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I. SECUENCIACIÓN DE PROTEÍNAS
La secuenciación de una cadena polipeptídica es imprescindible para
comprender la base estructural de la función de las proteínas, ya que es
precisamente la naturaleza de los aminoácidos que la integran la quedetermina la estructura tridimensional de las mismas y,
consecuentemente, sus propiedades.
El análisis de la secuencia de una proteína o cadena polipeptídica se lleva a
cabo, por lo general, según los pasos siguientes:
1. Rotura de todos los puentes disulfuro: Cys-S-S-Cys.2. Separación y purificación de las cadenas polipeptídicas individuales,
si la proteína tuviera más de una.
3. Análisis de la composición de aminoácidos.4. Identificación de los aminoácidos N-terminal y C-terminal.5. Fragmentación de la cadena polipeptídica nativa por rotura,
especifica o no especifica, en puntos internos, y posterior
separación y secuenciación de los distintos fragmentos.
6. Ordenación de los fragmentos peptídicos pequeños yestablecimiento de la secuencia del polipéptido original.
7.
Localización de los puentes disulfuro tanto dentro como entre las
cadenas polipeptídicas.
En estos estudios se utilizan básicamente técnicas cromatográficas y
electroforéticas, así como la reacción de identificación de aminoácidos con
ninhidrina.
1. Rotura de puentes disulfuroLos puentes disulfuro, con frecuencia entrecruzados, deben romperse
antes de proceder al análisis de aminoácidos de una proteína. Para ello sereducen con un tiol (β-mercaptoetanol) y posteriormente se alquilan paraimpedir, por una parte, la reasociación al azar de los distintos grupos -SH
formados y, por otra, estabilizar los residuos de cisteína durante la
hidrólisis ácida de las cadenas polipeptídicas.
De esta forma el residuo de cisteína queda alquilado, en forma de S-
carboxi-metilcisteína. Otros agentes utilizados en la alquilación de grupos -
SH son la iodoacetamida y la etilenimina.
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Otra forma de romper los puentes disulfuro intercatenarios consiste en la
oxidación con ácido perfórmico, desarrollada por Sanger.
Una vez escindidas, las cadenas se separan por cromatografia de
intercambio iónico o electroforesis.
En el caso de que una proteína tuviera una sola cadena polipeptídica, pero
existieran puentes disulfuro intracatenarios, habría que romperlos y
alquilar las correspondientes cisteínas antes de proceder a la hidrólisis de
dicha cadena.
2. Separación y purificación de cadenas polipeptídicasAntes de analizar la secuencia de aminoácidos de una proteína se ha de
determinar previamente el número de cadenas polipeptídicas que la
integran. Si la unión entre las cadenas es covalente, se procede como
hemos visto en el apartado anterior. Por otra parte, si las cadenas no
están unidas por enlaces covalentes, se pueden separar por tratamiento
con ácidos o bases, alta concentración de sales, calor y agentes
desnaturalizantes, altas concentraciones de urea o guanidina, etc.
3. Determinación de la composición de aminoácidosLa composición de aminoácidos de una cadena polipeptídica se determina
después de hidrolizar totalmente los enlaces peptídicos. Esta hidrólisis
normalmente se efectúa en medio ácido, con HCI 6N, en una ampolla
cerrada al vacío, y calentando a 110 °C durante 24 h, como mínimo.
Los aminoácidos resultantes se separan y se miden cuantitativamente en
un analizador automático. EI tratamiento ácido presenta diversos
inconvenientes:
- Hidroliza totalmente la glutamina y asparraguina, a glutámico y
aspártico, respectivamente + NH3, por lo que el Glu resultantepuede indicar (Glu ó Gln) y el Asp indicar (Asp ó Asn) de la proteína
nativa. Si cuantificamos el amoniaco obtenido podemos deducir la
cantidad original de glutamina y asparraguina.
- La serina y treonina se destruyen parcialmente durante la hidrólisis,por lo que se suelen realizar tres hidrolizados con HCI, 6 N, durante
24, 48 y 72 horas, determinándose el contenido de estos
aminoácidos por extrapolación a tiempo cero.
- También se destruyen por el tratamiento ácido la cisteína y el
triptófano; por ello, la cisteína se determina como ácido cisteico,
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después de oxidar la muestra con ácido perfórmico, según el
método descrito por Moore (l963). EI triptófano se determina
espectrofotométricamente, por el método de Edelhoch (l967).
4. Identificación de los aminoácidos terminales
EI aminoácido N-terminal de una cadena polipeptídica,convencionalmente el primer aminoacido, se señala haciendo reaccionar
la cadena polipeptídica con 1-fluoro-2,4-dinitrobenceno (FDNB) oreactivo de Sanger. EI 2,4-dinitrofenil-derivado resultante se somete a lahidrólisis ácida, en presencia de HCI 6N, durante la que se hidrolizan los
enlaces peptídicos de la cadena, mientras que permanece intacto el
enlace del primer aminoácido con el grupo 2,4-dinitrofenilo. EI derivado
correspondiente al primer aminoácido, de color amarillo, se separa
fácilmente del resto de los aminoácidos del hidrolizado, y se identifica por
cromatografía, utilizando como patrones los dinitrofenil-derivados
sintéticos de los diferentes aminoácidos.
EI método de Sanger, históricamente importante por el establecimiento
de la secuencia de la insulina, está siendo sustituido por otros métodos de
marcado más sensibles y eficaces. Uno de ellos es el que emplea cloruro
de I-dimetil-amino-naftalen-5-sulfonilo o cloruro de dansilo, que es unreactivo fluorescente que permite detectar y medir pequeñas cantidades
del aminoácido N-terminal. Se trata de un reactivo cien veces más sensible
que el FDNB
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Otras enzimas utilizadas en estos tratamientos, como quimotripsina,termolisina, pepsina, etc., son menos especificas en la rotura de losenlaces peptídicos internos, como se recoge en la tabla 1.
Los fragmentos resultantes se separan por cromatografía o electroforesis,
determinándose la composición de aminoácidos de cada uno de ellos. Los
péptidos de más de 30 residuos se someten a un segundo tratamiento de
rotura, separación y análisis de aminoácidos. La separación de los
fragmentos peptídicos es el paso más laborioso en la secuenciación de una
proteína.
Tabla 1. REACTIVOS Y ENZIMAS MÁS CORRIENTES UTILIZADOS PARA ROTURA Y
ANÁLISIS DE PÉPTIDOS
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indica el tiempo requerido para que tenga lugar un ciclo catalítico. Esta
expresión solo se puede utilizar en el caso en el que la preparación
enzimática sea homogénea y se conozca el peso molecular de la proteína.
Actividad catalítica (o número de recambio) por sitio activo: Seutiliza para aquellas enzimas que poseen más de un sitio activo. Expresa la
actividad catalítica, o número de recambio, dividida por el número de
sitios activos de la enzima. Esta actividad también se expresa en min-1 o s-1.
CINÉTICA ENZIMÁTICA
La velocidad de una reacción enzimática puede definirse como el cambio de laconcentración de sustrato o de producto por unidad de tiempo.
En cinética enzimática la velocidad de las reacciones se expresa en función dela variación de la concentración de sustrato, y, para determinadas enzimas, laecuación que liga ambas magnitudes, que ya ha sido explicada en teoría, es laecuación de Michaelis-Menten:
Vmáx x [S]v = ---------------
KM + [S]
La representación gráfica de la misma corresponde a una hipérbolaequilátera:
En esta gráfica existen dos zonas claramente diferenciadas:
1. A concentraciones bajas de sustrato (zona “A”), cuando lavelocidad de la reacción depende de su concentración (aumentao disminuye en función de incrementos o descensos de laconcentración de sustrato), las variaciones de esta inducenmodificaciones en el mismo sentido de la cantidad de enzima
asociada al sustrato. Es decir, en esta zona, la concentración del
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complejo ES y, consecuentemente, la velocidad de la reacción,dependen de la concentración de sustrato.
Si [S] > KM, entonces se puede despreciar KM, por lo que v =Vmáx. Es decir, cuando la concentración de sustrato es muchomayor que la KM (normalmente a partir de [S] > 100 KM) la enzimatrabaja a velocidad máxima.
A efectos prácticos, la velocidad, a concentraciones saturantes desustrato, es constante e independiente de la concentración desustrato, y, en este caso, la cantidad de sustrato transformado,[S]o - [S], será proporcional a la Vmáx y al tiempo transcurrido:
[S]o - [S] = Vmáx x t
[S]o t½ = ---------
2 Vmáx
Linearización de la ecuación de Michaelis-Menten
La representación gráfica de las velocidades iniciales de una reacciónenzimática frente a las concentraciones de sustrato requiere de muchospuntos, por tratarse de una curva, y esto dificulta la determinación de Vmáx y KM con precisión. A su vez, muchas enzimas requieren concentraciones muy altasde sustrato para alcanzar la Vmáx. Todo ello ha llevado a la transformación de laecuación de Michaelis-Menten en la de una recta (y = bx + a). Se hanpropuesto varias formas de lograr esta linearización y una de las más utilizadases la ecuación de Lineweaver-Burk que se obtiene invirtiendo la ecuación deMichaelis-Mente y, por ello, se la conoce como la ecuación de los inversos o de
los dobles recíprocos:
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Vmáx x [S] 1 KM + [S] KM [S]V = --------------- ; ---- = ----------------- = -------------- + -------------
KM + [S] v Vmáx x [S] Vmáx x [S] Vmáx x [S]
De aquí resulta:
1 KM 1 1---- = -------- x ------ + --------v Vmáx [S] Vmáx
Y la representación gráfica de la misma es la siguiente:
Si hacemos 1/[S] = 0 tendremos el punto de corte de la recta en laordenada y este será igual a 1/Vmáx. Si hacemos 1/v = 0 tendremos el punto decorte de la recta en la abcisa y este será igual a – 1/KM, por lo que es fácildeterminar tanto KM como Vmáx.
Inhibición enzimática
Cualquier sustancia que reduzca la velocidad de una reacción catalizadaenzimáticamente se puede considerar que es un inhibidor . La inhibición de laactividad enzimática es uno de los mecanismos de regulación más importantesde las células vivas, y uno de los más importantes procedimientos dediagnóstico. En este apartado examinaremos varios tipos sencillos deinhibidores enzimáticos, los cuales, por otra parte, ya han sido vistos en teoría:
inhibición competitiva, inhibición no competitiva e inhibición acompetitiva.a) Inhibición competitiva
Un inhibidor competitivo es una sustancia que se combina con el enzimalibre de forma que impide la unión al sustrato. Es decir, el inhibidor y el sustratose excluyen mutuamente, frecuentemente debido a la verdadera competiciónpor el sitio activo. Un inhibidor competitivo debe ser un análogo nometabolizable o un derivado del verdadero sustrato u otro sustrato para laenzima, o un producto de la reacción.
El esquema de reacciones que describe la inhibición competitiva es:
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En presencia de inhibidor competitivo la ecuación de Michaelis-Menten semodifica de la forma siguiente:
Vmáx x [S]V = --------------------------
KM (1 + [I]/KI) + [S]
Km (1 + I/KI) = KMa o KM aparente.
Las representaciones gráficas sin y con inhibidor serían las siguientes:
La ecuación de la velocidad en la forma inversa para una inhibición
competitiva es:
1 kM [I] 1 1--- = -------- (1 + -----) ------ + --------v Vmáx KI [S] Vmáx
Podemos observar que cuando [S] → ∞ 1/[S] → 0 y 1/v = 1/Vmáx, o loque es lo mismo v = Vmáx. Por tanto, la inhibición competitiva puede revertirseaumentando la concentración de sustrato.
Las representaciones gráficas sin y con inhibidor serían las siguientes:
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b) Inhibición no competitiva
Un inhibidor no competitivo clásico no tiene ningún efecto sobre la uniónal sustrato y viceversa. S e I se unen reversiblemente, al azar eindependientemente en diferentes sitios. Es decir, I se une a E y a ES; S seune a E y a EI. Sin embargo, el complejo resultante ESI es catalíticamenteinactivo. El inhibidor podría impedir la conformación adecuada del centro
catalítico. Los equilibrios son:
En presencia de inhibidor no competitivo la ecuación de Michaelis-Menten se modifica de la forma siguiente:
Vmáx [S]-------------
[I](1 + ----)
KI V = -----------------
KM+ [S]
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VmáxV`máx = --------------
[I](1 + -----)
KI
Las representaciones gráficas sin y con inhibidor serían las siguientes:
La ecuación de la velocidad en la forma inversa para una inhibición nocompetitiva es:
1 kM [I] 1 1 [I]--- = -------- (1 + -----) ------ + -------- (1 + -----)v Vmáx KI [S] Vmáx KI
Las representaciones gráficas sin y con inhibidor serían las siguientes:
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c) Inhibición acompetitiva
Un inhibidor acompetitivo clásico es un compuesto que se unereversiblemente al complejo enzima-sustrato, dando un complejo inactivo ESI.El inhibidor no se une a la enzima libre. La inhibición acompetitiva es descritapor el siguiente equilibrio:
En presencia de inhibidor acompetitivo la ecuación de Michaelis-Mentense modifica de la forma siguiente:
Vmáx [S]
--------------[I]
(1 + -----)KI
V = ---------------------KM
------------ + [S][I]
(1 + -----)KI
Vmáx
V`máx = --------------[I]
(1 + -----)KI
KM
K`m = -------------[I]
(1 + -----)KI
Inhibición no competitiva: representación de Lineweaver-Burk de lacinética de una enzima en ausencia ([I] = 0) o en presencia de inhibidor([I]).
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Las representaciones gráficas sin y con inhibidor serían las siguientes:
La ecuación de la velocidad en la forma inversa para una inhibiciónacompetitiva es:
1 kM 1 1 [I]--- = -------- ------ + -------- (1 + -----)v Vmáx [S] Vmáx KI
Las representaciones gráficas sin y con inhibidor serían las siguientes:
Inhibición acompetitiva: representación de Lineweaver-Burk de la cinéticade una enzima en ausencia ([I] = 0) o en presencia de inhibidor ([I]).
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III. CÓDIGO GENÉTICO Y MUTACIONES
Primera
posición(extremo 5’)
Segunda posición Tercera
posición(extremo 3’) U C A G
UPhePheLeuLeu
SerSerSerSer
TyrTyrTERMINACIÓNTERMINACIÓN
CysCysTERMINACIÓN2 Trp
UC AG
C
Leu
LeuLeuLeu
Pro
ProProPro
His
HisGlnGln
Arg
Arg Arg Arg
U
C AG
AIleIleIleMet1
ThrThrThrThr
Asn AsnLysLys
SerSer Arg2 Arg2
UC AG
GValValValVal
Ala Ala Ala Ala
Asp AspGluGlu
GlyGlyGlyGly
UC AG
MUTACIONES
En genética y biología, una mutación es una alteración o cambio en lainformación genética de un ser vivo y que, por lo tanto, va a producir un
cambio de una o varias características, que se presenta súbita y
espontáneamente, y que se puede transmitir o heredar a la descendencia.
La unidad genética capaz de mutar es el gen que es la unidad de
información hereditaria que forma parte del ADN. En los seres
multicelulares, las mutaciones sólo pueden ser heredadas cuando afectan
a las células reproductivas.
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Según el mecanismo que ha provocado el cambio en el material genético,
se suele hablar de tres tipos de mutaciones: mutaciones cariotípicas o
genómicas, mutaciones cromosómicas y mutaciones génicas o
moleculares.
Hay una tendencia actual a considerar como mutaciones en sentidoestricto solamente las génicas, mientras que los otros tipos entrarían en el
término de aberraciones cromosómicas.
TIPOS DE MUTACIONES GÉNICAS O MOLECULARES
Son las mutaciones que ocurren al alterar la secuencia de nucleótidos del
ADN. Entre las mutaciones puntuales podemos distinguir:
Mutación por sustitución de bases: Se producen al cambiar laposición de un nucleótido por otro, por ejemplo, donde debería
haber un nucleótido de citosina, se inserta uno de timina.
Se denominan transiciones si se cambia una pirimidina (C, T) por
otra, o una purina (A, G) por otra, o transversiones si se cambia una
pirimidina por una purina o viceversa.
Mutación por pérdida de nucleótidos o deleción: En la secuenciade nucleótidos se pierde uno y no se sustituye por nada.
Mutación por inserción de nucleótidos: Dentro de la secuencia delADN se introducen nucleótidos que no deberían estar.
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Las consecuencias de estas alteraciones son variables. Las sustituciones de
bases pueden provocar la interrupción prematura de las cadenas si a
partir de un codón que especifica un aminoácido se forma un codón de
parada (mutaciones sin sentido o "nonsense"), lo que conlleva la síntesis
de proteínas truncadas anormales.
Si se produce un cambio de una base por otra el efecto sobre la
funcionalidad es muy variable: puede no alterarla si debido al carácter
degenerado del código genético no provoca un cambio de aminoácido
(mutaciones del mismo sentido o "sense"), o si el cambio es por un
aminoácido semejante o tiene lugar en una posición que no afecta a la
estructura o función de la proteína (mutaciones silenciosas, conservativas,
o neutras; en inglés, "silent" o "conservative").
Por el contrario, un cambio en una sola base puede alterar drásticamente
la estructura y/o función de la proteína si causa la sustitución de un
aminoácido por otro muy distinto o si afecta a una posición crítica
(mutaciones de diferente sentido o "mis-sense").
Generalmente, las inserciones y deleciones incluso de una sola base
tienen efectos mucho más drásticos pues alteran la secuencia de los
codones y como consecuencia provocan la alteración de toda la secuencia
a partir del punto donde se producen (mutaciones de desplazamiento del
marco de lectura o "frame-shift"). Mutaciones en las secuencias que
delimitan los exones-intrones ("splice site") donde tienen lugar los cortes y
empalmes durante la maduración del RNA ("splicing") pueden alterar este
proceso y causar la formación de RNA aberrantes. También son posibles
mutaciones en la región reguladora que alteren los niveles de expresión
génica.
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