Departamento de QuDepartamento de Quíímica Fmica Fíísica y Analsica y Analííticatica
GRUPO DE INMUNOELECTROANGRUPO DE INMUNOELECTROANÁÁLISISLISIS
Prof. AgustProf. Agustíín Costa Garcn Costa Garcííaa
RED BIOSENSORESRED BIOSENSORES
MadMadridrid
13 de febrero de 200713 de febrero de 2007
UNIVERSIDAD DE OVIEDO
GRUPO DE INMUNOELECTROANGRUPO DE INMUNOELECTROANÁÁLISISLISISde la Universidad de Oviedode la Universidad de Oviedo
RED BIOSENSORESRED BIOSENSORES
Madrid, 13 / 02 / 2007Madrid, 13 / 02 / 2007
MicrochipsMicrochipsde electroforesis capilarde electroforesis capilarElectrodos serigrafiadosElectrodos serigrafiados
OroOro
CarbonoCarbono
10 10 mmmm
34 34 mmmm
Microchips de Electroforesis CapilarMicrochips de Electroforesis Capilar
SustratoSustrato vidriovidrio
DeposiciDeposicióónnfotoresinafotoresina
InsolaciInsolacióónn UVUV
EliminaciEliminacióónnresinaresina
GrabadoGrabado hhúúmedomedoHF:NHHF:NH44F 1:6F 1:6
ReveladoRevelado
SelladoSellado canalescanales650 650 –– 675 675 ººC, 5hC, 5h
Microscopia de Barrido Electrónico (SEM)Microscopia Confocal
A: Disolución reguladora
D: Desecho
C: Muestra
B: Detección
ColaboraciColaboracióón: n: Grupo de Grupo de ÓÓptica Integrada y ptica Integrada y OptoelectrOptoelectróónicanicaDpto. de FDpto. de Fíísica, Universidad de Oviedosica, Universidad de Oviedo
Canal separación
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RED BIOSENSORESRED BIOSENSORES
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Microchips de Electroforesis CapilarMicrochips de Electroforesis CapilarDiseDiseñño de detectores o de detectores amperomamperoméétricostricos
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Conexióneléctrica
Lámina Au10 nm Ti / 100 nm Au
10 μm0,4 mm
Diseño I: Detector “in-channel”
Diseño II: Detector “end-channel”con hilos metalicos
Hilo Au (100 o 250 μm Ø) o Pt (300 μm Ø)
Diseño IV: Detector “end-channel”con películas
Diseño III: Detector “dual”
10 μm0,4 mm
Hilo Au (250 μm Ø)
Lámina Au(100 nm)
SPE o Lámina Au
Conexióneléctrica
Lámina Au10 nm Ti / 100 nm Au
10 μm0,4 mm
Diseño I: Detector “in-channel”
Diseño II: Detector “end-channel”con hilos metalicos
Hilo Au (100 o 250 μm Ø) o Pt (300 μm Ø)
Diseño IV: Detector “end-channel”con películas
Diseño III: Detector “dual”
10 μm0,4 mm
Hilo Au (250 μm Ø)
Lámina Au(100 nm)
SPE o Lámina Au
SeparacionesSeparaciones enen microchipmicrochips de electroforesis capilars de electroforesis capilar
Microchip de Topas (comercial) con detector “end-channel” de hilo de Au
Microchip de Su-8 (Ikerlan) con electrodos integrados de Pt
12
13
14
15
16
17
18
19
50 75 100 125 150 175 200 225 250
tiempo (s)
Inte
nsidad
(nA
)
DA EPDopamina (DA) + Epinefrina (EP)
Viny = +250 V, tiny = 5 s,
Vsep = +750 V, Ed = +1.2 V,
Buffer: 25 mM MES-His pH = 5.7
p-aminofenol (pAP) + Acido Ascórbico (AA)
Viny = +2000 V, tiny = 5 s,
Vsep = +2000 V, Ed = +0.8 V,
Buffer: 50 mM Tris-Gly pH = 9.0
32
34
36
38
40
42
44
10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140
tiempo (s)
Inte
nsidad
(nA
)
pAP AA
Microchip de Topas (comercial) con detector “end-channel” de hilo de Au
Microchip de Su-8 (Ikerlan) con electrodos integrados de Pt
12
13
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50 75 100 125 150 175 200 225 250
tiempo (s)
Inte
nsidad
(nA
)
DA EPDopamina (DA) + Epinefrina (EP)
Viny = +250 V, tiny = 5 s,
Vsep = +750 V, Ed = +1.2 V,
Buffer: 25 mM MES-His pH = 5.7
p-aminofenol (pAP) + Acido Ascórbico (AA)
Viny = +2000 V, tiny = 5 s,
Vsep = +2000 V, Ed = +0.8 V,
Buffer: 50 mM Tris-Gly pH = 9.0
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10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140
tiempo (s)
Inte
nsidad
(nA
)
pAP AA
Microchips de Electroforesis CapilarMicrochips de Electroforesis Capilar
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RED BIOSENSORESRED BIOSENSORES
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15 30 45 60 75 90 105 120 135 150
time (s)
Curr
ent
15 30 45 60 75 90 105 120 135 150
time (s)
Curr
ent
• Reacción de Marcado (off-chip)
Hebra sencilla DNA (ssDNA)
Intercaladorelectroactivo
(Azul de metileno, MB)Temperaturaambiente
Inyección
Mezcla
• Análisis en Microchip
ssDNA-MB MB
DetecciónAmperométrica
200 pA
MB 100 μM + ssDNA 10 ng/μL
MB 100 μM
MB ssDNA-MBDetector end-channelde hilo de Au (100 μm Ø)
Buffer: TBE (50 mM Tris-Bórico pH = 7.0
1 mM EDTA)
Viny= +1500 V, tiny= 5 s
Vsep= +2000 V, Ed= -0.3 V
Separación
15 30 45 60 75 90 105 120 135 150
time (s)
Curr
ent
15 30 45 60 75 90 105 120 135 150
time (s)
Curr
ent
• Reacción de Marcado (off-chip)
Hebra sencilla DNA (ssDNA)
Intercaladorelectroactivo
(Azul de metileno, MB)
Hebra sencilla DNA (ssDNA)
Intercaladorelectroactivo
(Azul de metileno, MB)Temperaturaambiente
Inyección
Mezcla
• Análisis en Microchip
ssDNA-MB MB
DetecciónAmperométrica
200 pA
MB 100 μM + ssDNA 10 ng/μL
MB 100 μM
MB ssDNA-MBDetector end-channelde hilo de Au (100 μm Ø)
Buffer: TBE (50 mM Tris-Bórico pH = 7.0
1 mM EDTA)
Viny= +1500 V, tiny= 5 s
Vsep= +2000 V, Ed= -0.3 V
Separación
Microchips de Electroforesis CapilarMicrochips de Electroforesis CapilarAnAnáálisis de ADNlisis de ADN
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RED BIOSENSORESRED BIOSENSORES
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ParParáámetros optimizadosmetros optimizados
- [AuCl4-]
- E constante / I constante- Tiempo
Oro coloidal
Sequedad
- Tamaño de partícula- Densidad de partículas
Electrodeposiciónde oro
AuCl4-
AplicaciAplicacióónn
Electrodos serigrafiadosElectrodos serigrafiados
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NanopartNanopartíículasculas de orode oro
NanoestructuraciNanoestructuracióónn de la superficie de la superficie electrelectróódicadica
5 μm 1 μm
Electrodo Serigrafiado de Carbono
(SPCE)
SPCE-Nanotubos de carbono
5 μm 1 μm
NanoestructuraciNanoestructuracióónn de la superficie de la superficie electrelectróódicadicaElectrodos serigrafiadosElectrodos serigrafiados
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RED BIOSENSORESRED BIOSENSORES
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NanotubosNanotubos de carbonode carbono
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RED BIOSENSORESRED BIOSENSORES
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Superficie electródica
1. Estreptavidina
2. Albúmina
12 h, 4ºC
Estable a 4ºCdurante 12 meses
Anticuerpo BiotiniladoINMUNOSENSOR
Estable a 4ºC durante12 meses
Oligonucleótido BiotiniladoGENOSENSOR
Estable a 4ºCdurante 6 meses
0.1 M H2SO425 μA, 2 min
Activación
Electrodos serigrafiadosElectrodos serigrafiadosInmuno y Inmuno y genosensoresgenosensores
Electrodo serigrafiado Electrodo serigrafiado modificado con modificado con estreptavidinaestreptavidina(bloqueado con (bloqueado con albalbúúmina)mina)
NeumolisinaNeumolisina
Anticuerpo Anticuerpo policlonalpoliclonal de de conejo conejo αα--neumolisinaneumolisina
Anticuerpo monoclonal de ratAnticuerpo monoclonal de ratóón n αα--neumolisinaneumolisina biotiniladobiotinilado
33--IPIP
IndigoIndigoAPAPAPAP
Anticuerpo de cabraAnticuerpo de cabra αα--IgGIgG de de conejo, conejo, marcado con APmarcado con AP
Electrodos serigrafiadosElectrodos serigrafiados
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RED BIOSENSORESRED BIOSENSORES
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Inmuno y Inmuno y genosensoresgenosensoresInmunosensorInmunosensor para para neumolisinaneumolisina
Detección cronoamperométrica
directa
-Pt-FITC
-Pt-FITC
DNADNA(marcado con (marcado con FITCFITC a a
travtravéés des de PtPt))
APAP
Anticuerpo Anticuerpo antianti--FITC FITC marcado marcado concon APAP
33--IPIP
IndigoIndigo
APAP-Pt-FITC
Detección voltamperométrica
enzimática
Capaz de detectar 1.5 Capaz de detectar 1.5 fmolfmol de de oligonucleoligonucleóótidotido ((StreptococcusStreptococcus
pneumoniaepneumoniae: : plyply, , lytAlytA))DetecciDeteccióón de una mutacin de una mutacióónn
Capaz de detectar 250 Capaz de detectar 250 fmolfmol(1 mutaci(1 mutacióón), pero el n), pero el
tiempo de antiempo de anáálisis es menorlisis es menor
-2.0
-1.5
-1.0
-0.5
0.0
0.5
1.0
1.5
-0.3 -0.2 -0.1 0 0.1 0.2 0.3
E / V
i / μA
Voltammetry
-2.0
-1.5
-1.0
-0.5
0.0
0.5
1.0
1.5
-0.3 -0.2 -0.1 0 0.1 0.2 0.3
E / V
i / μA
Voltammetry
FosfatasaFosfatasaAlcalinaAlcalina33--IPIP Azul de Azul de
ÍÍndigondigoÍÍndigo ndigo
CarmCarmíínn
-1200-1000
-800-600-400
-2000
0 50 100 150 200 250 300 350
t / s
i / μ
A
Chronoamperometry
-1200-1000
-800-600-400
-2000
0 50 100 150 200 250 300 350
t / s
i / μ
A
Chronoamperometry
Pt(IIPt(II) + 2 e) + 2 e-- PtPt
2 H2 H++ HH22
E = E = --1.4 V1.4 V
Electrodos serigrafiadosElectrodos serigrafiados
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RED BIOSENSORESRED BIOSENSORES
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Inmuno y Inmuno y genosensoresgenosensoresGenosensorGenosensor para para StrpStrp. . pnpn..
Detección cronoamperométrica
directa
-Pt-FITC
-Pt-FITC
DNADNA(marcado con (marcado con FITCFITC a a
travtravéés des de PtPt))
APAP
Anticuerpo Anticuerpo antianti--FITC FITC marcado marcado concon APAP
APAP-Pt-FITC
Capaz de detectar 0.2 Capaz de detectar 0.2 fmolfmol de de oligonucleoligonucleóótidotido
((StreptococcusStreptococcus pneumoniaepneumoniae: : lytAlytA))
Capaz de detectar 250 Capaz de detectar 250 fmolfmol(1 mutaci(1 mutacióón), pero el n), pero el
tiempo de antiempo de anáálisis es menorlisis es menor
Electrodos serigrafiadosElectrodos serigrafiados
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Inmuno y Inmuno y genosensoresgenosensores
-100
102030405060708090
100
-0.3 -0.2 -0.1 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6
E / V
i / μ
A
Redisolución de plata
FosfatasaFosfatasaAlcalinaAlcalina33--IPIP
++AgAg++
Azul de Azul de ÍÍndigondigo++
AgAg00
33--IPIP + Ag+ Ag++
Indigo + Indigo + AgAg00
GenosensorGenosensor para para StrpStrp. . pnpn..
-1200-1000
-800-600-400
-2000
0 50 100 150 200 250 300 350
t / s
i / μ
A
Chronoamperometry
-1200-1000
-800-600-400
-2000
0 50 100 150 200 250 300 350
t / s
i / μ
A
Chronoamperometry
Pt(IIPt(II) + 2 e) + 2 e-- PtPt
2 H2 H++ HH22
E = E = --1.4 V1.4 V
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Electrodos serigrafiadosElectrodos serigrafiadosInmuno y Inmuno y genosensoresgenosensores
APAP33--IPIP
II
HSHS HSHSHS HS
APAP
HSHSHSHSHSHS
HSHSHS HSHSHS HSHSHSHSHSHS
HS
HSHS HSHS
APAP
HSHS HSHSHS HSHSHSHSHSHSHS
HSHSHSHS
OligoOligo--33’’CC33SHSH
11--hexanotiolhexanotiol
OligoOligo biotiniladobiotinilado
EstreptavidinaEstreptavidina--APAP
GenosensorGenosensor sobre superficie de orosobre superficie de oro
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Oportunidades de colaboraciOportunidades de colaboracióón n ……
Acoplamiento de Acoplamiento de deteccideteccióón electroqun electroquíímicamica a a microchipsmicrochips de electroforesis capilarde electroforesis capilar
FabricaciFabricacióónn en vidrio de en vidrio de microchipsmicrochips de electroforesis capilarde electroforesis capilar
Desarrollo de Desarrollo de inmunoinmuno-- y y genosensoresgenosensores sobre sobre electrodos serigrafiadoselectrodos serigrafiados micromicro-- o o nanoestructuradosnanoestructurados
Universidad de OviedoUniversidad de OviedoGRUPO DE INMUNOELECTROANGRUPO DE INMUNOELECTROANÁÁLISISLISIS
Prof. AgustProf. Agustíín Costa Garcn Costa Garcííaa
Facultad de QuFacultad de QuíímicamicaDptDpt. . QQªª FFíísica y Analsica y AnalííticaticaC/ JuliC/ Juliáán Clavern Claveríía, 8a, 833006 Oviedo33006 OviedoAsturiasAsturias
TelTel.: 985 103 488.: 985 103 488FAX: 985 103 125FAX: 985 103 [email protected]@fq.uniovi.es
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