Cultivos CelularesCultivos Celulares
Métodos y Técnicas de Estudio en Biología Celular
ObjetivosObjetivos
1. -Equipo básico de un laboratorio de cultivo celular
2. -Cultivos primarios y líneas estables
3. -Preparación del medio de cultivo
4. -Asepsia en el cuarto de cultivo y esterilidad
5. -Rutina en el mantenimiento de la línea celular estable
6. -Congelación y almacenamiento de las líneas celulares
Puntos que deben ser asimilados
Equipo Básico de un laboratorio de Cultivo Celular
1. Campana de flujo laminar
2. Baño termostatizado
3. Incubador CO2
4. Autoclave
5. Nevera y Congelador
6. Microscopio Invertido
7. Micro centrifuga
8. Depósito de Nitrógeno líquido
AutoclaveAutoclaveCualquier recipiente, herramienta... Debe ser esterilizada
Tanque de Nitrógeno líquidoTanque de Nitrógeno líquido
Congelación de líneas estables
Campana de Flujo LaminarCampana de Flujo LaminarEsterilidad!! (no evita contaminación un mal uso)
Incubador COIncubador CO22
Atmósfera controlada con elevada humedad y tensión de CO2
Micro CentrifugaMicro Centrifuga
Suspensiones celulares (lavados, concentrados, subcultivos)
Microscopio InvertidoMicroscopio Invertido
Seguimiento del cultivo: viabilidad, multiplicación, contaminación.
Control sobre cambios morfológicos (efectos de hormonas, de tratamientos con medicamentos, de iones, interacciones, etc.
Botellas y Placas de CultivoBotellas y Placas de Cultivo
Puntos ImportantesPuntos Importantes
EsterilidadAsepsiaHábito de trabajo
Cultivos PrimariosCultivos Primarios(El principio de la historia.....)(El principio de la historia.....)
A- Aislamiento del tejido
B- Disección/disgregación
C- Cultivo celular en recipiente
(Placa Petri) (Cultivo primario)
Aunque potencialmente se puede obtener un cultivo primario a partir de cualquier tipo de tejido, normalmente los tejidos embrionarios y tumorales dan los mejores resultados, debido a que su grado de diferenciación es menor y su capacidad de división mayor.
Preparación cultivosPreparación cultivos
Cultivos secundarios y líneas Cultivos secundarios y líneas establesestables
1. Si uno o varios tipos de células de un cultivo primario se re-siembran (sub-cultivo), el cultivo obtenido se denomina cultivo secundario.
2. La heterogeneidad celular es menor: el medio utilizado determinará qué células se desarrollarán.
3. Las líneas estables son las que se obtienen por sub-cultivo y selección de cultivos secundarios. También se pueden obtener a partir de tejidos tumorales.
Selección de la línea estableSelección de la línea estable
Líneas celulares establesLíneas celulares estables
Control del entorno celular
Homogeneidad celular
Conocimiento del tipo celular
Economía
Ventajas Desventajas
Falta de diferenciación
Inestabilidad de la línea (mutaciones DNA)
Medios de Cultivo: Medios BaseMedios de Cultivo: Medios Base
Medios base: Eagle’s Basal Medium, Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM), RPMI1640, etc.
Contienen: Hidratos de Carbono, ácidos grasos esenciales y otros lípidos, aminoácidos, sales minerales, oligoelementos.
*Cada línea celular tiene unos requerimientos que hacen que crezca mejor en un determinado tipo de medio
Medios de Cultivo: AditivosMedios de Cultivo: Aditivos
Antibióticos: estreptomicina (Gram +/-), penicilina (Gram +), amfotericina (levaduras y hongos)
Tampón pH: Hepes, bicarbonato, etc.Indicador pH.Suero fetal: Bovino, ovino, humano. 10% (2-50%).Aditivos específicos: Suplemento de piruvato,
suplemento de glucosa, etc.
Tamponadores de pHTamponadores de pH
Hepes Buffer tamponador que actúa de manera muy eficiente en
el rango 7,2-7,6
*Importancia de la ppCO2 en el mantenimiento del pH
H2O + CO2 H2CO3 H+ + HCO3-
* Rojo Fenol (Phenol Red-Na) (Indicador de pH)
Propiedades físico-químicos Propiedades físico-químicos del Mediodel Medio
CO2: Normalmente 5% (2-8% depende de tipo celular y [HCO3-]
pH.............................................................(7.0-7.7)
Osmolaridad.............................................(290-320) mOsm/Kg
Viscosidad................................................ Suero
Temperatura............................................. 37ºC (mamífero)
(aves: 38,5ºC; epitelio de ratón: 33ºC; insectos: 28ºC)
Test de medio completo con Test de medio completo con suerosuero
Previamente a la realización de experimentos los medios deben ser probados a diferentes niveles.
1. Posible Contaminación
2. Niveles de Proliferación Celular (eficiencia)
Elección del medio de cultivo Elección del medio de cultivo adecuado a cada línea celularadecuado a cada línea celular
Se deben realizar diferentes pruebas con varios medios de cultivo en la elección del medio más adecuado a las características de nuestra línea.
Las pruebas consisten en la realización de diferentes curvas de crecimiento
Conceptos básicos en el Conceptos básicos en el mantenimiento de una línea establemantenimiento de una línea estable
SubcultivoConfluenciaTiempo de duplicaciónCriogenizaciónCiclo celular: Fases G1,S,G2,M y G0
¿Qué son y cómo se realizan ¿Qué son y cómo se realizan los subcultivos?los subcultivos?
Objetivos:
i. Propagación de la línea celular
ii. Producción de células para la experimentación
Usualmente se realizan al llegar a confluencia.
Evitar que el medio de cultivo esté agotado.
Curva de Crecimiento (líneas Curva de Crecimiento (líneas estables): Fases del cultivoestables): Fases del cultivo
•Fase de latencia (período lag). Fijación al sustrato e inicio del ciclo celular.•Fase de crecimiento exponencial. El número de células se duplica aproximadamente cada 24 horas.•Fase de confluencia. Las células del cultivo, que se ha saturado, dejan de dividirse (monocapa: inhibición por contacto; suspensión: consumo del medio).•Fase de muerte. Si el cultivo se prolonga por demasiado tiempo, las células entran en una fase de senescencia que termina con la muerte de las células en cultivo.
Subcultivos CelularesSubcultivos Celulares
Protocolo SubcultivoProtocolo Subcultivo
Depende de las características de la línea celular con la que se esta trabajando.
1. Células en suspensión
2. Células adheridas al substrato
Células AdheridasCélulas Adheridas
Para realizar el subcultivo de células adheridas se debe proceder al levantamiento de las mismas:
Tripsinización.
Levantamiento Mecánico (raspado).
En células en suspensión es suficiente con realizar una dilución en medio nuevo (o bien adición de medio tras centrifugación).
La Fase ExperimentalLa Fase Experimental
Objetivos:
i. Investigación de un fenómeno biológico
ii. Estudio de las bases moleculares de una patología
iii. Investigación de los mecanismos empleados por los fármacos
iv. Estudio de la toxicidad de determinados compuestos
v. Investigación de la estructura y función de macromoléculas y orgánulos celulares
La Fase ExperimentalLa Fase Experimental
Planteamiento:
Se cultivan en frascos separados las células control y las células “problema”. Se adiciona un compuesto o se cambian las condiciones experimentales del frasco problema y se mantiene la incubación durante un tiempo (minutos a días). Finalmente se determinan las diferencias entre las células tratadas (problema) y las no tratadas (control).
En determinadas ocasiones no se realiza un tratamiento en paralelo de células en diferentes frascos, sino un tratamiento secuencial de las células control (antes y después de ciertas condiciones).
La Fase ExperimentalLa Fase Experimental
Investigación:
Es la fase en la que utilizando una técnica experimental determinamos algún fenómeno celular. Podemos estudiar el efecto de una hormona sobre la localización de proteínas celulares mediante microscopia confocal (células vivas), podemos determinar mediante RT-PCR o western blot la expresión de un determinado gen o hacer un estudio completo de la expresión génica mediante proteómica y/o genómica (células muertas).
La Fase ExperimentalLa Fase Experimental
Transfección: Introducción de DNA externo con un vector de expresión.TIPOS: Transitoria o estable.MÉTODOS: Electroporación
Fosfato cálcicoLipofecciónMicroinyección
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