Cultivos Microbianos Dr. Claudio Voget Curso CABBIO, Noviembre
2005
Diapositiva 2
Relaciones entre nutricin, metabolismo y crecimiento Excepto
algunos tomos de C de los nucletidos, la asimilacin del C deriva de
8 intermediarios: glucosa-6-P, triosa-P, 3-fosfoglicerato,
fosfoenolpiruvato, piruvato, acetil-CoA, oxalacetato,
-cetoglutarato. hhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhh hhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhh
hhhhhhhhhh
Diapositiva 3
Conceptos bsicos de cintica microbiana estado fisiolgico de la
clula (flujos metablicos) q i velocidad especfica de consumo de
sustrato o formacin de producto ( q i mmol/ g biomasa x h ) r i
velocidad volumtrica de consumo de sustrato o formacin de producto
r i ( mmol/ litro x h ) V r O2 = q O2 * X r i = q i * X X
concentracin de biomasa Los rendimientos pueden expresarse como
cociente de velocidades ! q O2 qSqS qpqp q CO2 O2O2 S CO 2 P
Diapositiva 4
Rendimientos verdaderos y mantenimiento d1 CH 2 O + 1 NH 3 + 1
O 2 g1 biomasa + 1CO 2 + w1H 2 O + h 1 d2 CH 2 O + 2 NH 3 + 2 O 2
s2 producto + 2 CO 2 + w2H 2 O + h 2 d3 CH 2 O + 3 O 2
mantenimiento + 3 CO 2 + w3 H 2 O + h 3 Rendimientos verdaderos
(d1+d2+d3) = d, (1+ 2) =, (1+ 2+ 3) = , (1+ 2+ 3) = , Si d=1 =a,
=b, = y co2/s CH 2 O + a NH 3 + b O 2 y x/s biomasa + y p/s
producto + y co2/s CO 2 + w H 2 0 + h Rendimientos experimentales
rxrx r sx rprp r sp r sm r s, r O2 r x, r p rsrs S NH 3 O2O2 rNrN r
O2
Diapositiva 5
Ecuacin lineal de consumo de sustrato (ELCS) m s = 0.05 g
glucosa / g biomasa x h (h -1 ) y x/s / y x/s 0.050,645 0.10,78
0.30,92 r p = 0
Diapositiva 6
Factores que afectan la velocidad de crecimiento () Ecuacin de
Monod = f(S) membrana celular S ext E S int qsqs qiqi Temperatura
pH H2O Composicin del medio cultivo restricto cultivo irrestricto
f(S) S (g/l) Ks = ug a mg/l
Diapositiva 7
Crecimiento de Saccharomyces cereviseae Efecto de y el sustrato
limitante en la fisiologa microbiana El metabolismo de S cereviseae
es netamente oxidativo hasta una de 0.2-0.25 h -1. Por encima de
este valor se induce la fermentacin alcohlica dando lugar a un
metabolismo mixto oxidativo-fermentativo. El rendimiento celular
disminuye. La produccin aerbica de etanol en S. cereviseae se
denomina Efecto Crabtree < crit > crit
Diapositiva 8
Efecto de y el sustrato limitante en la fisiologa microbiana
Parmetros de crecimiento y actividad -galactosidasa Cultivo
Continuo ( = 0.1 h -1 ) Nutriente limitante Yx/s g/g Actividad
LAU/mg Carbohidratos totales % Protena % Glucosa0.440.193042.5
Lactosa0.47183043.5 Amonio0.383.25229 Batch (fase estacionaria)
Lactosa0.404.3 -- Cepa: K. Lactis NRRL 1118, 30 C, pH 4.7, Medio
definido
Diapositiva 9
Sistemas de cultivo Los procesos fermentativos pueden dividirse
bsicamente en 2 grandes grupos Fermentaciones lquidas sumergidas
(FLS) Contenido de agua del medio 90-95 % Fermentaciones en
sustrato slido (FSS) El medio son partculas hmedas con ausencia o
casi ausencia de agua libre
Diapositiva 10
Reactores empleados en fermentaciones lquidas sumergidas
Diapositiva 11
Fermentacin en sustrato slido Hay dos formas bsicas de cultivos
slidos Cultivos en sustratos naturales (granos, residuos
agroindustriales) Cultivos con soportes inertes impregnados con
medio nutritivo (inertes: perlita, hemp, bagazo, poliuretano)
Comparacin a nivel de microescala entre FLS y FSS
Diapositiva 12
Tipos de reactores empleados en fermentaciones en sustrato
slido
Diapositiva 13
Comparacin entre FSS y fermentacin lquida sumergida
FSSFermentacin sumergida Medios simples. Requieren adicin de agua o
una solucin mineral. Sustratos variables Medios con mayor cantidad
de ingredientes, mayor costo. Buena reproducibilidad en medios
definidos Bajo H20 reduce riesgos de contaminacinMayores riesgos de
contaminacin Medios concentrados. Elevada concentracin de producto
Menor volumen de reactor Medios diludos, Volmenes de fermentacin
grandes. Altas concentraciones de medio puede afectar crecimiento.
Alimentacin de sustrato es comn Menor consumo de energia para
aerearTransferencia G-L es generalmente limitante Mezclado
imperfecto o casi imposible. Difusin puede limitar el proceso
Mezclado intenso. La difusin de nutrientes es generalmente no
limitante Remocin de calor es crtica. Transferencia de calor por
evaporacin puede ser importante Alto contenido de agua facilita
control de T ra Control del proceso dificultosa. Estimacin de
biomasa no es directa Amplio desarrollo en sistemas de medicin y
control Downstream processing simple. Contaminacin de producto con
componentes del medio es alta Bajos volmenes de efluentes lquidos
La remocin de grandes volmenes de agua aumenta costos en los
procesos de separacin y purificacin Cintica y fenmenos de
transporte poco conocidos Modelos cinticos y difusionales
Diapositiva 14
Operacin de reactores Ecuaciones de balance interfase G-L C o,
F o, C, F S VLCVLC Y o, F go Y, F gs VGYVGY Fase lquida Fase
gaseosa
Diapositiva 15
Cultivo Batch Es el cultivo mas simple Volumen constante
Cerrado para fase lquida Fo = Fs = 0 Composicin inicial del medio
determina el curso del cultivo Fase exponencial inculo
Diapositiva 16
Cultivo Batch Balance para biomasa Lag exponencial
desaceleracin estacionaria m (pendiente) = max
Diapositiva 17
Velocidades de crecimiento de microorganismos y clulas Cultivo
(h -1 ) tiempo de duplicacin (h) bacterias0,6-1,40,5-1,15 levaduras
y hongos filamentosos 0,2-0,61,15-3,0 clulas animales0,01-0,0417-70
clulas vegetales0,007-0,0323-100
Diapositiva 18
Fase de desaceleracin y estacionaria Puede deberse a inhibicin
por producto, agotamiento de nutrientes, limitacin por oxgeno En
medios complejos la fase de desaceleracin es mas extendida en
comparacin con medios definidos. La caracterstica de la biomasa al
final del batch puede ser controlada con la composicin inicial del
medio (el cultivo puede limitarse en C, N, P, etc) En la fase
estacionaria, los microorganismos suelen adaptarse a la falta de
nutrientes (condicin de starvation): supervivencia prolongada,
incremento en la resistencia a condiciones de stress (salino,
trmico, oxidativo, osmtico), etc. Hay expresin diferencial de genes
al entrar al estado estacionario Algunas clulas pierden la
capacidad de reproducirse, pero se mantienen viables (viables no
cultivables)
Diapositiva 19
Desventajas del cultivo batch Dificultad de controlar el ,
excepto variando la composicin del medio o las condiciones de
proceso Altas concentraciones de nutrientes pueden inhibir el
crecimiento debido al aumento de la presin osmtica del medio o
toxicidad de nutrientes Alta demanda de oxgeno puede generar una
limitacin debido a una insuficiente capacidad del reactor para
transferir O 2 al medio Inconvenientes para remover calor Tiempos
muertos entre procesos disminuye la productividad. Pie de cuba
Diapositiva 20
Cultivo continuo El tipo bsico es el quimiostato, que consiste
en una suspensin celular perfectamente mezclada a la cual se
adiciona medio fresco a una velocidad constante y se retira cultivo
a igual velocidad, de este modo el V L es cte. La composicin del
medio que se alimenta se disea segn que sustrato es el limitante
Fo, Ci reservorio bomba Fo BIOREACTOR rebalse medio fresco Cio
Ci
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Cultivo continuo inicio alimentacin transitorio estacionario X
s
Diapositiva 22
Cultivo continuo en e.e
Diapositiva 23
Balance de biomasa Cultivo continuo Balance de sustrato Balance
de producto
Diapositiva 24
Cultivo continuo Balance de sustrato con mantenimiento (r p =
0)
Diapositiva 25
Cultivo continuo max = 1.0 h -1 Y x/s = 0,5 gX /gS m s = 0,05
gS/gX h Ks = 5 mg/l S 0 = 2,0 g/l
Diapositiva 26
Aplicaciones del cultivo continuo Estudios fisiolgicos. Se
puede discriminar el efecto de la velocidad de crecimiento y de las
condiciones de cultivo en la fisiologa celular. Varo la composicin
del medio y parmetros del cultivo a =cte Varo manteniendo cte el
resto de los parmetros Muestreo estadstico en el estado
estacionario Inconvenientes del sistema continuo Inestabilidad
gentica de la cepa, prdida de plsmidos Contaminacin Imposibilidad
de establecer estado estacionario
Diapositiva 27
Cultivo batch alimentado (B.A) reservorio bomba F(t) BIOREACTOR
C(t) V(t) Vo Vf Vr = Vf - Vo C(t) Es un cultivo que se alimenta con
medio fresco. El volumen vara con el tiempo pues no se retira
cultivo. Dos tipos de B.A Controlado por alimentacin: el cultivo
sigue el curso que le dicta la alimentacin Con alimentacin
controlada: el estado del cultivo ( captado por sensores ) controla
la alimentacin
Diapositiva 28
Cultivo B. A Balance de biomasa Balance de sustrato Balance de
producto
Diapositiva 29
Cultivo B. A
Diapositiva 30
Diapositiva 31
El objetivo del BA es bsicamente controlar el Limitar la
demanda de O 2 del cultivo Obtener altas concentraciones de X
evitando el efecto osmtico y txico de nutrientes Incrementar el q p
(metabolitos secundarios, protenas recombinantes) para maximizar el
Yp/s. Maximizar el crecimiento celular (efecto Crabtree en
levaduras)