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OBTENCIÓN DE COLAGENO A PARTIR DE CRESTAS DE POLLOS.
CHRISTIAN DAIVID CASTRO VARGAS
UNIVERSIDAD INDUSTRIAL DE SANTANDER
FACULTAD DE CIENCIAS BÁSICAS
ESCUELA DE QUÍMICA
BUCARAMANGA
2012
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OBTENCIÓN DE COLAGENO A PARTIR DE CRESTAS DE POLLOS.
CHRISTIAN DAIVID CASTRO VARGAS
Proyecto de Grado Modalidad Investigación presentado como requisito para optar
por el título de Químico.
DIRECTOR:
Herminsul de Jesús Cano Calle, Ph.D.
DIRECTOR:
Cristian Blanco Tirado, Ph.D.
UNIVERSIDAD INDUSTRIAL DE SANTANDER
FACULTAD DE CIENCIAS BÁSICAS
ESCUELA DE QUÍMICA
BUCARAMANGA
2012
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DEDICATORIA
A mis padres, Maritza y Pedro por todo el amor y cariño que me han brindado todala vida, por el apoyo incondicional en cada proyecto que tomo y los buenos
consejos, los AMO.
A mi abuela Oliva que ha sido mi segunda madre toda mi vida, eres un amor de
mujer ojala todas las personas te conocieran y siguieran tus consejos.
A mi hermanita Angie que me enseña día a día como los tiempos cambian y que a
pesar de las alegrías, tristezas y rabietas siempre olvida todo rápido y muestra esa
linda sonrisa que alegra mis días, siempre contaras conmigo hermanita.
A July Gómez, por brindarme su compañía, cariño y comprensión durante gran
parte de mi vida universitaria, por ser mi apoyo durante momentos difíciles, por
enseñarme muchas cosas bonitas de la vida, gracias por aportar tantas cosas
positivas en mi vida; logramos crear una historia que nunca olvidaré.
A la familia Gómez Pereira, por abrirme las puertas de su casa en una etapa muy
importante en mi desarrollo como persona y profesional, siempre los llevo
presentes y nunca los olvidare.
A todos mis amigos, William, Carlos, Jose, Oscar, Jesica, Cindy, Julieth, Lina,
Marisol, Mafe, Javier, Camila, Jhon, Johana, Hernan, Diego, Carlos, Cesar y Juan
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Carlos, todos personas especiales que llevaran un lugar en mi corazón por todos
los momentos compartidos, mil gracias por todo.
A los profesores, Herminsul, Cristian y Yajaira por el apoyo y confianza para
alcanzar esta meta.
Finalmente y no menos importante a Dios por darme la fe, la fortaleza y la
esperanza para culminar esta etapa.
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AGRADECIMIENTOS
Al Doctor Herminsul Cano, por las enseñanzas recibidas, la dedicación, confianzay apoyo incondicional, un nuevo amigo en este juego de la vida.
Al Doctor Cristian Blanco, por la codirección del proyecto y ser siempre eje
fundamental del desarrollo del mismo, gracias por las correcciones y aportes.
A la Doctora Stelia Carolina Méndez, por tomarse el tiempo de calificar este
trabajo y aportar con su conocimiento al desarrollo del mismo.
A Jessika Hernández, por el tiempo y dedicación en compartir sus conocimientos
en electroforesis, también por ser un gran apoyo en momentos difíciles y ser una
gran amiga siempre dispuesta a ayudar.
A Johanna Flórez, por convertirse en una gran amiga y compañera de laboratorio,
sacar tiempo para leer y corregir este proyecto, también por sacar tiempo para
sacarme sonrisas en tiempos difíciles.
A César Ariza por su gran colaboración al momento de liofilizar las muestras,eternamente agradecido.
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A los Doctores, Rodrigo Torres y Claudia Ortiz, por abrirme las puertas del
laboratorio de Bioquímica y permitirme desarrollar el proyecto.
A todos los compañeros del laboratorio de Bioquímica por compartir conmigo
largas jornadas de trabajo y momentos de esparcimiento.
A la Doctora Yajaira Combariza, por los análisis de espectrometría de masas y
aportes al desarrollo de la investigación.
A Martha Liliana Chacón por su gran aporte de conocimientos en el área analítica
de esta investigación.
Por último a todas las personas que directa o indirectamente estuvieron vinculadas
de una u otra forma a este proyecto, colaborando para sacarlo adelante a pesar de
los contratiempos.
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CONTENIDO
INTRODUCCIÓN ................................................................................................... 15
1. DEFINICIÓN DEL PROBLEMA ...................................................................... 17
1.1. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA ....................................................... 17
1.2. JUSTIFICACIÓN ....................................................................................... 18
2. OBJETIVOS .................................................................................................... 19
2.1. OBJETIVO GENERAL .............................................................................. 19
2.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS ..................................................................... 19
3. MARCO DE REFERENCIA ............................................................................. 20
3.1. PROCESO DE EXTRACCIÓN .............................................................. 20
3.2. MARCO TEÓRICO ................................................................................... 21
3.2.1. Estructura del colágeno ...................................................................... 21
3.2.2. Usos y aplicaciones del colágeno ...................................................... 22
3.2.3. Fuentes de obtención ......................................................................... 23
3.2.4. Técnicas Analíticas ............................................................................ 23
3.2.7.1. Electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio(SDS) ........................................................................................................... 24
3.2.7.2. Espectrometría de Masas - MALDI/TOF ........................................ 24
3.2.7.3. Espectroscopia Ultravioleta-Visible ................................................ 25
4. METODOLOGÍA ............................................................................................. 26
4.1. DISEÑO EXPERIMENTAL .......................................................................... 26
4.1. PREPARACIÓN DE LA MATERIA PRIMA ............................................... 27
4.2. EXTRACCIÓN Y PURIFICACIÓN DEL COLÁGENO ............................... 29
4.3.1. Diálisis ................................................................................................ 30
4.3.2. Liofilización ......................................................................................... 30
4.4. CARACTERIZACIÓN DEL COLÁGENO .................................................. 32
4.4.1. Perfil Proteico - Electroforesis ............................................................ 32
4.4.2. Espectroscopia UV-Vis ....................................................................... 34
4.4.3. Espectrometría de Masas .................................................................. 34
5. RESULTADOS Y ANÁLISIS DE RESULTADOS ........................................... 36
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5.1. EXTRACCIÓN DE COLÁGENO .................................................................. 36
5.2. DETERMINACIÓN DEL PERFIL PROTEICO DE LAS EXTRACCIONES DECOLÁGENO ....................................................................................................... 38
5.3. ESPECTROSCOIA UV-VIS ...................................................................... 42 5.4. ESPECTROMETRÍA DE MASAS ............................................................. 44
CONCLUSIONES .................................................................................................. 45
RECOMENDACIONES .......................................................................................... 46
BIBLIOGRAFÍA ..................................................................................................... 47
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LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Estructura de las fibras de colágeno.. .................................................... 21Figura 2. Cambio en la estructura tridimensional del colágeno al reemplazar unresiduo de glicina por alanina. ............................................................................... 22Figura 3. Representación gráfica del diseño experimental. .................................. 27Figura 4. Crestas enteras y picadas ...................................................................... 28Figura 5. Crestas cortadas y listas para licuar.. .................................................... 28Figura 6. Muestra homogénea, lista para ser tratada.. .......................................... 29Figura 7. Liofilizador marca labconco lyph-lock. .................................................... 31Figura 8. Rampas de temperatura y tiempo programadas en el liofilizador. ......... 31Figura 9. Montaje utilizado para realizar electroforesis en geles de poliacrilamida
SDS.. ..................................................................................................................... 33Figura 10. Gel de SDS-PAGE al 7.5% sin tratar las muestras con pepsina;tratamiento 24 h -26ºC. .......................................................................................... 38Figura 11. Geles de SDS-PAGE al 10%: A) tratamientos de 12 horas y 24 h. B)tratamientos de 36 horas. ...................................................................................... 40Figura 12. Electroforesis (SDS-PAGE) de colágeno tipo I de diferentes especiesanimales ................................................................................................................ 41Figura 13. Espectros UV-Vis del colágeno extraído; tratamiento con pepsinadurante 36 horas. .................................................................................................. 43Figura 14. Espetros UV-Vis de colágeno tipo I de diferentes espécies animales. 43
Figura 15. Espectro de masas del colágeno tipo I, utilizando UV-MALDI-MS. ...... 44
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LISTA DE TABLAS
Tabla 1. Variables a modificar. Fuente: el autor. ................................................... 26Tabla 2. Componentes y volúmenes para el gel de separación. ........................... 32Tabla 3. Composición del buffer de corrido. .......................................................... 32Tabla 4. Composición de la solución colorante y las decolorantes. ....................... 34Tabla 5. Cantidades tratadas y cantidad de colágeno obtenido. ........................... 36Tabla 6. Rendimientos y desviaciones estándar de las extracciones. ................... 37
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RESUMEN
TÍTULO
OBTENCIÓN DE COLAGENO A PARTIR DE CRESTAS DE POLLO.*
AUTOR
CASTRO VARGAS, CHRISTIAN D. **
PALABRAS CLAVECOLAGENO, CRESTAS DE POLLO.
CONTENIDO: debido a la gran demanda de colágeno en la industria farmacéutica, cosmética yde biomateriales en la presente investigación se extrajo colágeno de las crestas de pollos,buscando dar un valor agregado a este subproducto de la industria avícola Santandereana. Elatelocolágeno es producido por la eliminación del telopéptido de colágeno por acción de enzimas.El propósito de este estudio fue evaluar el efecto de la digestión con pepsina a diferentes tiempos ytemperaturas; adicionalemente, se logró la caracterización de la proteína obtenida por diferentesanálisis fisicoquímicos y espectroscópicos. Por medio del análisis de electroforesis se determinó
que el atelocolágeno de las crestas de pollo estaba compuesto principalmente por colágeno tipo I.El espectro de absorción UV presenta un perfil en forma de campana que muestra un pico deabsorción entre los 215 a 220 nm. La caracterización por espectrometría de masas demostró lapresencia de 3 bandas correspondientes a las tres cadenas que conforman el colágeno la α1 a93.26 kDa, la α2 a 140.37 kDa y la β a 283.76 kDa.
Mediante los procesos de extracción implementados en este trabajo se obtuvo un rendimiento del2.44% logrando superar los presentados por Lin y Liu [8] en el 2006. Con base en esto se sugiereque las crestas de pollo son una fuente de colágeno tipo I, lo que genera un valor agregado a unode los subproductos de la industria avícola.
__________________________*Trabajo de Investigación** Facultad de ciencias básicas. Escuela de Química. Director: Herminsul de Jesús Cano Calle.Director: Cristian Blanco Tirado.
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ABSTRACT
TITLEOBTAINING COLLAGEN FROM CHICKEN COMBS
AUTHOR
CASTRO VARGAS, CHRISTIAN D. **
KEYWORDS
COLLAGEN, CHICKEN COMBS
CONTENT: due to the high demand of collagen in the pharmaceutical, cosmetics andbiomaterials industry in this investigation was extracted collagen from chicken combs, looking toadd value to the product of the poultry industry Santandereana. The atelocollagen is produced byremoval of the telopeptides of collagen by enzymes. The purpose of this study was to evaluate theeffect of digestion with pepsin at different times and temperatures; Also being achieved
characterization of the protein obtained by different physico-chemical and spectroscopic analysis.By means of analysis of electrophoresis was determined that the crests of atelocollagen wascomposed mainly of chicken collagen type I. The UV absorption spectrum has a bell-shaped profilewhich shows an absorption peak between 215 to 220 nm. The characterization by massspectrometry showed the presence of three bands corresponding to the three collagen chainscomprising the α1 to 93.26 kDa, α2 to 140.37 kDa and β to 283.76 kDa.
By means extracting processes implemented in this paper yield was obtained of 2.44% able toovercome those presented by Lin and Liu [8] in 2006. Based on this it is suggested that the crests ofchicken are a source of type I collagen, creating added value to one of the byproducts of the poultryindustry.
__________________________*Work Degree** Faculty of Basic Sciencies. Director: Herminsul de Jesus Cano Calle. Director: Cristian BlancoTirado.
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INTRODUCCIÓN
El colágeno es una de las proteínas más abundantes en tejidos de animales.
Estas proteínas hacen parte la matriz extracelular y le brindan propiedadesmecánicas, tales como la elasticidad, a los tejidos conectivos. [12] Estructuralmente
el colágeno tipo I está constituido por tres cadenas polipeptídicas denominadas
α1, α2 y β. [20] Estas cadenas se entrelazan para construir unidades de proteínas
de hasta 280 kDa.
En la naturaleza se encuentran 28 tipos de colágeno que se diferencian por su
secuencia aminoacídica y sus diferentes funciones.[20] El colágeno tipo I es el más
abundante de todos los colágenos y es de gran importancia en el campo de los
biomateriales, la industria farmacéutica y cosmética lo que ha impulsado la
investigación para encontrar nuevas fuentes de obtención de esta proteína.
En los últimos años se han realizado diversos estudios para la obtención de
colágeno tipo I de las diferentes partes del pollo como las patas, la piel y las
crestas.[3, 11] Se ha demostrado que el colágeno de las patas de los pollos es una
mezcla de de los tipos I y II, lo cual no es apetecido en la industria; [3] por otro lado
el colágeno proveniente de la piel del pollo se encuentra en una proporción muy
baja, solo 860g de proteína por cada 100kg de materia prima son obtenidos de
esta fuente, lo cual explica el poco interés por la utilización de esta materia prima.[4] Como consecuencia, las crestas, subproducto del sacrificio de pollos, son una
fuente importante de colágeno tipo I, pues se sabe que contienen alrededor del 1.6
% de colágeno en relación w/w.[11]
Las diversas aplicaciones industriales del colágeno crea la necesidad de tener una
fuente de esta proteína que permita su fácil extracción y que su rendimiento sea lo
suficiente alto para reducir costos de producción y abastecer parte de la demanda
de esta fuente de proteína.
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1. DEFINICIÓN DEL PROBLEMA
1.1. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
Gran parte del colágeno utilizado en las industrias farmacéutica, cosmética y de
biomateriales es importado del continente europeo, lo cual se ve reflejado en los
altos costos de los productos que utilizan esta proteína como principio activo.
Debido a que estas industrias están en constante desarrollo y expansión es de
gran importancia tener un proveedor a nivel nacional que permita la reducción de
costos y tiempos de entrega del colágeno. Esto sería posible si se lograra obtener
una fuente importante de colágeno que sea de fácil acceso y de constante
producción en Colombia.
La industria avícola genera varios residuos que pueden ser aprovechados para la
obtención de colágeno tipo I como se ha demostrado en diferentes
investigaciones. [12, 20, 3, 11] En el 2011, el sector avícola santandereano produjo
300.000 toneladas de pollo, representando el 26% de la producción nacional.[18]
Estos índices de producción presentan a Santander como una opción para el
desarrollo de este tipo de industria. Por esta razón se busca optimizar una
metodología de extracción de colágeno tipo I, aprovechando las crestas de pollo
criado en el departamento de Santander.
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1.2. JUSTIFICACIÓN
La producción de carne de pollo, en Santander, genera una gran cantidad de
subproductos los cuales se utilizan para producir alimentos concentrados,
principalmente. Sin embargo estos subproductos son una alta fuente de proteína.
Por ejemplo, a partir de las crestas se puede extraer entre el 1 y 1.6% de colágeno
tipo I. [8] Con la extracción selectiva de este tipo de proteínas consideramos que es
posible generar valor agregado a la cadena productiva avícola del departamento.
Adicionalmente, el aislamiento y producción de estas nueva sustancias permite el
desarrollo de nuevas industrias como la farmacéutica y la de productos
cosméticos. La investigación en dichas áreas es de gran importancia, pues estos
centros se enfocan principalmente en temas como: el envejecimiento, la
desaparición de cicatrices y manchas en la piel. Estas investigaciones dependen
en parte de la disposición de colágeno ya que este es uno de los principios activos
en los productos utilizados en la regeneración celular.
El colágeno es ampliamente utilizado en la medicina como un sistema
biodegradable para la liberación de una gran variedad de drogas, incluyendo
anticonceptivos, antibióticos, insulina, hormonas del crecimiento entre otras. El
colágeno en forma de fibras se ha utilizado en el cierre de heridas quirúrgicas e
incisiones.[21] Se utiliza como material de sutura para modificar la velocidad de
absorción y para permitir la retención de la resistencia prolongada. Las suturas de
colágeno puro se utilizan en cirugía oftálmica, así como para otras aplicaciones. [18]
Debido a la posibilidad de utilizar los subproductos de la industria avícola para la
producción de colágeno tipo I, consideramos que este trabajo será de gran
impacto porque permite establecer las condiciones, a nivel de laboratorio, para el
posible escalamiento e industrialización de esta proteína.
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2. OBJETIVOS
2.1. OBJETIVO GENERAL
Optimizar un procedimiento de extracción de colágeno a partir de crestas de pollo,
producto del proceso de sacrificio avícola en Santander.
2.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS
2.2.1. Evaluar el efecto de la temperatura y el tiempo de incubación de la
pepsina para la obtención de colágeno tipo I.
2.2.2. Utilizar reactivos grado comercial y de fácil consecución para la
extracción selectiva de colágeno tipo I de las crestas de pollo
producido en las plantas de sacrificio de aves en el departamento de
Santander.
2.2.3. Caracterizar el colágeno por medio de diferentes técnicas
instrumentales con miras a certificar la calidad y pureza del colágeno
obtenido.
2.2.4. Cuantificar el rendimiento a escala de laboratorio de la producción decolágeno tipo I a partir de las crestas de pollo.
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3. MARCO DE REFERENCIA
3.1. PROCESO DE EXTRACCIÓN
La primera investigación relacionada con la extracción de colágeno de fuentes
naturales fue realizada en Japón por Nagai y Suzuki, [13] los cuales obtuvieron
colágeno de diferentes especies de pescado utilizando la piel, el hueso y las
aletas. En esta investigación se analizó el perfil proteico de las cadenas α y β de
colágeno con un patrón de pesos moleculares.
Una de las propiedades a tener en cuenta según esta investigación es la
temperatura de desnaturalización de la proteína, que en la investigación realizada
por Nagai y Suzuki se encuentra en un rango de 25 a 26.5ºC para las diferentes
especies de pescado utilizadas.
Después de ser ampliamente investigado y de corroborar que el colágeno se
podía extraer de pieles de pescados, el mundo científico se abalanzó sobre otro
tipo fuentes de colágeno entre las que se encuentran: las patas de las aves, [11,8] la
piel bovina, [6,24] el tendón de los equinos [1], la piel del sapo [7,19], las escamas del
pescado
[14]
, las medusas
[15]
, la piel porcina
[16]
, la piel del tiburón
[17]
y la piel delos pollos [3]. Todas estas investigaciones se fundamentaron en el procedimiento
propuesto por Nagai y Suzuki en 1999; y Lin, Y. K. y Liu, D. C. en 2006
modificando levemente los tiempos y temperaturas de extracción.
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3.2. MARCO TEÓRICO
3.2.1. Estructura del colágeno
Estructuralmente, el colágeno está constituido de una hélice triple de tres cadenas
polipeptídicas diferentes, las cuales se mantienen unidas por enlaces de
hidrogeno.[20] En 1994 se reportó por primera vez la estructura cristalina del
colágeno (Figura 1) mostrando que es una proteína rica en prolina, glicina e
hidroxiprolina; aminoácidos que le confieren su estructura característica. Cualquier
cambio en la secuencia de aminoácidos, cambia la conformación espacial de la
proteína, como se observa en la figura 2 en la cual se ha reemplazado un residuo
de glicina por alanina.
.
Figura 1. Estructura de las fibras de colágeno. Fuente:http://www.rcsb.org/pdb/101/motm.do?momID=4 consultada 10 de agosto de2012.
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Figura 2. Cambio en la estructura tridimensional del colágeno al reemplazar unresiduo de glicina por alanina. Fuente:http://www.rcsb.org/pdb/101/motm.do?momID=4 consultada 10 de agosto de2012.
3.2.2. Usos y aplicaciones del colágeno
El colágeno posee propiedades únicas que le permiten ser utilizado en diferentesaplicaciones industriales, e.g. como materiales biomédicos, la industria
farmacéutica, cosmética y en alimentos. [21]
Un biomaterial es una sustancia farmacológicamente inerte diseñada para ser
implantada o incorporada dentro del sistema vivo. [22] Los biomateriales más
usados son las aleaciones metálicas, polímeros, cerámicos y sustancias
biológicas. Entre las sustancias biológicas, el colágeno ha sido uno de los más
empleados y más comerciales.
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La principal aplicación del colágeno en la industria farmacéutica y cosmética es el
tratamiento de arrugas, desaparición de manchas de la piel y el encapsulamiento
de medicamentos lo que facilita la administración y dosificación del mismo. De
igual manera, se ha utilizado en la fabricación de productos cosméticos para elfortalecimiento del cabello y la reducción de horquilla. [22]
3.2.3. Fuentes de obtención
Los residuos de la piel, huesos y cartílagos bovinos y porcinos representan hoy
día la principal fuente de extracción de colágeno en la industria. Pero una de las
dificultades que presenta este tipo de colágeno es que no puede cubrir todos losmercados debido a limitaciones socio-culturales. Además el costo de obtención de
colágeno a partir de los bovinos y porcinos es elevado, debido al alto valor que
tiene la cría de este tipo de animales y la baja productividad que se puede obtener
de colágeno. [3]
La problemática anterior ha obligado a la búsqueda de fuentes alternativas de
materia prima para la obtención de colágeno, entre las estudiadas se encuentran
las patas de las aves, [11,8] la piel bovina, [6,24] el tendón de los equinos [1], la piel del
sapo [7,19], las escamas del pescado [14], las medusas [15], la piel porcina [16], la piel
del tiburón [17] y la piel de los pollos [3].
3.2.4. Técnicas Analíticas
Para la caracterización del colágeno se realizaron tres técnicas analíticas
diferentes, la electroforesis, la espectroscopia UV-VIS y la espectrometría demasas.
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3.2.7.1. Electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio(SDS)
La electroforesis es una técnica de separación de moléculas gracias a la acción deun campo eléctrico. Las moléculas disueltas se desplazan en un campo eléctrico a
una velocidad determinada por su relación carga-masa. Para llevar a cavo la
electroforesis se prepara el gel de electroforesis en medio de dos láminas de vidrio
y mediante la polimerización de una solución de monómeros de acrilamida en
cadena de poliacrilamida. Para poder determinar el rango del peso molecular de
las moléculas se utiliza un marcador de peso molecular. Finalmente el revelado se
realiza con azul de coomassie. [12]
3.2.7.2. Espectrometría de Masas - MALDI/TOF
Para la caracterización espectrométrica se utilizó la técnica MALDI-TOF, la cual
utiliza una matriz para proteger a la biomolécula y facilitar la vaporización,[5] en
esta investigación se empleo el acido cinámico dopado con un 1% de ácido
trifluoroacético como matriz de soporte. La muestra es entonces irradiada con unláser pulsado, como un láser de Nd:Yag de 355 nm. La energía del láser expulsa
iones de la matriz electrónicamente excitados, cationes y macromoléculas
neutrales, que crean una densa nube de gas por encima de la superficie de la
muestra. La separación de las moléculas se da por su relación masa-carga en un
analizador de tiempo de vuelo.
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3.2.7.3. Espectroscopia Ultravioleta-Visible
El principio de la espectroscopia involucra la absorción de radiación ultravioleta-
visible (desde 160 hasta 780nm) por una molécula, causando la promoción de unelectrón de un estado basal a un estado excitado. [23]
La absorción de radiación UV-visible por una especie se da en 2 etapas:
1. La Excitación electrónica: corresponde a los electrones involucrados en los
enlaces
2. La Relajación. que puede ser por:
- Emisión de calor
- Reacción fotoquímica
- Emisión de fluorescencia / fosforescencia
Las bandas que aparecen en un espectro UV-visible son anchas, a causa de la
superposicion de transiciones vibracionales y electrónicas.
[23]
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4. METODOLOGÍA
4.1. DISEÑO EXPERIMENTAL
Para poder evaluar la repetitividad, precisión, desviación estándar y demás
parámetros estadísticos se realizó un diseño experimental para determinar
cuántos experimentos se debían hacer, teniendo en cuenta que solo se iban a
modificar dos variables la temperatura y el tiempo de acción de la pepsina sobre la
materia prima (crestas), los tiempos y temperaturas a evaluar se registran en la
tabla 1.
Tabla 1. Variables a modificar. Fuente: el autor.
Temperaturas (°C) Tiempo (h)4 1226 2436 36
Debido a que fueron solo dos variables el diseño resultante es cuadrático como se
observa en la figura 3.
En la figura 3 se señalaron los puntos en los cuales se trabajaron bajo la acción de
la pepsina, teniendo en cuenta que cada experimento se realizó por duplicado y
que el punto en el cual se encuentran todas las proyecciones de los experimentos
(experimento de 24 horas a 26ºC) se le realizaron tres extracciones más para
realizar la estadística de las extracciones, se reúnen un total de 21 extracciones.
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Figura 3. Representación gráfica del diseño experimental.
4.1. PREPARACIÓN DE LA MATERIA PRIMA
Las crestas fueron seleccionadas de dos proveedores distintos, uno de pollos
criollos de los puestos de la plaza de mercado central y otro de una avicultora dela planta de campollo de Rionegro-Santander.
Las crestas fueron prelavadas con agua destilada y cortadas en trozos pequeños
de aproximadamente 1 cm (Figura 4), para luego ser licuadas (Figura 5)
obteniendo una masa más homogénea como se muestra en la figura 6. Las
muestras fueron almacenadas a -20 ºC en un congelador de laboratorio Thermo
Scintific forma Value FREF 2117A, para conservar la muestra y evitar su
descomposición.
Tem. (°C)
Tiempo (h)
36
26
4
12 24 36
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Figura 4. Crestas enteras y picadas. Fuente: el autor.
Figura 5. Crestas cortadas y listas para licuar. Fuente: el autor.
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Figura 6. Muestra homogénea, lista para ser tratada. Fuente: el autor.
4.2. EXTRACCIÓN Y PURIFICACIÓN DEL COLÁGENO
Se siguió el procedimiento descrito por Lin y Liu [8] para aproximadamente 100
gramos de cresta, modificando los tiempos y la temperatura de acción de la
pepsina en la muestra.
En primer lugar se realizó la eliminación de las grasas y pigmentos mediante una
agitación constante en etanol al 20% durante 24 h a 4ºC. El paso siguiente fue
centrifugar la muestra a 10.000 g por 20 minutos y se desechó el sobrenadante en
el cual se encontraban todas la grasas presentes en el tejido tratado, este
procedimiento se realizó dos veces para asegurar la eliminación total de la grasa y
los pigmentos no deseados.
Posteriormente se eliminó la proteínas no colágenas mediante agitación constantecon NaOH 0.2 N por un tiempo de 24 h, para luego centrifugar nuevamente a
10.000 g durante 20 minutos y después se desechó el sobrenadante. A
continuación se agrego 5% p/p de pepsina (EC 232-629-3, P-7000, Sigma,
EE.UU.) y 500 mL de acido acético 0.5 M al precipitado. La mezcla se sometió a
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diferentes temperaturas y tiempos de acción de la pepsina (tabla 2). La mezcla se
centrifugó a 13.000 g durante 40 minutos, el sobrenadante se ajusto a pH 7.0
mediante NaOH 1 N y se mantuvo en agitación durante 24 h para inhibir la
actividad de la pepsina, trascurridas las 24 h se ajustó nuevamente el pH a 3.5 conácido acético 0.5 M. Por último, se añadió NaCl lentamente hasta una
concentración final de 0.9 M para precipitar la proteína, esta mezcla se centrifugó
a 13.000 g durante 40 minutos, el precipitado resultante se disolvió en acido
acético 0.5 M. Se realizó diálisis frente a agua destilada con una membrana
(Spectra/ for Dialysis Membrane MWCO: 12-14,000). Finalmente la solución fue
liofilizada en un liofilizador labconco lyph-lock para obtener la proteína pura y seca.
4.3.1. Diálisis
Se utilizaron segmentos de 10 cm de longitud de una membrana para diálisis
marca Spectra con 20.4 mm diámetro. Estas bolsas formadas se sumergieron en
500 mL de agua destilada a 100ºC para activar los poros de la membrana, los
cuales permiten el intercambio iónico. Posteriormente se cerró en uno de los
extremos y se adiciono la solución de ácido acético 0.5 M que contenía la proteínadisuelta; se anudo el otro extremo de la bolsa y se sumergió en agua destilada
durante 6 horas realizando un cambio del agua cada 2 horas.
4.3.2. Liofilización
Para el proceso de liofilización se utilizó un liofilizador marca labconco lyph-lock
(Figura 7), inicialmente los recipientes se llenaron a la mitad de su capacidad y secongelaron en un refrigerador convencional durante 24 horas previas a la
liofilización. Se configuró el correspondiente proceso de liofilización ingresando las
rampas de temperatura y tiempo (Figura 8). Se encendió la bomba de vacío y se
esperó hasta alcanzar los 0.133 mbarr. Las muestras se mantuvieron congeladas
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a -40ºC y al vacío durante 3 horas, luego a -10ºC durante otras 3 horas
conservando el vacío y finalmente a 25ºC durante 15 horas al mismo vacío
utilizado en los anteriores procesos. Cuando el equipo termino la etapa de secado
primario se procedió a realizar el cambio de manual a automático. Finalmente alterminar el proceso se retiraron los recipientes y se procedió a pesarlos para
calcular los rendimientos de cada extracción.
Figura 7. Liofilizador marca labconco lyph-lock.
Figura 8. Rampas de temperatura y tiempo programadas en el liofilizador.
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4.4. CARACTERIZACIÓN DEL COLÁGENO
4.4.1. Perfil Proteico - Electroforesis
Para obtener el perfil proteico se realizó electroforesis en geles de poliacrilamida-
SDS, utilizando una cámara MiniProtean I marca Biorad. Se preparó una solución
acuosa de la proteína a 0.25 µg/µL de cada una de las extracciones realizadas; de
estas soluciones se tomaron 12 µL y se mezclaron con 3 µL de buffer de carga
para finalmente sembrarlas en geles al 10%. Estos geles se prepararon de
acuerdo al protocolo mostrado en la tabla 2. Después de realizado el montaje se
utilizó como buffer de corrida la solución mostrada en la tabla 4.
Tabla 2. Componentes y volúmenes para el gel de separación.
COMPOSICIÓNGEL DE CORRIDO
AL 10%
GEL DE STACKING
AL 5%
Agua destilada tipo I 1.9 mL 0.93 mL
Acrilamida-Bisacrilamida 1.7 mL 0.23 mL
Tris-HCl pH=8.8 y pH=6.8
para stacking1.3 mL 0.375 mL
Persulfato de Amonio 0.0025mL 0.015 mL
SDS al 10% 0.005 mL 0.03 mL
Temed 0.001 mL 0.0075 mL
Tabla 3. Composición del buffer de corrido.
BUFFER DE CORRIDO
Tris Base 0.20%
Glicina 1.44%
SDS 0.10%
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Figura 9. Montaje utilizado para realizar electroforesis en geles de poliacrilamida
SDS. El voltaje utilizado fue de 120 V y una corriente de 3 A durante 1 hora y 30
minutos. Fuente: el autor.
Los geles fueron teñidos con azul de Coomassie al 0.25% durante 1 hora, con el
fin de determinar el peso molecular de las proteínas presentes en el colágeno.Para conocer el respectivo peso molecular se utilizó como marcador de peso
FERMETAS, que contiene proteínas entre los 10 y 200 kDa. A continuación, se
sumergió el gel en una solución decolorante fuerte durante 30 minutos y
finalmente en una solución decolorante débil durante 1 hora. En la tabla 5 se
muestra la composición de la solución colorante y las decolorantes para la tinción
con azul de coomassie R250.
Fuente de
poderCámara de
electroforesis
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Tabla 4. Composición de la solución colorante y las decolorantes.
SOLUCIÓN
COLORANTE
SOLUCI N
DECOLORANTE
FUERTE
SOLUCIÓN
DECOLORANTE DEBIL
Metanol 50% Metanol 50% Metanol 5%
Ácido acético 10% Ácido acético 10% Ácido acético 10%
Azul de Comassie 0.25% - -
4.4.2. Espectroscopia UV-Vis
Se prepararon soluciones de cada extracción a una concentración de 0.25 µg /µL
de proteína para ser caracterizadas por un espectrofotómetro UV-Vis marca
Shimadzu UV-1601-1601 PC con un ancho de rejilla de 0.5 nm. Se realizó un
barrido desde los 200 nm hasta los 500 nm y se determinó la longitud de onda
máxima característica para cada solución de las diferentes extracciones. La
solución se colocó en una cubeta de cuarzo y la absorbancia resultante se calculó
empleando la ley de Lambert-Beer.
4.4.3. Espectrometría de Masas
Para complementar la identificación del colágeno se empleo la técnica de
ionización suave denominada MALDI-TOF (Matrix-Assisted Laser
Desorption/Ionizatiom- Time of Fligth) que permite el análisis de biomoléculas y
moléculas orgánicas de gran tamaño.
La matriz empleada para este análisis fue el ácido cinámico utilizado por Klaus
Dreisewerd y colaboradores.[4] Se implementó la metodología de doble capa
siguiendo las recomendaciones del fabricante del equipo. Inicialmente se preparó
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5. RESULTADOS Y ANÁLISIS DE RESULTADOS
5.1. EXTRACCIÓN DE COLÁGENO
Los resultados de las diferentes extracciones se muestran en la tabla 5, en estetrabajo se contemplaron dos variables: el tiempo y la temperatura de acción de lapepsina sobre las crestas.
Tabla 5. Cantidades tratadas y cantidad de colágeno obtenido.
Tratamiento
Peso de crestas
(g)
Peso de pepsina
(g)
Colágeno
obtenido (g)12h - 4ºC
80.50 5.19 0.6534100.00 5.07 0.9845
12 h – 26ºC100.35 5.03 1.023570.00 4.88 0.8334
12h – 36ºC71.02 4.62 0.681799.95 4.99 1.6057
24h – 4ºC100.00 5.01 1.045380.06 5.05 0.7596
24h – 26ºC
80.51 5.04 1.129599.97 5.02 1.219399.76 4.96 1.220099.65 5.01 1.2412
100.35 5.05 1.2406
24h – 36ºC99.74 5.07 1.4533
100.98 4.96 2.1258
36h – 4ºC99.12 4.90 1.043888.19 5.02 0.8053
36h – 26ºC99.72 5.02 2.550388.22 4.98 2.0536
36h – 36ºC100.33 5.05 1.7671
88.11 4.94 1.7467
Los resultados obtenidos se promediaron, se calculó el rendimiento y desviaciónestándar mostrados en la tabla 6.
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Tabla 6. Rendimientos y desviaciones estándar de las extracciones.
Tratamiento Rendimiento (%)Desviaciónestándar
Coeficientede Varianza
(%)12h – 4ºC 0.90 0,12 13,61
12h – 26ºC 1.11 0,12 10,9212h – 36ºC 1.28 0,46 35,6324h – 4ºC 1.00 0,07 6,84
24h – 26ºC 1.27 0,08 6,1324h – 36ºC 1.78 0,46 25,7336h – 4ºC 0.98 0,10 10,06
36h – 26ºC 2.44 0,16 6,6536h – 36ºC 1.87 0,16 8,35
Al comparar los resultados obtenidos, se aprecia que el rendimiento alcanzado en
los diferentes tratamientos son muy similares a los obtenidos por Lin y Liu, [8] entre
el 0.7 y 1.6%. En este trabajo se logró un rendimiento significativamente mayor a
los reportados en la literatura, empleando el tratamiento de 36 horas y 26ºC con el
cual se obtuvo un rendimiento del 2.44%, lo cual incrementa en un 0.84% lo
esperado según Lin y Liu.[8]
Por otro lado las desviaciones estándar obtenidas en cada uno de los
experimentos ejecutados muestran una alta reproducibilidad en las extracciones
realizadas. Los tratamientos de 24 horas – 4ºC y 24 horas - 26ºC presentan
desviaciones estándar por debajo de 0.1 y con coeficiente de varianza inferior al
10%, lo que indica que fueron los tratamientos con mayor reproducibilidad, estos
resultados se evidencian en la tabla 5.
Al analizar la desviación obtenida por el tratamiento que mostró mejores
resultados en cuanto al rendimiento de extracción (36h-26ºC), se observa que su
desviación estándar esta en un valor aceptable, ya que 0.16 no representa gran
incertidumbre en el proceso de extracción y siguen presentando menos del 10%
en su coeficiente de varianza, cumpliendo con las buenas prácticas de laboratorio.
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200
150
120
5.2. DETERMINACIÓN DEL PERFIL PROTEICO DE LAS EXTRACCIONES DECOLÁGENO
Inicialmente se realizó la extracción de colágeno de las crestas sin tratarlas con lapepsina, con el fin de evaluar la posibilidad de no implementar este reactivo y
reducir en gran parte los costos de la investigación. En la figura 10 se observan los
resultados obtenidos, donde se evidencian un gran número de proteínas por
encima de los pesos esperados. Esto indica la posible formación de dímeros y
trímeros de las cadenas alfa del colágeno y la presencia de otras proteínas no
colágenas, lo cual evidencia que las extracciones realizadas no cumplen con los
resultados esperados ni los reportados en la literatura. [9] Por esta razón se decidió
utilizar la pepsina con el fin de realizar la ruptura de estos enlaces y
adicionalmente eliminar las proteínas no colágenas que podrían contaminar la
muestra final.
Figura 10. Gel de SDS-PAGE al 7.5% sin tratar las muestras con pepsina;tratamiento 24 h -26ºC.
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kDa
En la figura 11 se observan los resultados de la separación de proteínas en los
geles al 10% para cada método de extracción, las bandas de las cadenas alfa se
encuentran en el rango de los 100 y 120 kDa. Los perfiles de electroforesis solo
presentan 3 bandas de interés, las cadenas α1 y α2 se observan claramente entodas las extracciones realizadas en aproximadamente 100 kDa y 120 kDa, estas
dos bandas son las cadenas más representativas e importantes del colágeno tipo
I. Por otro lado, la cadena β aparece por encima de los 200 KDa lo que no permite
su plena identificación ya que este es el límite del marcador de peso molecular
utilizado.
Los anteriores resultados concuerdan con los obtenidos por Lin y Liu [8, 9], que
reportan bandas de 97 kDa y 120 kDa para estas cadenas alfa (figura 12). Este
tipo de detección se basa en la formación de complejos fuertes con las proteínas,
interaccionando electrostáticamente con los grupos aminos y se correlaciona mas
con la cantidad de aminoácidos básicos de las proteínas que con su masa total. [2]
Las masas moleculares de las proteínas se calcularon a partir de los geles SDS-
PAGE mostradas en la figura 11.
(A)
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kDa
(B)
Figura 11. Geles de SDS-PAGE al 10%: A) tratamientos de 12 horas y 24 h. B)tratamientos de 36 horas.
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Figura 12. Electroforesis (SDS-PAGE) de colágeno tipo I de diferentes especies
animales (M: marcador molecular; BF, patas de aves; BS, piel bovina; FS, piel derana; PS, piel de cerdo; SS, piel del tiburón, C II, colágeno tipo II de pollo Sigma).Tomado de: LIN, Y., LIU, D; “Comparison of physical –chemical properties of type Icollagen from different species”; Food Chemistry 99 (2006) 244–251.[9]
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5.3. ESPECTROSCOIA UV-VIS
Otra de las técnicas utilizadas para caracterizar el colágeno extraído fue la
espectroscopia Ultravioleta – Visible, donde se obtuvieron los espectros que
confirmaron la presencia de colágeno tipo I (figura 13). El colágeno extraído
presenta un pico de absorción entre los 215 y 220 nm.
El espectro UV-Vis del colágeno se puede utilizar para detectar cualquier
contaminante y para verificar la integridad de los telopéptidos no helicoidales. En
este estudio, cada espectro presenta un perfil con tendencia a una campana
gaussiana con un pico de alta absorción en la región antes mencionada. Este pico
de absorción concuerda con la región obtenida en las investigaciones realizadas
por Lin, Tan y Liu, [9, 8] cuyos espectros mostraron un pico de absorción a los
218 nm para el colágeno tipo I de diferentes especies animales.
Lin y Liu [8] indicaron que los espectro de absorbancia de UV-Vis de las diferentes
especies de colágeno se veía desplazado asía longitudes de onda superiores a los
250 nm debido a los contaminantes proteicos. En este estudio, los espectros de
colágeno obtenido son más estrechos, lo que indica que el colágeno extraído tenía
menos contaminantes.
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Figura 13. Espectros UV-Vis del colágeno extraído; tratamiento con pepsina
durante 36 horas.
Figura 14. Espetros UV-Vis de colágeno tipo I de diferentes espécies animales.Tomado de: LIN, Y., LIU, D.[9]
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
100 125 150 175 200 225 250 275 300 325 350
A b s o r b a
n c i a
Longitud de onda (nm)
36h-4ºC
36h-26ºC
36h-36ºC
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5.4. ESPECTROMETRÍA DE MASAS
El colágeno tipo I mostro tres señales en el espectro de masas (figura 15), se
observan las señales correspondientes a la cadena alfa 1 en 93.26 kDa, la alfa 2
en 140.37 kDa y la cadena beta que por medio de las electroforesis solo se podía
reportar por encima de los 200 kDa mostró que su peso esta en 283.76 kDa,
siendo este el primer reporte del peso exacto de esta cadena del colágeno.
Debido a que el espectrómetro de masas es un UV-MALDI-MS se pudo corroborar
al igual que el trabajo hecho por Klaus Dreisewerd[4] que este tipo de equipos no
alcanzan a generar la energía necesaria para que la muestra pase al estado
gaseoso para luego ser detectada obligando a la matriz a hacer todo el trabajo, a
diferencia de lo reportado por Dreisewerd con un IR-MALDI-MS donde las señales
son mucho más limpias y definidas.
Figura 15. Espectro de masas del colágeno tipo I, utilizando UV-MALDI-MS.
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CONCLUSIONES
El colágeno obtenido de las crestas de pollo es tipo I como se pudo corroborar con
los análisis de electroforesis. Estos análisis muestran que las tres bandas que
componen este tipo de colágeno son la banda alfa 1 a ~100 kDa, la alfa 2 a ~120
kDa y la beta por encima de los 200 kDa.
En el espectro de absorcion UV-Vis se observó una banda en el rango de 215 a
220 nm, lo que permitió corroborar que la proteína extraída fue el colágeno tipo I,
al comparar los espectros con los reportados en la literatura.
El resultado más significativo en la caracterización fue el espectro de masasobtenido por MALDI-TOF, en el cual se observa que la cadena alfa 1 tiene una
masa de 93.26 kDa, la alfa 2 de 140.37 kDa y la cadena beta de 283.76 kDa.
El tratamiento con pepsina de 36 horas a 26ºC fue el que mostró mayor
rendimiento con un 2.44% en la extracción de colágeno.
El bajo costo y amplia disponibilidad de las crestas de pollo en Santander, hacen
que sea una alternativa viable para escalar a nivel industrial la producción de
colágeno.
El colágeno obtenido a partir de las crestas de pollo puede ser un buen sustituto
para el colágeno bovino o porcino que se encuentra en el mercado para el uso
biomédico.
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RECOMENDACIONES
Durante el proceso de extracción se presenta una cantidad representativa de
grasa que es eliminada en la etapa de lavado. Es importante investigar alguna
aplicación que le pueda dar un valor agregado a este subproducto de la
extracción.
Es necesario identificar las operaciones unitarias y los equipos para escalar el
proceso de extracción a nivel industrial, ya que se demostró que las crestas son
una buena fuente de colágeno tipo I.
Se puede mejorar la señal del espectro de masas realizando variaciones en larelación matriz – muestra, ya que la cristalización de la muestra sobre el target es
un factor muy importante a la hora de impactar la muestra con el laser del
espectrómetro MALDI.
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BIBLIOGRAFÍA
[1] Angele, P., Abke, J., Kujat, R., Faltermerier, H., Schumann, D., Nerlich, M., et
al. Influence of different collagen species on physico-chemical properties of
crosslinked collagen matrices. 2004, Biomaterials, 25, 2831 –2841.
[2] Brush, M. Dye Hard: Protein Gel Staining Products. The Scientist. Vol. 12, 10
(1998); p.16.
[3] Cliché S., Amiot J., Avezard C., and Gariepy C.. Extraction andCharacterization of Collagen with or Without Telopeptides from Chicken Skin.2003, Poultry Science 82:503 –509.
[4] DREISEWERD, Klaus., ROHLFING, Andreas. Characterization of Whole Fibril-
Forming Collagen Proteins of Types I, III, and V from Fetal Calf Skin by
Infrared Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry. Anal.
Chem. 2004, 76, 3482-349.
[5] GROSS Jurgen. Mass Spectrometry, primer edición. Berlin: Editorial Springer.,
2004., Pág. 1-3.
[6] Huang, L. H., & Nimni, M. E. Preparation of type I collagen fibrillar matrices and
the effect of collagen concentration on fibroblast contraction. 1993, Biomedical
Engineering-Applications Basis Communications, 5, 60 –71.
[7] Li, H., Liu, B. L., Gao, L. Z., & Chen, H. L. Studies on bullfrog skin collagen.
2004, Food Chemistry, 84, 65 –69.
[8] Lin, Y. K., & Liu, D. C. Effect of pepsin digestion at different temperatures and
time on properties of telopeptide-poor collagen from bird feet. 2006, Food
Chemistry, 94, 621 –625.
8/18/2019 Colágeno a Partir de Crestas de Pollo
48/49
48
[9] LIN, Y., LIU, D; “Comparison of physical–chemical properties of type I collagen
from different species”; Food Chemistry 99 (2006) 244–251.
[10] LIN, Yen-Chih., TAN Fa-jui., MARRA Kacey G., LIU Deng-Cheng. Evaluation of
pepsin digestion of atelocollagen from different chicken combs at low
temperature, 2009 Food Chemistry.
[11] Liu, D. C., Lin, Y. K., & Chen, M. T. Optimum condition of extracting collagen
from chicken feet and its characteristics. 2001, Asian- Australasian Journal of
Animal Sciences, 14, 1638 –1644.
[12] Lodish Harvey; Berk Arnold. Biologia celular y molecular, 5a Edición. Buenos
Aires: Editorial medica Panamericana., 2005., Pág. 87.
[13] Nagai, T. and T. Suzuki. Isolation of collagen from fish waste material: (skin,
bone and fins). 1999, Food Chemistry68: 277-281.
[14] Nomura, Y., Sakai, H., Ishii, Y., & Shirai, K. Preparation and some properties of
type I collagen from fish scales. 1996, Bioscience Biotechnology and
Biochemistry, 60, 2092 –2094.
[15] Nagai, T., Worawattanamateekul, W., Suzuki, N., Nakamura, T., Ito, T., Fujiki,
K., et al. Isolation and characterization of collagen from rhizostomous jellyfish
(Rhopilema asamushi). 2000, Food Chemistry, 70, 205 –208.
[16] Nomura, Y., Toki, S., Ishii, Y., & Shirai, K. Improvement of the material property
of shark type I collagen by composing with pig type I collagen. 2000, Journal of
Agricultural and Food Chemistry, 48, 6332 –6336.
[17] Nomura, Y., Yamano, M., Hayakawa, C., Ishii, Y., & Shirai, K. Structuralproperty and in vitro self-assembly of shark type I collagen. 1997, Bioscience
Biotechnology and Biochemistry, 61, 1919 –1923.
8/18/2019 Colágeno a Partir de Crestas de Pollo
49/49
[18] Ordenanza N° 013 del 23 de Abril de 2012 Plan de Desarrollo, SANTANDEREN SERIO, EL GOBIERNO DE LA GENTE, 2012-2015. Disponible en:http://www.asambleadesantander.gov.co/Doc/Foro/pddsantander.pdf.
[19] Purna, K., & Babu, M. Studies on Rana tigerina skin collagen. 2001,Comparative Biochemistry and Physiology B, 128, 81 –90.
[20] Shoulders Matthew, Raines Ronald. Collagen Structure and Stability. 2009, Annual Review of Biochemistry 78:929 –58.
[21] Shu- Tung Li. Biologic Biomaterials: Tissue- Derived Biomaterials (Collagen).2003, CRC Press LLC. Cap. 6 pag. 117-135.
[22] SILVER FREDERICK; ATUL K. GARG. Collagen: Characterization, processing
and medical applications. Handbook of Biodegradable Polymers, Cap 17.
[23] VILLEGAS Wilbert; ACERETO Pablo; VARGAS Mimi. Analisis Ultravioleta-
Visible, primer edición. Merida: Universidad Autonoma de Yucatan., 2006., 4-1
a 4-7.
[24] Yoshimura, K., Hozan, D., Chona, Y., & Shirai, K. Comparison of the physico-
chemical properties of shark skin collagen and pig and bovine skins. 1996,
Animal Science and Technology, 67, 445 –454.
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