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5/10/2018 CEA Monobind EIA - slidepdf.com

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Distribuidora de React ivos y Agent

de Diagnóstico para LaboratorBlvd. J. Alonso de Torres 312 pte. Col. San Jerónimo León G

(477) 718-5948 ventasleon@microelisas

Inser to Antígeno Carcinoembrionar io (CEA) MONOBIND, INC.

ANTÍGENO C ARCINOEMBRIONARIO (CEA) Cód igo d e Produ cto: 1825-300

Intensión de uso:La determinación cuantitativa de la Concentración del AntígenoCarcinoembrionario (CEA) en suero humano por un ensayoinmunoenzimométrico de microplato.

RESUMEN Y EXPLICACION DE LA PRUEBA.El antígeno Carcinoembrionario (CEA) es una glicoproteína con un p eso molecularde 180 kDA. El CEA es el primero de las nombradas proteínas carcinoembrionariasque fueron descubiertas en 1965 por Gold y Freeman(1). El CEA es el marcadormás amplio usado para el cáncer colo-rectal.

A pesar de que el CEA está primariamente asociado con cáncer colo-rectal, otros

males que pueden causar niveles elevados de CEA incluyendo senos, pulmón,estómago, páncreas, ovarios y otros órganos. Condiciones benignas que causansignificativamente niveles más altos que los normales incluyendo inflamación depulmón y tracto Gastrointestinal (GI) y cáncer benigno de hígado (2,3). Fumadoresfrecuentes, como grupo, tienen la concentración mas alta que la línea base de lonormal.

En este método, el calibrador CEA, el espécimen del paciente o control es primeroagregado a un pozo cubierto de streptavidin. El Monoclonal Biotinilado yanticuerpos etiquetados de enzima (directamente contra epitopes distintos ydiferentes de CEA) son agregados y mezclados los reactivos. La reacción entrevarios anticuerpos de CEA y CEA nativos forma un sándwich complejo que ata conel streptavidin cubierto al pozo. Después de completado el periodo deincubación requerido, el anticuerpo de la enzima-CEA conjugada limite esseparada de la enzima-CEA ilimitada conjugada por la aspiración o decantación. Laactividad de la enzima presente sobre la superficie del pozo esta cuantificado por lareacción con un sustrato adecuado para producir luz.

El empleo de varias referencias de niveles de Antígeno Carcinoembrionario (CEA)

conocida permite la construcción de una curva de respuesta de una dosis a laactividad y concentración. De la comparación de la dosis de la curva de respuesta,la actividad de un espécimen desconocido puede ser correlacionada con laconcentración de CEA.

PRINCIPIOENSAYO INMUNOENZIMOMÉTRICO (Tip o 3):Los reactivos esenciales requeridos por un ensayo Inmunoenzimométrico incluyenalta afinidad y anticuerpos específicos (enzima e inmovilizado) con diferentes yreconocimiento distinto epítome, en exceso y ant ígeno nativo. En esteprocedimiento, la inmovilización toma lugar durante el ensayo en la superficie delmicro pozo a través de la interacción de streptavidin recubierto en el pozo yexógeno agregado anticuerpo monoclonal biotinilado anti-CEA. Mezclando elanticuerpo monoclonal biotinilado, el anticuerpo etiquetado y un suero quecontienen e l antígeno nati vo, la reacción de la competición resulta entre el a ntígenonativo y los anticuerpos, sin la competencia o steric hidrance, para formar unsándwich complejo soluble. La interacción es ilustrada por la ecuación seguida:

Simultáneamente, el complejo es depositado en el pozo a través de la reacción dealta afinidad de streptavidin y anticuerpo biotinilado. Esta interacción esta ilustradaabajo:

Después de obtenido el equilibrio, la fracción del anticuerpo-limite es separantígeno desatado por la decantación o la aspiración. La actividad enzimáanticuerpo-limita la fracción es directamente proporcional a la concentracantígeno nativo. Utilizando varias diversas referencias del suero de los valoantígeno conocido, una curva de la reacción a cierta dosis puede ser genela cual la concentración del antígeno de un d esconocido puede ser comprob

REACTIVOSMATERIAL PROVEEIDO

A. Antígeno Carcinoembrionario (CEA) -- 1ml/vial - frascos del A-F Seis (6) frascos de referencia de Antígeno CEA en niveles de 0 (A), 5 (B),25 (D), 50(E) y 250(F) ng/ml. Almacén en 2-8°C. Se ha agregado un preservNota: Los estándares, basados en suero humano, fueron calibrados usanpreparación de referencia, la cual fue analizada contra la 1ª PreparacReferencia Internacional (IRP# 73/601).

B. TRAZADOR DE CEA - 13ml/vial. Un frasco (1) que contiene anticuerpo etiquetado de enzima, biotinilado monde ratón IgG en solución, tinte y preservativo. Almacé n de 2-8°CC. 96 Pozos de Reacción a la Luz - ic ono ? Un (1) microplato de 96 pozos cubierto con streptavidin y empaquetado bolsa de aluminio con un agente deshidratador. Almacén en 2-°C.

D. SOLUCION CONCENTRADA LAVADORA - 20ml - Icono Un (1) frasco que contiene un surfactante en solución salina. Preseagregado. Almacén en 2-30 °C. (Ver Sección de Preparación del Reactivo).E. REACTIVO DE SEÑAL A -- 7ml/botella del ic ono SA Un (1) bote que contiene Luminol en solución. Almacén en 2-8ºC. (Ver SecPreparación del Reactivo).

F. REACTIVO DE SEÑAL B -- 7ml/botella del icono SB Un (1) bote que contiene el peróxido de hidrógeno (H²O²) en solución. Alma2-8ºC. (Ver Sección de Preparación del Reactivo).G. INSERTO DE LA PRUEBA.Nota 1: No utilice los reactivos más allá de la fecha de vencimiento del kit.Los reactivos abiertos son estables por sesenta (60) días cuandoalmacenados en 2-8ºC.Nota 3: Los reactivos son para un solo microplato de 96-pozos.

MATERIAL REQUERIDO PERO NO PROPORCIONADO:1. Mida con una pipeta capaz de entregar los volúmenes 25µl y 50µl cprecisión mejor de 1.5%.2. Dispensadores para las entregas repetidas de los volúmenes 0.100ml y 0con una precisión de mejor de 1.5%.3. Lavador de Micro placas o una botella de apretón (opcional).4. Luminómetro de Microplatos.5. Papel absorbente para retirar los excesos de los pozos de la micro placa.6. Plástico envolvente o tapa para la micro placa para los pasos de la incu7. Aspirador de vací o (opcional) para los pasos de la vado.

8. Contador de tiempo.9. Materiales del control de calidad. PRECAUCIONESPara el Uso De Diagnóst ico i n Vitro. No Para Uso Interno o Externo en

Humanos o Animales.Todos los productos que contienen el suero humano han sido encontrados pno-reactivos para el antígeno superficial de la hepatitis B, los anticuerpos d1&2 y de HCV por los reactivos con licencia del FDA. Puesto que ninguna sabida puede ofrecer termine el aseguramiento que los agentes infecciosoausentes, todos los productos humanos del suero deben ser dirigidospotencialmente peligrosos y capaces de transmitir enfermedad. Los procedimientos del laboratorio para manejar productos de la sangre se encontrar en el Centro para el Control de Enfermedad/el Instituto NacionSalud, "Bioseguridad en laboratorios microbiológicos y biomédicos," 2da E1988, publicación No. (CDC) 88-8395 de HHS.



RECOLECCION DE LA MUESTRA Y PREP ARACIONLos especimenes serán sangre, suero en tipo y las p recauciones generalmente enla colección de muestras de veni-puntura deben ser observados. Para lacomparación exacta a los valores normales establecidos, una muestra de ayunodel suero de la mañana debe ser obtenida. La sangre se debe recoger en un tubollano de venipunctura de tapón rojo sin añadidos o anticoagulantes. Permita que lasangre coagule. Centrifugue el espécimen para separar el suero de las células.Las muestras se pueden refrigerar en 2-8°C por un período máximo de cinco (5)días. Si el espécimen no se puede probar dentro de este tiempo, la muestra sepuede almacenar en las temperaturas de -20°C por hasta 30 días. Evite congelar ydeshelar. Cuando sea analizado en duplicado, se requiere 0.050ml del espécimen.

PREPARACION DE LOS REACTI VOS: 1. SOLUCIÓN LAVADORA. Diluir contenidos del concentrado lavador con 1000mlcon agua desionizada o destilada en un contenedor adecuado para almacenar.Almacénese a temperatura ambiente 20-27°C. hasta por 60 días.2. SOLUCIÓN DE TRABAJO REACTIVO DE SEÑAL. – Mezcle volúmenes igualesde Reactivo de Señal A y Reactivo de Señal B en un contenedor limpio. Úsesedentro de las 36 horas siguientes. Por ejemplo, agregue 1ml de A y 1ml de B pordos (2) tiras de ocho pozos (se crea un pequeño exceso de solución). Deseche laporción sin usar.

PROCEDIM IENTO DE LA P RUEBA. Antes de proceder con el ensayo, tenga todos los reactivos cerca, las referenciasdel suero y controles a temperatura ambiente (20-27°C).1. Ajuste el formato de todos los pozos para cada referencia de suero, controles yespécimen del paciente a ser ensayados en duplicado. Reempaque cualquier ti rade micro pozos de ntro de la bols a de aluminio , séllese y guárdese a 2-8°C.2. Pipetear 0.025 ml (25µl) de la referencia de suero apropiada, diluir el control oespécimen en los pozos designados.3. Añada 0.100 ml (100µl) del trazador del reacti vo CEA a cada pozo. Es muy

importante dispensar todos los reactivos cerca del fondo del pozo cubierto.4. Remolinear el micro plato gentilmente p or 20-30 segundos para mezclar y cubrir. 5. Incubar 45 minutos a t emperatura ambiente. 6. Descarte los contenidos del micro plato por decantación o aspiración. Sidecanta, golpee ligeramente y borre la placa seca con toalla absorbente. 7. Agregue 350µl de so lución lavadora (ver la sección de preparación de reacti vos)decante (golpee y borre) o aspire. Repetir cuatro (4) veces adicionales para un to talde cinco (5) lavados. Un lavador automático o manual de platos puede serusado. Siguiendo las instruccion es del fabricante para un uso apropiad o. Siuna bot ella de apretón es empleada, llene cada pozo presion ando el envase(evite las burbujas) para dispensar el lavador. Decante el lavador y repitacuatro (4) veces adicionales.8. Agregue 0.100 ml (100µl) de solución de trabajo Reactivo de Señal a todos lospozos ( ver Sección de Preparación de Reactivos). Siempre agregue los reactivosen el mismo ord en para minimizar la diferencia de tiempo de reacción entrelos pozos. 9. Incube por cinco (5) minutos en la oscuridad.10. Lea las Unidades Relativas de Luz (RLU’s) en cada pozo en 0.2 – 1.0segundos. Los resultados deben darse dentro de los 30 minutos que se

agrego el Reac tivo d e Señal. CON TROL DE CALI DADCada laboratorio debe t ener controles de ensayo en bajo, medio y alto rango de lacurva de la reacción para monitorear el buen funcionamiento del ensayo. Estoscontroles deben ser tratados como desconocidos y determinar los valores en cadamétodo de prueba realizada. Las tablas de control de Calidad deben demantenerse para seguir el funcionamiento de los reactivos proveídos. Los métodosestadísticos pertinentes deben ser empleados para comprobar las tendencias.Desviaciones significativas del funcionamiento establecido pueden indicar uncambio experimental en las condiciones o degradación del kit de reactivos.Reactivos frescos deben usarse para determinar la razón de las variaciones.

RESULTADOSUna curva de la reacción a cierta dosis se utiliza para comprobar la concentraciónde CEA en especimenes desconocidos.1. Registre los RLU’s (Unidades Relativas de Luz) obtenidos de la impresora dellector del micro placas conforme al ejemplo 1.2. Trace los RLU’s para cada referencia duplicada del suero contra la

concent ración correspondiente de CEA en ng/ml en el papel de gráfico lineal. (Nopromedie los duplicados de las referencias del suero antes de trazar).3. Dibuje la mejor curva a través de los puntos trazados.4. Para determinar la concentración del CEA para un desconocido, localice elpromedio de RLU’s de los duplicados para cada desconocido en el eje vertical delgráfico, encuentre el punto que se interseca en la curva, y lea la concentración (enpg/ml) del eje horizontal del gráfico (los duplicados del desconocido se puedenpromediar según lo indicado). En el siguiente ejemplo, promedie los RLU’s (23210)de las intersecciones desconocidas la curva de calibración a (88ng/ml)concentración CEA (Ver figura 1)*.

Nota: El software de reducción de datos de c omputadora diseñado para los análisisde CLIA se puede utilizar también para la reducción de datos. Los duplicados de undesconocido deben ser promediados como se indica (ver figura 1).

* Las informaciones presentadas en el Ejemplo 1 y figura 1 son ilussolamente no d eben usarse para basarse en la curva preparada con cada eEn adición, los RLU’s de los calibradores han sido normalizados aproximada 100,000 RLU’s para el calibrador F (mayor salida de luz). Esta conversión las diferencias causadas por la eficiencia de varios instrumentos que puedusados para medir la sa lida de luz.

PA RAMETROS DE CONTROL DE CALI DADEl siguiente criterio debe s er conocido en orden de que los resultadosanálisi s sean c onsiderados válidos:

1. La curva de respuesta a la dosis (Intercepciones 80%; 50% & 20%) debdentro de los parámetros establec idos.2. Cuatro fuera de seis pools del control de calidad debe estar dentro de losestablecidos.

LIMITACIONES DEL P ROCEDIMIENTOA. Funcionamiento del Análisis.1. Es importante que el tiempo de la reacción en cada uno de los pozollevada a cabo constante para los resultados por reproducir.2. El medir con una pipeta de muestras no debe extender más allá de diminutos para evitar la deriva del análisis.3. Si más de un (1) plato es usado, se recomienda repetir la dosis de la curespuesta.4. La falta de retirar la solución adecuadamente en el paso del lavado aspiración o de la decantación puede dar lugar a la réplica pobre y a resfalsos.5. Las muestras que puedan estar contaminada microbiológicamente, no deusadas en este análisis. Alta lipemica o especimenes bemolizados no deusados.

6. Use componentes del mismo lote. No mezcle l os reactivos de d iferentes lo7. Las pipetas multicanales se recomiendan para la adición de los reactivos.8. Especimenes de pacientes con concentraciones de CEA arriba de 250pueden diluirse (por ejemplo 1/10 o mayor) con suero masculino normal (Cng/ml) y reanalizado. Las concentraciones de muestras son obtenidas multipel resultado por el factor de dilución (10).B. Interpretación1. Si la reducción controlada de información de la computadora es usadinterpretar el r esultado de la prueba, es imperativo que el valor predeciblecalibradores caiga dentro del 10% de las concentraciones asignadas.2. EL CEA tiene una sensibilidad clínica baja y especificidad como un mtumoral. Clínicamente, un CEA el evado no es un valor de diagnóst icoprueba para el cáncer y debe ser usada solamente en conjunto comanifestaciones clínicas (observaciones) y parámetros de diagnósticpacientes con cáncer colorectal que no exhiben valores elevados de CEestos no siempre cambian con la progresión o regresión de la enfermedafumadores demuestran un rango alto de valores de la línea base que fumadores.



RAN GOS ESPERA DOS DE VALORESCerca del 99% de los no-fumadores tienen una concentración menor de los 5.0ng/ml. Similarmente 99% de los fumadores tiene concentraciones menores a los10ng/ml(4).

TABLA IValores Esperado s para el Sist ema CEA CLIA

No Fumador es < 5 ng /mlFumadores < 10 ng/ml

Es importante tener presente que el establecimiento de una gama de los valores

que se pueden esperar ser encontrado por un método dado para una población de"personas -normales" es dependiente sobre una multiplicidad de factores: laespecificidad del método, de la población probada y de la precisión del método enlas manos del analista. Por estas razones cada laboratorio debe depender de lagama de valores esperados establecidos por el fabricante solamente hasta que unalata interna de la gama determinada por los analistas usando el método con unapoblación indígena al área en la cual el laboratorio está situado. CA RACTERISTICAS DE ACTUACIÓ NA. Precisión.La precisión en y entre la precisión del análisis del procedimiento de CEA CLIA fuedeterminada por análisis en tres diversos niveles de los sueros de control. Elnúmero, el valor medio, la desviación de estándar (? ) y el coeficiente de variaciónpara cada uno de estos sueros del control se presentan en la tabla 2 y la tabla 3.

B. SensibilidadEl procedimiento del CEA tiene una sensitividad de 0.0125 ng. Esto es el

equivalente a una muestra que contiene una concentrac ión de CEA de 0.5 ng/ml.

C. ExactitudEl procedimiento del CEA CLIA fue comparada con un método de referencia deELISA. Los especimenes biológicos de concentraciones bajo, normal y elevadofueron analizados. El número total de especimenes fue 202. La ecuación deregresión del ultimo cuadro y el coeficiente de correlación fueron computadas parael CEA en comparación del método de referencia. La información obtenida semuestra en la Tabla 4.

TABLA 4Ultimo recuadro

Regresión Cor relaciónMétodo Significado Análisis Coeficiente

Este método (X) 5.67 y=0.1164+1.0324(X) 0.998Referencia (Y) 5.75

D. Especificidad.Los anticuerpos altamente específicos de las moléculas del CEA han sido en el procedimiento de ELISA del CEA. Ninguna interferencia fue detectadafuncionamiento del CEA de ELISA una vez adicionando las cantidades maslas siguientes sustancias a una piscina de suero humano.

Ácido Acetilsalicílico 100 µg/mlÁcido Ascórbico 100 µg/mlCafeína 100µg/mlAFP 10 µg/mlPSA 1.0 µg/mlCA-125 10,000 U/mlhCG 1000 IU/mlhLH 10 IU/ml

hTSH 100 mlU/mlhPRL 100µg/ml

REFERENCIAS.