Desarrollo de metodologías para la
determinación de drogas veterinarias y
residuos de pesticidas en productos
cárnicos mediante HPLC y GC-MS/MS
Souza, Rodrigo; Muela, Agustina; Fernández, Paula;
Heinzen, Horacio; Cesio, María Verónica; Pareja, Lucia
Grupo de Análisis de Compuestos Traza (GACT)
• Cátedra de
Farmacognosia y
Productos Naturales
• Departamento de
Química del litoral
• Centro Universitario
Regional Este
Introducción
• Uruguay es uno de los
mayores productores y
consumidores de
productos ganaderos en el
mundo.
• Presenta un consumo
interno de
aproximadamente 180 mil
toneladas de carne y una
exportación de 256 mil
toneladas.
https://www.inac.uy/innovaportal/file/1283/1/exportacion-producto-adelanto-bol-digital.pdf
Introducción
•El ganado es alimentado con agua, pasturas y ración que
puede contener residuos de plaguicidas.
•A su vez el uso de drogas veterinarias es una práctica muy
extendida para evitar enfermedades.
•El uso de estos productos fitosanitarios puede resultar en la
presencia de los mismos en tejidos y órganos.
•La presencia de los mismos en riñón es un riesgo al
consumidor y un indicador de exposición del animal a dichos
contaminantes.
Objetivo
“Desarrollo y validación de una metodología
para el análisis de 76 pesticidas y 24 drogas
veterinarias en productos cárnicos”
Experimental
Selección de compuestos
• Se seleccionaron compuestos en base a los criterios
establecidos en el Plan Nacional de Residuos Biológicos
(Uruguay), Codex Alimentarius y Unión Europea.
• Se escogieron distintas familias de compuestos (insecticidas,
herbicidas, acaricidas, fungicidas y antibióticos).
Inse
ctic
idas
AcephateAcetamipridAzinphos MethylBeta CyfluthrinBifenthrinBuprofezinCarbarylCarbofuranChlorpyrifosChlorpyrifos methylClothianidinCypermethrinDimethoateEmamectin-BenzoateEthionFenthionFenvalerateFipronilLambda-CyhalothrinHexythiazoxImidaclopridMalathion/MalaoxonMetidathionMethiocarbMethomylMethoxyfenozidep,p-DDEp,p-DDTSpinosadChlorantraniliprolePermethrinPirimifos methylPropoxur
Inse
ct. Tebufenozide
ThiaclopridThiametoxamTriflumuron
AbamectinAlbendazoleAzaperolClembuterolCoumaphosDiclofenacEprinomectinFenbendazoleFlunixinIvermectinMoxidectinNitroxinilParacetamolSalbutamolTriclabendazoleClorsulonClosantelOxyclonazide
PropanilBentazoneDicambaHaloxyfop methylMCPATrifluralinFluazifop
Fun
gic
idas Azoxystrobin
BoscalidCarbendazimDifenoconazoleEpoxiconazoleFenhexamidFlusilazoleFlutriafolKresoxim methylIsoprothiolaneMebendazoleMepanipyrimMetconazolePyraclostrobinTetraconazoleTrifloxystrobinPropiconazoleTitriconazole
ChloramphenicolFlorfenicolNitrofurantoinAmoxicilinDanofloxacinMonensinEnrofloxacinStreptomycin
Otr
os
He
rbic
idas
An
tib
ioti
cos
Condiciones Cromatográficas LC-MS/MS
Volumen de inyección: 5μL
Voltaje de fuente (IS): 5000/-4500 V (+/-)
Temperatura de la fuente (T): 400 ºC,
Curtain Gas (CUR): 20 psi
Collision Gas (CAD): Medio (N2)
Ion Source Gas (GS1, GS2): 50 psi
t (min) % A (H2O 0,1% Ac.Form) % B (ACN)
0 50 50
1 50 50
3 0 100
7 0 100
8 50 50
12 50 50
t (min)% A (H2O 0,1% Ac.Form,
5 mM Form.Amonio)
% B (MeOH 0,1% Ac.Form, 5
mM Form.Amonio)
0 98 2
1 98 2
12 0 100
16 0 100
21 98 2
26 98 2
ESI +
Columna: Agilent Zorbax Eclipse XDB, C-18
4000-QTRAP-MS/MS
ESI -
Condiciones Cromatográficas GC-MS/MS
GCMS TQ8040 Shimadzu
Rtx-5MS capilar
Columna
1 μL, splitless
Volumen de
inyección 240 °C inyector,
300 °C interfase
Temp.
He a 14 mL/min
Gas
RateTemp Final
(°C).
Tiempo de
espera (min)
- 80.0 2.00
20.00 180.0 0.00
5.00 300.0 3.00
• Tiempo total: 34 min
Extracto de riñón envenenado a 50 μg/kg
SRM 1 y SRM 2 de abamectina
Tiempos de retención 2 transiciones (SRM)Relación de
SRM2/SRM1
Criterios de identificación
Métodos evaluados
5 g de muestra
15 mL AcOEt, 1,5 g de NaCl, 4 g de MgSO4
Freeze out 24 hs, 60 mg de C18, 100 mg de
Al2O3, 600 mg de MgSO4
5 g de muestra/5 mLH2O
15 mL AcOEt, 1,5 g de NaCl, 4 g de MgSO4
Freeze out 24 hs, 60 mg de C18, 100 mg de
Al2O3, 600 mg de MgSO4
5 g de muestra/5 mLH2O
10 mL ACN, 1 g de NaCl, 4 g de MgSO4, 1 g de Na3C6H5O, 0,5 g de
Na2C6H5O7.6H2O
60 mg de C18, 600 mg de MgSO4
Análisis instrumental
• Porcentaje de recuperación de la muestra fortificada
Veracidad
• Repetitividad y ReproducibilidadPrecisión
• LOQ, nivel de concentración más bajo con porcentaje de recuperación 70-120% y RSD < 20%
LOQ
• Análisis de residuales y coeficiente de regresión, en solvente y matriz.
Linealidad
• Comparación de las pendientes de las curvas en solvente y matriz
Efecto matriz
Document No.SANTE/11813/2017;http://ec.europa.eu/food/plant/pesticides/guidance_documents/docs/qualcontrol_en.pdf.
Resultados
Veracidad y precisión
• De los métodos evaluados el previamente validado por
nuestro grupo para leche mostró los mejores resultados.
• Se evaluó la veracidad y (repetitividad y reproducibilidad) a
5, 20 y 50 µg/kg.
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
% R
ecupera
ció
n
Compuesto
5 μg/kg 20 μg/kg 50 μg/kg
70%
120%
14%
29%57%
LOQ, Linealidad y Efecto Matriz
LC-MS/MS
• 72 compuestos presentaron un limite de cuantificación de
5 μg/kg, con un rango lineal de 1-100 μg/kg.
• Sólo 2 compuestos presentaron limites más altos a 20
μg/kg, con un rango lineal de 10-100 μg/kg
% EM < 20
% EM > 50
20 < %EM< 50
y = 3003.4x + 3494.5R² = 0.9993
y = 4574.7x + 9818.6R² = 0.9989
0
100000
200000
300000
400000
500000
600000
700000
0 20 40 60 80 100 120 140
Áre
a
Concentración
LOQ, Linealidad y Efecto Matriz
GC-MS/MS
• 23 compuestos presentaron un limite de cuantificación de 5
μg/kg, con un rango lineal de 1-100 μg/kg.
• 3 compuestos presentaron limites más altos a 20 μg/kg, con
un rango lineal de 10-100 μg/kg.
8%
37%55%
% EM < 20
% EM > 50
20 < %EM< 50y = 650.79x - 576.42
R² = 0.9997
y = 980.8059x - 121.1005R² = 1.0000
0
20000
40000
60000
80000
100000
120000
0 20 40 60 80 100 120
Áre
a
concentracion
Otras Matrices: Método Final
Hígado
Análisis intrumental
HPLC-MS/MS GC-MS
Extracción5 g muestra + 15 mLAcOEtSalting out MgSO4 + NaCl
Clean-up 2
60 mg C-18, 100 mg Al2O3,
600 mg MgSO4
Clean-up 1
Freeze-out (12 hs)
Músculo
+ 5 mL H2O
0
20
40
60
80
100
120
140
% R
ec &
RSD
Compuesto
10 µg/kg 100 µg/kg 250 µg/kg
Hígado: GC-MS y LC-MS/MS
% Recuperación y RSD a 10, 100 and 250 µg/kg
70%
120%
0
20
40
60
80
100
120
140
% R
ec &
RSD
Compuesto
10 µg/kg 100 µg/kg 250 µg/kg
Músculo: GC-MS y LC-MS/MS
% Recuperación y RSD a 10, 100 and 250 µg/kg
•LOQs en LC-MS/MS fueron 5 y 10 µg/kg, menores a los LMRs
establecidos por la UE y Codex Alimentarius.
•Para GC-MS los LOQs fueron en general 10 µg/kg (5-fold
concentration).
Hígado y Músculo
•La linealidad fue correcta en ambos instrumentos para mbas
matrices; evaluadas mediante el coeficiente de
determinación y el cálculo de residuals (BCC).
y = 35045x + 511651R² = 0.9987
y = 31820x + 249277R² = 0.9989
0
5000000
10000000
15000000
20000000
25000000
30000000
35000000
40000000
0 500 1000 1500
Are
a
Concentración (μg/kg )
Solvent Liver
Hígado: GC-MS & LC-MS/MS
90%
6%4%
Linealidad y EM
% EM < 20
% EM > 5020 < %EM< 50
y = 13085x + 294582R² = 0.9973
y = 13912x + 320274R² = 0.9969
0
2000000
4000000
6000000
8000000
10000000
12000000
14000000
16000000
0 200 400 600 800 1000 1200
Are
a
Concentración (μg/kg)
Solvent Muscle
Músculo: GC-MS & LC-MS/MS
85%
9%6%
Efecto Matriz
% EM < 20
% EM > 5020 < %EM< 50
Muestras reales: Ivermectina en hígado
Rt=18,07 min
Concentración: < MRL UE (100 µg/kg)
Conclusiones y trabajo a futuro
• Se validó una metodología para el análisis simultáneo de
pesticidas y drogas veterinarias en riñón.
• Se logró introducir en el alcance del método las
avermectinas.
• Compuestos de elevada polaridad como los herbicidas
ácidos se pueden analizar con el mismo método.
Perspectivas
• Evaluar un mayor número de muestras comerciales con
el fin de generar información que contribuya a evaluar
la inocuidad de los productos cárnicos de nuestro país.
• Aumentar el alcance del método a más drogas
veterinarias.
Agradecimientos
Gracias