Análisis de la secuencia del gen DCDC2 asociado a Dislexia Evolutiva en una muestra de pacientes colombianos
Gineth Alexis López Colorado
Universidad Nacional de Colombia
Facultad de Medicina
Maestría en Neurociencias
Bogotá, Colombia
2016
Análisis de la secuencia del gen DCDC2 asociado a Dislexia Evolutiva en una muestra de pacientes colombianos
Gineth Alexis López Colorado
Tesis presentada como requisito parcial para optar al título de:
Magister en Neurociencias
Director:
JUAN JOSÉ YUNIS LONDOÑO MD, MSc
Profesor Titular
Grupo Patología Molecular – Universidad Nacional de Colombia
Codirectora:
MARÍA FERNANDA LARA DÍAZ MSc., PhD
Profesora Asociada
Departamento de Comunicación Humana – Universidad Nacional de Colombia
Universidad Nacional de Colombia
Facultad de Medicina
Maestría en Neurociencias
Bogotá D.C. Colombia
Junio de 2016
A mi preciosa hija, María Isabel.
Cada persona debe trabajar para su mejoramiento y
al mismo tiempo participar en la responsabilidad
colectiva de toda la humanidad.
Marie Curie
Agradecimientos
El presente proyecto es un trabajo colaborativo de instituciones y personas que participaron
para su adecuada realización.
En primer lugar agradezco a la Dirección de Investigación Sede Bogotá (DIB) por financiar el
proyecto y a la Maestría en Neurociencias de la Universidad Nacional por haberme vinculado
en su programa y permitirme aprender así como también por posibilitarme el uso de espacios y
materiales de la institución.
Quisiera hacer extensiva mi gratitud a la Liga Central Contra la Epilepsia, Colegios Nueva
Esperanza I.E.D., Colegio Alfonso López Pumarejo I.E.D y el Gimnasio Moderno San Sebastián
por permitirme el acceso a sus historias y contacto con los pacientes vinculados al proyecto. A
los niños y niñas y familias por su participación y confianza en la investigación.
Me gustaría agradecer de manera especial al Doctor Juan José Yunis Londoño, director de
esta investigación, por el interés mostrado en mi tema de investigación, la orientación en la
parte molecular y administrativa, el seguimiento, el apoyo y la confianza continúa de la misma.
De la misma manera agradezco a la Doctora María Fernanda Lara Díaz, codirectora de la
investigación, por la orientación fundamental en la consecución del desarrollo teórico y práctico
del diagnóstico de la Dislexia.
Agradezco al Doctor Diego Fernando Espíndola Abril por el interés mostrado por mi trabajo,
explicación de la aplicación de la prueba Evaluación Neuropsicológica Infantil y las sugerencias
dadas frente a la parte clínica de la investigación.
Un reconocimiento a mis compañeros de Laboratorio del Instituto de Genética de la
Universidad Nacional (IGÚN) principalmente al profesor Andrés Mauricio Pinzón, Carlos
Eduardo Arboleda, Angélica Alarcón e Irene Riveros y compañeros de la Maestría en Genética
quienes con sus explicaciones orientaron el aprendizaje en técnicas del laboratorio y análisis de
la información.
A mi familia y a mis amigos por su colaboración, tiempo, ánimo y apoyo incondicional durante el
tiempo que se desarrollo el proyecto.
A todos ellos, muchas gracias.
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Resumen
Introducción. La Dislexia Evolutiva o Trastorno Específico de la Lectura es uno de los trastornos neuroconductuales más frecuentes, con tasas de prevalencia entre el 5% al 17%, se caracteriza por una alteración en la capacidad para desarrollar la lectura con fluidez y precisión en sujetos con capacidades sensoriales y oportunidades educativas adecuadas. La dislexia ha sido asociada con los alelos del STR READ1, un polimorfismo de repeticiones cortas en tándem en el intrón 2 del gen DCDC2. Objetivo: Se analizó la deleción y los alelos de READ1 ubicados en el intrón 2 del gen DCDC2 en pacientes colombianos con Dislexia en edades comprendidas entre los 7 y 16 años de edad. Materiales y métodos. La selección de pacientes se realizó teniendo en cuenta historia clínica y escolar, adicionalmente se aplicó la batería Evaluación Neuropsicológica Infantil (Matute, et al., 2007) para determinar su desempeño en las medidas de fluidez, precisión y comprensión lectora. El ADN se obtuvo de sangre venosa o de células bucales. Se analizó la deleción mediante amplificación por PCR convencional seguidas de electroforesis y los alelos de READ1 mediante Secuenciación. Resultados. Se encontró diferencia estadísticamente significativa entre pacientes con dislexia vs controles en los alelos del gene DCDC2 (p=>0,02004), de igual forma, en el análisis de subgrupos, la presencia del alelo D en el grupo de Dislexia de Superficie mostró una asociación estadísticamente seignificativa. (p=0.0028). Conclusión. Este estudio relacionó la dislexia con la deleción y los alelos de READ1 ubicados en el intrón 2 del gen DCDC2 descritos en estudios previos, lo que sugiere que su asociación podría ser un factor de susceptibilidad para el componente genético cognitivo y la lectura en las lenguas transparentes como el español. Palabras Clave. Dislexia Evolutiva, gen DCDC2, Deleción, Alelos READ1 (elemento regulador asociado a la dislexia 1), STR (repeticiones cortas en tándem) y Colombia.
6 Análisis de la secuencia del gen DCDC2 asociado a
Dislexia Evolutiva en una muestra de pacientes colombianos
SUMMARY
Introduction: Dyslexia or Specific Reading Disabilities are neurobehavioral disorders that affect between 5% to 17%, of school-aged children, depending on the criteria used to make the diagnosis, and it is characterized as a heterogeneous disorder that compromises the ability of reading and spelling in subjects despite adequate sensory skills and schooling opportunities for learning. Previously, READ1 alleles, a polymorphic short tandem repeat compound within intron 2 of risk gene DCDC2, was associated with dyslexia. Objective: We assessed the interactions between the deletion and alleles of READ1 within intron 2 of risk gene DCDC2 in Colombian patients with Dyslexia among children between 7 and 16 years of age. Materials and methods: Medical and school history was used for patient selection. The Child Neuropsychological Evaluation Battery (Matute, et al., 2007) was applied to determine their performance on measures of fluency, accuracy and reading comprehension. DNA was obtained from venous blood or buccal cells. Deletion was analyzed by conventional PCR amplification and electrophoresis followed READ1 alleles by sequencing. Results: A statistically significant association between Dislexia and the DCDC2 deletion allele was found (p value=>0,02004). Furthermore, the presence of the allele “D” was found to be statistically significant associated with surface dislexia (p 0.0028). Conclusion: This study linked dyslexia with the deletion and READ1 alleles located within intron 2 of the DCDC2 gene described in previous studies, suggesting that his association could be a susceptibility genetic factor for cognitive and reading components, in transparent languages such as Spanish. Key words: Developmental dyslexia, DCDC2 gene, Deletion, Alleles READ1 (regulatory element associated with dyslexia 1), STR (Short Tandem Repeat) and Colombia.
7
Contenido
Pág.
Resumen………............………………………………………………………………………….V
Lista de figuras………………………………………………………...…………………………IX
Lista de figuras………………………………………………………...………………………….X
Introducción………………………………………………………………………………………XI
1.Planteamiento del problema……………………………………………………………….15
2. Justificación………………………………………………………………………………….18
3. Objetivos………………………………………………………………………………………19
3.1 Objetivo General…………………………………………………………………………….19
3.2 Objetivo Específico…………………………………………………………………………19
4. Marco Teórico…………………………………………………………………………………20
4.1 Naturaleza de las dificultades de la lectura ..................................................... ……..20
4.2 Manifestaciones comportamentales de la Dislexia .................................................. 23
4.3 Teorías y déficits causales de la dislexia del desarrollo ........................................... 24
4.4 Bases neurobiológicas de la dislexia ...................................................................... 29
4.5 Neurogenética de la Dislexia .................................................................................. 31
5. Metodología ............................................................................................................. 42
5.1 Población de estudio….. .......................................................................................... 42
5.2 Instrumentos ........................................................................................................... 43
5.3 Procedimientos........................................................................................................ 44
5.4 Diseño Experimental ............................................................................................... 46
5.5 Análisis estadístico .................................................................................................. 47
8 Análisis de la secuencia del gen DCDC2 asociado a
Dislexia Evolutiva en una muestra de pacientes colombianos
6. Resultados ............................................................................................................... 48
6.1 Frecuencias genotípicas .......................................................................................... 48
6.2 Frecuencias Alélicas ................................................................................................ 49
6.3 Análisis de los Subgrupos de Dislexia ..................................................................... 49
7. Discusión y Conclusiones ...................................................................................... 54
7.1 Discusión ................................................................................................................. 54
7.2 Conclusiones ........................................................................................................... 56
6.3 Limitaciones del estudio y recomendaciones ........................................................... 57
Anexos…………………………………………...…………………………………………………58
Glosario…………………………………………………………………………………………….65
Bibliografía…………………………………………...……………………………………………69
9
Lista de figuras
Pág.
Figura 1: Modelo para la lectura. ..................................................................................................... 23
Figura 2: Los sistemas neurales compensatorios de las personas con dislexia. ........................... 31
Figura 3: Patrones candidatos de expresión génica en el cerebro ................................................. 35
Figura 4: Interacción de Doublecortin en la migración neuronal………………….………………… 38
Figura 6: Diseño Experimental………………………………………….……….……...……..………....48
Figura 7: Fotografía de una amplificación de PCR (homocigotos y heterocigotos)….…….....……51
Figura 8: Electroferograma con estructura completa de las Unidades 1 y 2 obtenido mediante Software SeqScape. ... 61
Figura 9: Electroferograma con paciente heterocigoto con deleción de una unidad. .................... 61
Figura 10: Supresión de las unidades 1 y 2 de la secuencia. ......................................................... 62
Figura 11: Secuencia de paciente homocigoto (I/I) mediante Software MSR.………………...…... 63
Figura 12: Descomposición de la secuencia en “alelo mayor” y “alelo menor” en paciente heterocigoto. ... 63
10 Análisis de la secuencia del gen DCDC2 asociado a
Dislexia Evolutiva en una muestra de pacientes colombianos
Lista de tablas
Pág.
Tabla 1: Tipos de Dislexia en español…..………………………………………………………………………...26
Tabla 2: Revisión de GWAS publicados…………………………………………………………………..………33
Tabla 3 Datos Sociodemográficos…………………………………………….………..……..…………….…….42
Tabla 4: Distribución de los alelos del STR READ1 y la Deleción en el intrón 2 del gen DCDC2...............54
Tabla 5: Frecuencias genotípicas de los alelos d READ1 en pacientes en los grupos…………………......51
Tabla 6: Frecuencias alélicas para el STR READ1 del gen DCDC2.………................................................52
Tabla 7: Frecuencias alélicas de READ1 en las diferentes cohortes………………..……………….............52
Tabla 8. Distribución de los genotipos en los Subgrupos………………………………………………………54
Tabla 9. Distribución de los alelos en los Subgrupos………………………………………………..…............54
Tabla 10. Condiciones de amplificación por PCR para la Microdeleción y el polimorfismo STR READ1...59
Tabla 11. Protocolo para la amplificación por PCR………………………………….…………………………..60
11
Introducción
El Trastorno Específico de la Lectura o Dislexia Evolutiva es uno de los trastornos
neuroconductuales más frecuentes en la edad escolar, con una prevalencia reportada que oscila
entre el 5% a 10% e incluso hasta 17,5%; esta amplia gama es el resultado de diferentes
factores tales como las características clínicas, la variación en la definición, los criterios de
diagnóstico y la lengua materna (Paracchini, et al., 2007) y a partir de estudios con gemelos, se
estima que la influencia genética es de 60-70% (Wilke, et al., 2009).
De acuerdo con el Manual Diagnóstico y Estadístico de los Trastornos Mentales de la Asociación
Estadounidense de Psiquiatría DSM-5 (APA, 2015), el Trastorno de la Lectura es definido como
la dificultad significativa en el rendimiento en las pruebas de deletreo, decodificación, fluidez,
entonación y comprensión, y que se sitúa sustancialmente por debajo del esperado en función de
la edad cronológica, del coeficiente de inteligencia y de la escolaridad propia de la edad.
En cuanto a su definición y etiología, se ha dado un considerable progreso en todos los niveles
de análisis en los últimos años. A un nivel neuropsicológico, la teoría fonológica sigue siendo la
que ofrece mayor evidencia, aunque cada vez es más claro que los problemas fonológicos
interactúan con otros factores de riesgo de tipo cognitivo (Ramus, et al., 2003). Desde el
enfoque neurobiológico, las investigaciones recientes confirman que la dislexia se caracteriza por
una disfunción de la cadena de habla hemisferio izquierdo normal y también implica un desarrollo
anormal de la sustancia blanca. Otros estudios demuestran que muchas diferencias neurales
observadas reflejan causas y no los efectos de la dislexia. En un nivel de riesgo etiológico, se
han identificado seis genes candidatos han sido identificados (Peterson & Pennington, 2012).
Estudios previos independientes han sido desarrollados en el Reino Unido, Estados Unidos y
Japón y han identificado loci de riesgo y genes candidatos que parecen ser muy prometedores
para una mejor comprensión de la Dislexia (OMIM 608706), pero que han aportado muy poca
información sobre los mecanismos moleculares (Powers, et al., 2013).
12 Análisis de la secuencia del gen DCDC2 asociado a
Dislexia Evolutiva en una muestra de pacientes colombianos
En el presente documento se realizó una caracterización de algunos de los genes más
relacionados con la Dislexia (Trastorno Específico de la Lectura), término que se utilizará de aquí
en adelante para fines de este documento, y se analizó específicamente la secuencia del
DCDC2, un gen miembro de la familia doublecortin, que se encuentra en el cromosoma 6p22,3 y
en el que se identificó dentro de su intrón 2, una microdeleción (BV677278) de 2445 pb que
codifica polimorfismo tipo STR dentro de sus puntos de interrupción (Meng, et al., 2011).
Recientemente, se demostró que BV677278 se une a ETV6, una proteína nuclear expresada
en el cerebro con alta especificidad y que es capaz de modular la expresión del gen DCDC2
desde la región promotora. También se refirió que los patrones de activación en áreas del
cerebro relacionadas con la lectura, medidas por resonancia magnética funcional, están
influenciados por alelos de BV677278, los cuales se asocian específicamente con discapacidad
en pruebas de lectura y ortografía de una sola palabra (Powers, et al., 2013).
El objetivo de este estudio fue verificar los hallazgos recientes de los estudios realizados en
Estados unidos, Japón y Europa en una cohorte colombiana de casos y controles, ya que es
importante para establecer la asociación en varios idiomas dadas las diferencias en el tipo de
correspondencia entre la forma fonológica y ortográfica, siendo el español una lengua de
ortografía transparente. Para la selección de pacientes se administró la batería Evaluación
Neuropsicológica Infantil (Matute, et al., 2007) para determinar su desempeño en las medidas de
fluidez, precisión y comprensión lectora. Posteriormente se el ADN se obtuvo de sangre venosa
o de células bucales, las cuales se procesaron en el Laboratorio de Neurociencias del Instituto
de Genética de la Universidad Nacional de Colombia. Se analizó la deleción y los alelos del STR
READ1 mediante amplificación por PCR seguidas de electroforesis en gel de Agarosa.
Finalmente, para la identificación de alelos heterocigotos y homocigotos sin la deleción, se
realizó una secuenciación en Sanger y el análisis se llevó con los programas SeqScape V.5.4
(Biosystems, 2003) y Mixed Sequence Reader (Chang, et al., 2012). En el presente documento
se proporciona un glosario de términos genéticos y psicológicos para los lectores que no están
familiarizados con los términos técnicos correspondientes a cada área.
13
1. Planteamiento del problema
La dislexia es una discapacidad oculta; las personas que la presentan son a menudo
brillantes y no tienen signos externos de un problema. Para muchos, esto representa un
obstáculo significativo debido a su dificultad para la lectura, por definición, inesperada, y parece
que tienen todo el equipamiento cognitivo necesario para ser buenos lectores, por lo que los
niños disléxicos están a menudo sin diagnosticar, mal diagnosticados, o peor, acusados de no
esforzarse lo suficiente o de no estar motivados o de ser "perezosos". Dado que las personas
que son disléxicas no tienen signos visibles de su dificultad, muchos incluso ponen en duda la
existencia misma de la dislexia (Shaywitz, 2003).
La dislexia representa el prototipo por excelencia de un trastorno específico del aprendizaje,
interfiere significativamente en el rendimiento académico o las actividades de la vida cotidiana
que exigen habilidades para la lectura en pacientes que la presentan. Una de las mayores
dificultades a las que se enfrentan estas personas es encontrar un diagnóstico e intervención
adecuados; por lo cual se hace necesario establecer la correlación con la base genética y cómo
las causas (neurológicas, cognitivas y sensoriales) o los factores ambientales como el estilo de
aprendizaje de lectura y los comportamientos lectores pueden incidir en el desarrollo de este
trastorno (Ardila, et al., 2006).
En los últimos años se ha impuesto el modelo de déficit fonológico como base cognitiva que
permite entender la dislexia. Dicho modelo, a la luz de las últimas investigaciones en genética y
en psicología cognitiva, no ofrece una respuesta totalmente satisfactoria a diversos pormenores
relacionados con la comorbilidad y ciertas características de la dislexia (Artigas, 2009). Los
trastornos asociados más comunes con la dislexia, y que repercuten directamente en el
aprendizaje, agravando más las dificultades manifiestas son el Trastorno de Escritura,
Trastorno por Déficit de Atención con o sin Hiperactividad (TDAH), el Trastorno del cálculo, el
Trastorno de la coordinación y los trastornos afectivos y/o comportamentales (Alvarado, et al.,
2007) y el Trastorno Especifico del Lenguaje (Bishop & Snowling, 2004).
Sin duda, la habilidad para la lectura está depositada en los genes, dada la alta heredabilidad
que se pone en evidencia al comparar la coincidencia entre gemelos homocigotos y dicigotos.
14 Análisis de la secuencia del gen DCDC2 asociado a
Dislexia Evolutiva en una muestra de pacientes colombianos
Sin embargo, difícilmente se puede pensar en ‘genes alterados’, puesto que la lectura, como se
ha dicho, es un invento reciente en la humanidad siendo dependiente de la cultura. En este
caso, los genes se supone que influirán simplemente en la facilidad o dificultad para aprender
una técnica inventada por el hombre. No obstante, es coherente admitir que distintas
combinaciones genéticas pueden influir favorable o desfavorablemente en la habilidad lectora.
Los genes relacionados con la dislexia tienen unas características que comparten una parte
importante de los genes implicados en los trastornos cognitivos del desarrollo. Los genes
cognitivos se caracterizan por ser cuantitativos y pleiotrópicos. Además, en el campo de los
trastornos del neurodesarrollo, dichos genes se implican de modo poligénico y con
heterogeneidad (Artigas, 2009).
Estas investigaciones implican lugares específicos del cerebro donde los genes relacionados
con la lectura y el lenguaje se expresan, y probablemente se alteran permitiendo el desarrollo
de la dislexia. Al menos catorce genes candidatos han sido propuestos para la dislexia, pero
hasta la fecha algunos tienen poca evidencia de apoyo. Dentro de los tres loci asociados a la
dislexia más replicados, se han identificado cuatro genes candidatos: DYX1C1 en DYX1 en el
cromosoma 15q21, DCDC2 y KIAA0319 en DYX2 en el cromosoma 6p21, y ROBO1 en DYX5
en el cromosoma 3p12-q12 (Raskind, et al., 2013).
En estudios previos también se identificó y genotipificó una deleción de 2445pb, y un STR
compuesto dentro de sus puntos de interrupción, en el intrón 2 del gen DCDC2. Esta
microdeleción (GenBank BV677278) es altamente polimórfica, rica en purina y abarca una
repetición corta en tándem (STR). En el estudio de Meng (2005), se puso de manifiesto que
cuando la microdeleción se combinó con varios de los más raros alelos del STR, se observó
una fuerte asociación con endofenotipos para la discapacidad de la lectura (DL).
En la investigación realizada por Powers y colaboradores (2013), se replica y amplía la
asociación previa entre BV677278 con discapacidad de la lectura (DL) y el trastorno del
lenguaje (TL), y se demuestra que al menos dos de sus alelos confieren riesgo de un efecto
perjudicial sobre la lectura y el lenguaje y que éstos interactúan genéticamente con un
haplotipo de riesgo del gen KIAA013 que influye en el lenguaje, la lectura y el coeficiente
intelectual.
15
De acuerdo con los hallazgos encontrados en otras cohortes y evidenciando la importancia de
corroborar sus mecanismos moleculares en lenguas como el español, en este proyecto se quiso
analizar en una muestra colombiana de casos y controles, si la relación entre la presencia de la
deleción y los alelos de READ1 es significativa y puede considerarse un factor de riesgo para la
Dislexia. Así mismo, se correlacionan alelos de riesgo específicos con los endofenotipos
correspondientes a la dislexia y se plantea la siguiente pregunta de investigación:
La Dislexia tradicionalmente se ha considerado como un déficit conductual (Artigas, 2009); sin
embargo, debido a los hallazgos encontrados en genes como el DCDC2 ¿Sería posible
analizarlo como un trastorno genético vinculado a una alteración estructural (deleción y alelos de
riesgo del STR READ1) de una parte de la secuencia genética, a partir de la cual suele haber
manifestaciones multisistémicas asociadas al trastorno?
16 Análisis de la secuencia del gen DCDC2 asociado a
Dislexia Evolutiva en una muestra de pacientes colombianos
Justificación
La complejidad del proceso de la adquisición de la lectura y la escritura, la variedad de errores
observados, su alta comorbilidad con otros trastornos y las diferentes aproximaciones teóricas han
hecho muy difícil llegar a una definición universalmente aceptada de la Dislexia del Desarrollo. En
consecuencia, una abundante y larga historia de investigación ha acompañado a este concepto en
los últimos 100 años, así como una importante controversia en relación a su naturaleza,
diagnóstico y tratamiento (Branchetiere, 2004).
De acuerdo con la Asociación Internacional de Dislexia (2002), la dislexia es una dificultad
específica de aprendizaje y de origen neurobiológico. Se caracteriza por la dificultad para
reconocer palabra de forma precisa y/o con fluidez y por deficiencias en las habilidades de
ortografía y decodificación.
Dentro de los efectos secundarios del trastorno se producen dificultades como las siguientes:
a) De acuerdo con Benítez (2009), la dislexia evidencia precisamente la dificultad en el
reconocimiento y la comprensión de los fonemas/sílabas/palabras, lo que dificulta la adquisición
de nuevo vocabulario, la fluidez de la lectura y la consecuente falta de comprensión de la misma.
b) Según Bishop & Snowling (2004), los niños con dislexia pueden desarrollar una aversión a la
lectura a causa de una falta de fluidez; por lo tanto, limitan su propia exposición a los libros.
c) Puede afectar a la propia imagen de una persona. Los estudiantes con dislexia a menudo
terminan por sentirse "tontos" y menos capaces de lo que realmente son. Después de
experimentar una gran cantidad de estrés debido a problemas académicos, un estudiante puede
desanimarse acerca de continuar en la escuela (International Dyslexia Association, 2002).
Finalmente, al analizar la dislexia, es crucial considerar que los mismos genes podrían tener
consecuencias específicas en los diferentes idiomas (Wilke, et al., 2009). Así como anteriormente,
se han realizado estudios en inglés y alemán, ahora es importante desarrollar estudios con el
idioma español debido a que existen fuertes diferencias en la regularidad de la correspondencia
grafema-fonema.
17
3. Objetivos
3.1 Objetivo general
Analizar la asociación de la secuencia del gen DCDC2 con Dislexia Evolutiva en una
muestra de pacientes Colombianos.
3.2. Objetivos específicos
Determinar las frecuencias alélicas y genotípicas de la variante deleción en el gen DCDC2
en pacientes y controles.
Determinar las frecuencias alélicas del STR READ1 presente en la secuencia del gen
DCDC2 en pacientes y controles.
Establecer si existe o no asociación de la deleción y de los alelos STR READ1 con dislexia
en una muestra de la población colombiana.
18 Análisis de la secuencia del gen DCDC2 asociado a
Dislexia Evolutiva en una muestra de pacientes colombianos
4. Marco Teórico
4.1. Naturaleza de las dificultades de la lectura
Leer y escribir son procesos cognitivos complejos que los niños y niñas en culturas letradas
deben aprender durante los primeros años de escolaridad. La mayoría adquieren estos
aprendizajes a un ritmo adecuado y sin esfuerzo aparente, pero otros, con capacidad cognitiva
intelectual normal media e incluso superior, manifiestan dificultades. Algunos de ellos presentan
un retraso simple de aprendizaje de lenguaje escrito, que suelen normalizar con ayuda y práctica
dentro del propio contexto escolar. Pero entre el 2% y el 4%, se sitúan sustancialmente por
debajo de sus compañeros. En este caso se considera que sufren un trastorno especifico de
aprendizaje que puede afectar exclusivamente a la lectura (dislexia del desarrollo) (Navarra-
Alzamora, et al., 2014).
Para aprender a leer es indispensable un funcionamiento adecuado de los sistemas sensoriales
y motores básicos así como la integridad de los componentes ortográficos, fonológicos y
semánticos, los cuales al interactuar conjuntamente permiten obtener significados a partir de la
escritura. Es decir, la lectura requiere un procesamiento visual de la palabra escrita seguido de
una comprensión de que estos símbolos pueden fragmentarse en sus elementos fonológicos
subyacentes a partir de los cuales se debe extraer el significado. Como se puede observar, en el
proceso de la lectura intervienen distintos niveles de procesamiento de la información: procesos
periféricos, intermedios y centrales. La presencia de cualquier alteración en algunos de los
distintos niveles cognitivos y neurológicos mencionados ocasionaría una dificultad en la
adquisición de la lectura. La complejidad de este proceso, la variedad de errores observados, su
alta comorbilidad con otros trastornos y las diferentes aproximaciones teóricas han hecho muy
difícil llegar a una definición universalmente aceptada de la dislexia de desarrollo (Branchetiere,
2004).
Para favorecer la interpretación de los resultados, analizar los perfiles individuales y comprender
mejor la naturaleza y manifestaciones de los desórdenes evolutivos, Morton & Frith (1995)
propusieron el modelo evolutivo causal. Este modelo que es neutral con respecto a cualquier
teoría particular, pretende establecer las relaciones entre: (1) los factores biológicos, cognitivos,
comportamentales y ambientales y (2) los desórdenes del desarrollo.
19
La propuesta de estos autores contemplan tres niveles de descripción: cerebro, cognición y
comportamiento. También, introducen el ambiente que puede tener un efecto en cualquiera de
estos tres niveles. Los problemas particulares se representan, de manera convencional, en un
apartado y se localizan dentro de uno de los niveles descriptivos (cerebro, cognición, conducta
ó medio ambiente). La figura presenta el esquema del modelo.
De acuerdo al modelo, los factores biológicos, cognitivos y comportamentales que se
relacionan de distinta forma y, por lo tanto, ofrecen diferentes alternativas para comprender y
explicar los desórdenes de lectura. Entre los factores biológicos se identifican el desarrollo
embriológico, los factores hormonales o funcionales del cerebro que también influyen en el
aprendizaje de la lectura. Esto significa que en el desarrollo del lenguaje, los factores
contextuales y los aspectos biológicos interactúan entre sí en el proceso de aprender a leer.
Por consiguiente, la mayoría de las dificultades en lectura son consecuencia de un fallo en la
relación entre factores biológicos, cognitivos y contextuales. En general las diferencias
individuales en la adquisición de la lectura son causadas por la interacción entre los genes y el
ambiente (Gayán & Olson, 2003; Morton, 2004; Perfetti, 1999) (Grigorenko, et al., 2000).
A otro nivel, el cognitivo, los niños con dislexia muestran déficit en: la formación de una
estructura cognitiva responsable de la comprensión de la relación grafema- fonema y del
procesamiento del habla o el sistema fonológico. Más allá de la dificultad para establecer
correspondencias entre grafemas y sonidos, los factores cognitivos incluyen en: la dificultad en
el sistema de control de atención; la memoria a corto plazo; la dificultad en la percepción de
patrones acústicos y visuales; el procesamiento general de información; el pobre desarrollo del
sistema fonético – fonológico; la dificultad en comprender el sistema de correspondencia
grafema fonema; o problemas en el procesamiento fonológico del lenguaje hablado (Leitão &
Fletcher, 2004; Mody, 2003; Morton, 2004; Pennington & Bishop, 2009).
Por su parte, los factores comportamentales son la evidencia de la influencia de efectos
biológicos y cognitivos en conjunto. Algunos ejemplos de efectos comportamentales son:
problemas en la articulación, fallos en la segmentación silábica, dificultades en la
denominación, poco conocimiento de las letras, dificultades en la planificación del habla,
problemas en la comprensión o producción del sistema fonético – fonológico, y fallas en la
percepción visual y auditiva (Morton, 2004).
20 Análisis de la secuencia del gen DCDC2 asociado a
Dislexia Evolutiva en una muestra de pacientes colombianos
Figura 1. Modelo Evolutivo Causal para la Lectura. Tomado de: Morton, J. (2004). Adaptado por Lara, Aguilar y Serra (2005).
21
4.2 Manifestaciones comportamentales de la Dislexia
La Dislexia, es un trastorno neuroconductual complejo, con tasas de prevalencia entre el 5% y el
17% dependiendo de los criterios de diagnóstico aplicados. Se caracteriza por una alteración de
la capacidad de lectura en sujetos con una inteligencia normal y oportunidades educativas
adecuadas (Meng, et al., 2005).
La Dislexia de Desarrollo o Dislexia Evolutiva es definida como una dificultad inesperada en el
procesamiento de lenguaje escrito (Powers, et al., 2015) que no se explica por un déficit en la
inteligencia general, falta de oportunidades educativas, problemas motivacionales o dificultades
sensoriales (Branchetiere, 2004)
Algunos problemas de lectura específicos se asocian con la dificultad para descifrar las palabras
y/o para reconocer palabras poco frecuentes. Para evaluar, se utilizan la decodificación, la
lectura de pseudopalabras o no palabras que pueden pronunciarse mediante la aplicación del
principio alfabético, pero no están asociados con un significado convencional, mientras que para
evaluar la lectura real de la palabra, se utilizan palabras escritas que están asociados con uno o
más significados convencionales (Raskind, et al., 2013).
De acuerdo con el DSM-5, el Trastorno de la Lectura es uno de los Trastornos Específicos del
Aprendizaje y es definido como “…Un rendimiento en lectura (esto es, deletreo, precisión,
velocidad, entonación o comprensión de la lectura, evaluadas mediante pruebas normalizadas
administradas individualmente) que se sitúa sustancialmente por debajo del esperado en función
de la edad cronológica, del coeficiente de inteligencia y de la escolaridad propia de la edad del
individuo…” (APA, 2015). El DSM-5 plantea los siguientes criterios para hacer el diagnóstico de
trastorno específico de la lectura pertinente:
1. Presenta errores en la lectura de palabras o la lectura de lenta y esforzada (ej. Lee en voz alta palabras de manera incorrecta y o lentamente y con vacilaciones, frecuentemente adivina palabras, tiene dificultades para pronunciar las palabras).
2. Presenta dificultades en la comprensión del significado de lo que lee (ej. Puede leer el texto correctamente pero no comprende las frases, las relaciones entre ellas, las inferencias o el significado más profundo de lo que lee).
3. Presenta dificultades para deletrear (ej. Puede cometer adiciones, omisiones, o sustituciones de vocales o consonantes).
22 Análisis de la secuencia del gen DCDC2 asociado a
Dislexia Evolutiva en una muestra de pacientes colombianos
La Asociación Internacional de la Dislexia (2002), la define como una discapacidad de
aprendizaje específica que es de origen neurológico y se caracteriza por las dificultades en la
precisión y/o fluidez en el reconocimiento de palabras, además con habilidades pobres de
ortografía y decodificación general, estas dificultades son el resultado de una deficiencia en el
componente fonológico del lenguaje que es a menudo inesperado en relación con otras
habilidades cognitivas y la provisión de instrucción eficaz en el aula. Consecuencias colaterales
pueden incluir problemas con la comprensión de la lectura y la reducida experiencia con la
lectura que podría impedir el incremento de vocabulario y conocimientos básicos.
Finalmente, conviene distinguir también entre dislexia y retraso lector. No todos los problemas en
el aprendizaje de la lectura pueden calificarse como dislexia. Un gran porcentaje de niños con
dificultades lectoras padecen retraso lector. Frente a la dislexia, el retraso lector es inespecífico,
puede explicarse por causas ajenas a la propia lectura: cociente intelectual bajo, déficit
sensoriales y/o motores, déficit cognitivos y lingüísticos generales, escolaridad deficiente,
privación sociocultural, problemas emocionales, motivacionales o daños neurológicos
sobrevenidos. Además, de forma general, los errores son más leves y en menor cantidad y los
niños responden mejor y más rápidamente a la intervención.
4.3 Teorías y déficits causales de la dislexia del desarrollo
El trastorno tiene una persistencia a lo largo de toda la vida; el retraso en la lectura es solamente
una de sus manifestaciones. Más allá del consenso, y a pesar de décadas de intensa
investigación, las causas cognitivas y biológicas subyacentes de retardo en la lectura aún se
debaten intensamente. De hecho, existen no menos de tres teorías fundamentales según el
predominio del déficit causal (Ramus, et al., 2003): visual fonológico y de automatización.
Cada teoría es apoyada por conjuntos alternativos de evidencia empírica, representada
principalmente por los diferentes subgrupos de pacientes que muestran características
específicas (Paracchini, et al., 2007).
En español, se distinguen tres tipos de dislexia: Dislexia de Superficie, Dislexia Fonológica y
Dislexia Profunda. A continuación se exponen cada uno de éstos subtipos (Cuetos, et al., 2002).
23
Tabla 1. Tipos de Dislexia en Español
Tipos de Dislexia en castellano
TIPOS DESCRIPCIÓN
Dislexia de Superficie
o Semántica
Su déficit radica en el léxico ortográfico, ya que no distingue las palabras por su forma ortográfica. Inventan palabras Dificultad para leer palabras irregulares. Confusiones en la comprensión de homófonos Errores de regularización Conversión de palabras en pseudopalabras. Ejemplos: Leer /hola y ola/ /oruga-hormiga/
Dislexia Fonológica
La utilización de esta vía lleva a leer dificultosamente todas aquellas palabras no conocidas o inventadas (pseudopalabras). Dificultad para leer pseudopalabras. Se encuentra dificultad para reconocer las correspondencias entre grafemas y
fonemas Dificultad para leer palabras infrecuentes. Errores visuales Lexicalizaciones. Ejemplos: Leer /papel por gapel/ o /gorila por gojipa/
Dislexia Profunda o mixta
Comenten errores de tipo semántico, visual y derivativos, e igualmente son incapaces de leer correctamente palabras abstractas, funcionales y pseudopalabras. Es la dislexia más difícil de tratar. Dificultad para leer pseudopalabras, a consecuencia de alteración en la ruta
fonológica, y la producción de errores semánticos. Ejemplos: Leer /capitán por coronel/, /Jueves por Martes/ Incapacidad para leer pseudopalabras. Peor lectura de palabras abstractas que concretas Peor lectura de palabras funcionales que de contenidos Peor lectura de verbos que de sustantivos y adjetivos Errores semánticos Errores visuales Sustitución de una palabra funcional por otra.
24 Análisis de la secuencia del gen DCDC2 asociado a
Dislexia Evolutiva en una muestra de pacientes colombianos
4.3.1. Modelo del déficit fonológico
Desde este enfoque, la dislexia se caracteriza por dificultades con el reconocimiento fluido y/o
preciso de las palabras y por habilidades débiles de deletreo y de codificación. Típicamente, sus
dificultades resultan de un déficit en el componente fonológico del lenguaje, que a menudo es
inesperado con relación a otras habilidades cognitivas y una adecuada instrucción (Shaywitz,
2005).
A nivel neurológico, comúnmente se asume que el origen del trastorno es una disfunción
congénita de áreas perisilvianas del cerebro correspondientes al hemisferio izquierdo que
subyace a las representaciones fonológicas o que vincula lo fonológico con las representaciones
ortográficas. La evidencia que apoya la teoría fonológica proviene del desempeño deficiente de
los individuos disléxicos en pruebas que requieren habilidades fonológicas (por ejemplo, la
segmentación y manipulación consciente de los sonidos del lenguaje). Sin embargo, la evidencia
de deficiencia en la memoria verbal a corto plazo y la lentitud en la denominación automática en
los disléxicos también apunta hacia un déficit fonológico más básico, tal vez en relación con la
calidad de las representaciones fonológicas, o su acceso y recuperación (Ramus, et al., 2003).
Los niños tienen dificultades en segmentar el lenguaje fonológicamente en tareas que implican
síntesis, aislamiento, segmentación y omisión de fonemas; tienen dificultades al nombrar y
utilizan códigos de memoria a corto plazo ineficientes. Este tipo de dificultades ha llevado a
muchos investigadores a localizar el locus próximo de la dislexia en el reconocimiento de
palabras (López, 2007).
El problema de los niños diagnosticados con dislexia está en el desarrollo de las reglas de
conversión grafema-fonema como consecuencia de sus déficits fonológicos y consecuentemente
del desarrollo de las representaciones léxicas. El déficit fonológico es el que le impide a los niños
establecer relaciones entre las letras y sus correspondientes sonidos, es decir, en la adquisición
del principio alfabético.
25
4.3.2 Modelo del déficit en la recepción Visual o Dislexia diseidética
Según estas teorías, los errores de predominio visual que se producen en la lectura
(sustituciones, inversiones, omisiones y rotaciones de grafemas, sustituciones de palabras por
semejanza visual), dificultades de progresión secuencial en el rastreo ocular…) tienen que
implicar básicamente a los análisis visual de palabras y de identificación de los grafemas (sean
fijaciones binoculares, los procesos sensoriales y perceptivos y/o los atencionales de captación
simultánea de estímulos) (Navarra-Alzamora, et al., 2014).
La teoría visual no excluye un déficit fonológico, pero se consigue una aportación visual para la
lectura de los problemas, al menos en algunos individuos disléxicos. A nivel biológico, la
etiología propuesta de la disfunción visual se basa en la división del sistema visual en dos vías
distintas que tienen diferentes funciones y propiedades: la magnocelular y las vías
parvocelulares. La teoría postula que la vía magnocelular se interrumpe selectivamente en
ciertos individuos disléxicos, dando lugar a deficiencias en el procesamiento visual, y, a través
de la corteza parietal posterior, al control binocular anormal y atención visuoespacial (Ramus,
et al., 2003).
Los niños afectados se concentran en fonemas y no en estructura del grafema, es decir, las
palabras irregulares se escriben fonéticamente correctas, pero ortográficamente mal. Cuando
una palabra se analiza grafémicamente, se evidencian problemas al leer letras similares o
letras que difieren sólo en su orientación espacial (por ejemplo, bd, pq, s-z-c). Incluso la lectura
"espejo" o la escritura aparece. Debido a los déficits en la palabra visual y el reconocimiento de
letras, omisión de letras o palabras enteras es común. Además, los niños del subtipo
diseidética a menudo pierden la línea de base (renglón) o palabra de posición durante la lectura
(Wilke, et al., 2009).
4.3.3. Modelo del déficit de automatización
La manera más obvia para desafiar la especificidad del déficit fonológico es postular que es
secundaria a un déficit auditivo más básico. Esta es la afirmación de la teoría del
procesamiento auditivo rápido, que especifica que el déficit radica en la percepción de sonidos
cortos o que varían rápidamente. El apoyo a esta teoría surge de la evidencia de que los
26 Análisis de la secuencia del gen DCDC2 asociado a
Dislexia Evolutiva en una muestra de pacientes colombianos
disléxicos muestran bajo rendimiento en una serie de tareas auditivas, incluida la discriminación
de frecuencia y de orden temporal (Ramus, et al., 2003). Adicionalmente, el entrenamiento
perceptivo mejora los procesos de lectura en algunos disléxicos (Taipale, et al., 2003).
Los déficit de automatización y rapidez afectan principalmente a los mecanismos de acceso y
conversión de entrada y/o salida, a la programación fonorarticuladora y a la grafomotora. En las
primeras fases del aprendizaje de la lectura estos déficit afectarían a la adquisición de los
procesos de conversión subléxica grafema-fonemas (lentitud en la simbolización y/o en la
programación fonoarticulatoria), y, en las fases más avanzadas a los procesos de
descodificación por la ruta léxica, que provocarían sobre todo un deletreo persistente y mala
prosodia) (Navarra-Alzamora, et al., 2014).
Una relación específica entre los déficits no lingüísticos se refiere al cambio de atención. Dentro
de un marco multisensorial "El cambio lento de atención", cuando los disléxicos se ocupan de
secuencias de estímulos rápidos, su sistema de atención automática no puede desenganchar lo
suficientemente rápido de un elemento al siguiente, produciendo el procesamiento lento y
degradado. Se supone que se distorsionan las redes corticales, más específicamente aquellas
que apoyen en representaciones sub-léxicas auditivo-fonológicas (por ejemplo, sílabas y/o
fonemas) y visual-ortográficas (por ejemplo, sílabas y/o grafemas). Cambio de atención y
deficiencias en el procesamiento rápido se han propuesto como un problema más básico
cediendo al deterioro fonológico observado en personas con dislexia (Ruffino, et al., 2014).
Un problema importante sin resolver es si la atención espacial también puede acelerar la
velocidad a la que se procesa la información. La atención espacial no sólo mejora la resolución
espacial, también acelera la velocidad de procesamiento de la información. Por otra parte,
permite que las decisiones se basen en información en la ubicación seleccionada por sí sola, sin
tener en cuenta ningún estímulo de distracción. Sobre la base de estos efectos de percepción y
atención espacial influye en todos los procesos de post-sensoriales, tales como el contenido de
la memoria a corto plazo, las decisiones de percepción y respuestas voluntarias (Ruffino, et al.,
2014).
27
4.4 Bases neurobiológicas de la dislexia
En unos procesos tan complejos como los del aprendizaje de la lectura y escritura tienen que
intervenir, forzosamente, diversas estructuras cerebrales, corticales y subcorticales, y numerosas
redes neuronales de interconexión. Partiendo de los modelos de doble ruta, las principales
regiones cerebrales en la lectura se han identificado en el hemisferio izquierdo (Navarra-Alzamora,
et al., 2014).
Las áreas temporo parietales (Región dorsal) se asocian a la ruta subléxica por ser las más
activas en la conversión grafema-fonema (proceso de análisis secuencial). Estas son áreas
que tienen más participación en el aprendizaje de la lectura en sistemas ortográficos
trasparentes.
Las áreas occipito-temporales (región ventral) están implicadas en la ruta léxica y sin las
más activas en el reconocimiento visual global de las palabras escritas (procesamiento
simultáneo). Su participación es destacable en el aprendizaje de la lectura en sistemas
ortográficos opacos como el inglés.
Las áreas inferiores frontales participan en los procesos articulatorios orales y el acceso a la
representación léxica y semántica de áreas posteriores, entrando en acción sea cual sea el
sistema ortográfico de aprendizaje.
Estas regiones cerebrales se activan de forma diferente dependiendo, no solo del sistema
ortográfico de aprendizaje, sino también de factores como el método de enseñanza, la edad de
inicio de aprendizaje, el nivel adquirido de la competencia lectora, la frecuencia de aparición de las
palabras escritas y su longitud (Navarra-Alzamora, et al., 2014).
Actualmente, las técnicas de neuroimagen y el rápido desarrollo de las neurociencias han permitido
establecer las peculiaridades y anomalías de los sistemas neuronales que sirven para la lectura y
cómo estos sistemas difieren en lectores disléxicos (Shaywitz & Shaywitz, 2008), aunque todavía
no se conocen con exactitud los mecanismos neurológicos alterados. (Meng, et al., 2005) (FIGURA
2).
28 Análisis de la secuencia del gen DCDC2 asociado a
Dislexia Evolutiva en una muestra de pacientes colombianos
FIGURA 2. Los sistemas neurales compensatorios y las bases neuronales de la necesidad de tiempo adicional para estudiantes disléxicos en las pruebas de lectura de alta complejidad. La imagen es una vista en sección del cerebro que muestra los hemisferios izquierdo y derecho. Lectores sin alteración activan tres sistemas neurales hemisferio izquierdo para la lectura: un sistema anterior y dos sistemas posteriores. Lectores disléxicos tienen una alteración en los sistemas neuronales de la lectura (hemisferio posterior izquierdo), pero compensan mediante el desarrollo de sistemas anteriores en los hemisferios derecho e izquierdo y el homólogo posterior del área de forma visual de la palabra en el hemisferio derecho (Shaywitz & Shaywitz, 2008).
En el caso de la dislexia, como se ha explicado anteriormente, el déficit nuclear parece
debeserse con una disfunción del componente fonológico de la memoria de trabajo verbal. El
cerebro de los individuos disléxicos presenta diversos tipos de malformaciones estructurales, así
como patrones anómalos de actividad cerebral durante las tareas de lectura y deletreo, que
conciernen, entre otras, a las áreas que integran el dispositivo de procesamiento cuya actividad
se ha asociado con estas actividades en la población no disléxica (Benitez-Burraco, 2007).
29
La relación entre las áreas anteriores y posteriores del cerebro es interesante. En las personas
disléxicas, las regiones posteriores, tales como la zona de Wernicke, el giro angular y las
cortezas extra estriada y estriada muestran fallas en activación durante la lectura,
especialmente a medida que aumenta la dificultad de establecer la relación entre fonemas y
grafemas. Por otro lado, las regiones anteriores muestran un patrón de sobre activación, aun
frente a las tareas de análisis fonológicos más simples (Shaywitz, et al., 2002). A su vez, este
tipo de trastornos se ha convertido en el punto de partida fundamental de los análisis de
carácter genético que, haciendo uso generalmente del paradigma de la clonación posicional,
buscan determinar la naturaleza de los factores moleculares que resultan disfuncionales o
funcionales en dichos trastornos (y, por extensión, que serían determinantes para la
emergencia ontogenética y el funcionamiento normal de los centros cerebrales implicados en el
procesamiento lingüístico) (Benitez-Burraco, 2007).
4.5 Neurogenética de la Dislexia
4.5.1 Genes de susceptibilidad candidatos para la dislexia
Los estudios genéticos previos realizados con niños, sugieren que este trastorno es
genéticamente complejo, con al menos una docena de genes que tienen un papel importante en
su desarrollo, y que influyen de forma específica en la dislexia y la variación del desarrollo
neurológico normal, subyacente en la lectura y la ortografía (Bates, et al., 2010). El patrón de
herencia de la dislexia (autosómico dominante, autosómico recesivo o poligénico) no ha podido
establecerse de manera inequívoca (Benitez, 2007), sin embargo los análisis de ligamiento y de
asociación, han determinado la existencia nueve regiones (DYX1-DYX9), numeradas por el
Comité de Nomenclatura de genes humanos. De estos loci, la región candidata 6p21-p22, debe
ser considerada como una de las más prometedoras, ya que varios grupos han informado de
forma independiente vinculación entre DYX2 y la dislexia (Schumacher, 2006). Los estudios de
30 Análisis de la secuencia del gen DCDC2 asociado a
Dislexia Evolutiva en una muestra de pacientes colombianos
asociación han presentado genes implicados con mecanismos biológicos que tratan de explicar
la aparición y desarrollo de la dislexia, los cuales son descritos a continuación:
TABLA 2. Revisión de GWAS publicados
Revisión de los GWAS publicados en dislexia
ESTUDIO DISEÑO POBLACIÓN CASOS CONTROLES GENES ASOCIADOS
FRECUENCIA No.
SNPS
Cope, y otros, (2005)
Caso-Control
Reino unido (Muestra de
Cardiff y Oxford) 223 273
VMP, KIAA0319, TTRAP y ELLOS2
5–10% 20
Elbert, Maureen, Cate-Carter,
Pitch, Kerr & Bar (2011)
Caso-Control
Toronto 48 KIAA0319
17
Ludwig y otros, (2008)
Estudio de familias
Alemania 244 KIAA0319 y DCDC2
4
Luciano, Lind, Duffy, Castles, &
Wright (2007)
Estudio de hermanos gemelos y
no gemelos
Brisbane, Queensland
Australia 855 KIAA0319 y TTRAP
10
Dennis MY, Paracchini, Scerri
TS, Prokunina-Olsson L, Knight JC, et al. (2009)
Estudio de familias
Reino unido 264 KIAA0319
7
Meng, y otros (2005)
Estudio de familias
(padres y hermanos)
Colorado 147 DCDC2
5-17%
39
Ludwig, y otros (2008)
Estudio de familias
Alemania 1.188 DCDC2
2
Scerri TS (2011) Caso-Control
Alemania 3.725 DCDC2, KIAA0319
y CMIP
3%–5% 19
Schumacher y otros (2006)
Caso-Control
Alemania 47 47
VMP/ DCDC2 /KAAG1 y
KIAA0319 / TTRAP /THEM2
5%–12%
19
Marino C y otros, (2011)
Estudio de familias
nucleares Italia 180 DCDC2 y DYX1C1
2
Taipale y otros (2003)
Caso Familia
Helsinki, Finlandia
35 113 DYX1C1 3% - 10%
8
Bates, Lind, Luciano,
Montgomery, Martin, & Wright
(2010)
Estudio de familias
(gemelos y no
gemelos)
Brisbane, Australia
790 DYX1C1
4
Hannula-Jouppi, y otros (2005)
Caso-Control
Helsinki, Finlandia
27 100 ROBO1 3% - 10%
2
Wilcke y otros
Caso-
Turingia,
19
14
FOXP2
5
31
Según Ludwig y colaboradores (2008) los resultados de varios estudios de ligamiento genético
han apuntado hacia un locus de susceptibilidad en el cromosoma 6p21-p22 (DYX2). Esta
región alberga dos grupos de genes independientes en estrecha proximidad entre sí, a saber,
VMP/DCDC2/KAAG1 y KIAA0319/TTRAP/THEM2. Ambas regiones han recibido el apoyo de
diferentes muestras independientes y se ha llegado a la conclusión de que de los genes
candidatos discutidos hasta ahora, la evidencia de DCDC2 y KIAA0319 es la más convincente.
Galaburda, Loturco, Ramus, & Fitch (2006) reconocen cuatro genes vinculados a la dislexia
(DYX1C1, ROBO1, DCDC2 y KIAA0319) que pueden ser responsables de alteraciones de la
migración celular lo que ocasiona la generación de circuitos anómalos en el cerebro que
afectan a diferentes funciones que son básicas para el proceso lector.
En particular, los estudios de RNAi, sugieren que DYX1C1, DCDC2 y KIAA0319 desempeñan
un papel en la migración neuronal durante el desarrollo de la corteza de rata. Curiosamente, la
migración neuronal alterada ha sido implicado en la dislexia basada en el único estudio
anatómico post mortem realizado hasta la fecha; específicamente, se encontró que los
cerebros de los individuos disléxicos tienen anomalías estructurales sutiles coherentes con la
migración neuronal defectuosa (Dennis, et al., 2009).
4.5.1.1 Gen KIAA0319
Estudios de asociación genética han implicado en el cromosoma 6p22, a KIAA0319 (OMIM
609269) como un gen de susceptibilidad para la dislexia. La variante(s) causal sigue siendo
desconocida, pero se conoce que puede modular la expresión génica, dado que un haplotipo
asociado con dislexia se ha implicado en la reducción de la expresión de KIAA0319, y la
asociación más fuerte se ha encontrado en el exón 1 del gen KIAA0319 (Dennis, et al., 2009).
Este gen codifica una proteína transmembrana que contiene un dominio extracelular. La
proteína codificada puede desempeñar un papel en el desarrollo de la corteza cerebral
mediante la regulación de la migración neuronal y la adhesión celular. Polimorfismos de
nucleótido único en este gen están asociados con la dislexia. En un estudio realizado por
(2012) Control Alemania
Pinel y otros
(2012)
Caso-
Control
Francia
94
FOXP2/KIAA0319/T
TRAP/THEM2
15
Eicher, Powers y otros (2014)
Bases de datos
Colorado
10,259
TDP2 / DCDC2/ KIAA013
5–8 %
27
32 Análisis de la secuencia del gen DCDC2 asociado a
Dislexia Evolutiva en una muestra de pacientes colombianos
Luciano, Lind, Duffy, Castles, & Wright (2007) KIAA0319 y TTRAP han sido implicados como
genes de susceptibilidad para la dislexia, y a partir de la tipificación de diez polimorfismos de
nucleótido único (SNP), se observó asociación significativa con rs2143340 (TTRAP) y
rs6935076 (KIAA0319). La asociación con rs2143340 se encontró en dirección opuesta a la
que se informó en otros estudios.
En un estudio realizado por Dennis (2009) se identificó que variante de riesgo en un haplotipo
del cromosoma 6p22 que disminuye la expresión de KIAA0319 y es probable que el SNP
rs9461045, sea funcionalmente relevante para el desarrollo de la dislexia. Específicamente,
demostraron que rs9461045 es uno de los marcadores más significativamente asociados en los
grupos familiares estudiados; disminuye la expresión génica en ensayos basados en la
luciferasa, y crea un sitio de enlace para una proteína(s) nuclear, que probablemente incluya el
silenciador transcripcional OCT-1.
Recientemente se ha mostrado que los alelos menores (A) de rs9461045 y (G) de rs3212236,
alteran la expresión de genes mensajeros a partir de un constructo de luciferasa en líneas de
células neuronales y no neuronales (Dennis et al, 2009). La alteración en el alelo de
rs71815143 puede funcionar para aumentar el riesgo de dislexia influyendo en la expresión
KIAA0319 (Elbert, et al., 2011). El alelo menor del gen KIAA0319 vinculado a la dislexia
produce una disminución de un 40% de su expresión en estudios in vitro (Paracchini, et al.,
2007), pero todavía no se sabe si esto se traduce a disminuciones similares en el cerebro. Un
desafío importante para estudios futuros, entonces, será establecer relaciones entre las
variantes genéticas específicas y cambios específicos en la función durante el desarrollo del
cerebro humano (Galaburda, et al., 2006)
4.5.1.2 Gen FOXP2
El gen FOXP2 (OMIM 605317) es un gen candidato de gran relevancia, situado en el
cromosoma 7q31, cerca de 7q32, una región genómica de susceptibilidad para la dislexia. Ha
sido relacionado principalmente con el lenguaje y la dispraxia orofacial, sin embargo los
investigadores (Wilcke, et al., 2012), presentaron un primer estudio relacionado con este gen y
dislexia utilizando resonancia magnética funcional (fMRI) y la genética para investigar la
pertinencia de las variantes genéticas en la activación cerebral. La investigación mostró
asociación nominalmente significativa con la dislexia en el SNP rs12533005.
33
El SNP correlacionado se asoció con la expresión alterada de FOXP2 in vivo en el tejido de
hipocampo humano. Por lo tanto, se estudió la influencia de la variante de riesgo rs12533005-G
en la actividad cerebral. FMRI reveló un efecto principal significativo para el factor de "riesgo
genético" en una zona temporo-parietal involucrado en el procesamiento fonológico, así como
un efecto de interacción significativa entre los factores de "desorden" y "riesgo genético" en la
activación de las áreas cerebrales frontales inferiores (Wilcke, et al., 2012).
Por su parte (Pinel, et al., 2012), realizaron una investigación en la que identificaron la
alteración de FOXP2 y polimorfismos de KIAA0319/TTRAP/THEM2 en las redes lingüísticas.
Se estudió la correlación entre los polimorfismos genéticos con la variabilidad interindividual en
la activación cerebral y la asimetría funcional en las cortezas frontal y temporal. En FOXP2, los
SNPs rs6980093 y rs7799109 se asociaron con variaciones de activación en la corteza frontal
izquierda. En el locus KIAA0319/TTRAP/THEM2, se asoció rs17243157 con asimetría en la
activación funcional del surco temporal superior (STS). Sus resultados confirman que tanto el
gen FOXP2 como los genes KIAA0319/TTRAP/THEM2 juegan un papel importante en el
desarrollo del lenguaje humano, pero probablemente a través de diferentes vías cerebrales.
Los efectos corticales observados coinciden con los resultados anteriores de la fMRI en el
desarrollo del lenguaje y trastornos de la lectura, y sugieren que puede existir una continuidad
entre estas patologías y la variabilidad interindividual normal.
4.5.1.3 Gen DYX1C1
DYX1C1 (OMIM 608706) es un gen que consta de 10 exones, se extiende aproximadamente
por 78 kb de ADN genómico y se encuentra cerca del locus DYX1. Ha sido implicado por
primera vez como candidato a la dislexia en un estudio de una familia finlandesa realizado por
Taipale (2003), en el que se evidenció en el análisis la transmisión de una translocación
cromosómica en la secuencia de la variación 15q21.1 y se sugirieron dos polimorfismos de baja
frecuencia asociados con la dislexia: rs3743205 en la región reguladora del gen y rs61761345,
en la creación de un codón de parada prematuro en la región codificadora (Bates, et al., 2010).
Este gen, ha sido considerado como candidato para el desarrollo de la dislexia debido a que
codifica una proteína de dominio de repetición tetratricopeptide nuclear regulada
dinámicamente en el cerebro. Dos cambios de secuencia en DYX1C1, uno que implican la
secuencia de iniciación de la traducción y un Elk-1 factor de transcripción sitio de unión (-3G -
34 Análisis de la secuencia del gen DCDC2 asociado a
Dislexia Evolutiva en una muestra de pacientes colombianos
>A) y un codón (1249G ->T), introduciendo un codón de parada prematuro y el truncamiento de
la proteína predicha por 4 aa, asociado solo y en combinación con la dislexia (Taipale, et al.,
2003).
Según estos investigadores, en el cerebro humano, la proteína DYX1C1 se localiza en una
fracción de las neuronas corticales y células gliales de la materia blanca y concluyen que
DYX1C1 debe considerarse como un gen candidato para la dislexia del desarrollo. El estudio
detallado de su función puede abrir un camino hacia la comprensión de un complejo proceso
de desarrollo y maduración del cerebro humano.
A pesar de la translocación y la evidencia molecular del desarrollo de DYXC1, KIAA0319 y
DCDC2 parecen tener efectos significativos sobre la variación normal en la lectura, que no se
ha demostrado para DYX1C1 (Bates, et al., 2010).
Resultados de un estudio realizado por Bates y colaboradores (2010), en el que presentan la
asociación de este gen con la lectura y la capacidad de ortografía en una muestra de gemelos
adolescentes y sus hermanos. Mostraron asociación significativa en la mutación rs17819126,
para todas las medidas de lectura y la ortografía de las palabras de procesamiento léxico, así
como también observaron en rs3743204 para la lectura tanto irregular y no palabras.
Además de un papel en la migración neuronal, se evidenció recientemente que DYX1C1
interactúa tanto con los receptores alfa y beta de estrógeno, con los niveles de proteína de
estos receptores está reducido en la sobreexpresión de DYX1C1 (Massinen et al., 2009)
citados por (Bates, et al., 2010).
Otro estudio realizado por Schumacher (2006), en el que se realizó una prueba con muestra
inicial y otra con muestra de replicación sugieren que independientemente de la variación
genética en el locus de DCDC2, este contribuye en particular, al desarrollo del trastorno
Estudios previos de asociación de dos genes candidatos de susceptibilidad, DYX1C1 y
DCDC2, basados grupos familiares, encontraron asociación con los procesos de memoria a
corto plazo y de trabajo, mientras que DCDC2 únicamente se encontró asociado con la lectura
de palabras y no palabras (pseudopalabras). Estos resultados sugieren que, si bien ambos
genes influyen en la variación individual en la recuperación y el almacenamiento transitorio de
la información, DCDC2 solo estaría implicado en tareas fonológicas.
35
4.5.2 Caracterización del gen DCDC2 asociado a la Dislexia
4.5.2.1 Gen DCDC2
La historia cromosoma 6 es la más intrigante en hasta el momento cuando de Dislexia se trata.
Señales de vinculación positivas sobre el brazo corto del cromosoma 6 se han reportado
consistentemente en estudios independientes. La concentración de varios grupos en este locus
ha dado como resultado la identificación de no uno, sino dos genes de susceptibilidad
candidatos: KIAA0319 y DCDC2. Los dos genes comparten muchas similitudes: están
físicamente cerca, son ambos expresados en el cerebro y muestran funciones similares
(Paracchini, et al., 2007).
Figura 3: Patrones candidatos de expresión génica en el cerebro. Los niveles relativos de expresión de diferentes genes en diferentes tejidos se han sido determinados utilizando PCR en tiempo real (RT-PCR) y microarrays. El primer gráfico muestra los resultados de un experimento de RT-PCR realizada por Meng y colaboradores (2005), que ilustra los niveles de expresión en KIAA0319 y DCDC2 en diversas regiones del cerebro en relación con el tálamo, y el segundo gráfico representa los datos obtenidos de un experimento de microarrays que muestra los niveles relativos de expresión de KIAA0319 y ROBO1 en diversas regiones del cerebro en relación con el tálamo (Paracchini, et al., 2007).
36 Análisis de la secuencia del gen DCDC2 asociado a
Dislexia Evolutiva en una muestra de pacientes colombianos
A partir de estudios de desequilibrio de ligamiento en DYX2, se reportaron dos grupos de genes
de susceptibilidad para la dislexia, VMP / DCDC2 / KAAG1 y KIAA0319 / TTRAP / ELLOS2.
Junto con sus respectivos grupos investigación Meng (2005) y Schumacher (2006) encontraron
que la asociación más convincente correspondía al dominio doublecortin (DCDC2, OMIM
605755) en dos estudios independientes de los Estados Unidos y Alemania. DCDC2, tipificado
por dos dominios péptidos doublecortin que abarcan los exones 1-2 y 3-5, los cuales intervienen
en los procesos de migración neuronal durante el desarrollo cerebral cortical (Ludwig, et al.,
2008).
El rol más conocido de DCDC2 está en la migración neuronal referido por Karl (2004) quien
ofrece una interesante hipótesis con respecto a la conexión entre DCDC2 y la dislexia. DCDC2
se expresa en células precursoras neuronales, pero no en las neuronas adultas. Contiene
dominios doublecortin cuya función se sabe que es similar a la doublecortin-gen (DCX). DCX se
expresa en la corteza en desarrollo y participa en la estabilización y la migración de las
neuronas. La función conocida de doublecortin-dominios es agrupar y estabilizar los
microtúbulos, que son esenciales en la migración neuronal. Doublecortin también participa por
medio del aparato de Golgi en la migración neuronal dirigida. Una completa falta de resultados
en doublecortin genera defectos cerebrales graves. Estudios del gen DCX relacionados con
DCDC2 indican que una deleción similar a la observada en DCDC2 se encuentra en una región
reguladora e influye en el nivel de expresión génica. Las pérdidas en esta región inducen
disminución de la expresión (Wilke, et al., 2009).
Figura 4. Interacción de Doublecortin en la migración neuronal (Karl, 2004).
37
4.5.2.2. READ1 (Elemento Regulador Asociado a la dislexia 1)
READ1 (GenBank no BV677278), es una variante funcional y altamente polimórfica con seis
alelos comunes y 39 alelos raros descritos hasta ahora. De origen natural y asociado a la
población humana, abarca una microdeleción de 2.445 pb y un compuesto de repeticiones cortas
en tándem (STR) en el intrón 2 del gen DCDC2 y tiene un papel regulador en la transcripción, ya
que se une específicamente a la proteína ETV6 y puede modular la actividad promotora de
DCDC2. Sus alelos varían principalmente por el número de cinco unidades repetidas y en
consecuencia, también varían en longitud.
El polimorfismo STR se compone del número de copias variables de (GAGAGGAAGGAAA)n y
(GGAA)n unidades de repetición. Así mismo, se refirió el hecho de que el marcador STR se
asocia a sitios de unión cerebrales activos de transcripción que favorecen la posible relevancia
funcional de este polimorfismo complejo (Ludwig, et al., 2008). Los datos obtenidos mediante
RT-PCR muestran que DCDC2 se localiza en las regiones del cerebro donde se produce la
lectura fluida, y los estudios de iRNA muestran que la baja regulación de RNA altera la migración
neuronal. Los análisis estadísticos y funcionales son complementarios y concuerdan con los
últimos datos de imágenes clínicas para dislexia. Por lo tanto, se ha propuesto a DCDC2 como
un gen candidato para la discapacidad de la lectura (Meng, et al., 2005).
Figura 4. Estructura del gen DCDC con la microdeleción y el STR. Cromosoma 6p22,1. Locus de DYX2. Localización de la microdeleción (bloque amarillo) y el STR READ1 (línea morada). Los exones están numerados (Powers, et al., 2013).
A fin de realizar el análisis mediante la combinación de 11 alelos, éstos se agruparon por
frecuencia y se encontró que la deleción y varios alelos del STR (alelos 2, 5, 6, 7, 8, 9, y 10)
están fuertemente asociados (p=0,00002) con las medidas de los componentes de la lectura y el
lenguaje. Cuatro haplotipos juntos abarcan la mayor parte de DCDC2 y se asociaron con mal
38 Análisis de la secuencia del gen DCDC2 asociado a
Dislexia Evolutiva en una muestra de pacientes colombianos
desempeño en varias medidas lectura entre aquellos individuos con CI> 80. Para examinar cada
uno alelos de BV677278 asociados a la dislexia, se analizaron los potenciadores de la actividad
relacionada específicamente con DCDC2, mediante la clonación de 600 pb de la región 5´
previos al codón de inicio ATG de DCDC2 (con el supuesto de que esta secuencia contiene al
menos algunos elementos promotores) (Meng, et al., 2011).
De su mecanismo de acción, hasta el momento se conoce que alelos READ1 suprimen la
expresión de KIAA0319 mediante interacción directa, siendo un regulador en cis y dependiendo
de su magnitud y también de la presencia o ausencia de una variante con KIAHap.
Un alelo puede ser perjudicial o de protección dependiendo de su longitud y/o la estructura;
alelos largos con inserciones en unidad de repetición 2 tienden a ser perjudiciales, mientras que
los alelos más cortos con una deleción de una copia de unidad de repetición 1 tienden a ser no
perjudiciales (Powers, et al., 2015).
Los alelos deletéreos son aquellos con mayor longitud, como los alelos 5 y 6, los cuales difieren
por tener 4pb. El alelo 5 tiene un efecto más fuerte que el alelo 6, y afecta preferentemente a las
medidas relacionadas con lectura y Coeficiente Intelectual, mientras que el alelo 6 afecta
principalmente el lenguaje verbal. Cuando los dos alelos se combinan entre sí, sus efectos son
los principales impulsores de sus respectivos fenotipos.
4.5.2.3 Caracterización de la microdeleción
Dentro del gen DCDC2, Meng y colaboradores (2011) identificaron una microdeleción
(BV677278) de 2445pb ubicada en el intrón 2, presente en el 8,5% de las familias de su estudio,
que contiene un polimorfismo tipo STR dentro de sus puntos de interrupción.
Esta microdeleción (GenBank BV677278) es altamente polimórfica, rica en purina y abarca una
repetición corta en tándem (STR). En el estudio de Meng (2005), se puso de manifiesto que
cuando la microdeleción se combinó con varios de los más raros alelos del STR, se observó una
fuerte asociación con un endofenotipo para la discapacidad de la lectura (DL).
4.5.2.4 Caracterización de la Repetición Corta en Tándem (STR-READ1)
En la investigación realizada por Natalie Powers y colaboradores (2013), se replica y amplía la
asociación previa entre BV677278 con dislexia y el trastorno del lenguaje, allí se refiere que este
39
es un elemento regulador que ejerce su efecto a través la proteína ETV6, y se demuestra que al
menos dos de sus alelos confieren riesgo de un efecto perjudicial sobre la lectura y el lenguaje.
También se evidencia que estos dos “alelos de riesgo” del STR BV677278 interactúan
genéticamente con un haplotipo de riesgo del gen KIAA0319 que influye en la lectura, el
lenguaje, y el coeficiente intelectual. Debido a que BV677278 tiene estos efectos, le han
cambiado el nombre “READ1”, que significa “elemento regulador asociado con dislexia 1.” Y es
así como también se denominará en lo sucesivo en este documento.
4.5.2.5 Endofenotipos para la lectura
Aunque no se espera encontrar asociaciones uno-a-uno entre los marcadores y fenotipos de la
dislexia porque, primero, el marcador no es lo mismo que un gen de riesgo, pero es más bien un
segmento de ADN que tiende a heredarse junto con el gen y segundo la mayoría de los
trastornos complejos dependen de la influencia combinada de muchos genes de efecto pequeño,
así como las influencias ambientales (Bishop & Snowling, 2004).
READ1 es una variante altamente polimórfica, específicamente humana, con seis alelos
comunes y 34 alelos raros descritos hasta ahora. READ1 de origen natural, que abarca una
microdeleción de 2.445 pb. Alelos de READ1 varían principalmente por el número de cinco
unidades repetidas discretas y, en consecuencia, también varían en longitud. Funcionalmente, la
hipótesis de que READ1 sirve como un papel regulador de la transcripción, ya que se une
específicamente al represor transcripcional de ETV6 y puede modular la actividad promotora de
DCDC2. Los alelos de riego 5 y 6, contienen una inserción GGAA en relación con el alelo más
común.
40 Análisis de la secuencia del gen DCDC2 asociado a
Dislexia Evolutiva en una muestra de pacientes colombianos
Capítulo 5. Metodología
5.1 Población de Estudio
En total se incluyeron 100 participantes de los cuales 69 fueron niños y 31 niñas. La muestra
evaluada en este estudio se dividió 49 pacientes pertenecientes al grupo de disléxicos y 51 que
correspondían al grupo de controles y se ubicaban en edades comprendidas entre los 7 y los 14
años y pertenecían a las instituciones educativas Gimnasio Moderno San Sebastián, Nueva
Esperanza I.E.D., Alfonso López Pumarejo I.E.D. y a la Liga Central contra la epilepsia y otros
casos particulares.
Una vez se tuvo la aprobación para el desarrollo del proyecto en cada una de las instituciones
educativas, se realizó una reunión con docentes para dar a conocer los criterios de inclusión de
los niños, niñas, y otra reunión con padres de familia con el fin de obtener su aprobación para la
participación de sus hijos mediante el diligenciamiento de los consentimientos informados para ser
tenidos en cuenta para el proceso evaluativo.
Los participantes fueron divididos en dos grupos de comparación, con criterios de inclusión y de
exclusión establecidos: El grupo denominado Dislexia, hace relación a los casos diagnosticados,
bien sea por consenso previo o mediante la evaluación con la Batería de Evaluación
Neuropsicológica Infantil (ENI) (Rosselli, et al., 2004), y con historia clínica y/o reportes escolares
en los que no se sugiere discapacidad cognitiva o algún otro trastorno psiquiátrico o
neuroconductal. El grupo llamado Control fue conformado por niños y niñas sin antecedentes
personales ni familiares de enfermedades neurodegenerativas, psiquiátricas y/o conductuales.
En la mayoría de pacientes se hizo revisión de antecedentes del neurodesarrollo e historia
escolar; sin embargo, los datos propiciados por las familias, no fueron muy precisos o no los
recordaban con exactitud. La procedencia de los pacientes corresponden a un mayor porcentaje a
la ciudad de Bogotá, esto se debe a que los pacientes aquí analizados, fueron evaluados dentro
de las instituciones educativas del Distrito Capital y la Fundación Liga Central Contra la Epilepsia.
Sin embargo, se tuvo la oportunidad de encontrar pacientes con origen en otros departamentos
como Boyacá, Chocó, Tolima, Valle del Cauca, Córdoba, Caquetá, Huila y Tolima. Dado que
excede los alcances de este estudio este aspecto no fue tenido en cuenta, para ello sería
necesario realizar un estudio poblacional en el territorio colombiano.
41
5.2 Instrumentos
5.2.1 Evaluación Neuropsicológica Infantil (ENI)
Es una batería desarrollada para población infantil hispanohablante con dislexia y otros
trastornos clínicos. El componente relacionado con lectura (sílabas, palabras, no palabras,
oraciones, comprensión de oraciones, texto en voz alta comprensión oral, lectura silenciosa,
comprensión lectura silenciosa) y escritura (nombre, dictado silabas, dictado palabras, dictado
no palabras, dictado oraciones, copia de un texto). Esta prueba fue la administrada solamente
en los casos que fueron evaluados por la investigadora principal. Los diagnósticos por
consenso previo fueron identificados con esta o con otras pruebas de lectura.
5.2.2 Subgrupos y medidas de Lectura
La muestra evaluada en este estudio fue de 49 pacientes pertenecientes al grupo experimental y
51 controles en edades comprendidas entre los 7 y los 14. Los grupos fueron pareados por edad
(± 3 años), grado escolar y tipo de dislexia (fonológica o de superficie). Esta tipología se
determinó mediante la revisión de los resultados en las pruebas de lectura y la discusión con los
profesionales tratantes en los casos diagnosticados por consenso previo. En la mayoría de
pacientes se hizo revisión de antecedentes del neurodesarrollo e historia escolar; sin embargo,
los datos suministrados por las familias, no eran muy precisos o no los recordaban con exactitud.
Las medidas de lectura fueron tomadas de la Evaluación Neuropsicológica Infantil (Rosselli, et
al., 2004). La severidad se clasificó como resultado de más de 1,5 por debajo de la puntuación
media del rendimiento de lectura.
5.2.3 Relación entre variables de interés
En primer lugar, se identificó la deleción y 39 alelos del STR READ1 (Powers, et al., 2013; Meng,
et al., 2005), los cuales fueron establecidos mediante la revisión bibliografía de estudios de
genoma completo (GWAS) y replicas que habían reportado asociación significativa con la
Dislexia en regiones distintas a Colombia. En segundo lugar, se investigó sobre su relación con
los subgrupos tanto Fonológicos como de Superficie (Wilcke, et al., 2012).
42 Análisis de la secuencia del gen DCDC2 asociado a
Dislexia Evolutiva en una muestra de pacientes colombianos
5.3 Procedimientos
5.3.1 Toma de muestras
Una vez se obtuvo firmado el consentimiento por el representante legal, se procedió a una
muestra de sangre del niño(a) de 5ml mediante venopunción o de células epiteliales de mucosa
bucal. Las muestras fueron llevadas a los laboratorios del grupo de neurociencias de la
Universidad Nacional de Colombia y se le asignó un número de identificación para reservar su
privacidad. Se separó la muestra de sangre o saliva del nombre y cualquier otra información que
lo pudieran identificar. Solo la investigadora principal tenía acceso a los archivos guardados con
el fin de que otras personas no conocieran los resultados de las pruebas que se realizaron.
5.3.2 Extracción, Purificación, cuantificación y almacenamiento de ADN
con muestra de sangre
La extracción se llevó a cabo utilizando utilizando 200 ul de sangre periférica con la utilización
del kit QIAamp® DNA Mini Bloodkit; siguiendo las especificaciones del Protocolo fabricante
(Qiagen, Hilden Germany). La cuantificación del ADN se llevó a cabo y mediante
espectrofotometría en un equipo Nanodrop 2000 (Thermo Fisher Scientific). Se evalúo el radio
260/280nm para determinar la pureza del material, el cual se mantuvo almacenado en tubos
eppendorf de 1.5 ml a una temperatura de -20°C.
El ADN obtenido de muestras de sangre fue aislado mediante el método de descrito a
continuación:
1. En un tubo eppendorf de 1.5 ml se agregó 200μL de sangre total periférica.
2. Se puso un volumen de 20μL de proteinasa K y mezcló en vórtex durante 15 segundos.
3. Se adicionó 400μL de Buffer de Lisis de glóbulos rojos y se mezcla en vórtex durante 10 segundos.
4. A continuación, se pusieron las muestras por 40 minutos a baño María Baño María a 56°C (Previamente puesto a calentar por 15 minutos) contenidas en una gradilla.
5. Al terminar, para la purificación se agregaron 200μL de etanol sobre la mesa y en vórtex por 15 segundos.
43
6. A continuación se transfirió el contenido de los tubos a columnas y se centrifugó a 8.000rpm durante 1 minuto.
7. Agregamos 500 μL de Buffer de lavado WBI I a cada muestra. Se centrifugó a 10.000rpm durante 1 minuto y se descarta el contenido restante del tubo de alusión de la columna e un tubo falcón.
8. Se agrega 500μL Buffer II y se centrifuga a 14.000rpm durante 3 minutos.
9. Finalmente se pasan las columnas a tubos Eppendorf de 1.5 μL y se agregan 200μL Buffer Elution y se centrifuga a 14.000rpm durante 1 minuto. Se separaron los tubos con el contenido de ADN y se dejó encubar por 1 minuto.
El ADN extraído de células epiteliales de mucosa bucal fue aislado mediante el método de descrito a continuación:
1. Se descongelaron los tubos Eppendorf con 200 μL de cada muestra.
2. Se centrifugaron a 3.000rpm x 5 minutos todas las muestras y se descartó la solución salina, conservando solo el botón de células.
3. Se agregó 20 μl de Proteinasa K a cada muestra y mezcló en vórtex durante 10 segundos.
4. A continuación se agregó 200 μL de Buffer AL a cada muestra y se mezcló en vórtex por otros 10 segundos.
5. Se colocaron las muestras en Baño María por 40 minutos a 56°C y se centrifugó a 12.000rpm durante 1 minuto.
6. Luego se agregaron 200 μL de Etanol Absoluto a cada muestra y se mezcló en vórtex durante 10 segundos. En seguida se transfirió el contenido de cada tubo Eppendorf a una columna debidamente marcada.
7. Se centrifugaron las muestras a 8000 rpm durante 1 minuto y se agregó 500 μl de Buffer WS1 a cada muestra y centrifugar a 8000 rpm durante 1 minuto.
5.3.3 Verificación del ADN genómico
Posteriormente, se realizó la verificación de calidad de preservación del ADN genómico de
pacientes y controles, mediante electroforesis en geles de agarosa 1.5%, teñidos con SYBR®
Safe y visualizados con luz U.V, para esto se usó 5μl de muestra de ADN y 5μl de buffer de
carga.
44 Análisis de la secuencia del gen DCDC2 asociado a
Dislexia Evolutiva en una muestra de pacientes colombianos
5.4 Diseño Experimental
5.4.1 Primers
La genotipificación de la deleción se llevó a cabo mediante amplificación por PCR alelo-
especifica, para lo cual se usó una combinación de tres primers en una reacción y que
tomados de estudios previos (Meng, y otros, 2005; Powers N. R., et al., 2013): Primer Forward
Universal (5´-AGCCTGCCTACCACAGAGAA-3´), Primer Reverse para los cromosomas Sin
Deleción (5´-GGAACAACCTCACAGAAATGG-3´), y el Primer Reverse para los cromosomas
Con Deleción (5´-TGAAACCCCGTCTCTACTGAA-3´). De igual manera, se tomaron las
secuencias de los primers para el compuesto STR READ1: Primer Forward STR (5´-
TGTAAAACGACGGCCAGTTGTTGAATCCCAGACCACAA-3´) y Primer Reverse STR (5-
ATCCCGATGAAATGAAAAGG-3´).
La deleción se genotipificó por PCR convencional usando un termociclador Agilent
Technologies Surecycler 8800 basada en método de amplificación por PCR y electroforesis en
gel de agarosa con el uso de una reacción de tres primers de ~600 pb para los cromosomas
completos y ~200 pb para la amplificación para los cromosomas con la deleción, permitiendo
que los heterocigotos y homocigotos sean fácilmente distinguibles unos de otros. Las
condiciones de amplificación por PCR se presentan en el Anexo I, Tablas 10 y 11.
Los productos de PCR se sometieron a electroforesis en geles de agarosa al 1,5% con el uso
de Buffer estándar 1X SG con SYBR® Safe (0,2 mg/ml) y 100-150 voltios, dependiendo del
tamaño de gel. Los geles fueron teñidos con SYBR® Safe y visualizados en un transiluminador
UV.
Con el fin de caracterizar mejor el STR READ1 con relación a la lectura y los efectos de sus
alelos se riesgo, se genotipificó y se secuenció en todas las muestras, excepto en aquellas que
fueran homocigotas para la deleción. El STR-READ1 se genotipificó mediante amplificación por
PCR, seguido de secuenciación Sanger en el servicio de secuenciamento SSiGMol del
Instituto de Genética de la Universidad Nacional de Colombia. Los resultados de las
secuencias y asignación de los alelos se realizó mediante dos programas: SeqScape V.5.4
(Biosystems, 2003) y Mixed Sequence Reader (Chang, et al., 2012) mediante la alineación de
las secuencias con relación a la de referencia.
45
Figura 6. Diseño Experimental
5.5. Análisis estadístico
5.5.1 Frecuencias Genotípicas y Alélicas
Las frecuencias genotípicas se obtuvieron por conteo directo. Para probar si existían diferencias
significativas entre las frecuencias genotípicas observadas entre pacientes con Dislexia y
Controles se llevóa a cabo un test de exacto de Fisher en Interactive Chi-Square Tests -
Quantpsy.org.
Las frecuencias alélicas se calcularon por conteo directo. Posteriormente se llevó a cabo un test
exacto de fisher para determinar si existían diferencias estadísticamente significativas entre
pacientes y controles.
5.5.2 Equilibrio de Hardy Weinberg (HWE)
Se llevo a cabo una valoración para determinar si las frecuencias genotípicas se enuentran en
equilibrio Hardy-Weinberg mediante prueba de chi cuadrado y las esperadas bajo equilibrio HW.
46 Análisis de la secuencia del gen DCDC2 asociado a
Dislexia Evolutiva en una muestra de pacientes colombianos
Capítulo 6. Resultados
La muestra evaluada en este estudio fue de 49 pacientes pertenecientes al grupo experimental y
51 controles en edades comprendidas entre los 7 y los 14. Los grupos fueron pareados por edad
(± 3 años), grado escolar y tipo de dislexia (fonológica o visual). Los grupos fueron pareados
género, estrato socio económico, procedencia, grado escolar y nivel lector (Tabla 4), sin que
existiera diferencia significativa entre ellos.
Tabla 4. Datos Sociodemográficos
Grupo Disléxico Grupo Control
Sujetos 49% 51%
Edad
7 - 10 años 34% 41%
11 - 14 años 15% 10%
Género
Femenino 14% 17%
Masculino 35% 34%
Estrato Socio Económico
1-2 22% 26%
3-4-5 27% 25%
Procedencia
Bogotá 44% 45% Boyacá 1% 0% Córdoba 1% 0% Caquetá 0% 1% Tolima 1% 1% Huila 1% 1% Manizales 0% 1% Quibdó 1% 0% Valle del Cauca 0% 1%
Nivel Educativo
2º - 4º 36% 40%
5º - 8º 13% 11%
6.1 Frecuencias Genotípicas
La deleción del intrón 2 del Gen DCDC2, fue detectada mediante la Reacción en cadena de la
polimerasa (PCR). Las secuencias de los primer utilizados fueron los descritos por Meng y
colaboradores (2005). el fragmento con deleción tiene una longitud de ~ 200 pb y el fragmento
47
sin deleción es de ~ 600 pb, los cuales se visualizan en electroforesis en gel de agarosa al
1.5%.
Figura 7: Fotografía de una amplificación de PCR en la se puede identificar la deleción en el gen DCDC2 visto a través de la luz U.V. Se utilizó Gel de Agarosa a 1,5% que permite evidenciar en los carriles 2, 3 y 4 los pacientes del grupo control (600bp), en los carriles 6, 7 y 8 los pacientes del grupo experimental que resultaron heterocigotos para la deleción (600bp-200bp) y en el carril 10, el paciente que resultó homocigoto para la deleción (200bp).
Una vez se definió cuantas muestras eran homocigotas para la deleción en el intron 2 del gen
DCDC2, se procedió a la amplificación del STR READ1 en las muestras heterocigotos para la
deleción y en las homocigotas para la ausencia de la deleción.
Para el análisis de secuencias del producto de amplificación del STR READ1 se utilizaron dos
programas de análisis. El Software SeqScape V5.4 (Applied Biosystems) el cual sirvió para alinear
las secuencias del STR READ1 con la secuencia de referencia del gen DCDC2 OMIM
NG_012829.2. Dada la complejidad para el análisis del STR READ1 en las muestras que no tenían
la deleción en ninguno de los dos alelos, se utilizó el programa informático Mixed Sequence
Reader, un programa que utiliza un algoritmo matemático que permite desfasar las secuencias de
los dos alelos para identificar las inserciones o deleciones en cada uno de ellos (ver Anexo II).
Mixed Sequence Reader (MSR), un software para la identificación y análisis de heterocigotos
mediante la lectura directa de los datos del cromatograma de fluorescencia en formato de archivo
48 Análisis de la secuencia del gen DCDC2 asociado a
Dislexia Evolutiva en una muestra de pacientes colombianos
.abi y haciendo uso de las comparaciones con las secuencias de referencia. Las secuencias de
heterocigotos se identifican como dos secuencias distintas y alineadas con las secuencias de
referencia. MSR puede ubicar físicamente secuencias indel y STR y determinar el número de
copias de STR mediante la búsqueda en secuencias de referencia NCBI (Chang, y otros, 2012).
Tabla 4. Distribución de los alelos del STR READ1 y la Deleción en el intrón 2 del gen DCDC2.
Alelo Unidad de
Repetición 1 Unidad de
Repetición 2 SNP 1
Unidad de Repetición 3
Región Constante
Unidad de Repetición 4
Unidad de Repetición 5
Longitud (pb)
1 (GAGAGGAAGGAAA) 2 (GGAA) 7 (GAAA) 1 (GGAA) 2 (GGAAAGAATGAA) (GGAA) 4 (GGGA) 2 102
3 (GAGAGGAAGGAAA) 1 (GGAA) 6 (GAAA) 1 (GGAA) 2 (GGAAAGAATGAA) (GGAA) 4 (GGGA) 2 85
4 (GAGAGGAAGGAAA) 2 (GGAA) 6 (GAAA) 1 (GGAA) 2 (GGAAAGAATGAA) (GGAA) 4 (GGGA) 2 98
5 (GAGAGGAAGGAAA) 2 (GGAA) 8 (GAAA) 1 (GGAA) 2 (GGAAAGAATGAA) (GGAA) 4 (GGGA) 2 106
9 (GAGAGGAAGGAAA) 1 (GGAA) 7 (GAAA) 1 (GGAA) 2 (GGAAAGAATGAA) (GGAA) 4 (GGGA) 2 89
10 (GAGAGGAAGGAAA) 2 (GGAA) 4 (GAAA) 1 (GGAA) 2 (GGAAAGAATGAA) (GGAA) 4 (GGGA) 2 90
Del X X X X X X X X
Para la muestra de pacientes con Dislexia, se observó homocigosidad en 25 de los 49 pacientes
estudiados, representados en 24 homocigotos para el genotipo 1/1 y un homocigoto para D/D
(H=51%). Para el grupo control, la homocigosidad fue del 72.5%, a expensas de 34 individuos
homocigotos para el genotipo 1/1 y 3 homocigotos para genotipo 4/4).
La tabla 5 muestra las frecuencias genotípicas encontradas entre pacientes con Dislexia evolutiva
y controles. El genotipo más frecuente en ambos grupos analizados fue el genotipo 1/1 presente
en 24 pacientes con dislexia (49%) y en 34 controles (66.7%). En segundo lugar de frecuencia se
observó el genotipo 1/4 con frecuencia del 14.3% y 13.7% entre pacientes y controles, seguido
en frecuencia por el genotipo 1/D presente en 7 pacientes con dislexia (14.3%) y en 1 control
(2%) Los genotipos. Las frecuencias observadas no muestran una diferencia estadísticamente
significativa entre pacientes y controles.
49
Tabla 5. Frecuencias genotípicas de los alelos del STR READ1 en pacientes con Dislexia y grupo control.
InDel Alelo 1 Alelo 2 Disléxicos Control Disléxicos Control p-value:
II 1 1 24 34 49,0% 66,7% 0.3542
1 3 3 2 6,1% 3,9% 0.6315
1 4 7 7 14,3% 13,7% 0.9436
1 5 3 1 6,1% 2,0% 0.3078
1 9 2 0 4,1% 0,0% 0.1532
1 10 0 2 0,0% 3,9% 0.1696
4 4 0 3 0,0% 5,9% 0.0940
ID 1 D 7 1 14,3% 2,0% 0.0359
3 D 1 0 2,0% 0,0% 0.3101
4 D 0 1 0,0% 2,0% 0.3292
9 D 1 0 2,0% 0,0% 0.3101
DD D D 1 0 2,0% 0,0% 0.3101
49 51 100,0% 100,0% 0.0611
Se llevo a cabo una valoración para determinar si las frecuencias genotípicas se encontraban en
equilibrio Hardy-Weinberg mediante prueba de chi cuadrado. Los resultados obtenidos muestran
que no existen diferencias estadísticamente significativas entre las frecuencias genotípicas
observadas y las esperadas bajo equilibrio HW.
6.2 Frecuencias Alélicas
Las frecuencias alélicas se estimaron con base en los resultados de las frecuencias genotípicas y
se presentan en la Tabla 6. El alelo 1 se encontró con una frecuencia del 73.96% en pacientes y
en 76.92% en controles, seguido en frecuencia del alelo D con 11.46% en pacientes y 1.92% en
controles. En tercer lugar, el alelo 4 con frecuencia del 7.29% en pacientes Disléxicos y 13.46%
en Controles. Se observó una diferencia estadísticamente significativa al comparar las
frecuencias alélicas de pacientes contra controles (p=0,02004). Esta diferencia, se debe
principalmente a la diferencia en frecuencia para el alelo D detectada (11.46% Vs 1.92%).
Finalmente, en la Tabla 7 se puede evidenciar como los resultados de las frecuencia alélicas
identificadas en la población colombiana son similares con las otras cohortes descritas en los
antecedentes.
50 Análisis de la secuencia del gen DCDC2 asociado a
Dislexia Evolutiva en una muestra de pacientes colombianos
Tabla 6. Frecuencias alélicas para el STR READ1 del gen DCDC2 en pacientes con Dislexia y
Controles.
ALELO Dislexia f % Controles f %
1 71 73,96% 80 76,92%
3 3 3,13% 3 2,88%
4 7 7,29% 14 13,46%
5 3 3,13% 1 0,96%
9 3 3,13% 0 0,00%
10 0 0,00% 2 1,92%
D 11 11,46% 2 1,92%
98
102
Tabla 7. Frecuencias alélicas de READ1 en las diferentes cohortes.
Alelo Frecuencia Alélica
Estados Unidos
Meng, et al. (2005)
Alemania Ludwig, et al. (2008)
Italia Marino, et al. (2012)
ALSPAC Powers, et al.
(2013)
Colombia (2016)
DISLEXIA CONTROL
1 0.624 0.606 0.597 0.624 0.7396 0.7692
2 0.003 - - 0.003 - -
3 0.060 0.055 0.081 0.060 0.313 0.0288
4 0.106 0.106 0.086 0.106 0.729 0.1346
5 0.028 0.043 0.045 0.028 0.313 0.0096
6 0.039 0.048 0.062 0.039 - - 7 0.003 - - 0.003 - - 8 0.003 - - 0.003 - -
9 0.005 0.008 0.002 0.005 0.313 -
10 0.044 - 0.049 0.044 - 0.0192 D 0.085 0.086 0.063 0.085 0.1146 0.0192
6.3 Análisis de los Subgrupos
Se establecieron los subgrupos funcionales en Dislexia Fonológica y Dislexia de Superficie. Aunque
se observó una tendencia por la presencia de alelo 5 (genotipo 1/5) en el grupo de dislexia
Fonológica (13%), comparado con solo el 2% en la población control, la presencia del alelo 5 no es
estadísticamente significativa. Por otro lado, la presencia del alelo D en el grupo de Dislexia de
Superficie (8/52) mostró una asociación estadísticamente significativa al compararla con la población
control (2/102) (p 0.0028).
51
Tabla 8. Distribución de los genotipos en los Subgrupos de Dislexia
Genotipo Fonológico F% Superficie F% Control F%
1/1 12 52% 12 46% 34 67%
1/3 1 4% 2 8% 2 4%
1/4 3 13% 4 15% 7 14%
1/5 3 13% 1 2%
1/9 1 4% 1 4%
1/10 2 4%
D/D 1 4%
1/D 2 9% 5 19% 1 2%
3/D 1 4%
4/D 1 2%
9/D 1 4%
4/4 3 6%
23 26 51
Tabla 9. Distribución de los alelos en los Subgrupos
Alelo Fonológico F% Superficie F% Control F% P
1 34 74% 36 69% 81 79% NS
3 1 2% 3 6% 2 2% NS
4 3 7% 4 8% 14 14% NS
5 3 7% 1 1% NS
9 2 4% 1 2% NS
10 2 2% NS
D 3 7% 8 15% 2 2% 0.0028
46 52 102
52 Análisis de la secuencia del gen DCDC2 asociado a
Dislexia Evolutiva en una muestra de pacientes colombianos
7. Discusión y conclusiones
7.1 Discusión
Las dificultades para aprender a leer se atribuyen a disfunciones específicas en el cerebro cuya
naturaleza e identificación son aun objeto de investigación. Sin embargo, esta base neurológica
es causada en gran parte por factores genéticos, tal y como se describió en el marco teórico de
este proyecto (Paracchini, et al., 2007). De acuerdo con el modelo evolutivo causal planteado por
Morton y Frith (2005) es importante identificar los factores genéticos y su relación con el tipo de
ortografía en los casos de dislexia. La mayoría de estudios que han abordado este tema lo han
hecho analizando lenguas de tipo indoeuropeo como el alemán y el inglés, que comparten una
raíz común, pero que sin embargo tienen sistemas de representación ortográfica diferentes (en el
inglés es opaco o arbitrario y en el alemán es transparente). Este asunto es de gran importancia
dado que la forma de acceder a las palabras al leer varía de acuerdo a este sistema. El español,
lengua romance, cuenta con un sistema altamente transparente, por ello los resultados
encontrados contribuyen a la comprensión de la naturaleza de la relación entre el componente
genético, el cognitivo y la lectura.
Dentro de las revisiones realizadas no se encontró información que relacionara a la deleción ni a
los alelos de READ1 con dislexia en ortografías transparentes de raíz romance pero que
resultaría muy interesante profundizar, ya que aun teniendo correspondencias grafo-fonológicas
que son completamente consistentes y facilitan el aprendizaje de la lectura, la dislexia es un
fenómeno frecuente aunque se diferencia en sus manifestaciones de acuerdo al tipo de
ortografía. Las personas con dislexia suelen desarrollar estrategias compensatorias y responden
por lo general de forma positiva a los tratamientos, aunque las dificultades de base afectan
aspectos relacionados con la carga de procesamiento cognitivo. El estudio de Jiménez (2002)
encuentra que a pesar de que es clara la distinción de los subtipos disléxicos en español, los dos
comparten dificultades fonológicas de base y que las diferencias en la identificación de subtipos
puede depender de los tipos de tareas clásicas de evaluación. Al analizar la influencia genética
en los factores cognitivos relacionados con el procesamiento de la lectura, se destaca la
importancia de la asociación entre los procesos de memoria de trabajo y a corto plazo de los
genes candidatos DYX1C1 y DCDC2, así como de la asociación de DCDC2 con la lectura de
palabras y pseudopalabras. En este sentido DCDC2 estaría vinculado a aspectos más
53
fonológicos que cognitivos (Schumacher, et al., 2005). En sentido contrario (Wilke, et al., 2009)
que estudio la relación de este gen con la lectura en alemán encuentra una mayor relación con
los factores visuales involucrados en la lectura. El peso relativo de la importancia de estas dos
rutas, fonológica y visual, varía de acuerdo a la arbitrariedad de la lengua, lo que explicaría la
diferencia entre los dos resultados, el inglés requiere mayores competencias en lo fonológico
mientras que el alemán lo requiere en lo visual.
Se analizó la presencia de la deleción y la secuencia de READ1, un elemento regulador asociado
a dislexia 1 ubicado en el intrón 2 del gen DCDC2, que fueron establecidos mediante la revisión
bibliografía de estudios de genoma completo (GWAS) y replicas que habían reportado asociación
significativa con la Dislexia en regiones distintas a Colombia.
El presente trabajo se llevó a cabo para determinar si la asociación reportada previamente para
países de habla anglosajona entre la Dislexia evolutiva y un polimorfismo presente en el intrón 2
del gen DCDC2 (Meng, y otros, 2005; Powers N. R., et al., 2013; Wilke, y otros, 2009), también
mostraba una asociación significativa con una lengua como español, siendo este trabajo el primer
trabajo realizado con poblaciones de habla hispana.
Schumacher, y colaboradores (2005) encontraron una asociación significativa (P=0,004) para la
presencia de los alelos 5 y 6 del STR READ1 en los niños afectados. Este resultado ha sido
reafirmado posteriormente por Powers y colaboradores (2015), a partir de sus estudios con la
cohorte del Estudio Longitudinal Avon de Padres e Hijos (ALSPAC) en Reino Unido, quienes al
realizar el análisis de la combinación de 11 alelos, éstos se agruparon por frecuencia y se
encontró que la deleción y varios alelos del STR (alelos 2, 5, 6, 7, 8, 9, y 10) están fuertemente
asociados (p=0,00002) y reafirman que el alelo 5, tiene un efecto más fuerte que el alelo 6, y
afecta preferentemente a las medidas relacionadas con lectura y CI mientras que el alelo 6 ha
sido asociado al trastorno del lenguaje, aunque la estructura de ambos es similar.
Adicionalmente, Powers (2013) refiere una mayor frecuencia a los alelos 3 (p=0.060), 4
(p=0.106), 6 (p=0.039) 10 y D (p=0.085) en pacientes. El alelo 3 ha sido asociado con la
activación de la transcripción de DCDC2 a partir de su región promotora. Por su parte,
(Deffenbacher (2004) encontró una asociación más fuerte en otros cuatro marcadores (alelos 6,
11, 12, y 13) en el Centro de Investigación de Dificultades del aprendizaje de Colorado (CLDRC).
En este estudio, aunque se identificaron seis de los alelos de READ1 en los pacientes con
dislexia (alelos 3,4,5,9,10 y D), no hubo diferencia estadísticamente significativa con el grupo
54 Análisis de la secuencia del gen DCDC2 asociado a
Dislexia Evolutiva en una muestra de pacientes colombianos
control al evaluar los genotipos observados. Sin embargo, se obtuvo una asociación
estadísticamente significativa al comparar las frecuencias alélicas entre pacientes y controles
debido principalmente a la presencia del alelo D en pacientes (11.46%) comparado con controles
(1.92%) (p=0,02004). Además, En el presente trabajo, se observó que la presencia del alelo D
tiene una asociación estadísticamente significativa con el subgrupo de Dislexia de Superficie (p
0.0028), hallazgo similar al descrito por Wilke y colaboradores (Wilke, et al., 2009).
Estos resultados coinciden con los hallazgos expuestos por Wilcke y colaboradores (2009) en
disléxicos alemanes, los cuales confirman el papel prominente de la deleción en DCDC2
(p=<0.001). Al analizar la influencia genética en los subgrupos de dislexia (fonológica y de
superficie) ese estudio encuentra una fuerte asociación. En contraste, las cohortes americanas y
británicas encuentran más asociación con alelos como los alelos 5 y 6 (Meng, et al., 2005;
Powers, et al., 2015).
Las diferencias observadas con estudios previos realizados podrían deberse entre otros, a la
influencia de factores genéticos, dadas las diferencias en la composición étnica de las
poblaciones estudiadas, a factores ambientales, al tamaño de muestra analizada, y a criterios de
selección de la muestra o a una combinación de todos ellos. Al respecto no existen datos de
estudios de asociación del polimorfismo del gen DCDC2 en poblaciones Amerindias y Afro
descendientes, ambas con importantes aportes a la estructura genética de la población
Colombiana
Resultaría interesante entonces ampliar la investigación analizando el polimorfismos READ1 del
gen DCDC2 en poblaciones afrodescendientes, y Ameridindias, y ampliar el análisis a genes
cercanos como el gen KIAA0319 para poder evaluar el efecto combinado de las variaciones
genéticas en nuestra población.
7.2 Conclusiones
El presente trabajo, realizado por primera vez en una población de lengua hispana, se encontró una
asociación estadísticamente significativa entre Dislexia y el gen DCDC2 (p 0.02), en particular el
alelo D el cual se encuentra a una frecuencia de 11.46% comparado con 1.92% en controles.
Adicionalmente, se observó que la presencia del alelo D tiene una asociación estadísticamente
significativa con el subgrupo de Dislexia de Superficie (p 0.0028). Estos resultados difieren un poco
55
de los hallazgos observados en poblaciones anglosajonas, lo cual podría deberse a las diferencias
en la composición genética o a otros factores por determinar.
7.3 limitaciones del estudio y recomendaciones
Debido a dificultades de tipo logístico y de acceso a los sujetos no fue posible contar una
evaluación completa de lectura bajo los mismos parámetros. Si bien se realizó un diagnostico por
consenso, este factor limito el análisis de diferentes tareas de lectura tales como la lectura de
palabras, lectura de pseudopalabras, comprensión de texto y comprensión auditiva. Estas tareas
contribuirían a la identificación de subtipos de lectura ya que se correlacionan con los factores
cognitivos subyacentes que las soportan. Por ello se sugiere en estudios futuros realizar esta
evaluación para así indagar a mayor profundidad la asociación de los alelos con los endofenotipos.
Por otro lado, se recomienda ampliar la muestra de sujetos de estudio ya que el trabajo realizado
fue un estudio piloto para tener un mayor poder estadístico.
Se recomienda ampliar el estudio a otros genes ligados o en cercanía al gen DCDC2 tal como el
gen KIAA039, ya que se postula que el gen DCDC2 regula la expresión del segundo.
Adicionalmente, la muestra recolectada serviría para analizar otros genes tales como el gen
FOXP2, DYX1C1, TTRAP y ROBO1 que han sido asociados con dislexia. También sería
recomendable llevar a cabo estudios similares en poblaciones Afrodescendientes y Amerindias
que permitan analizar variantes genéticas relevantes para nuestra población.
56 Análisis de la secuencia del gen DCDC2 asociado a
Dislexia Evolutiva en una muestra de pacientes colombianos
Anexos
ANEXO I. Tablas
Tabla 10. Condiciones de amplif icación por PCR para la Microdeleción y el
polimorfismo STR READ1.
Experimento Condiciones de Amplificación
Genotipificación
de la
Microdeleción
Reactivo [Inicial]
Stock
[Inicial]
Tubo PCR
Volumen
Master Mix
Buffer Go Taq (Promega) 5X 5X 4 μl
MgCl2 25mM 1.5mM 1.2 μl
dNTPs (10mM) 10mM 200μM 0.8 μl
Del_F 100mM (10μM) 1 μl
Del_RC 100mM (10μM) 0.8 μl
Del_RD 100mM (10μM) 0.8 μl
Enzima -Taq Polimerasa (5u/μl) (5u/μl) 0.2 μl
H2O 9.2 μl
Template DNA (~10ng/μl) (~10ng/μl) 2 μl
Genotipificación
de READ1
Buffer Go Taq (Promega) 5X 5X 4 μl
MgCl2 (25 mM) 25mM 1.5mM 1.2 μl
dNTPs (10mM) 10mM 200μM 0.8 μl
STR_F: (10μM) 100mM (10μM) 1 μl
STR_R: (10μM) 100mM (10μM) 1 μl
Taq Polimerasa (5u/μl) (5u/μl) (5u/μl) 0.2 μl
H2O 9.8 μl
Template DNA (~10ng/μl) (~10ng/μl) (~10ng/μl) 2 μl
57
Tabla 11. Protocolo para la amplificación por PCR tomado y modificado del Artículo original (Powers, et al., 2013).
Genotipificación de La Microdeleción y READ1
Protocolo de
Amplificación
1. Hot Start 95°C
03:00
2. Start Cycle 9 Times
3. Denaturation 95°C
00:00:30 Std.
4. Annealing 65°C
00:00:30 Std.
5. Elongation 72°C
00:01:00 Std.
6. End Cycle
7. Start Cycle 34 Times
8. Denaturation 95°C
00:00:30 Std.
9. Annealing 56°C
00:00:30 Std.
10. Elongation 72°C
00:01:00 Std.
11. End Cycle
12. Temperature 72°C
00:05:00 Std.
13. Temperature 4°C
Hold Std.
58 Análisis de la secuencia del gen DCDC2 asociado a
Dislexia Evolutiva en una muestra de pacientes colombianos
ANEXO II. Resultados de Seq Scape y Mixed Sequences Reader
Figura 8. Electroferograma con estructura completa de las Unidades 1 y 2 obtenido mediante Software
SeqScape.
Figura 9. Electroferograma con paciente heterocigoto con deleción de una unidad (GAGAGGAAGGAAA).
59
Figura 10. Supresión de las unidades 1 (GAGAGGAAGGAAA) y 2 (GGAA) de la secuencia.
Figura 11. Secuencia de paciente homocigoto (I/I) mediante la metodología Mixed Sequences Reader (MRS).
60 Análisis de la secuencia del gen DCDC2 asociado a
Dislexia Evolutiva en una muestra de pacientes colombianos
Figura 12. Descomposición de la secuencia en “alelo mayor” y “alelo menor” en paciente heterocigoto un deleción
una unidad menos en la Repetición 2 (GGAA).
ANEXO III. CONSENTIMIENTO INFORMADO
61
Análisis de la secuencia del gen DCDC2 asociado a Dislexia Evolutiva en una muestra de pacientes colombianos
Desde el programa de posgrado Maestría en Neurociencias de la Universidad Nacional de Colombia se pretende llevar a cabo una investigación con el objetivo de analizar la asociación de la secuencia del gen DCDC2 con Dislexia Evolutiva en pacientes colombianos, un trastorno especifico de la lectura que se presenta en algunos niños y niñas cociente intelectual y escolaridad propia de la edad. Se pretende realizar una evaluación del desempeño en las habilidades de lectura (Identificación de letras y palabras, fluidez y velocidad lectora, comprensión de textos, comprensión oral). Así mismo se pretende recolectar una muestra de sangre venosa del niño(a) para este estudio, nosotros extraeremos alrededor de 10ml de sangre de su brazo. Estas muestras serán llevadas a los Laboratorios del Grupo de Neurociencias de la Universidad Nacional de Colombia, donde quedaran almacenadas y será analizado el gen DCDC2 a partir de estas. Estimamos que 100 niños (as) participarán en el proyecto y facilitaran una muestra de sangre para nuestro estudio. Se espera realizar la evaluación del desempeño las habilidades de lectura en niños y niñas en edades comprendidas entre 7 y 11 años que asisten a colegios privados de la cuidad de Bogotá y al Departamento de Comunicación Humana de la UNAL. La información suministrada por usted como acudiente o representante legal del menor, se mantendrá en estricta confidencialidad; de manera que a cada muestra de material genético y prueba de desempeño motor, así como la encuesta, se le asignara un código, la información personal suministrada y cualquier otra información que lo pueda identificar a usted o a su hijo (a) se mantendrá separada del material genético de tal forma que no se pueda relacionar. Los archivos que contengan la información se mantendrán bajo estricto control y con clave para que solo el investigador principal del proyecto tenga acceso a esa información. En la presentación de resultados en congresos o artículos científicos no aparecerá ninguno de los datos personales suministrados por usted. Los riesgos de participar en este estudio a los que estará expuesto su hijo (a), son riesgos mínimos; cuando se inserta la aguja para extraer la sangre, se puede sentir un dolor moderado o sólo una sensación de pinchazo o picadura. Posteriormente, puede haber algo de sensación pulsátil. Posteriormente puede aparecer un hematoma (acumulación de sangre debajo de la piel). Es importante mencionar que se mantendrán todos los cuidados y precauciones estándar a fin de minimizar el riesgo de transmisión de cualquier tipo de microorganismo. Usted no obtendrá ningún beneficio directo por proveer la muestra de material genético de su hijo (a) para este estudio; sin embargo a través del análisis de los resultados de las habilidades de lectura se obtendrá un perfil de desempeño en esta área con una guía de estrategias generales para mejorar el desempeño de su hijo (a) en actividades de lectura. La participación en este estudio, tanto en la evaluación del desempeño lectura como en la muestra de material genético, no tendrá ningún costo, por las pruebas y exámenes que se realicen dentro de la investigación. A usted no se le pagara por la participación de su hijo en este estudio. Se realizaran conferencias acerca de los resultados grupales que se obtengan en la investigación. Así mismo en la publicación de artículos no se expondrán datos individuales de los participantes del este proyecto.
Después que el estudio termine, se planea tener la muestra de material genético no utilizada en este estudio para posteriores investigaciones, no se tienen planes específicos de investigación, sin embargo se
62 Análisis de la secuencia del gen DCDC2 asociado a
Dislexia Evolutiva en una muestra de pacientes colombianos
pretende usar estas muestras para el estudio de otros trastornos diferentes al de Dislexia. Las muestras se almacenaran bajo un código numérico y se mantendrá el archivo que enlaza el código con su nombre o información personal, en estricta confidencialidad. Se podrá compartir la información acerca de los genes y enfermedades pero no su información personal y/o confidencial que permitan identificarlo. Adicionalmente el comité de Ética institucional revisara todos los proyectos futuros; usted puede escoger que la muestra de material genético de su hijo (a) no permanezca almacenada para futuras investigaciones y aun ser parte de este estudio; usted podrá manifestar su interés al final de este formato. Usted es libre de decidir si su hijo (a) participa en este estudio, no habrá ningún tipo de sanción o perdidas de benéficos si usted desea no ser parte del mismo. Si usted decide que su hijo (a) participe en este estudio, usted puede decidir abandonarlo en cualquier momento. Usted puede decidir o no que la muestra de su hijo (a) permanezca almacenada y sea parte de este estudio o estudios posteriores. Además usted puede acceder a que la muestra de su hijo (a) sea almacenada y luego decidir que sea retirada del almacenamiento. Se le dará una copia del consentimiento informado para que usted lo guarde en sus archivos. Si tiene alguna duda o pregunta acerca de este estudio puede contactar a la Licenciada en Educación Especial Gineth López Colorado, estudiante de la Maestría en Neurociencias de la Universidad Nacional de Colombia o al Dr. Juan José Yunis persona que dirige este estudio en la Facultad de Medicina de la Universidad Nacional de Colombia. Consentimiento y firma Yo acepto dar una muestra una muestra de sangre venosa de mi hijo(a) y que participe en el desarrollo de pruebas de desempeño en habilidades de lectura necesarias para este estudio. Yo he tenido la oportunidad de hacer preguntas y siento que todas mis inquietudes al respecto han sido resueltas. Yo entiendo que el dar una muestra para el estudio es mi elección. Comprendo que los resultados individuales genéticos del estudio no me serán dados. Yo he leído la sección de este formato sobre el almacenamiento de la muestra de mi hijo (a) para investigación futura. Mi elección sobre que la muestra de material genético de mi hijo (a) permanezca almacenada para ser usada en investigaciones futuras bajo las condiciones descritas es: ____ positiva o ____negativa. Nombre del participante (representante legal): ________________________________________________________________________ Firma y Cedula: ________________________________________________________________________ Nombre del participante (representante legal): ________________________________________________________________________ Firma y Cedula: ______________________________________________________________________ Nombre del Niño: _________________________________________________________ Firma: _______________________ ______ _______ Fecha: ___________________________________________________
63
GLOSARIO
ADN (ácido desoxirribonucléico). Es un polímero largo de nucleótidos (un polinucléotido) que codifica
la secuencia de residuos de aminoácidos en proteínas, usando el código genético.
Cociente de Inteligencia CI [IQ, sigla en inglés]. Un número dado que expresa la inteligencia relativa
de una persona, originalmente determinado por la división de la edad mental por la edad cronológica y
multiplicado por cien.
Conciencia fonológica. la sensibilidad o el conocimiento explícito de la estructura de los sonidos del
lenguaje. Se afirma generalmente que los problemas en la conciencia fonológica hacen que sea difícil
para los niños con dislexia a aprender cómo aplicar el principio alfabético para decodificar y deletrear
palabras impresas. Numerosos estudios han documentado un déficit en la conciencia fonológica en
niños con dislexia o en niños en situación de riesgo para este trastorno (Catts, et al., 2010).
Decodificación. Un proceso elemental en el aprendizaje de la lectura de sistemas alfabéticos de
escritura (por ejemplo, inglés, español, alemán o italiano) en el cual las palabras no familiares son
descifradas por la asociación de letras de palabras con los sonidos hablados correspondientes.
Déficit de atención e hiperactividad (TDAH). Es una alteración en el desarrollo del cerebro humano
que se manifiesta con síntomas de la conducta y el control emocional. El evento más frecuente con las
mayores características problemáticas es la necesidad de permanecer quieto y con activación mental
permanente en los escenarios de aprendizaje académico.
Deleción: Perdida de uno o más aminoácidos que a diferencia de las mutaciones sin sentido, ocurren
en el interior de una cadena.
64 Análisis de la secuencia del gen DCDC2 asociado a
Dislexia Evolutiva en una muestra de pacientes colombianos
Desarrollo. Cambio progresivo que ocurre en los seres humanos a medida que envejecen. Las
inclinaciones biológicas interactúan con la experiencia para guiar el desarrollo durante toda la vida.
Dislexia. Trastorno manifestado por la dificultad en aprender a leer, a pesar de instrucción
convencional, inteligencia adecuada y oportunidad sociocultural.
Dislexia Fonológica. Capacidad de conversión grafema-fonema para acceder al léxico, resultando en
una mala capacidad de lectura, en particular para pseudopalabras pronunciables. Este tipo de dislexia
dificulta la lectura de palabras largas y poco frecuentes y de palabras funcionales e imposibilita la
lectura de pseudopalabras, donde suelen cometer muchos errores visuales que provocan
lexicalizaciones.
Dislexia “diseidética” o visual. Implica una deficiencia primaria en la capacidad para percibir
palabras completas.
Electroforesis. Consiste en el movimiento de las moléculas cargadas en un campo eléctrico de
corriente continua de alto voltaje, creado por un aparato llamado fuente de electroforesis. Las
proteínas, el DNA y otras muchas moléculas biológicas llevan una carga eléctrica. En el caso del DNA
y el RNA la carga es negativa debido a los grupos de fosfato, así tienden a moverse hacia el polo
positivo del campo eléctrico.
Epigenética. Cambios en la función del gen, a menudo suscitados por factores ambientales.
Fonemas. Unidades básicas del idioma hablado que componen las palabras.
Gen. Es la unidad de herencia en los organismos vivos. Los genes influyen el desarrollo físico y
conductual del organismo.
Genética. La ciencia de los genes, de la herencia y de la variación de los organismos. La genética
clásica consiste en las técnicas y metodologías de la genética anteriores a la biología molecular. La
genética molecular construye sobre la fundación de la genética clásica pero se enfoca en la estructura
y función de los genes a nivel molecular. La genética del comportamiento estudia la influencia de
genéticas variables en la conducta animal, y las causas y efectos de los trastornos humanos.
65
Genes reguladores. Es el encargado de codificar proteínas o ARN en la regulación de la expresión de
otros genes.
Lectura. La lectura es un proceso cognitivo, complejo e interactivo, cuya finalidad es la comprensión
de unos significados que se obtienen a partir de la decodificación de unos signos gráficos
convencionales (letras o grafemas en los sistemas en los sistemas alfabéticos). El acto lector es
complejo porque incluye diversos procesos es complejo porque incluye diversos procesos que se
adquieren y automatizan a lo largo del desarrollo y el aprendizaje.
Memoria fonológica. Suele ser deficiente en las formas hereditarias de los problemas de lenguaje y
alfabetización. Corresponde a la repetición de “no palabras” o la capacidad de repetir secuencias de
polisílabas desconocidas. Esta tarea suele ser considerada como en un sistema de evaluación de
memoria a corto plazo especializada y diseñada para retener la información fonológica durante
intervalos breves.
Memoria operativa, de trabajo o de corto plazo. Una fase de la memoria en la cual se puede
mantener una limitada cantidad de información por varios segundos y hasta minutos. Se refiere a
estructuras y procesos usados para almacenar y manipular información temporalmente. La memoria de
corto plazo puede llegar a ser memoria de largo plazo, a través de procesos de ensayo y asociaciones
significativas
Migración neuronal. El desarrollo embriónico temprano del sistema nervioso se caracteriza en parte
por la migración de poblaciones de neuronas. Es probable que ciertas moléculas de reconocimiento y
adhesión son necesarias para que este proceso migratorio ocurra. Algunos defectos genéticamente
mediados en su estructura y función resultan en patrones de migración aberrantes.
Neurobiología. Estudio de las células y los sistemas del sistema nervioso.
Neurociencia cognitiva. Estudio y desarrollo de la investigación de la mente y el cerebro, orientado a
investigar las bases psicológicas, computacionales y neurocientíficas de la cognición.
PCR (reacción en cadena de la polimerasa). Conocida por sus siglas en inglés (polymerase chain
reaction), es una técnica de biología molecular mediante la cual se obtiene un gran número de copias
de un fragmento original de ADN particular.
66 Análisis de la secuencia del gen DCDC2 asociado a
Dislexia Evolutiva en una muestra de pacientes colombianos
PCR en tiempo real (en inglés real time PCR). Es una variante de la reacción en cadena de la
polimerasa (PCR) utilizada para amplificar y simultáneamente cuantificar de forma absoluta el producto
de la amplificación de ácido desoxirribonucleico (ADN).
Pleiotropía: (del griego pleio, "muchos", y tropo, "cambios") es el fenómeno por el cual un gen es
responsable de efectos fenotípicos o caracteres distintos y no relacionados. Se debe a que los
procesos del desarrollo embrionario están intricadamente integrados unos con otros, de manera que
una mutación que afecte a un proceso primario del desarrollo puede tener repercusión en múltiples
procesos secundarios.
Polimorfismo. Muchas formas diferentes (en este caso longitudes). Es una variación en la secuencia
de un lugar determinado del ADN entre los individuos de una población.
Primer, iniciador o cebador. Es un oligonucleótido, es decir, una molécula de ácidos nucleicos de una
sola cadena que se usa para iniciar una reacción de PCR. El primer se pega a la secuencia
complementaria y eso permite que la polimerasa en la cadena de ADN comience la elongación o
extensión de la molécula de ADN.
Teoría de la «doble ruta» de la lectura. Esta teoría sostiene que la lectura puede realizarse por dos
rutas. Una, denominada léxica, responsable del procesamiento de palabras y, otra, llamada subléxica se
encarga del procesamiento de unidades menores (grafemas o unidades menores).
BIBLIOGRAFÍA
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