CROMATOGRAFíA EN CROMATOGRAFíA EN COLUMNACOLUMNA
Licda. Carol de SantistebanAnálisis Instrumental
Departamento de FisicoquímicaEscuela de Química USAC
C. de líquidos
C. de gases
C. de fluidos supercríticos
TIPOS, SEGÚN FMTIPOS, SEGÚN FM
Todos los tipos de fases estacionarias y móviles.
Diferentes posibilidades de mecanismos de separación, según tipo de fase estacionaria.
Características esenciales de solventes: ◦ índice de polaridad (reparto)◦ fuerza eluyente (adsorción)
C. De líquidosC. De líquidos
C. de adsorción C. de reparto C. de afinidad C. de intercambio iónico C. de exclusión molecular
Mecanismos de separaciónMecanismos de separación
Fase estacionaria de acuerdo a interacciones posibles según naturaleza del analito◦ Van der Waals reparto fase reversa◦ Polar reparto fase normal◦ Medianamente polar adsorción◦ Iónico intercambio iónico
◦ Biomoléculas:◦ Distribución de tamaños exclusión molecular◦ Distribución de cargas intercambio iónico, otras◦ Actividad biológica afinidad
Fase móvil de acuerdo a fase estacionaria e interacciones deseadas
SelecciónSelección
CROMATOGRAFÍA DE ADSORCIÓNCROMATOGRAFÍA DE ADSORCIÓN
Fase estacionaria adsorbente
Carbonato de calcio, Tswett
Sílica, alúmina las más utilizadas actualmente
Sílica > alúmina (capacidad de carga, variedad, reacciones indeseadas)
Forma, porosidad, superficie,
FASES ESTACIONARIASFASES ESTACIONARIAS
En sílicaEn sílica
Fases estacionarias Fases estacionarias comercialescomerciales
InteraccionesInteracciones
Dada una FS la FM controla k’ y α
Fuerza eluyente◦ Energía de adsorción del disolvente (en la FS) por unidad
de área (de FM)
A mayor valor de ε0 mayor fuerza mayor polaridad
Mezcla de solventes valores intermedios de fuerza eluyente, pero la relación no es lineal
FASES MÓVILESFASES MÓVILES
Variación de retención◦ Cambio de proporciones◦ Cambio de fuerza eluyente
Variación de selectividad◦ Cambio de solventes◦ Conservación de fuerza eluyente
Pruebas preliminares en capa fina
Variación de k’ y αVariación de k’ y α
Fases móviles comunesFases móviles comunes
Alcanos < olefinas < aromáticos < haluros,
sulfuros < éteres < nitroderivados < ésteres
– aldehídos – cetonas < alcoholes – aminas
< sulfonas < sulfóxidos < amidas < ácidos
carboxílicos
RETENCIÓNRETENCIÓN
Desplazamiento
Competición entre moléculas de FM y analito por adsorberse sobre los sitios activos de FS
MECANISMOMECANISMO
Apolares a medianamente polares Peso molecular < 5000 Poco solubles en agua Generalmente complementario a reparto
Amplio rango de aplicación Bueno para separar isómeros Todas las ramas de investigación
APLICACIONESAPLICACIONES
CROMATOGRAFÍA DE REPARTOCROMATOGRAFÍA DE REPARTO
Desarrollada como alternativa a c. de adsorción (fácil, reproducible; mejor resolución y vida útil que adsorción
Más utilizada actualmente (fases enlazadas, HPLC)
Modalidades líquido-líquido y fase enlazada
Fase normal o fase reversa
C. De repartoC. De reparto
Película de fase estacionaria líquida o pseudo-líquida unida a soporte
Idealmente el soporte no interacciona
Unión de FS física (c. líquido-líquido) o química (c. de fase enlazada)
Sangrado de columna
FASES ESTACIONARIASFASES ESTACIONARIAS
SangradoSangrado
Preparación por varios métodos.◦ Evaporación de solvente◦ Recubrimiento directo◦ Precipitación◦ Recubrimiento dinámico
Para fase normal: agua, formamida, glicerol, polialcoholes
Para fase reversa: escualano, octanol, hidrocarburos grandes
Fases líquidasFases líquidas
Unión con enlace covalente de cadena orgánica (grupo funcional) al soporte
Funcionalización de la cadena, longitud de la cadena, grado de recubrimiento del soporte
Polaridad, capacidad, retención.
Fases enlazadasFases enlazadas
Fases enlazadasFases enlazadas
Fases enlazadasFases enlazadas
De acuerdo a la polaridad de analito y fase estacionaria
Influye sobre la estructura de la fase estacionaria
Sus variaciones influyen en la resolución
Índice de polaridad (sol. En dioxano, nitrometano y etanol)
FASES MÓVILESFASES MÓVILES
Efecto sobre FSEfecto sobre FS
PropiedadesPropiedades
Basado en polaridad
Polaridad analitos: Hidrocarburos < éteres < ésteres < cetonas
< aldehídos < amidas < aminas < alcoholes
MECANISMOMECANISMO
Relaciones de polaridad Relaciones de polaridad FSFS
Relaciones de polaridad FMRelaciones de polaridad FM
Variación de k’Variación de k’
Variación de αVariación de α
Tradicionalmente, analitos polares de bajo a medio peso molecular
En general, mayoría de analitos, con la técnica adecuada
APLICACIONESAPLICACIONES
AplicacionesAplicaciones
EjemplosEjemplos
Derivatización
C. de pares iónicos
C. con fases quirales
CASOS ESPECIALESCASOS ESPECIALES
CROMATOGRAFÍA DE AFINIDADCROMATOGRAFÍA DE AFINIDAD
Mecanismo de retención basado en interacciones ESPECÍFICAS reversibles, propias de los sistemas biológicos (interacción antígeno-anticuerpo, enzima sustrato)
Modelo llave-cerradura
C. De afinidadC. De afinidad
Fase estacionaria: inmobilización al soporte (unión química) de uno de los componentes de un par (ligando de afinidad)
Ligandos generales y ligandos de alta especificidad
Ligandos de origen natural o sintético
FASES ESTACIONARIASFASES ESTACIONARIAS
Soporte: baja retención de analitos en general, fácil modificación (unión de ligandos), estable a condiciones de análisis
Bajo rendimiento: material no rígido, de partícula grande (geles orgánicos)
Alto rendimiento: rígido, partícula pequeña (sílica, vidrio, poliestireno)
FASES ESTACIONARIASFASES ESTACIONARIAS
C. De afinidadC. De afinidad
Elución por fases
Inyección del analito, en presencia de FM con las condiciones adecuadas para la unión ligando- analito (composición, pH, fuerza iónica). Fase móvil débil
Elución del analito en presencia de FM que los desplaza o promueve la disociación del complejo ligando-analito. Fase móvil fuerte
FASES MÓVILESFASES MÓVILES
Elución inespecífica
Elución bioespecífica
◦ Elución bioespecífica en fase normal
◦ Elución bioespecífica en fase reversa
OJO En este tipo de cromatografía fase normal y fase reversa NO se refieren a polaridad
Tipos de eluciónTipos de elución
Normal: El buffer de elución contiene un agente que compite con el ligando por unirse con el soluto.
Reversa: El buffer de elución contiene un agente que compite con el soluto por unirse con el ligando.
La elución no específica, debilita el enlace.
Tipos de eluciónTipos de elución
MECANISMOMECANISMO
Elución bioespecíficaElución bioespecífica
Biomoléculas
Moléculas con efecto biológico
Células
APLICACIONESAPLICACIONES
CROMATOGRAFÍA DE INTERCAMBIO IÓNICOCROMATOGRAFÍA DE INTERCAMBIO IÓNICO
Basado en los equilibrios de intercambio entre los distintos iones de una solución sobre la fase estacionaria
Competición entre iones de FM y de analito por adsorberse sobre los sitios activos de FS
C. De intercambio iónicoC. De intercambio iónico
Sólido de elevada masa molecular, insoluble en FM, superficie con grupos funcionales ionizables
Naturales (arcillas, zeolitas) o sintéticos (resinas)
FASES ESTACIONARIASFASES ESTACIONARIAS
Intercambiadores catiónicos
Intercambiadores aniónicos
Clasificación según tipo Clasificación según tipo analitoanalito
Fases estacionarias porosas: Copolímero estireno-divinilbenceno como
soporte, superficie modificada con grupos ionizables
Fases estacionarias peliculares: Partículas esféricas no porosas de soporte
(vidrio, polímero, sílica) con película de resina de intercambio
Clasificación según forma Clasificación según forma
Soluciones acuosas con o sin modificadores orgánicos (metanol)
Contienen sustancias iónicas (buffer)
pH controla ionización de FS controla retención/elución
Fuerza iónica controla competición contra analitocontrola elución
FASES MÓVILESFASES MÓVILES
http://www.wiley.com/college/fob/quiz/quiz05/5-5.html
MECANISMOMECANISMO
Polivalentes más que monovalentes
Para grupos con la misma carga, las diferencias de retención se dan por tamaño del ión hidratado y otras propiedades
RetenciónRetención
Analitos iónicos, bajo a medio peso molecular
Orgánicos e inorgánicos
Fármacos, metabolitos, alimentos
APLICACIONESAPLICACIONES
AplicacionesAplicaciones
CROMATOGRAFÍA DE EXCLUSIÓN MOLECULARCROMATOGRAFÍA DE EXCLUSIÓN MOLECULAR
Exclusión por tamaño
Basado en la capacidad de penetración de los analitos en los poros de la FE de acuerdo con su tamaño (y en menor medida con su forma)
C. De exclusión molecularC. De exclusión molecular
Red de poros uniforme, a manera de tamiz
Poca interacción con el analito (evitando otros mecanismos de retención)
Partículas de sílica o poliméricas
Polímeros orgánicos o inorgánicos Geles hidrofóbicos o hidrofílicos
FASES ESTACIONARIASFASES ESTACIONARIAS
Tamaño promedio de poro impone límites a la separación (porosidad o grado de enrecruzamiento).
Límite de exclusión: Peso molecular por encima del cual no se retienen las moléculas
Límite de penetración: Peso molecular por debajo del cual hay libre penetración
Propiedades FSPropiedades FS
Capaz de disolver completamente los analitos
En este tipo de c. NO existe fase normal y reversa:
Filtración sobre gel: rellenos hidrofílicos y solventes acuosos
Penetrabilidad sobre gel: rellenos hidrofóbicos y solventes orgánicos no polares
FASES MÓVILESFASES MÓVILES
http://www.wiley.com/college/fob/quiz/quiz05/5-6.html
MECANISMOMECANISMO
Moléculas grandes, amplio rango de polaridad
Biomoléculas
Polímeros
APLICACIONESAPLICACIONES
Aplicaciones de la C. Aplicaciones de la C. líquidalíquida
MUCHAS GRACIAS MUCHAS GRACIAS POR SU ATENCIÓNPOR SU ATENCIÓN
Fin