivos agentes antimicrobianos tanto en su fase
vapor como por contacto directo contra numerosas bacterias patógenas, Gram
negativos y Gram positivos, como mohos, levaduras e incluso moho productores
de micotoxinas (Ramos, 2014). Dichas propiedades se debe a los compuestos
químicos presentes en los aceites esenciales, siendo los monoterpenos,
sesquiterpenos y diterpenos los responsables de las propiedades antioxidantes,
aromáticas y antimicrobianas.
2.2.2.2 Características físicas de los aceites esenciales
Los aceites esenciales son volátiles y son líquidos a temperatura ambiente.
Los aceites esenciales recien destilados son incoloros o ligeramente
amarillos. Su densidad es inferior a la del agua (la esencia de sasafrás o de clavo
constituyen excepciones). Casi siempre dotados de poder rotatorio, tienen un
índice de refracción elevado. Son solubles en alcoholes y en disolventes
orgánicos habituales, como éter o cloroformo, y alcohol de alta gradación. Son
liposolubles y muy poco solubles en agua, pero son arrastrables por el vapor de
agua (Navarrete y otros, 2009).
2.2.2.3 Carácter químico de los aceites esenciales
Los componentes de los aceites se clasifican en terpenoides y no terpenoides.
No terpenoides: En este grupo tenemos sustancias alifáticas de cadena corta,
sustancias aromáticas, sustancias con azufre y sustancias nitrogenadas. No son
tan importantes como los terpenoides en cuanto a sus usos y aplicaciones.
Terpenoides: Son los más importantes en cuanto a propiedades y
comercialmente (Andrade y otros, 2017).
24
2.2.3 Aceite esencial de Citrus limon
Los aceites esenciales tienen una calidad que pueden verse afectadas por
los métodos de extracción, por factores como la variedad o tipo de limón que se
vaya a utilizar, la madurez de la fruta y su almacenamiento, también puede
afectar la presencia de luz y de oxígeno, considerando que el factor más
importante es la conservación a bajas temperaturas para evitar alteraciones.
El aceite esencial del limón (Citrus limon) es uno de los aceites más ricos
en vitaminas, contiene sobretodo vitamina C y caroteno, que es un forma de
vitamina A. Contiene también terpenos (limoneno, felandreno, pineno,
sequiterpenos, citrol, citronelol, linelol), acetatos de linalol y geraniol, aldehídos,
etc.). La esencia es obtenida presionando la parte exterior del pericarpio o
corteza de la fruta. Son necesarios 4000 limones para obtener 1 Kg de aceite
esencia (Rojas y otros, 2013).
Tiene innumerables propiedades: es el ingrediente básico en la industria de
perfumes y se utiliza además, en jabones, desinfectantes y productos similares.
También tiene importancia en la medicina, tanto por su sabor como por su efecto
calmante del dolor y su valor fisiológico. En caso de los aditivos, son combinados
con los alimentos para producir ciertas modificaciones que impliquen
conservación, color, reforzamiento del sabor y estabilización, los cuales van a
ayudar a efectuar una mejora sorprendente en nuestros suministros alimenticios,
así como a disminuir el trabajo en la cocina (Ramos, Corona y Guevara, 2015).
Los aceites esenciales de limón se pueden extraer de la cutícula de la cáscara
de limón o de destilar por completo en su totalidad, siendo el segundo con mayor
aporte brinda para tener un mejor rendimiento. Los aceites procedentes de Citrus
limón se considera que tiene más partes liquidas volátiles, obtenidas por
https://www.monografias.com/trabajos11/lasvitam/lasvitam.shtmlhttps://www.monografias.com/trabajos29/especialistas-medicos/especialistas-medicos.shtmlhttps://www.monografias.com/trabajos14/nuevmicro/nuevmicro.shtmlhttps://www.monografias.com/trabajos7/alim/alim.shtmlhttps://www.monografias.com/trabajos/fintrabajo/fintrabajo.shtml
25
destilación mediante un proceso físico, que contienen las sustancias que brindan
el aroma y el sabor característico al limón (León, 2017).
El aceite esencial de limón se producen aproximadamente 3.600 toneladas
anualmente. Este aceite esencial ocupa el segundo lugar luego de la naranja
dulce, los países donde se produce más este aceite esencial se encuentran en
Argentina, Estados Unidos e Italia de ahí van los productores de menor
importancia que están en Brasil, Costa de Marfil, Grecia, España, Israel,
Australia, Perú, Guinea, Indonesia, Venezuela y Chile. La producción de este
producto considerado GRAS (Generally Recognized as Safe), se destina, según
la demanda, al oeste de Europa (40 %), a los Estados Unidos (35 %) y a Japón
(8 %).
La cáscara del limón contiene 0,4 % de aceite, se encuentra en sacos de
forma ovalada en el pericarpio o en la porción coloreada de la cáscara, y actúa
como barrera tóxica natural contra varios microorganismos e insectos. La mayor
producción de aceite esencial de limón se realiza por prensado en frío; de menor
calidad y más económicos, son los destilados de aceites esenciales usados para
la producción de aceites libres de terpenos. Una pequeña parte de aceite de jugo
de limón es producido durante la concentración del jugo. Existen diferencias que
responden al terreno, clima y métodos de producción. En el limón, el tenor de
aceite se incrementa con la maduración del mismo y decrece justo después de
los períodos de lluvia. Los frutos blandos generalmente dan menores
rendimientos que los firmes, esto es debido a que en los blandos, la ruptura de
los sacos contenedores de aceite es ineficiente (Cerutti y Neumayer, 2004).
26
2.2.3.1 Componentes Químicos del Limón
Hesperidina
Es una flavonona glicosídica que se encuentra en frutas y vegetales, se
encuentran en los frutos cítricos como por ejemplo en las mandarinas, limones,
limas y en algunos híbridos (Escobar, 2010). Presentan beneficios para la salud.
Eriocitrina
El papel de los flavonoides y otras sustancias fenólicas en la protección frente
a los ataques por hongos puede producirse de dos formas. Cartaya y Reynaldo
(2001) afirma que es una flavonona glicosidica que se encuentra comúnmente
en los limones, es una flavonona -7-O-glucósidico entre el eriodictyol de
flavonona y el disacárido rutinosa.
2.2.4 Limón Tahiti (Citrus lantifolia)
Origen
El "Limón pérsico", también conocido como "Lima Tahití", "Tahití Lime" o
"Persian Lime" en inglés, es de origen desconocido, pero se supone que pudo
originarse en el sur este de Asia (entre Bruma y el sur de China). Se considera
un híbrido entre la lima mexicana (Citrus aurantifolia Swingle) y la sidra (Citrus
medica Linn) puesto que las flores están desprovistas de granos de polen u
óvulos viables y los frutos raras veces tienen semilla (Garcia, 2014).
Entre los que se halla el limón Tahití que seguramente no es un limón
verdadero sino una lima ácida. Es posible que sea un híbrido entre el Citrus
aurantifolia Chistom y otra especie de citrus no determinada aún (Sarango,
2015).
27
2.2.5 Limón Meyer (Citrus meyeri)
El Limón Meyer (Citrus meyeri) es un cítrico nativo de China del que se cree
que es un cruce entre el limón y la mandarina o la naranja dulce. Entre sus
características destaca su sabor, que en lugar de ser tan ácido como los limones
comunes, es dulce, por lo tanto, mucho más agradables al paladar.
El nombre de estos limones se debe a su descubridor, parece ser que fue en
1908 cuando el norteamericano Frank Meyer, empleado del Departamento de
Agricultura de Estados Unidos, descubrió este cítrico en China, donde se
cultivaban en macetas como planta ornamental y se llevó una muestra a su país,
donde el fruto adquirió gran popularidad.
Hubo un problema con los cultivos de limón Meyer en 1940, cuando se
cultivaba muchísimo en California. Cuentan que la mayoría de árboles estaban
afectados por el virus de la tristeza, así que para evitar que éste afectara al resto
de cultivos de cítricos tuvieron que destruirlos. En la década de los 50, científicos
de la Universidad de California desarrollaron esta variedad de limón mejorada y
más resistente al virus (Medina, 2007).
2.2.5.1 Composición Química
Las características de los flavonoides de Meyer limón son similares a las de
erucocitrina, hesperidina, nobiletina, narirutina, 6,8 diglucosylapigenin, 6,8
diglucosildiosmetina, diosmina es similar al limón Eureka Fue El análisis de los
componentes principales del contenido de flavonoides de cada fruta reveló que
el limón Meyer era una posición intermedia entre el limón Eureka y las
mandarinas (naranja mandarina Unshi) en el ingrediente principal primero y en
el segundo ingrediente del principal diagrama de dispersión. La cumarina 5
geraniloxi 7 metoxicoumarina, 8-geraniloxipsoraleno, 5-geraniloxipsoraleno
https://es.wikipedia.org/wiki/Virus_de_la_tristeza_de_los_c%C3%ADtricos
28
existe específicamente en el limón Eureka y no se incluyó en el limón Meyer. La
5,7 dimetoxicoumarina, de manera característica, contiene un alto contenido en
el limón Meyer y estaba contenida en frutos inmaduros del verde pericarpio
(Miyaki, Inou, y Itoigawa, 2011).
2.2.6 Limón Criollo (Citrus aurantifolia Swingle)
Origen
Su origen fue en el sur de Asia, su transportación fue hecha por los árabes a
través del norte de África y llevada a España y Portugal. Con la colonización llego
a América en el siglo 16, después de un tiempo se trasladó a otros países
antillanos, caribeños y en el sur de Florida, el cual se aclimató. Este tipo de limón
es cultivado en regiones tropicales, subtropicales y semi tropicales del planeta.
Sus principales productores son la India, México, Egipto y los países Caribeños.
Se ha adaptado muy bien y convertido en silvestre en el sur de Florida y en la
América tropical (Phillips y otros, 2015).
2.2.7 Bacteria E. coli
Taxonomía
Esta bacteria pertenece al género Escherichia, de la tribu Escherichieae,
perteneciente a Enterobacteriaceae. Estas bacterias pueden transmitirse
indirectamente a través de agua o alimentos contaminados. Se conocen
diferentes cepas capaces de producir diversos cuadros de gastroenteritis
(Gutiérrez y Sánchez, 2017).
Características
Escherichia coli se caracteriza por poseer bacilos Gram negativos, no
esporulante, producción de indol a partir de triptófano, no utilización de citrato
como fuente de carbono y no producción de acetoína. Además, fermenta la
29
glucosa y la lactosa con producción de gas. Como todas las bacteria Gram
Negativo, la cubierta de E. coli consta de tres elementos: la membrana
citoplasmática, la membrana externa y, entre ambas, un espacio periplásmico
constituido por péptido glucano. Esta última estructura confiere a la bacteria su
forma y rigidez, y le permite resistir presiones osmóticas ambientales
relativamente elevadas (Gonzalez, 2013).
Es una bacteria mesófila, su óptimo de desarrollo se encuentra en el entorno
de la temperatura corporal de los animales de sangre caliente (35 a 43 ºC). La
temperatura límite de crecimiento se sitúa alrededor de 7 ºC, lo que indica que
un control eficaz de la cadena de frío en las industrias alimentarias es esencial
para evitar el crecimiento en los alimentos. La congelación tiene pocos efectos
sobre la población de esta bacteria en el alimento, y no garantiza la destrucción
de un número suficiente de bacterias viables para asegurar su inocuidad (Merino,
2018). Sin embargo, es sensible a temperaturas superiores a 70 ºC, a partir de
la cual son fácilmente eliminadas; por ello, es muy importante la pasteurización
de alimentos como la leche, zumos, etc., para garantizar su eliminación.
Además de la temperatura, el pH y la actividad de agua pueden influir en la
proliferación de E. coli. las condiciones óptimas de desarrollo para estos
parámetros son de 7,2 y 0,99 respectivamente. El desarrollo de E. coli se detiene
a pH extremos (inferiores a 3,8, o superiores a 9,5), y valores de aw inferiores a
0,94. Por ello, el grado de acidez de un alimento puede constituir un factor de
protección y garantizar su seguridad.
2.2.7.2 Alimentos asociados
La contaminación fecal de las redes de abastecimiento de agua y los
manipuladores de alimentos contaminados, han sido implicados muy
30
frecuentemente en brotes de enfermedad causados por E. coli
enteropatógeno (EPEC), E.coli enteroinvasor (EIEC) y E. coli
enterotoxigénico (ETEC) que produce en los tejidos del hospedador toinas
lábiles al calor (ST) (Instituo de Salud Publica, 2013). Son varios los alimentos
implicados en infecciones por este microorgaqnismos como por ejemplo
sustitutivos del café, hortalizas, ensaladas y purés de patatas, sushi, quesos
blandos madurados por mohos, carne picada insuficientemente cocida
(hamburguesas) y accidentalmente la leche fresca. Los porcentajes aproximados
de presencia de este microorganismo en alimentos es, carne de vacuno 3 a 7 %,
carne de cerdo, aves de corral y carne de cordero 1 a 3 %.
2.2.7.3 Características Coloniales
En la actualidad existen muchos medios para el cultivo de aislamiento e
identificación de enterobacterias. Soria (2009) refiere que el cultivo mencionado
fue desarrollado por MacConkey a comienzos del siglo XX. Este medio está
basado en el hecho de que las sales biliares son precipitadas por los ácidos.
Dentro de los microorganismos entéricos tenemos fermentadores de lactosa
y no fermentadores. Los microorganismos fermentadores de lactosa dan
colonias rosadas a rojas con o sin precipitado biliar, mientras que los no
fermentadores aparecen como colonias trasparentes. La presencia de sales
biliares y cristal violeta inhibe el crecimiento de la mayoría de las bacterias Gram
positivas como Enterococcus y Staphylococcus. La selección de los productos
que entran en su composición evitan el “swarming” del Proteus spp. Este medio
es utilizado con muestras clínicas en flora mixta y también es utilizado en análisis
de alimentos.
31
Las colonias de E. coli en agar Levine EMB. (Eosina y azul de metileno) tienen
2 a 4 mm de diámetro, un centro grande de color oscuro e incluso negro, y tienen
brillo verde metálico cuando se observan con luz refleja. En agar McConkey las
colonias son rojas con halo turbio (Callicó y otros, 2004).
2.2.8 Bacteria Staphylococcus aureus
Características
Pertenece a la familia Staphylococcaceae. Es Gram positivo, aunque las
cepas viejas o los microorganismos fagocitados se tiñen como Gram negativo.
Tiene forma de coco y puede aparecer en parejas, en cadenas o en racimos. Su
tamaño oscila entre 0,8 a 1,5 micras de diámetro, es inmóvil y algunas cepas
producen una cápsula externa mucoide que aumenta su capacidad para producir
infección. En relación con su metabolismo, es anaerobio facultativo, coagulasa
positivo, catalasa positiva y oxidasa negativo.
S .aureus se encuentra habitualmente a nivel de la nasofaringe y de zonas
húmedas como pliegues inguinales y axilas. “A nivel del vestíbulo nasal anterior
la adherencia parece estar mediada por el contenido en ácidos teicoicos. Se
estima que el índice de portación nasal en los adultos es de alrededor del 20-30
%. Expresado longitudinalmente, cerca del 30 % de la población puede ser
portador permanente, el 50 % portador intermitente y el 20 % no es colonizado.
Algunas poblaciones pueden tener una tasa de colonización mayor como el
personal de salud, los pacientes en hemodiálisis, diabéticos, adictos a drogas
intravenosas, etc. A pesar que S. aureus posee numerosos factores de
virulencia, puede convivir con el huésped humano formando parte de su flora
normal sin causar ningún daño. Existen ocasiones en que este equilibrio se
puede romper” (Instituto Nacional de Seguridad e Higiene , 2012).
32
Desde las narinas, los portadores pueden transferir bacterias a diferentes
sectores de la piel, aunque habitualmente existe resistencia a la colonización de
la piel intacta. Sin embargo, un traumatismo (muchas veces desapercibido)
puede dar una puerta de entrada al microorganismo. En caso de infección, por
tanto, S. aureus puede ser muchas veces de origen endógeno.
2.3 Marco legal
Ley Orgánica Del Régimen De La Soberanía Alimentaria
TÍTULO I: Principios Generales Artículo 1. Finalidad.- Esta Ley tiene por objeto establecer los mecanismos mediante los cuales el Estado cumpla con su obligación y objetivo estratégico de garantizar a las personas, comunidades y pueblos la autosuficiencia de alimentos sanos, nutritivos y culturalmente apropiados de forma permanente. El régimen de la soberanía alimentaria se constituye por el conjunto de normas conexas, destinadas a establecer en forma soberana las políticas públicas agroalimentarias para fomentar la producción suficiente y la adecuada conservación, intercambio, transformación, comercialización y consumo de alimentos sanos, nutritivos, preferentemente provenientes de la pequeña, la micro, pequeña y mediana producción campesina, de las organizaciones económicas populares y de la pesca artesanal así como microempresa y artesanía; respetando y protegiendo la agro biodiversidad, los conocimientos y formas de producción tradicionales y ancestrales, bajo los principios de equidad, solidaridad, inclusión, sustentabilidad social y ambiental. El Estado a través de los niveles de gobierno nacional y subnacionales implementará las políticas públicas referentes al régimen de soberanía alimentaria en función del Sistema Nacional de Competencias establecidas en la Constitución de la República y la Ley. Artículo 3. Deberes del Estado.- Para el ejercicio de la soberanía alimentaria, además de las responsabilidades establecidas en el Art. 281 de la Constitución el Estado¸ deberá: Fomentar la producción sostenible y sustentable de alimentos, reorientando el modelo de desarrollo agroalimentario, que en el enfoque multisectorial de esta ley hace referencia a los recursos alimentarios provenientes de la agricultura, actividad pecuaria, pesca, acuacultura y de la recolección de productos de medios ecológicos naturales; Establecer incentivos a la utilización productiva de la tierra, desincentivos para la falta de aprovechamiento o acaparamiento de tierras productivas y otros mecanismos de redistribución de la tierra; Impulsar, en el marco de la economía social y solidaria, la asociación de los microempresarios, microempresa o micro, pequeños y medianos productores para su participación en mejores condiciones en el proceso de producción, almacenamiento, transformación, conservación y comercialización de alimentos;
33
Incentivar el consumo de alimentos sanos, nutritivos de origen agroecológico y orgánico, evitando en lo posible la expansión del monocultivo y la utilización de cultivos agroalimentarios en la producción de biocombustibles, priorizando siempre el consumo alimenticio nacional; Adoptar políticas fiscales, tributarias, arancelarias y otras que protejan al sector agroalimentario nacional para evitar la dependencia en la provisión alimentaria; y, Promover la participación social y la deliberación pública en forma paritaria entre hombres y mujeres en la elaboración de leyes y en la formulación e implementación de políticas relativas a la soberanía alimentaria. TÍTULO III: Producción y Comercialización Agroalimentaria CAPÍTULO I.- Fomento a la producción Artículo 12. Principios generales del fomento.- Los incentivos estatales estarán dirigidos a los pequeños y medianos productores, responderán a los principios de inclusión económica, social y territorial, solidaridad, equidad, interculturalidad, protección de los saberes ancestrales, imparcialidad, rendición de cuentas, equidad de género, no discriminación, sustentabilidad, temporalidad, justificación técnica, razonabilidad, definición de metas, evaluación periódica de sus resultados y viabilidad social, técnica y económica (LORSA, 2008). Normas técnicas relacionadas INEN 1 529-1. Control microbiológico de los alimentos. Preparación de medios de cultivos. INEN 1 529-4. Control microbiológico de los alimentos. Recuento microbiológico. INEN 1 529-8. Numero probable de determinación de coliformes fecales y las pruebas confirmatoria de E. coli e identificación de las especies del grupo coliforme. INEN-ISO 212 (Aceites esenciales. Muestreo (ISO 212:2007, IDT)) INEN-ISO 855 (Aceite esencial de limón (Citrus limon (L.), (ISO 855:2003, IDT).
34
3. Materiales y métodos
3.1 Enfoque de la investigación
3.1.1 Tipo de investigación
El nivel de conocimiento de la investigación fue de tipo explorativa y
descriptiva.
3.1.2 Diseño de investigación
Se planteó una investigación experimental debido a que se trabajó con tres
subespecies de limones (Citrus limon ssp: aurantifolia, lantifolia y meyeri),
mismos que según se ha reportado poseen propiedades de inhibición
bacteriana.
Se extrajo los aceites de las cáscaras, con el fin de determinar las
propiedades de inhibición bacteriana a nivel in vitro.
3.2 Metodología
3.2.1 Variables
Se analizó las siguientes variables:
3.2.1.1 Variables independientes
Tres especies de limón (Citrus limon ssp. aurantifolia, lantifolia y meyeri)
Tres concentraciones de aceites esenciales
3.2.1.2 Variable dependiente
Efecto antimicrobiano del aceite esencial de cada variedad
Diámetro del halo inhibitorio
Número de halos (por cada aceite) por especie bacteriana
3.2.2 Tratamientos
Los tratamientos serán distribuidos de la siguiente manera:
35
El factor A estará compuesto de las 3 variedades de limón y el factor B lo
constituirán las 3 concentraciones de aceites esenciales obtenidas de cada una
de las variedades. Los tratamientos testigos corresponderán al antibiótico
penicilina, eritromicina y estreptomicina (Neogen, USA). Los tratamientos
evaluados se detallan en la Tabla 1.
Tabla 1: Tratamientos de evaluación de la actividad antimicrobiana del aceite esencial de tres especies de Citrus limon contra Escherichia coli y Staphylococcus aureus
N° Factor A (Variedades) Factor B
(concentraciones de aceites) %
Combinación
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
a1:Citrus lantifolia a1:Citrus lantifolia a1:Citrus lantifolia a2:Citrus meyeri a2:Citrus meyeri a2:Citrus meyeri a3:Citrus aurantifolia a3:Citrus aurantifolia a3:Citrus aurantifolia Penicilina Eritromicina Estreptomicina
b1: 25 b2: 50 b3: 75 b1: 25 b2: 50 b3: 75 b1: 25 b2: 50 b3: 75
a1b1 a1b2 a1b3 a2b1 a2b2 a2b3 a3b1 a3b2 a3b3
Espinel, 2019
3.2.3 Diseño experimental
Se aplicó un diseño Completamente al Azar DCA A x B con arreglo factorial
32 + 3 Para el desarrollo de esta investigación. La comparación de medias de los
tratamientos se realizará con la aplicación del test de Tukey (p
36
Tabla 2. Tabla de dosificación de los aceites esenciales
Especie de limón μL
Citrus aurantifolia Swingle
5 10 15
Citrus lantifolia 5 10 15
Citrus meyeri 5 10 15
Espinel, 2019.
3.2.4 Recolección de datos
Recursos
Recursos materiales
Aceites Esenciales:
Citrus lantifolia
Citrus meyeri
Citrus aurantifolia Swingle
Equipos de Laboratorio:
Balanza (Elite 200-3)
Equipo de Destilación (Tecnal TE-2761/20)
Autoclave (Mediclife YX- 280D)
Insumos:
5 kg. de cascara de limón de cada variedad
Agua
Utensilios:
Cuchillo
Caja Petri
Reactivos:
Agar Macconkey sorbitol 500 g. (Acumedia, USA)
Agar Baird Parker (Acumedia, USA)
Discos con antibióticos (Difco, USA)
37
Cultivo de E. coli. (ATCC 25922, INSPI- Ecuador, 2019)
Cepas de S. aureus (ATCC 25923, INSPI- Ecuador, 2019)
3.2.4.2 Métodos y técnicas
Extracción de Aceite esencial de cascara de Limón (Citrus aurantifolia)
Vapor de agua 90 °C
15 kg. De limón
Aceite esencial
Recepción materia
prima
Selección y
clasificación de la MP
Pelado
Pesado
Condensado
Decantación
Envasado
Extracción
Almacenado
Separación del agua
con el aceite
Figura 1. Diagrama de flujo de la extracción de aciete esencial de la cáscara de limón (Citrus aurantifolia) Espinel, 2020
5 kg. De cáscara
38
Procedimiento:
Recepción de la materia: Se lava la materia prima, las variedades de C.
limon.
Selección y clasificación: Se procede a seleccionar los limones que
cumplan con los requisitos para elaborar los aceites esenciales.
Pelado: Se empieza a pelar la fruta ya que solo nos va a servir el epicarpio.
Pesado: Se pesa todo el epicarpio obtenido en el pelado.
Extracción: En el primer balón de destilación se agrega agua para generar
vapor. A partir del vapor que se genera (90 °C), vamos a producir un arrastre del
vapor del aceite esencial que se encuentra en la cascara del limón, el cual va
continuar en forma de vapor hasta el tubo refrigerante.
Condensación: En el tubo refrigerante se condesa el vapor convirtiéndose
en estado líquido, consigo va a llevar el aceite. Se tendrá una mezcla de agua y
el aceite esencial de limón. En un decantador se va a separar el agua del aceite
esencial.
Envasado: Se envasa el producto en un frasco de vidrio ámbar.
Almacenado: Se lo almacena a temperatura ambiente.
Preparación del medio de cultivo agar Mac Conkey
Procedimiento
Pesar el medio, por 300 mL. de agua destilada se utiliza 15.45 g. del medio
de cultivo.
Colocar en un vaso de precipitación de litro, aforar con agua destilada hasta
completar 300ml. De agua destilada, mezclar hasta disolver.
Medir el pH 7.2 ± 0.2 a 25 °C.
Fundir en el microondas hasta que hierva (5 minutos).
39
Transferir a un Erlenmeyer de litro para colocar en el auto clave.
Autoclavar a 121 °C, 0.1 MPa por 15 minutos, dejar enfriar hasta 45 °C.
Dispensar en caja petri 20 mL por cada una.
Preparación del medio de cultivo agar Baird Parker
Procedimiento
Pesar el medio, por 300 mL. de agua destilada se utiliza 19.05 g. Del medio
de cultivo. La preparación de EYT (Egg Yolk Tellurite) se realiza para 300 mL
de agua destilada se le pone 15 g, esta preparación se le agrega en un
Erlenmeyer.
Colocar en un vaso de precipitación de litro, aforar con agua destilada hasta
completar 300 mL. De agua destilada, mezclar hasta disolver.
Medir el pH 6.8 ± 0.3 a 25 °C.
Fundir en el microondas hasta que hierva (5 minutos).
Transferir a un Erlenmeyer de litro para colocar en el auto clave.
Autoclavar a 121 °C, 0.1 MPa por 15 minutos, dejar enfriar hasta 45 °C.
Se le agrega la preparación de EYT y se lo mezcla bien.
Dispensar en caja petri 20 mL. Por cada una.
Método de determinación de sensibilidad antimicrobiana por difusión
La sensibilidad bacteriana a los antimicrobianos in vitro se puede determinar
por varios métodos pero el método que se va a utilizar es por determinación de
sensibilidad antimicrobiana por difusión.
Preparación del Inóculo
Se esteriliza la caja Petri
Preparación del medio de cultivo y siembra la cepa, dejando incubar por 24
horas a una temperatura de 37 °C.
40
Colocar los aceites esenciales en los discos antibiograma para incluirlos en
la caja Petri para continuar con la incubación de la cepa.
Después de las 24 horas que se dejó incubar la cepa, se prepara las
diferentes concentraciones del aceite y del testigo, colocando los discos en el
cultivo.
Observar el halo de inhibición, medir el diámetro o por recuento de
microorganismos y ver resultados.
3.2.5 Análisis estadístico
Para valorar estadísticamente los efectos de los tratamientos se empleó el
análisis de varianza, cuyo esquema se indica en la Tabla 3. Los datos fueron
sometidos a pruebas de normalidad y homocedasticidad.
Tabla 3. Esquema de análisis de Varianza
Factores de Variación Grados de Libertad
Factor A (Variedades) (a-1) Factor B (Dosis) (b-1) Interacción AB (a-1) (b-1) Factorial Vs testigo 1 (f-1) Factorial vs testigo 2 (f-1) Factorial vs testigo 3 (f-1) Error experimental (ab+3) (r-1) Total tr-1
2 2 4 1 1 1
24 35
Espinel, 2020
41
4. Resultados
4.1 Extracción de los aceites esenciales
La extracción de los de aceites esenciales de las diferentes especies de C.
limon, se la trabajo por el método arrastre de vapor donde se utilizó las cortezas
de cada especie de limón con la ayuda de cantidades muy pequeñas de agua.
La corriente de vapor fue de una temperatura de entre 110 °C y 132 °C, que
arrastra de 0,1 a 1,2 % de aceite a una zona donde tiene lugar la evaporación a
muy baja presión. Se pudo observar que la extracción del aceite esencial de C.
meyeri duro 2 días, donde se extrajo 8 onzas, mientras que la especie de C.
lantifolia y C. aurantifolia, donde se extrajo 7 onzas y se demoró en su extracción
3 días.
A continuación se muestran las características físicoquímicas de los aceites
esenciales de las especie de limón bajo estudio.
Tabla 4. Resultados de los análisis fisicoquímico de los aceites esenciales
Análisis C. aurantifolia C. meyeri C. lantifolia
Índice de refracción 1,5100 1,4720 1,4760
Densidad Relativa 0,8572 0,8460 0,8462
Solubilidad en alcohol Soluble Soluble Soluble
pH 7,1 6,0 6,9
Espinel, 2019
4.2 Evaluar el efecto antibacteriano del aceite esencial extraído de la
especies de C. limón sobre Escherichia coli y Staphylococcus
Las concentraciones que mayor control inhibitorio fue de 15 µL tanto para el
aceite esencial de C. aurantifolia que presentó la mayor inhibición ante la cepa
S. aureus, mientras C. lantifolia presento mayor inhibición para E. coli.
Las mediciones de los halos presentados en los crecimientos en caja Petri son:
Tabla 5. Medición del halo bacteriano de Staphylococcus aureus en muestras con aceites esenciales de C. limon y antibioticos.
42
Antibióticos Halo (mm) Aceite utilizado (15 µL) Halo (mm)
Penicilina 2.0 C. aurantifolia 2.0
Eritromicina Estreptomicina
1.0 1.0
C.lantifolia C. meyeri
1.0 1.0
Espinel, 2020
Tabla 6. Medición del halo bacteriano de Escherichia coli en muestras con aceites esenciales de C. limon y antibioticos.
Antibióticos Halo (mm) Aceite utilizado (15 µL) Halo (mm) Penicilina 0 C. aurantifolia 0
Eritromicina Estreptomicina
2.0 0.25
C. lantifolia C. meyeri
1.5 0.5
Espinel, 2020
Los datos estadísticos demostrados en la Tabla 7. fueron analizados con el
programa SPSS v. 16., donde los datos estadísticos con la prueba de Tukey es
0.000 (p 0,05)
Espinel, 2020.
4.3 Comparar el efecto antibacteriano de los aceites esenciales frente a los
antibióticos comerciales
Se observo que el efecto antibacteriano de los aceites esencial C. lantifolia y
C. aurantifolia tiene un control de crecimiento bacteriano similar al de los
antibióticos, ante S. aureus y E. coli. Demostrando que es una alternativa muy
eficaz para sustituir el uso de antibióticos.
43
Tabla 8. Conteo bacteriano en muestras con aceites esenciales de C. limon y antibioticos.
Microorganismo Aceite utilizado (15 µL)
Contaje microbiano
UFC
Antibióticos Contaje microbia
no UFC
Staphylococcus aureus
C. aurantifolia 1x10 Penicilina 10 x 10
Staphylococcus aureus
C. lantifolia 1x10 Eritromicina 1 x 10
Staphylococcus aureus
C. meyeri 3 x 101 Estreptomicina 1 x 103
Espinel, 2020.
Tabla 9. Conteo bacteriano en muestras con aceites esenciales de C. limon y antibioticos
Microorganismo
Aceite utilizado(15 µL)
Contaje microbiano
UFC
Antibióticos Contaje microbiano
UFC Escherichia coli C. aurantifolia 10x10 Penicilina 10 x 10 Escherichia coli C. lantifolia 5.0 x 10 Eritromicina 5.0 x 10 Escherichia coli C. meyeri 1.5 x 102 Estreptomicina 10 x 102
Espinel, 2020
Los datos estadísticos realizados en la Tabla 10 fueron analizados con el
programa SPSS v. 16., donde hay diferencia significativas en los resultados. Se
puede encontrar una relación más significativa entre los aceites esenciales de
“C. aurantifolia” y “C. lantifolia” y entre los antibioticos “Penicilina” (Testigo 1) y
“Estreptomisina” (Testigo 3).
Tabla 10. Contaje microbiano Test:Tukey Alfa=0,05 DMS=1,20188 Error: 0,1667 gl: 24 Tratamientos Medias n E.E. T8 2,67 3 0,24 A T9 2,67 3 0,24 A Penicilina 2,33 3 0,24 A T7 2,33 3 0,24 A T6 1,00 3 0,24 B T5 1,00 3 0,24 B T1 1,00 3 0,24 B T2 1,00 3 0,24 B Eritromicina 0,67 3 0,24 B Estreptomicina0,33 3 0,24 B T4 0,00 3 0,24 B T3 0,00 3 0,24 B Medias con una letra común no son significativamente diferentes (p > 0,05)
Espinel, 2020.
44
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b1:5 uL b2:10 uL b3:15 uL
Factor B (Dosis)
6
30
55
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Co
nte
o
C. auratifolia
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b1:5 uL b2:10 uL b3:15 uL
Factor B (Dosis)
24
57
90
123
156
Co
nte
o
C. meyeri
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b1:5 uL b2:10 uL b3:15 uL
Factor B (Dosis)
6
30
55
80
105
Co
nte
o
C. auratifolia
45
5. Discusión
La extracción de las diferentes especies de C. limon fueron realizados por el
método de arrastre de vapor, el cual es el método más eficaz y utilizado para la
extracción de aceites esenciales como indica la investigación de Lopez y Peredo
(2010) donde confirma que hay diferentes metodos de extracción por
disolventes, la extracción por fluidos supercitricos, por medio del uso de
microondas, entre otros, pero el mas convencional es por arrastre de vapor pero
son necesarios tiempos de extracción prolongados.
Las propiedas fisicoquimicas de los aceites esenciales o esencias son
diversas, donde los valores de estos parametros suelen variar según el tipo o
especie de materia prima, tal como lo indica Oviedo (2008). Cabe destacar que
estos valores deben estar adjuntos a los parámetros indicados por la norma ISO
855.
Las industrias de cítricos ha mostrado un crecimiento, la cual fue originada
por la gran demanda de productos a base de frutas, de acuerdo a la investigación
de Navarreta, Gil y Durango (2009), donde confirma que la producción de
productos elaborados con frutas ha conllevado a la generación de una gran
cantidad de residuos, los cuales tienen potencialidad como material de partida
para la elaboración de productos comerciales con alto valor agregado como:
aceites esenciales, aceites fijos y fibras entre otros. Este trabajo describe la
extracción y caracterización del aceite esencial de obtenido, mediante arrastre
con vapor, a partir de desechos agroindustriales. Se evaluó el efecto de la
presión de vapor, el espesor y el número de capas del material vegetal, sobre el
rendimiento y calidad del aceite esencial.
46
Se comprueba que el aceite esencial de las tres variedades de C. limon tienen
un efecto antibacteriana en menor cantidad en la bacteria E. coli, que son
bacterias Gram negativas y en mayor control en S. aureus, que son bacterias
Gram positivas, donde se demostró datos de acorde a la investigación de Argote
(2017), donde manifiesta que la capacidad antibactericida de los aceites
esenciales de eucalipto y limón, los que tuvieron mayor inhibición con las
bacterias Gram positivas y para la Gram negativa el aceite de mandarina.
El aceite esencial de C. lantifolia tuvo un mayor control contra la bacteria S.
aureus, esto se debe que esta variedad tiene mayor cantidad de monoterpenos
como el D-limoneno como indica la investigación que realizo Montero Celis
(2010), donde demuestra que el C. lantifolia es rica en monoterpenos como el D-
limoneno y por la misma naturaleza lipídica del aceite esencial, es probable que
la actividad antimicrobiana se deba a la habilidad de penetrar y romper la
estructura lipídica de la 44 pared celular de algunas bacterias, conduciendo a la
desnaturalización de las proteínas y destrucción de membranas celulares
permitiendo la salida del citoplasma, lisis celular y eventualmente muerte celular.
Las cantidades que se utilizó de los aceites fueron de 10μl y 15μl, en el cual
se demostró que tuvo mayor resultado inhibitorio fue las cantidades de 15μl como
se demuestra en la investigación de Black, Ventura, Barrera y Bautista (2017),
demoslos aceites de mayor connotación fueron el aceite de canela que inhibió el
crecimiento micelial de A. alternata, mientras que, la germinación se inhibió 100
% con la presencia de aceites de limón y epazote (0.25 y 0.5 μL∙ mL-1).
47
6. Conclusiones
Con base en los resultados obtenidos se plantean las siguientes
conclusiones:
El aceite esencial que tuvo una mayor inhibición contra S. aureus provino de
la variedad aurantifolia y el que inhibió el crecimiento de E. coli. Fue el aceite de
la variedad de lantifolia.
El aceite esencial que tuvo menor resultado inhibitorio fue el que se extrajo
de C. Meyeri tanto para E. coli, como para S. aureus.
El antibiótico (Testigo) que se observó que tuvo un mayor índice de
efectividad en E. coli, fueron los discos con penicilina y para S. aureus, fue la
Streptomicina.
En función de los resultados obtenidos y la discusión planteada se acepta la
hipótesis: “Los aceites esenciales del limón poseen actividad antibacteriana”.
48
7. Recomendaciones
Se recomienda utilizar para la extracción de aceite esencial de limón 5 kg de
cascara de de limón para obtener 7 onzas de aceite esencial.
Al analizar la efectividad de los aceites esenciales de las tres variedades de
C. limon se recomienda emplear para la inhibición de E. coli, el aceite de la
variedad C. aurantifolia (conocido como Criollo), y para S. aureus el aceite de C.
lantifolia, (conocido como limon Tahiti).
Se recomienda el uso prioritario de aceites esenciales del limon en sus
variedades C. aurantifolia y C. lantifolia, por su eficaz control frente a las
bacterias. Considerando que este compuesto yace en los ‘desechos’ -en este
caso la cáscara del limon, siendo efectiva, sin el inconveniente de que las
bacterias se vuelvan resistentes como sucede con los antibioticos.
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8. Bibliografía
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