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DETECCIÓN DEHelicobacter pylori

POR PCR ANIDADA EN MUESTRAS NO INVASIVAS

Aracely García Cuan, Anahí Barros Martínez,

Anny Miranda Cárdenas, Andrés De la Hoz Pabola,

Juan Lara Cobos, Franklin Torres Jiménez

©2019

DETECCIÓN DE Helicobacter pylori POR PCR ANIDADA EN MUESTRAS NO INVASIVAS

Universidad Libre Seccional Barranquilla Facultad de Ciencias de la Salud Programa de Medicina

Editora: Ana Mercedes Medina Buelvas

Compiladores: Celia Rossi, Anahí Barros

Coordinador Editorial: Juan Carlos Miranda

Ediciones Corporación Universidad Libre Barranquilla

Barranquilla

Km 7 Antigua Carretera a Puerto Colombia

www.unilibrebaq.edu.co

ISBN: 978-958-9145-72-2

ISBN Digital: 978-958-9145-77-7

Diagramación e impresión:

Xpress Estudio Gráfico y Digital S.A.S. - Xpress Kimpress

Tel. 6020808

Bogotá, D.C. , Colombia

Detección de Helicobacter pylori por PCR anidada en muestras no invasivas : guía práctica / Aracely García Cuan … [et al.]. -- editora, Ana mercedes Medina Buelvas ; compiladores, Celia Rossi, Anahí Barros. -- Barranquilla : Corporación Universidad Libre Barranquilla, 2019.

96 p. : il., gráficas

ISBN: 978-958-9145-72-2

ISBN Digital: 978-958-9145-77-7

Contenido: C.1 Extracción del ADN Genómico -- C.2 Cuantificación de ADN por Espectrofotometría -- C.3 Electrofóresis en Gel de Agarosa -- C.4 Electrofóresis en Gel de Poliacrilamida -- C.5 Preparación de un control interno para PCR Anidada -- C.6 Determinación de parámetros de desempeño de la PCR anidada para la amplificación del producto externo e interno del gen ureA en Helicobacter pylori -- C.7 Amplificación del gen Cag A en Helicobacter pylori mediante PCR convencional -- C.8 Aplicación de la técnica de PCR anidada para la detección de Helicobacter pylori en placas arterioescleróticas – Apéndices -- Bibliografía.

1. Helicobacter pylori – Diagnóstico - Guías -- 2. Úlcera péptica -- 3. Enfermedades del aparato digestivo. -- I. García Cuan, Aracely-- II. Universidad Libre Seccional Barranquilla. Facultad de Ciencias de la Salud. Centro de Investigaciones

616.3 -- dc23

Guía práctica

Universidad Libre Seccional Barranquilla Facultad de Ciencias de la Salud

Programa de Medicina Centro de investigaciones

DETECCIÓN DEHelicobacter pylori

POR PCR ANIDADA EN MUESTRAS NO INVASIVAS

DIRECTIVA NACIONAL

Presidente Nacional: JORGE ALARCÓN NIÑO Rector Nacional: FERNANDO DEJANÓN RODRÍGUEZ

Censor: RICARDO ZOPÓ MÉNDEZDirector Centro de Investigaciones: ELIZABETH VILLARREAL CORRECHA

DIRECTIVA SECCIONAL

Presidente Delegado: BEATRIZ TOVAR CARRASQUILLA Rector Seccional: MAURICIO MOLINARES CAÑAVERA

Censor: PATRICIA OLIVARES BOLIVARDirectora Centro de Investigaciones: WENDY ROSALES RADA

Decano: SALVADOR RADA JIMÉNEZDirector Centro de investigación de facultad: JESÚS IGLESIAS ACOSTADirectora programa de Medicina: LUCIANA HERNÁNDEZ MALDONADO

CONTENIDO

Prólogo ........……........................................................................................ 15

Introducción ........……................................................................................ 17

Capítulo 1

Extracción del ADN Genómico ........….............................................….... 19

Capítulo 2

Cuantificación de ADN por Espectrofotometría ........…....................….... 31

Capítulo 3

Electrofóresis en Gel de Agarosa ........……............................................. 35

Capítulo 4

Electrofóresis en Gel de Poliacrilamida ........……................................... 43

Capítulo 5

Preparación de un control interno para PCR Anidada ........................... 47

Capítulo 6

Determinación de parámetros de desempeño de la PCR anidada para la amplificacion del producto externo e interno del gen ureA en Helicobacter pylori ..........…….......................... 55

Capítulo 7

Amplificación del gen Cag A en Helicobacter pylori mediante PCR convencional ........……................................................... 65

Capítulo 8

Aplicación de la técnica de PCR anidada para la detección de Helicobacter pylori en placas arterioescleróticas ............. 69

APENDICESApéndice 1

Recomendaciones previas para preparar medios de cultivo y soluciones ........……................................................................ 76

Apéndice 2

Preparación de medios de cultivo ........……........................................... 76

Apéndice 3

Cálculos para preparar soluciones ........................................................ 77

Apéndice 4

Preparación de soluciones para procedimientos de biología molecular ........…….................................................................. 79

Apéndice 5

Preparación de los reactivos comerciales ........……................................ 81

Apéndice 6

Cálculos para preparación de soluciones de ADN ........……................... 82

Anexo 1

Secuencias de nucleótidos de los cebadores ........…......................….... 87

Anexo 2

Secuenciación de fragmento interno ........……....................................... 88

Bibliografía ........…….................................................................................... 93

ÍNDICE DE TABLAS

Tabla 1. Resultados de la cuantificación de ADN obtenido a partir de una muestra de saliva ...................................................... 33

Tabla 2. ADN de diferentes microorganismos y diferentes concentraciones ............................................................................. 38

Tabla 3. Porcentajes de concentración de agarosa sugeridos para la visualización de moléculas de ADN ..................................... 39

Tabla 4. Reactivos para preparación del gel de poliacrilamida ..................... 45

Tabla 5. Reactivos y concentraciones necesarias para preparar un tubo de reacción Control Interno del gen UreA para la PCR anidada (Primera amplificación) ........………...................... 49

Tabla 6. Perfil de temperatura para la PCR anidada del Control Interno del gen UreA (Primera amplificación) ................................. 50

Tabla 7. Reactivos y concentraciones necesarios para preparar un tubo de reacción Control Interno del gen UreA para la PCR anidada (Segunda amplificación, Master Mix comercial) .................................................................. 58

Tabla 8. Reactivos y concentraciones necesarios para preparar un tubo de reacción Segmento Externo del gen UreA para la PCR anidada (Primera amplificación, Master Mix no comercial) .............................................................. 58

Tabla 9. Perfil de temperatura para PCR anidada del Segmento Externo del gen UreA (Primera amplificación) ........……………......... 59

Tabla 10. Reactivos y concentraciones necesarios para preparar un tubo de reacción Segmento Interno del gen UreA para la PCR anidada (Segunda amplificación) ............….............. 59

Tabla 11. Perfil de temperatura para PCR anidada del Segmento Interno del gen UreA (Segunda amplificación) .............................. 60

Tabla 12. Reactivos y concentraciones necesarios para preparar un tubo de reacción del gen CagA para PCR convencional ................................................................................ 67

Tabla 13. Perfil de temperatura para PCR convencional del gen CagA .............. 67

Tabla 14. Oligonucleótidos seleccionados para la estandarización de la prueba de PCR anidado para la detección de H. pylori ....................................................................................... 87

ÍNDICE DE FIGURAS

Figura 1. Curva de absorbancia de ADN obtenido a partir de una muestra de saliva ......................................................................... 33

Figura 2. Cuantificación de ADN método de dots ......................................... 41

Figura 3. Efecto sonrisa, por lo general causado por variaciones del voltaje, temperatura o incorrecta solidificación de la agarosa .................................................................................... 41

Figura 4. Corrido electroforético de ADN degradado ..................................... 41

Figura 5. Corrido electroforético de fragmento externo de muestras de saliva ........................................................................ 52

Figura 6. Corrido electroforético en gel de poliacrilamida de ADN genómico de Helicobacter pylori y Control Interno (CI) a 100 copias ................................................................................... 52

Figura 7. Corrido electroforético de fragmento externo de muestras de saliva ........................................................................ 53

Figura 8. Corrido electroforético de fragmento interno de muestras de saliva ....................................................................... 62

Figura 9. Corrido electroforético de PCR realizada a partir de muestras de ADN de distintos orígenes .................................... 63

Figura 10. Curva del límite de detección de la PCR anidada a partir de soluciones de ADN de cantidades conocidas ............... 63

Figura 11. Corrido electroforético de fragmento CagA en muestras de saliva ....................................................................... 68

Figura 12. Ateroma obtenido de arteria carótida interna ............................... 74

Figura 13. Ateroma obtenido a partir de la arteria coronaria derecha ......................................................................... 74

Figura 14. Corrido electroforético de PCR realizada a partir de muestras de ADN extraídas de placas de ateroma, obtenidas de pacientes con diversas patologías cardiovasculares .......................................................... 75

Figura 15. Verificación de ADN CI .................................................................. 86

Figura 16. Cromatograma de la secuenciación del fragmento interno de H. pylori ........................................................................ 90

Figura 17. Cromatograma de la secuenciación del fragmento interno de H. pylori ........................................................................ 91

ABREVIATURAS

• ADN: Ácido desoxirribonucleico

• ARN: Ácido ribonucleico

• BD: Tampón de digestión

• BL: Tampón de lisis

• CI: Control interno

• CNM: Control de negativo de manipulador

• CN: Control negativo

• CNR: Control negativo de reactivo

• CP: Control positivo

• DNsa: Desoxirribonucleasa

• dNTPs: Desoxinucleótidos trifosfatos

• DO: Densidad óptica

• ECV: Enfermedades cardiovasculares

• EDTA: Ácido etilendiaminotetraacético.

• fg: Fentogramo

• G: Tampón de elución G

• g: Gramos

• GW1: Tampón de lavado GW1

• GW2: Tampón de lavado GW2

• H2O TI: Agua Ultrapura Tipo I

• ICONTEC: Instituto Colombiano de Normas Técnicas

• ISO: Organización Internacional para la Estandarización

• KH2PO4: Fosfato de potasio monobásico

• L: Litro

• LDL: Lipoproteínas de baja densidad

• lb: Libras

• M: Molar

• MgCl2: Cloruro de Magnesio

• mM: Milimolar

• mL: Mililitros

• NaCl: Cloruro de sodio

• Na2HPO4: Fosfato disódico

• nm: Nanómetro

• PAI: Isla de patogenicidad

• PBS: Tampón fosfato salino

• PCR: Reacción en cadena de la polimerasa

• PK: Proteinasa K

• PR: Tampón para proteinasa

• PW1: Tampón de prelavado

• RNsa: Ribonucleasas

• RPM: Revoluciones por minuto

• SDS: Dodecilsulfato sódico

• TAE: Tris, acetato y EDTA.

• TEMED: Tetrametiletiléndiamina

• TBE: Tris, borato y EDTA

• TG3: Tampón de lisis G3

• TG: Tampón de lisis

• µL: Microlitros

• UV: Luz ultravioleta

AGRADECIMIENTOS DE LOS AUTORES

A los patrocinadores: Gobernación del Atlántico (SGR), Convenio 0103*2015*000031, Universidad Libre Seccional Barranquilla.

Centros de Gastroenterología: CEVIED, Clínica de la Costa, Jorge Carreño.Laboratorio de docencia en Microbiología y Biología Molecular de la Universidad Libre Seccional Barranquilla, Grupo de Infecciones Nosocomiales y Resistencias Microbianas de la Universidad Simón Bolívar, Grupo de Investigación en Genética y Biología Molecular de la Universidad del Norte.

MD gastroenterólogos: Jorge Carreño Rueda, Carlos Quin Quin, Jesús Pérez Orozco, Alberto Villegas Sanguino, por sus asesorías y el suministro de las muestras del estudio.

Al Director Científico de la Clínica de la Costa: Eduardo Martínez por el apoyo otorgado durante el proceso de recolección de datos y muestras.

Compiladores: Celia Rossi Trespalacios. Químico farmacéutica Universidad de Cartagena, Magister en Microbiología convenio Universidad Pontificia Javeriana-Universidad del Norte.

Anahí Barros Martínez. Microbióloga Universidad Libre Seccional Barranquilla.

Fotografías en la portada: Mario Peña Freyle, Laura Martínez Parra con su aporte con la imagen "Coloración Epifluorescencia del Helicobacter pylori."

PRÓLOGO

El propósito de esta guía es describir técnicas para la detección de Helicobacter pylori aplicando nuevas tecnologías basadas en el método de PCR anidado en material biológico tomado de manera no invasiva como saliva y heces. De acuerdo con los resultados obtenidos en este trabajo, el método ha demostrado buena sensibilidad y especificidad.

En esta guía hemos querido sintetizar los requerimientos mínimos y las técnicas utilizadas y validadas, estas últimas descritas paso a paso, para que el profesional de laboratorio pueda implementarlas en su trabajo.

La obra se compone de las técnicas de extracción, purificación y cuantificación de ADN genómico, aplicable a las muestras de saliva, sangre, biopsia y heces fecales teniendo en cuenta las modificaciones pertinentes en los protocolos, específicas para cada matriz; se describen los parámetros de desempeño de la PCR anidada para la amplificación del producto externo e interno del gen ureA y PCR convencio-nal para el gen cagA en Helicobacter pylori, la técnica de electroforesis en gel de agarosa utilizada para la confirmación de la presencia de ambos genes, la prepa-ración de las soluciones reactivos y medios de cultivo incluidos en la sección en los Apéndices; además, recomendaciones para mejorar el desempeño de la técnica.

Al final, también se incluye la aplicación de la técnica para detectar H. pylori en formas extragástricas (placas de ateroma).

INTRODUCCIÓN

Helicobacter pylori es un bacilo, microaerófilo y agente etiológico asociado con la enfermedad ácido-péptica en humanos. Actualmente se le conoce responsable del 85-95 % de las úlceras duodenales, 70- 80 % de las úlceras gástricas y tiene protagonismo relevante en el 60- 70 % de los casos de cáncer gástrico, neoplasias más frecuentes a nivel mundial (1,2). En zonas costeras de Colombia (Barranquilla, Cartagena y Santa Marta), un estudio realizado a partir de biopsias gástricas reportó una frecuencia de infección por H. pylori de 77,9% (3).

El riesgo de desarrollo, distribución y la severidad de las patologías relacionadas con infección por H. pylori depende de una variedad de factores: la patogenicidad y virulencia de la bacteria, la susceptibilidad del huésped y el nivel socio-económico, entre otros (4–8).

Hoy se emplean diversidad de técnicas para el diagnóstico del H. pylori: cultivos microbiológicos, estudios histopatológicos, test del aliento, test rápido de la ureasa, test serológicos, test de antígeno en heces y más recientemente pruebas molecula-res de ADN y ARN. Sin embargo, las técnicas convencionales se caracterizan por su complejidad, escaso valor predictivo y costos elevados (9–11).

La PCR es la prueba molecular más extensamente usada por su sensibilidad, espe-cificidad y aplicabilidad para detectar microorganismos de difícil aislamiento, como es el caso de H. pylori (12).

Detección de Helicobacter pylori por PCR Anidada en muestras no invasivas

18

La PCR anidada es una variante en la cual el fragmento externo resultante de una primera ronda de amplificación contiene sitios de hibridación para un segundo par de cebadores, los cuales inician la síntesis del segmento interno reconocido. Debido al mayor número de ciclos se aumenta la sensibilidad y verifica la especificidad de la primera reacción (13,14), y ha sido empleada para la detección de Helicobacter pylori en muestras con poca densidad microbiana como saliva, biopsia, heces y sangre humana (15–18).

El presente documento es un producto resultado del proyecto de investigación: “Identificación de Helicobacter pylori mediante prueba molecular no invasiva, y factores de riesgo asociados en el departamento del Atlántico” del Sistema General de Regalías (SGR), el cual desarrolla en forma detallada las técnicas moleculares utilizadas para detectar Helicobacter pylori en distintas matrices, a fin de facilitar la comprensión del lector. Se incluyen los requerimientos de materiales, insumos y equipos, además de recomendaciones en la práctica de laboratorio para obtener mejores resultados. Además, se realizaron pruebas de calidad interna y externa, acorde con las normas de acreditación reglamentadas por el Sistema General de Seguridad Social en Salud para Colombia (Decreto 1011 del 3 de abril de 2006) para laboratorios prestadores de servicio; los estándares ISO/IEC 17025: 2005 para Laboratorio de Ensayo y Calibración (19) y la Resolución 1619 de 2015 que describen los estándares de calidad en salud pública (20). Asimismo, los procedimientos se apoyan en fotografías derivadas del desarrollo del proyecto.

CAPÍTULO 1

EXTRACCIÓN DE ADN GENÓMICOAndrés Felipe De la Hoz Pabola, Anny Paola Miranda Cárdenas,

Anahí María Barros Martínez.

La extracción de ácido desoxirribonucleico (ADN) genómico es el punto de partida de una serie de técnicas de biología molecular, por la cual es posible aislar y ca-racterizar genes que no han podido determinarse por métodos tradicionales y que pueden emplearse en el diagnóstico de enfermedades y trastornos genéticos. La técnica de extracción consiste en separar el ADN de las células (y demás organelos) o virus en las que normalmente reside.

Palabras clave: extracción de ADN, ADN, saliva, heces, biopsia, sangre.


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ObjetivoDescribir las pautas para realizar la extracción de ADN total a partir de saliva, heces, biopsia y sangre, utilizando métodos de extracción tradicionales y kits comerciales, con el fin de obtener un material íntegro y libre de inhibidores de la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR).

DefinicionesADN genómico: molécula de doble hélice presente en todas las células nucleadas, que guarda las instrucciones para el funcionamiento de los seres vivos y su rela-ción con el entorno. Por ello, su extracción y purificación son el primer paso para cualquier experimento que implique su estudio (21).

Materiales, insumos y equipos• Bata de laboratorio, gafas protectoras y guantes desechables

• Tubos de centrífuga de 1.5 mL estériles

• Puntas de micropipetas estériles y libres de desoxirribonucleasa (ADNsas)

• Gradillas

• Papel absorbente

• Alcohol al 70%

• Marcador permanente

• Pinzas

• Tampón fosfato salino (PBS)1

• Agua peptonada al 1%

• Tampón de lisis (BL)2

• Lisozima A (Sigma-Aldrich CAS Number 12671-19-1)

• Dodecilsulfato sódico (SDS) al 10%

• Cloruro de sodio (NaCl) al 5M

• Isopropanol puro

• Etanol al 96-100%

1 Ver preparación y composición en Apéndice 4.

2 Ver preparación y composición en Apéndice 4.

Guía Práctica

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• Agua ultrapura tipo I (H2O TI)

• Microcentrífuga (capacidad para 11000 x g)

• Pipetas automáticas

• Incubadora

• Vórtex

• Mechero de alcohol

• Baño maría

• “ISOLATE II Blood DNA Kit”

• “ISOLATE II Genomic DNA Kit”

• Tubos de recolección de 2 mL

• Columnas

• Tampón de lisis G3 (TG3)

• Tampón de lavado GW1 (GW1)

• Tampón de lavado GW2 (GW2)

• Tampón de elución G (G)

• Proteinasa K (liofilizada) (PK)

• Tampón para proteinasa PR (PR)

Nota: Para ver preparación de los reactivos de los kits, ir a Apéndice 5. Preparación de los reactivos comerciales.

Procedimiento

SALIVARecolección de muestra mediante hilo dental

1. Frotar suavemente el hilo dental entre los dientes del paciente.

2. Depositar el hilo en un tubo de centrífuga previamente esterilizado y en el cual se han dispensado 500 µL de agua peptonada o PBS.

3. Codificar los tubos en la tapa y rótulo con el número de paciente, institución hospitalaria y fecha en que fue tomada la muestra.


22

Preparación de la muestra

4. Dejar reposar las muestras a temperatura ambiente (entre 25- 28°C) durante 5 minutos.

5. Humedecer las pinzas con alcohol al 70%.

6. Flamear en un mechero y dejar enfriar.

7. Sujetar con las pinzas el hilo dental por un extremo y hacer presión contra la tapa y la boca del tubo, con la finalidad de extraer la saliva impregnada.

8. Homogeneizar usando el vórtex y adicionar 50 µL de PBS.

9. Continuar con las instrucciones en “Obtención de ADN (lisado de células)”.

Recolección de muestra mediante esputo

1. Depositar saliva directamente desde la boca al tubo de centrífuga hasta com-pletar 2 mL.

2. Codificar los tubos en la tapa y rótulo con el número de paciente, institución hospitalaria y fecha en que fue tomada la muestra.

Preparación de la muestra

3. Depositar 150 µL de saliva en un tubo de centrífuga estéril de 1,5 mL.

4. Completar con 50 µL de PBS para un total de 200 µL.

5. Mezclar en vórtex por 5 minutos y un spin (10 segundos) en microcentrífuga.

6. Llevarlas a baño serológico por 10 minutos a 37 °C.

7. Centrifugar a 12000 RPM por 5 minutos.

8. Continuar con las instrucciones en “Obtención de ADN (lisado de células)”

Obtención de ADN (lisado de células)

1. Adicionar 200 µL de BL, 4 µL de lisozima y 150 µL de SDS al 10%. Homogenei-zar con vórtex por 10 segundos e incubar durante 1 hora a 37 °C.

Remoción de contaminantes y separación de fases

2. Agregar 400 µL de NaCl al 5M.

3. Incubar durante 10 minutos a 4 °C.

Guía Práctica

23

4. Centrifugar a 12000 RPM por 10 minutos.

5. Transferir el sobrenadante a un tubo de reacción nuevo y estéril libre de desoxirri-bonucleasa (DNasas) y ribonucleasas (RNasas).

Limpieza del ADN

6. Añadir 800 µL de isopropanol puro.

7. Centrifugar por 5 minutos a 13000 RPM y 4 °C.

8. Descartar sobrenadante y lavar el pellet con 500 µL de etanol al 70%.

9. Mezclar suavemente por inmersión y centrifugar por 5 minutos a 13000 RPM y 4 °C.

10. Descartar el sobrenadante y dejar secar con calor seco a 50 °C.

Reconstitución y almacenamiento del ADN

11. Adicionar 50 µL de H2O TI, cuantificar el ADN (ver Capítulo 2. Cuantificación de ADN por espectrofotometría) y distribuir en alícuotas.

12. Almacenar en congelador a -20 °C o a menor temperatura si es posible.

Nota: El protocolo original fue obtenido de (1)the amount of human DNA (as mea-sured by a TaqMan-based assay.

MATERIA FECALRecolección de muestra

1. Depositar una muestra de materia fecal suficiente en un frasco coprológico. Este paso debe realizarlo el paciente.

2. Transportar la muestra en refrigeración entre 4-9°C hasta el laboratorio para su procesamiento.

3. Transferir 0,5 g de materia fecal aproximadamente a tres tubos de centrífuga estériles de 1,5 mL y llevar a congelación a – 80° C (incluido el recipiente original).

Preparación de muestra (lavado)

4. Descongelar tres tubos de centrífuga, adicionar 1000 µL de PBS y mezclar con vórtex vigorosamente para homogeneizar.


24

5. Centrifugar a 3000 rpm durante 15 minutos y luego transferir el sobrenadante a un nuevo tubo de centrífuga de 1,5 mL.

6. Adicionar PBS hasta capacidad del tubo, centrifugar a 3000 rpm durante 5 minutos y transferir sobrenadante a un nuevo tubo.

7. Centrifugar a 13000 rpm por 5 minutos y descartar sobrenadante.

8. Adicionar 700 µL de PBS y mezclar con vórtex vigorosamente para homogeneizar.

9. Centrifugar a 13000 rpm por 5 minutos y continuar con la obtención del ADN.

Obtención de ADN (lisis celular)

10. Resuspender el pellet obtenido en el lavado en 50µL de BL, 50µL de SDS 10% y 50µL de lisozima.

11. Incubar a 37°C durante 10 minutos.

12. Incubar a 100°C en baño maría por 30 minutos.

13. Adicionar 1000 µL de fenol-cloroformo.

14. Centrifugar a 13.000 rpm por 5 minutos.

15. Transferir el sobrenadante a un nuevo tubo de centrífuga de 2 mL. Repetir el paso 34 dependiendo del estado de limpieza del pellet (opcional).

Limpieza del ADN

16. Adicionar 600 µL de etanol absoluto frío (4°C).

17. Centrifugar a 13.000 rpm por 5 minutos.

18. Decantar y desechar el etanol.

19. Incubar mínimo 30 minutos a 56°C para evaporación del etanol y secado de la muestra.


20. Adicionar 50 µL de H2O TI, cuantificar la cantidad de ADN (ver Capítulo 2. Cuantificación de ADN por espectrofotometría) y distribuir en alícuotas.


Guía Práctica

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Nota: Se sugiere utilizar un pellet entre incoloro a blanco. Pellets de color amarillo, marrón o negro indican presencia de contaminantes que pueden inhibir la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR).

Nota: El método fue extraído de (1)the amount of human DNA (as measured by a TaqMan-based assay y modificado durante el desarrollo del proyecto.

SANGRERecolección de muestra

Nota: El siguiente procedimiento debe ser realizado por un profesional en bacteriología o en áreas afines y que ha sido capacitado para ello.

1. Preparar los elementos necesarios.

2. Identificar al paciente y explicarle el procedimiento que se va a realizar. El paciente debe permanecer sentado y en reposo.

3. Lavar las manos de acuerdo con el procedimiento establecido y colocarse los guantes.

4. Ubicar el torniquete por encima del sitio que se va a punzar para que la vena sea más visible.

5. Localizar la vena mediante inspección. Esto se facilita si el paciente cierra y abre su puño.

6. Desinfectar el área que se va a punzar con el algodón y alcohol.

7. Punzar la vena en dirección contraria al flujo sanguíneo utilizando la palomilla de seguridad.

8. Retirar el torniquete cuando la sangre empiece a brotar. Conectar el tubo vacutainer suplementado con ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) (tapa lila). Recoger en tres tubos vacutainer, 3 mL de sangre en cada uno.

9. Sacar la aguja y aplicar presión suave con un algodón.

10. Colocar un apósito en el sitio que fue punzado.

11. Etiquetar los tubos.

12. Desechar el material usado y lavarse las manos.

13. Registrar el procedimiento en los formatos designados.


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Almacenamiento de las muestras

Para la obtención de ADN, las muestras de sangre se conservan a temperatura ambiente por algunos días o semanas y a 4°C y hasta por más de 1 año. Se obtienen mejores resultados si el material fresco se procesa lo antes posible, o si es almacenado a -20°C o -70°C. La sangre almacenada a esta temperatura permitirá la obtención de ADN por años.

Observación: El procedimiento descrito a continuación corresponde al protocolo de extracción de ADN disponible en el inserto del Kit comercial BIOLINE ISOLATE II Blood DNA BIO-52064. Para ver insertos originales en inglés, remitirse a los enlaces de las páginas en línea citadas en las recomendaciones.

Lisado de células sanguíneas

14. Agregar 200 µL de sangre en un tubo de centrifuga de 1,5 mL, 25 µL de PK, 200 µL de G3 y aplicar vórtex de 10 a 20 segundos.

15. Incubar las muestras a 70 °C en baño termorregulador de 10 a 15 minutos.

Unión del ADN

16. Agregar 210 µL de etanol (96-100%) y realizar vórtex por 10 segundos.

17. Colocar la columna que provee el kit en un tubo de colección de 2 mL y cargar la muestra del tubo de centrífuga en la columna.

18. Centrifugar por 1 minuto a 11.000 x g. Repetir este paso a una mayor gravedad si la muestra no se filtra completamente a través de la matriz. Se recomienda centrifugar por 2 minutos, en caso tal, la muestra no atraviese la membrana.

19. Descartar el tubo y llevar la columna a un nuevo tubo de colección de 2 mL.

Lavado de la membrana de sílica

20. Adicionar 500 µL del GW1 y centrifugar por 1 minuto a 11.000 x g, y transferir la columna a un tubo de colección.

21. Agregar 600 µL del GW2 y centrifugar por 1 minuto a 11.000 x g. Descartar el líquido sobrenadante y colocar la columna de nuevo en el tubo de colección.

Secado de la membrana de sílica

22. Incubar los tubos a 56 °C de 30 a 60 minutos para facilitar la evaporación del etanol.

Guía Práctica

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Elución del ADN

23. Precalentar el G a 70 °C.

24. Adicionar directamente en la membrana de sílica 30 µL del G precalentado a 70 °C e incubar por 1 minuto a temperatura ambiente3.

25. Centrifugar por 1 minuto a 11.000 x g.

26. Repetir los pasos 24 y 25.

27. Descartar la columna con la membrana de sílica y conservar el producto cen-trifugado a -20 °C.


28. Adicionar 50 µL de H2O TI, cuantificar la cantidad de ADN (ver Capítulo 2. Cuan-tificación de ADN por espectrofotometría) y distribuir en alícuotas.


BIOPSIARecolección de las muestras

La recolección de las muestras debe ser realizada por endoscopia por el médico gastroenterólogo endoscopista; las muestras se sumergen en 2 mL de PBS en tubo Falcon con tapa rosca, debidamente etiquetados para una buena identificación por el laboratorio.

Preparación de muestras

1. Cortar el tejido en trozos de 25 mg y depositar en tubos de centrífuga de 1,5 mL.

2. Adicionar entre 50-70 µL de PBS y homogeinizar

El procedimiento descrito a continuación corresponde al protocolo de extracción de ADN disponible en el inserto del kit comercial BIOLINE ISOLATE II Genomic DNA BIO-52067. Para ver insertos originales en inglés, remitirse a los enlaces de las páginas en línea citadas en las recomendaciones.

Pre Lisado de células de tejido

3. Adicionar 180 µL de GL, 25 µL de PK y aplicar vórtex de 10 a 20 segundos.

3 Modificación del kit, realizada durante el desarrollo del ensayo.


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4. Incubar las muestras a 56 °C en incubadora de 1 a 3 horas. Agitar y aplicar vórtex cada 30 minutos hasta observar la completa disolución del tejido. Las muestras pueden dejarse incubando durante la noche si es necesario.

Lisado de células de tejido

5. Adicionar 200 µL de G3, mezclar con vórtex e incubar las muestras a 70 °C en baño termorregulador por 10 a 15 minutos.

Nota: Si se observan partículas, centrifugar durante 5 minutos a alta velocidad y transferir el sobrenadante a un nuevo tubo de centrífuga.

Unión del ADN

6. Agregar 210 µL de etanol (96-100%) y realizar vórtex por 10 segundos.

7. Colocar la columna que provee el kit en un tubo de colección de 2 mL y adicionar la muestra del tubo de centrífuga en la columna.

8. Centrifugar por 1 minuto a 11.000 x g. Cuando la muestra no atraviese la membrana, centrifugar por 2 minutos adicionales, a una mayor gravedad.

9. Descartar el líquido sobrenadante y colocar la columna de nuevo en el tubo de colección.


10. Adicionar 500 µL del GW1 y centrifugar por 1 minuto a 11.000 x g, y transferir la columna a un tubo de colección.

11. Agregar 600 µL del GW2 y centrifugar por 1 minuto a 11.00 x g. Descartar el líquido precipitado y rehusar el tubo de colección.

Secado de la membrana de sílica

12. Incubar los tubos a 56 °C durante 30 a 60 minutos para facilitar la evaporación del etanol.

13. Descartar la columna con la membrana de silica y conservar el producto centrifugado a -20°C

Elución del ADN

14. Precalentar el G a 70 °C.

Guía Práctica

29

15. Adicionar directamente en la membrana de sílica 30 µL del G precalentado a 70 °C e incubar por 1 minuto a temperatura ambiente4.

16. Centrifugar por 1 minuto a 11.000 x g.

17. Repetir los pasos 24 y 25.

18. Descartar la columna con la membrana de sílica y conservar el producto cen-trifugado a -20°C.


19. Adicionar 50 µL de H2O TI, cuantificar la cantidad de ADN (ver Capítulo 2. Cuan-tificación de ADN por espectrofotometría) y distribuir en alícuotas.


Procedimiento para purificación de ADN (opcional)

1. Centrifugar a 3.000 rpm durante 1 minuto los viales con las muestras de ADN

2. Adicionar, por cada 20 µL de ADN, 5 µL de EDTA 125 mM y 60 µL de etanol al 100%. Verificar que el EDTA llegue al fondo del vial.

3. Mezclar por inversión e incubar a temperatura ambiente y en oscuridad durante 15 minutos.

4. Centrifugar a 14.000 RPM y 4 °C durante 5 minutos.

5. Descartar suavemente el sobrenadante y escurrir sobre papel absorbente

6. Adicionar 60 µL de etanol al 70%, centrifugar a 10.000 RPM y 4 °C durante 5 minutos.

7. Descartar sobrenadante y centrifugar a 5.000 RPM durante 1 minuto.

8. Repetir pasos 6 y 7, hasta observar limpieza del pellet.

9. Dejar evaporar totalmente el etanol a 56 °C

10. Adicionar 50µL de agua H2O TI

11. Almacenar inmediatamente las muestras a -20 °C.

Nota: No se recomienda utilizar este procedimiento en muestras que contengan una cantidad de ADN muy baja.

4 Modificación del kit, realizada durante el desarrollo del ensayo.


30

RecomendacionesA. Evitar intercambiar las micropipetas, puntas para micropipetas y todo lo que

sea necesario para la realización de la técnica a otras áreas de trabajo. Utilizar etanol grado molecular. Otros podrían contener aditivos como acetona y meta-nol.

B. Verificar la evaporación total del etanol durante el secado de las muestras pues-to que puede inhibir la PCR.

C. Utilizar un control negativo (CN) al final de la línea de muestras para garantizar que no hubo contaminación por arrastre de puntas con la micropipeta automá-tica o durante la manipulación de las muestras.

D. Almacenar el ADN extraído a -80 y -20 °C para su conservación a largo plazo. Si el ADN se va a utilizar a corto plazo, se sugiere almacenar a 4 °C, para evitar que sufra daño tras sucesivas congelaciones y descongelaciones. De acuerdo con las observaciones realizadas en el laboratorio, se ha podido almacenar el ADN a 4°C durante un mes sin afectar su calidad.

E. Diluir el ADN en varias alícuotas para evitar la generalización de una posible contaminación y la congelación-descongelación del vial stock de ADN, puesto que favorece su degradación.

F. Evitar tener cerca fuentes de aerosoles durante el proceso de extracción que pueda contaminar las muestras.

G. Revisar el Apéndice 4 (“Preparación de soluciones para procedimientos de bio-logía molecular”) para revisar los protocolos de preparación de los reactivos

H. Leer los insertos originales en inglés de los kits BIOLINE ISOLATE II Genomic DNABIO-52067 en: https://www.bioline.com/us/isolate-ii-genomic-dna-kit.htmL y BIOLINE ISOLATEII Blood DNA BIO-52064 en https://www.bioline.com/downloads/dl/file/id/875/isolate_ii_blo od_dna_kit_product_manual.pdf.

CAPÍTULO 2

CUANTIFICACIÓN DE ADN POR ESPECTROFOTOMETRÍA

Andrés Felipe De la Hoz Pabola, Anny Paola Miranda Cárdenas,Anahí María Barros Martínez, Aracely García Cuan.

El método espectrofotométrico proporciona una estimación sencilla y precisa de la concentración de una muestra de ADN. Después de la extracción del ácido desoxirri-bonucleico (ADN), se hacen necesarios la cuantificación y el análisis de la calidad del material obtenido. El análisis consiste en la medición de la absorción UV, puesto que los nucleótidos presentan un máximo de absorción alrededor de 260 nm; si la muestra se encuentra pura, la proporción OD 260 nm/ OD 280 nm es mayor a 1,6.

Palabras clave: extracción de ADN, cuantificación del ADN, absorción UV, NanoDrop.


32

ObjetivosDescribir las directrices para cuantificar ADN mediante la técnica de espectrofotometría, que se realizan después de los procedimientos de extracción de ADN genómico y amplificación por la reacción en cadena de la polimerasa (PCR).

DefinicionesEspectrofotometría: técnica de análisis óptico que permite determinar la concentración de un compuesto en una solución. La técnica se fundamenta en la ley de Lambert-Beer, que explica la relación proporcional entre la cantidad de luz absorbida de un compuesto y su concentración en una solución (2).

Materiales, insumos y equipos• Micropipetas

• Puntas de micropipetas

• Muestras de ADN


• Papel absorbente (que no tenga pelusa)

• Espectrofotómetro

Procedimiento1. Dejar reposar las muestras a temperatura ambiente (entre 25-28 °C).

2. Ajustar la ratio de las absorbancias a A260/A280 nm del equipo.

3. Leer el blanco que corresponde a H2O TI y luego las muestras a una longitud de

onda de A260/A280 nm.

4. Determinar la concentración y pureza de ADN teniendo en cuenta las siguientes formulas:

• Concentración ADN (µg/mL) = Densidad óptica (DO) a 260 nm x factor de dilución x 50 (µg/mL).

• Pureza de ADN = A260/A280 nm.

Guía Práctica

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RecomendacionesTener en cuenta lo siguiente:

A. La ratio de absorbancia entre 260 y 280 nm es utilizada para medir la pureza de los ácidos nucleicos. La ratio de 1,8 es generalmente aceptado como “puro” para ADN. Si la ratio es menor que eso, puede indicar la presencia de proteínas, fenol y otros contaminantes que tiene fuerte absorción cercana o igual a 280 nm. Si se busca medir la pureza en la ratio de absorbancia entre 260 y 230 nm, entre 1,8 y 2,2 es aceptado como puro. Valores fuera de esos rangos indica contaminación por nucleótidos libres, tampones, proteínas o componentes de los colorantes. Observar el ejemplo en la Tabla 1 y Figura 1. Una curva ideal debería verse de la siguiente manera:

Tabla 1. Resultados de la cuantificación de ADN obtenido a partir de una muestra de saliva. Equipo: NanoDrop 2000/2000C Spectrophotometers.

nm = longitud de onda(λ) en nanómetros.

Concentración de ADN

260(λnm) 260/280 (λnm)

264,1 ng/µL 5,283 1,87

Fuente: Autores del proyecto.

Figura 1. Curva de absorbancia de ADN obtenido a partir de una muestra de saliva.

Fuente: Datos del proyecto. Gráficos obtenidos mediante el equipo NanoDrop 2000/2000C

Spectrophotometers.

B. Cantidades residuales en las muestras de guanidina, fenol y ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), reactivos utilizados en los de extracción de


34

ADN, contribuyen a la absorbancia entre 230 nm y 280 nm, lo cual puede afectar los resultados de la medición

C. Revisar el inserto del equipo, tener en cuenta los límites de detección del espectrofotómetro.

D. La calibración de la absorbancia = 0, se realiza con la solución tampón utilizada para suspender el analito de interés. La solución tampón debe tener el mismo pH y fuerza iónica que la solución analito. Se recomienda realizar un ciclo de calibración con el blanco para valorar si la absorbancia es alta en las ondas de análisis (por lo general en 260 nm), que puedan afectar las mediciones.

E. Agitar las muestras en vórtex y realizar un spin de 5 segundos antes de cuantificar. Evitar la creación de burbujas durante la mezcla y el pipeteo. Este protocolo se ejecutó usando el equipo NanoDrop One de Thermo Scientific. El manual para la utilización del equipo está disponible en: https://assets.thermofisher.com/PBS-Assets/CAD/manuals/3091-NanoDrop-One-User-Guide-v1.3-sw-SPANISH.pdf.

CAPÍTULO 3

ELECTROFORESIS EN GEL DE AGAROSAAndrés Felipe De la Hoz Pabola, Anny Paola Miranda Cárdenas,

Anahí María Barros Martínez, Aracely García Cuan.

La electroforesis en gel de agarosa es utilizada para separar macromoléculas como ácidos nucleicos y grandes complejos proteicos. La calidad de las moléculas de Ácido desoxirribonucleico (ADN) es analizada aplicando este método. El ADN está cargado de forma negativa a pH neutro, permaneciendo constante la relación carga/masa. La velocidad del ADN en la matriz de agarosa depende del tamaño y conformación del ADN, la concentración de agarosa y el voltaje aplicado.

Palabras clave: electroforesis en gel de agarosa, electroendosmosis, cámara de electroforesis, método dots.


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ObjetivoDescribir las pautas para ejecutar la técnica de electroforesis en gel de agarosa con el fin de verificar la cantidad, calidad e integridad del ADN y visualizar los fragmentos de interés posterior a un procedimiento de Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR).

DefinicionesElectroforesis: técnica utilizada para separar, analizar y caracterizar ácidos nucleicos de distintas procedencias, a través de una matriz sólida de acuerdo con su tamaño y carga eléctrica mediante la aplicación de un campo eléctrico (22,23).

Agarosa: polímero natural, polisacárido formado por galactosas alfa y beta, físicamente resistentes y alto grado de electroendósmosis. Se emplean para el análisis de ácidos nucleicos y proteínas. En la electroforesis, se comporta como un tamiz molecular y permite separar moléculas cargadas en función de su tamaño, forma y carga eléctrica (22,24).

Marcador de peso molecular: fragmento de ADN de tamaño conocido. Se utiliza para calcular los pesos moleculares de las muestras de ADN problema.

Materiales, insumos y equipos• Papel parafina

• Puntas de micropipetas con filtro

• Agarosa de grado de biología molecular, libre de ADNsas y Ribonucleasas (ARNsas)


• Tampón de carga “5X Green GoTaq® Flexi Buffer”

• Tampón de corrido TAE o TBE al 5X, 1X y 0.5X

• Marcador de peso molecular de 100 pb Promega

• Tampón de carga del marcador de peso “Blue/Orange 6X Loading Dye”

• Cámara de electroforesis horizontal

• Fuente de poder

• Micropipetas

• Bromuro de etidio (u otro tinte fluorescente para ADN)

Guía Práctica

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Procedimiento

Condiciones para productos de PCR1. Pesar la cantidad apropiada de agarosa y adicionar al tampón de corrido Tris/

Borato/EDTA (TBE) a 0.5X necesarios para preparar el gel correspondiente a las dimensiones de la cámara (24).

2. Calentar la solución en intervalos de 30 segundos y remover el recipiente hasta obtener una solución transparente y homogénea. Dejar enfriar, pero no solidificar.

3. Preparar la cuba y la cámara de electroforesis. Colocar los peines adecuados.

4. Servir la agarosa en el soporte del gel y esperar de 40 a 60 minutos hasta que gelifique, protegiéndolo de corrientes de aire directas con papel aluminio u otro material. Se debe evitar el uso de toallas de papel cerca de los geles de agarosa para evitar contaminarlo con fibras que exhiban fluorescencia ultravioleta.

5. Retirar los peines del gel cuidadosamente para evitar romper los pocillos.

6. Llenar la cámara de electroforesis hasta cubrir el gel con el tampón de corrido TBE a 1X.

7. Cargar el marcador de peso molecular en el primer pocillo de cada línea de peines. Colocar en los pocillos subsiguientes cada muestra previamente mezclada con el tampón así: en un papel parafinado mezclar por cada 10 µL de muestra, 2 µL de tampón de carga “5X Green GoTaq® Flexi Buffer”.

8. Cerrar la cámara y conectar los electrodos a la fuente de poder. Ajustar las condiciones de electroforesis a 90 voltios y 110 MA durante 50 minutos.

9. Apagar la fuente de poder una vez terminado el tiempo de corrido, retirar el gel de la cámara y sumergirlo por completo en una solución de bromuro de etidio a 0,5 µg/mL, durante 40 minutos.

10. Sumergir el gel en agua destilada durante 15 minutos para retirar el exceso de bromuro.

11. Visualizar el gel en un transiluminador UV (320 nm).


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Condiciones para cuantificación de ADN mediante electrofo-resis en geles de agarosa (método dots)

El método dots es una forma de verificar la cuantificación y pureza de las mediciones obtenidas mediante espectrofotometría.

1. Prepare el gel en la cámara de electroforesis horizontal teniendo en cuenta los pasos 1-6 del presente procedimiento.

2. Preparar concentraciones de ADN de diferentes microorganismos y diferentes concentraciones. La concentración de ADN en cada tubo se debe confirmar por espectrofotometría, como se muestra en la Tabla 2.

Tabla 2. ADN de diferentes microorganismos y diferentes concentraciones.

Cepas Concentración –ADN

Helicobacter pylori Hp3 29,75 ng/µL

Proteus mirabilis 20,50 ng/µL

Klebsiella pneumoniae 12,90 ng/µL


3. Adicionar en cada pozo del gel una alícuota de 15 µL de las concentraciones de ADN obtenidas en el paso anterior y mézclela con 4 µL de tampón de carga. Sembrar 10 µL del ADN muestra mezclado con 4 µL de tampón de carga.

4. Sembrar una escala patrón de ADN del fago λ en escalas de 2,5, 5, 10, 20 y 40 ng/µL, valores que corresponden a una región lineal en la curva.

5. Tapar la cámara de electroforesis, conectar a la fuente de poder.

6. Encender la fuente de poder y correr a 80 voltios durante una hora y 30 minutos.

7. Apagar la fuente de poder una vez terminado el tiempo de corrido, retirar el gel de la cámara y sumergirlo por completo en una solución de bromuro de etidio a 0,5 µg/mL, durante 40 minutos.



10. Realizar una comparación visual de la intensidad de las bandas del fragmento problema y la solución patrón conocida. Estimar la concentración aproximada de ADN desconocido (ver figura 2).

Guía Práctica

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RecomendacionesA. Se recomienda correr los ensayos a una temperatura en el laboratorio cercanas/

menores a 22°C a fin de evitar la distorsión del frente de migración del ácido nucleico en el gel (ver figuras 3 y 4).

B. No se recomienda limpiar o secar la cama de electroforesis con toallas desechables de papel tipo Sanitas (o incluso emplearlas en los alrededores del área de electroforesis y fotodocumentador) debido a que liberan fibras fluorescentes bajo iluminación ultravioleta.

C. Los geles de agarosa son preparados usando una proporción w/v (% peso/volumen) y su concentración depende del tamaño de los fragmentos de ADN que se desean separar (ver la tabla 3).

Tabla 3. Porcentajes de concentración de agarosa sugeridos para la visualización de moléculas de ADN.

Concentración de Agarosa (%) Rango de tamaño - DNA (bp)

0.2 5000-40000

0.4 5000-30000

0.6 3000-10000

0.8 1000-7000

1,0 500-5000

1.5 300-3000

2 200-1500

3 100-1000

Fuente: Barril y Nates, 2012 (25).

Los porcentajes de concentración anterior pueden estar sujetos a modificación, puesto que el corrido de los fragmentos también depende de: el tiempo de corrido, voltaje, miliamperios, tamaño de la cámara y tampón de corrido, entre otros.

D. Preparar la solución stock del tampón de corrido (TAE o TBE) al 5X y evitar preparar soluciones más concentradas que puedan precipitarse.

E. Es importante esperar el tiempo necesario hasta la completa solidificación de la agarosa, de lo contrario se vería afectada la migración del ADN durante el corrido. También evitar fuentes de vibración, corrientes de aire y movimiento que afecte la solidificación uniforme de la agarosa.


40

F. Preparar el marcador de peso “100bp DNA Ladder Promega” utilizando la siguiente proporción: 10 µL del marcador + 10 µL del colorante “Blue/Orange 6X Loading Dye” + 30 µL de H2O TI. Almacenar el volumen final en un tubo de 200 µL.

G. El bromuro de etidio es una sustancia altamente mutagénica e irritante para los ojos, piel y vías respiratorias. Por tanto, es obligatorio el uso de guantes desechables para su manipulación, señalizar las áreas de trabajo con bromuro y seguir las normas de bioseguridad pertinentes en relación con el descarte y desactivación del material y soluciones contaminadas. En la actualidad se encuentran disponibles tintes alternativos que no tiene efectos mutagénicos: Diamond™ Nucleic Acid Dye y SYBR Green, entre otros. Es necesario leer con precisión las pautas del inserto de cada reactivo.

H. Tener en cuenta que el tampón TBE es un mejor conductor y resulta menos propenso al sobrecalentamiento, lo cual hace que sea más adecuado para corridas largas. Por otro lado, favorece el despliegue de fragmentos <2kb. El TAE se recomienda para facilitar la separación de grandes fragmentos de ADN.

I. Utilizar una Uninterruptible Power Supply (UPS) para conectar los equipos. Esto reducirá el efecto de las variaciones del voltaje en la migración del ADN.

J. La interpretación de los corridos es más eficiente si se utilizan equipos de fotodocumentación, que incluyan cámaras de alta resolución y software de captura y análisis de las fotografías de los geles.

Guía Práctica

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Interpretación de corridos electroforéticos

Figura 2. Cuantificación de ADN método de dots. Carril 1. Proteus mirabilis ADN; Carril 2. K. pneumoniae; Carril 3. ADN Helicobacter pylori Hp3; Carril 5. ADN CI; Carriles 6-10. ADN fago λ [2,5 ng/µL], [5.0 ng/µL], [10 ng/µL], [20 ng/µL], [40 ng/µL]. Por ejemplo: la concentración de ADN estimada por espectrofotometría para K. pneumonie (12.9 ng/µL), se ubicaría entre las bandas de los carriles 8 y 9, en la escala patrón.

Fuente: Aracely García, 2010 (26).

Figura 3. Efecto sonrisa, por lo general causado por variaciones del voltaje, temperatura o incorrecta solidificación de la agarosa. Carril 1. MP; Carriles 2. Amplificados de Cag A a partir de muestras de saliva.

Fuente: Datos del proyecto.

Figura 4. Corrido electroforético de ADN degradado. Carril 1. MP; Carriles 2, 3 y 8. Estelas de ADN degradado.


CAPÍTULO 4

ELECTROFORESIS EN GEL DE POLIACRILAMIDA

Anahí María Barros Martínez, Aracely García Cuan.

Los geles de poliacrilamida también son utilizados para verificar la calidad y cantidad del material genético extraído debido a que tienen un poder de resolución mayor que la agarosa, permitiendo la separación de moléculas que difieren en un solo par de bases. Los geles de poliacrilamida, a pesar de que son más complicados en su preparación y manejo, su ventaja consiste en poder separar fragmentos entre 5-700 pares de bases.

Palabras clave: electroforesis en gel de poliacrilamida, polimerización, poliacrilamida/bis-acrilamida.


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ObjetivoDescribir las directrices y recomendaciones para el desarrollo de la técnica de electroforesis horizontal en geles de poliacrilamida para el análisis de muestras de ácido desoxirribonucleico (ADN).

DefinicionesGel de poliacrilamida: soporte empleado en electroforesis, formado por la polimerización vinílica del monómero acrilamida y del monómero entrecruzador N, N’-metilen-bis-acrilamida. Sus características son: químicamente inerte, de propiedades uniformes; además, es capaz de formar geles transparentes con estabilidad mecánica, insolubles en agua, relativamente no iónicos y que permiten buena visualización de las bandas durante tiempo prolongado (27,28).

Materiales, insumos y equipos• Solución poliacrilamida/bis-acrilamida (29:1)5

• Tampón Tris/Borato/EDTA (TBE) de 5X6

• Solución de persulfato de amonio

• Tetrametiletiléndiamina (TEMED)

• Agua destilada

• Muestra de ADN

• Cámara de electroforesis

• Fuente de poder

• 5X Green GoTaq Flexi Reaction Buffer (tampón de carga)

• Micropipetas

Descripción general1. Montar la cámara de electroforesis horizontal.

2. Preparar el gel mezclando cada uno de los componentes con las cantidades descritas en la tabla 4, para un gel de 40 mL a 3,5% de acrilamida/bisacrilamida

5 Ver preparación en tabla 4.

6 Ver preparación en apéndice 4. Preparación de soluciones para procedimientos de biología molecular.

Guía Práctica

45

(30%). A excepción del persulfato de amonio, que se agrega en el momento antes de verter el gel.

Tabla 4. Reactivos para preparación del gel de poliacrilamida.

Reactivos Cantidad

Agua Hasta completar 40 mL

TBE 10X 4 mL

Solución acrilamida/bisacrilamida (30%) 4,67mL

TEMED 72 µL

Persulfato 10% 360 µL

Fuente: Adaptado de Barril y Nates, 2012 (25).

3. Mezclar suavemente el tubo por 15 minutos para eliminar el aire que pueda inhibir la reacción de polimerización.

4. Agregar el persulfato de amonio a la mezcla, verter el gel y colocar el peine. Evitar que burbujas de aire queden atrapadas debajo de los dientes del peine; de ser necesario, utilizar el resto de la solución de gel de acrilamida para llenar completamente el molde de gel. Asegurarse que la solución de acrilamida no se derrame del molde del gel.

5. Tapar la cámara de inmediato, para evitar el contacto con el aire. Esperar entre 30 y 60 minutos hasta solidificación de la mezcla.

6. Quitar los peines y llenar la cámara con el tampón de corrido. Usar una pipeta Pasteur o una jeringa para enjuagar los pocillos una vez más con TBE 1x. En papel parafinado mezclar con una micropipeta 10 µL de muestra con 2 µL de tampón de carga.

7. Cargar las muestras en los pozos del gel. Evite expulsar burbujas de aire que vacíen la muestra del pozo. Sin embargo, es importante no tomar demasiado tiempo para completar la carga del gel; de lo contrario, las muestras se difundirán desde los pozos.

8. Correr las muestras a 80 voltios durante 80 minutos. Apagar la fuente de poder, retirar el gel de la cámara y sumergirlo por completo en una solución de bromuro de etidio a 0,5 µg/mL, durante 40 minutos.




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RecomendacionesA. Se recomienda utilizar esta técnica para obtener mejor resolución de moléculas

de ADN de 1-1.000 pb. En las condiciones adecuadas y ajustes de la técnica, las moléculas de ADN que difieren en tamaño por un solo par de bases pueden diferenciarse.

B. Preparar el gel en TBE a 5X o 1X, y bajo voltaje (1-8) V / cm largo de la cámara para evitar la desnaturalización de pequeños fragmentos de ADN por calentamiento. Es posible utilizar tampón TAE 1X; sin embargo, no es recomendable por ser menos resistente al calentamiento. Los geles de poliacrilamida no desnaturalizantes se usan por lo general a voltajes entre 1 V / cm y 8 V / cm. Si la electroforesis se lleva a cabo a un voltaje más alto, produce sobrecalentamiento y provoca el arqueamiento de las bandas de ADN o incluso fusión de hebras de pequeños fragmentos de ADN.

C. Utilizar guantes para manipular las placas de vidrio y los espaciadores de fondo, a fin de evitar la trasferencia de la grasa de las manos a las superficies de trabajo de las placas.

D. Agregar el TEMED para completar el gel antes de que la acrilamida se polimerice.

E. Enjuagar el material con agua desionizada y etanol y dejar secar.

F. Utilizar el tampón de electroforesis del mismo lote para el llenado de la cámara y preparación del gel. Pequeñas diferencias en la fuerza iónica o pH producen amortiguación de los frentes que pueden distorsionar en gran medida la migración del ADN.

G. Cuando se desea repetir la experiencia, el mismo gel se puede volver a usar para cargar nuevas muestras. Para ello, hacer un corrido electroforético hasta observar que el gel esté limpio del tampón de carga (y por tanto de ADN), retirar el tampón de corrido y lavar el gel por inmersión en agua destilada. Colocar el gel en la cámara con tampón de corrido nuevo.

H. El gel puede conservarse en una bolsa plástica y a 4°C, de 1 a 3 días.

I. Es obligatorio utilizar guantes durante todo el proceso y máscaras para pesar el reactivo en polvo, puesto que la acrilamida es una sustancia neurotóxica. Aun si la poliacrilamida no lo es, se debe manejar con precaución debido a la posible presencia de acrilamida libre.

CAPÍTULO 5

PREPARACIÓN DE UN CONTROL INTERNO PARA PCR ANIDADA

Aracely García Cuan, Andrés Felipe De la Hoz Pabola, Juan Felipe Lara Cobos.

Debido a la presencia de inhibidores en las muestras, para la amplificación del ADN se hace necesario incorporar al ensayo de PCR un sistema de amplificación con “control interno” que permita detectar posibles resultados falsos negativos cumpliendo con lo establecido por las Normas de la Organización de Estándares Internacionales (ISO), de tal manera que permita la amplificación de productos de los ácidos nucleicos con la calidad requerida.

Palabras clave: PCR, control interno, fago M13mp19, gen ureA.


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ObjetivoDescribir las pautas para elaborar un control interno para su uso durante la amplificación del fragmento externo en la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) anidada, a fin de evitar resultados falsos negativos debido a la presencia de inhibidores.

DefinicionesControl interno (CI): corresponde a un fragmento de ácido desoxirribonucleico (ADN) híbrido que contiene una secuencia central del fago M13mp18, flanqueado de secuencias de H. pylori, el cual es adicionado a la reacción y es amplificado por los mismos cebadores que hibridan en el fragmento externo del gen ureA. Para sintetizar el CI, se amplifica en una primera ronda ADN del fago, usando un par de cebadores mixtos (ver secuencias en anexo 1, tabla 14) que contienen por una parte la secuencia de nucleótidos de los iniciadores del segmento externo (279 pb) del gen ureA y, del otro lado, la secuencia nucleotídica que amplifica al fago M13mp19. El producto se somete a una segunda reacción de PCR utilizando los cebadores externos de PCR anidado HpF1 y HpB25, buscando la producción de un fragmento homogéneo de ADN de 144 pb, que posee en sus extremos las secuencias del gen ureA contenidas en los cebadores externos del gen ureA y en el centro de la secuencia correspondiente al fago M13mp18. Una cantidad estimada de este fragmento se adicionará a los tubos de reacción que también contendrán el ADN de las muestras. Puesto que el CI también amplifica con los mismos cebadores del gen diana, su visualización en el corrido electroforético descarta un falso negativo debido a la presencia de inhibidores. La concentración de este control endógeno debe ser lo suficientemente baja para que sea sensible a la presencia de inhibidores, fallas en la preparación o en alguna fase del proceso. Utilizar un CI le otorga mayor validez a la técnica 7,8.

PCR anidada: variante de la PCR convencional que consiste en la realización de una segunda reacción de amplificación con dos cebadores nuevos que hibridan dentro del fragmento diana amplificado por el primer par. Debido al aumento en el número de ciclos utilizado en proceso (65 ciclos para el gen ureA de H. pylori), la sensibilidad aumenta8.

Materiales, insumos y equipos• Tubos de reacción de PCR de 200 µL• Puntas de micropipetas con filtro

Guía Práctica

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• Gradillas• Enzima Uracil ADN glicosilasa (UNG) 2.0 U/ µL• GoTaq® G2 Green Master Mix (Master mix)• Agua ultrapura tipo I (H

2O TI)• Cebadores Forward (CIHP F) y Reverse (CIHP R) para el fago M13mp19

(Invitrogen)7

• Cebadores Forward (HpF1) y Reverse (HpB25) para el fragmento externo del gen ureA (Invitrogen)7

• ADN del fago M13mp19 a 0.1 ng/ µL marca SIGMA REF: D4404 Lote 013H67348

• ADN muestra• Pipetas• Cabina de flujo laminar tipo II• Termociclador• Vórtex• Mini Centrífuga (Spin)

Procedimientos1. Preparar la master mix utilizando los cebadores mixtos CIHP R y CIHP F

(ver secuencias en anexo 1, tabla 14), y siguiendo la tabla 5.

Tabla 5. Reactivos y concentraciones necesarios para preparar un tubo de reacción Control Interno del gen UreA para la PCR anidada (Primera amplificación).

Reactivos Concentración inicial Concentración finalCantidad por tomar

(µL)

Master mix 2X 0,8X 10

Cebador Forward 10 pm 1,0 pm 2.5

Cebador Reverse 10 pm 1,0 pm 2.5

ADN 103 copias 102 copias 2.5

Agua - - 7.5

Volumen total - - 25


7 Ver secuencia en Anexo 1., Tabla 14.

8 Ver preparación de la solución trabajo en Apéndice 6. Cálculos para preparación de soluciones de ADN, 2. Preparación de solución del fago M13mp19.


50

2. Realizar una primera amplificación bajo las condiciones de la tabla 6. Ajustando el número de ciclos del equipo a 35, solo en las etapas de desnaturalización y extensión. Las etapas de desnaturalización inicial y extensión final se realizarán solo en el primer y último ciclo, respectivamente.

Tabla 6. Perfil de temperatura para la PCR Perfil de temperatura para PCR anidada del Control Interno del gen UreA (Primera amplificación).

Etapa Temperatura °CTiempo

(minutos)Desnaturalización inicial 94 5

Desnaturalización 94 1Hibridación 55 1Extensión 7 1

Extensión final 72 10

Fuente: Tomado de García, A. 2010 (26).

3. Realizar la segunda amplificación con los cebadores Forward (HpF1) y Reverse (HpB25) que flanquean el segmento externo del gen ureA.

4. Cuantificar los ADN siguiendo las instrucciones del capítulo 2. Cuantificación de ADN por espectrofotometría.

5. Correr los productos en gel de agarosa al 3,5% (preparada en tampón TBE al 0,5X), tampón de corrido TBE al 1X, 90 voltios, 110 miliamperios y 50 minutos.

6. Visualizar con bromuro de etidio una vez finalizado el corrido (ver figura 5). Revisar capítulo 3. Electroforesis horizontal en gel de agarosa.

7. Lavar el producto utilizando el procedimiento para purificación de ADN (opcional), descrito en el capítulo 1.

8. Preparar alícuotas en varios viales para congelar a -20 oC, pues el producto es lábil.

RecomendacionesA. Descartar los guantes en uso una vez finalizado cualquier procedimiento en las

áreas de trabajo.

Guía Práctica

51

B. No utilizar las batas de laboratorio de biología molecular para otros procedimientos diferentes a los pertinentes.

C. Utilizar puntas de micropipetas con filtro para evitar contaminación de estas por formación de aerosoles.

D. Micropipetas, puntas para micropipetas, marcadores y todo lo que sea necesario para la realización de la técnica deben ser exclusivos y no intercambiables.

E. Preparar alícuotas de los reactivos stocks previamente, de modo que, en casos de contaminación, sólo se elimina la alícuota en uso.

F. Eliminar cualquier reactivo, tubo de agua a partir de la cual se detecta alguna contaminación.

G. Centrifugar por 5 segundos (spin) los tubos que contengan ácidos nucleicos y abrir cuidadosamente para evitar contaminar los guantes y las superficies.

H. Todos estos elementos deben estar rotulados según el área a la que pertenezcan y no deben ser trasladados a otro espacio del laboratorio.

I. Irradiar la superficie de trabajo dentro de la cabina con luz ultravioleta previo a su uso, de forma que las pirimidinas de cualquier traza de ácido nucleico presente en la cabina formen dímeros entre sí (cross-link) bloqueando el paso de la polimerasa en una futura reacción de PCR.

J. Se recomienda diluir el ADN a una concentración de trabajo de 102 y agregar el CI a una concentración de 100 copias de ADN hibridado, con el fin de evitar saturación de la reacción (pérdida de sensibilidad). Revisar el apéndice 6. Cálculos para preparación de diluciones de ADN. El ADN muy concentrado desplaza al control interno (en menor concentración) por competencia de la unión con la enzima polimerasa. En consecuencia, el fragmento más pequeño no amplifica (ver figuras 6 y 7).

K. Si la contaminación por amplicones es un problema frecuente, es recomendable adicionar al tubo de reacción la enzima UNG a una concentración final de 0,5 U/µL para una máster mix de 25µL, y programar en el protocolo del termociclador 10 minutos adicionales de incubación a 20 °C. La enzima se debe dispensar en varias alícuotas y guardar a -20 °C. La UNG hidroliza los enlaces entre las bases, ribosa y residuos de uracilo, previniendo la replicación de la secuencia, al detenerse la actividad de la enzima cuando esta encuentra el sitio básico y así se elimina una de las fuentes más comunes de contaminación.

Nota: Las anteriores recomendaciones aplican para TODOS los procedimientos de


52

PCR que se describan en el presente manual.

Figura 5. Corrido electroforético de fragmento externo de muestras de saliva. Carril 1. MP, Carril 2. Fragmento externo de 279 pb y CI de 144 pb, Carril 3-4. Fragmento externo, Carril 5. ADN

degradado, Carril 6. CI.


Figura 6. Corrido electroforético en gel de poliacrilamida de ADN genómico de Helicobacter pylori y CI a 100 copias. Carril 1. CN; Carril 2. CI 144 pb; Carril 3. Muestra Helicobacter pylori (Hp3) + sin diluir más CI a 100 copias; Carril 5. Marcador de peso molecular de 100 pb. Nota: Podemos observar en el carril 3 la inhibición de la banda del CI de 144 pb y sólo se aprecia la banda de

279 pb de Helicobacter pylori (Hp3).

Fuente: Aracely Garcia, 2010 (26).

Guía Práctica

53

Figura 7. Corrido electroforético de fragmento externo de muestras de saliva. Carril 1. MP; Carriles 2-8. Muestras procesadas de saliva, se observa fragmento externo de 279 pb.


CAPÍTULO 6

DETERMINACIÓN DE PARÁMETROS DE DESEMPEÑO DE LA PCR ANIDADA

PARA LA AMPLIFICACIÓN DEL PRODUCTO EXTERNO E INTERNO DEL GEN ureA EN Helicobacter pylori

Aracely García Cuan, Andrés Felipe De la Hoz Pabola, Juan Felipe Lara Cobos, Anahí María Barros Martínez.

Una prueba de PCR anidada, por ser una técnica muy sensible, requiere mayor cuidado para evitar la contaminación en su manejo que una PCR convencional, por lo que se debe ser riguroso en la medición de sus parámetros de desempeño o validación, como son: selectividad de los cebadores (especificidad), el límite de detección, precisión y reproducibilidad.

Palabras clave: PCR anidada, parámetros de desempeño, gen ureA, amplicones, inhibidores de PCR anidada.


56

ObjetivoDescribir las pautas para establecer los parámetros de desempeño de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) anidada para la amplificación del producto externo e interno del gen ureA en Helicobacter pylori.

DefinicionesureA: gen involucrado en la síntesis y actividad de la enzima ureasa, que regula la expresión de factores de virulencia (26).

Fragmento externo: segmento específico del gen ureA en el genoma de H. pylori, que se amplifica mediante el primer par de cebadores para obtener amplicones de 279 pb (11).

Fragmento interno: segmento de 120 pb, que se obtiene en la segunda ronda de amplificación, utilizando cebadores que hibridan dentro del fragmento externo obtenido en la primera amplificación (11).

Materiales, insumos y equipos• Tubos de reacción de PCR de 200 µL

• Puntas de micropipetas con filtro

• Gradillas

• Cultivo de Helicobacter pylori ATCC 43526

• Cultivo de Helicobacter pylori ATCC 51652

• Cultivo de Helicobacter pylori ATCC BAA-1606 cagA +

• Cultivo de Klebsiella sp

• Cultivo de Proteus sp

• GoTaq® G2 Green Master Mix (Master mix)


• Dimetil sulfóxido (DMSO)

• Cloruro de magnesio

• Taq polimerasa

• Nucleotidos fosfatados (dNTPs)

Guía Práctica

57

• Tampón de PCR

• Cebadores Forward (F) (HpF1) y Reverse (R) (HpB25) para fragmento exter-no de gen ureA9

• Cebadores Forward (HpF2) y Reverse (HpB5) para fragmento interno de gen ureA9

• Muestra de Ácido desoxirribonucleico (ADN)• Solución de Control Interno (CI), preparado a 100 copias de ADN)10

• Marcador de peso (MP)• Control Negativo de Manipulador (CNM)• Control Negativo de Reactivo (CNR)• Pipetas• Cabina de flujo laminar tipo II• Termociclador• Vórtex

• Mini Centrífuga (Spin)

ProcedimientoSe describen a continuación dos alternativas de preparación de la máster mix:

Protocolo usando preparación de GoTaq® G2 Green Máster Mix (Master mix) comercial.

Dispensar en un tubo de reacción de 200 µL o un tubo de centrífuga de1,5 mL el agua, la master mix y los cebadores para obtener una solución final 17,5 µL apro-ximadamente (ver tabla 7). Este paso se debe realizar dentro de la cabina de flujo. Luego, continuar con la incubación en el termociclador.

9 Ver secuencias en anexo 1, tabla 14.

10 Ver preparación en apéndice 6. Cálculos para preparación de soluciones de ADN, Obtención de solucio-nes de ADN a 100 copias.


58

Tabla 7. Reactivos y concentraciones necesarios para preparar un tubo de reacción Control Interno del gen UreA para la PCR anidada (Segunda amplificación, Máster Mix comercial).

ReactivosConcentración

InicialConcentración

FinalCantidad por tomar (µL)

Máster mix 2X 0,7X 10

Cebador externo(Forward) 50 pm 1,0 pm 0,6

Cebador externo Reverse 50 pm 1,0 pm 0,6

ADN 103 copias 102 copias 3

Agua - 7,5 12,8

Control Interno 103 copias 102 copias 3


Fuente: Adaptado de Promega Corporation.

Protocolo usando preparación de máster mix no comercialDispensar en un tubo de reacción de 200 µL o un tubo de centrífuga de 1,5 mL el agua, los reactivos descritos en la tabla 8. Este paso se debe realizar dentro de la cabina de flujo. Luego, continuar la incubación en el termociclador.

Tabla 8. Reactivos y concentraciones necesarias para preparar un tubo de reacción Segmento Externo del gen Urea A para la PCR anidada (Primera amplificación, Master Mix no comercial). 11

Reactivo Concentración inicialVolumen a tomar

(µL)Concentración final

Tampón de PCR 5X 5,0 1X

DMSO 100% 1,25 5%

dNTPs 25mM 0,4 0,4 mM

Primer F 60pmol/ µL 0,625 1,5 pmol

Primer R 60pmol/ µL 0,625 1,5 pmol

Cloruro de Mg 25mM 1,5 1,5 mM

Taq polimerasa 5 U/ µL 0,2 0,04 U/ µL

ADN CI 103 copias / µL 2,5 102 copias

ADN H.p. 103 copias / µL 2,5 102 copias

Agua tipo I - 10,40 -

Volumen final. - 25 µL


11 GoTaq® G2 Green Master Mix Protocol – Promega Corporation. En: https://worldwide.promega.com/

Guía Práctica

59

1. Colocar los tubos en el termociclador y programar los ciclos, según tabla 9.

Tabla 9. Perfil de temperatura para PCR anidada del Segmento Externo del gen Urea A (Primera amplificación).

ETAPA TEMPERATURA °C TIEMPO CICLOS

Desnaturalización inicial 94 5

Desnaturalización 94 1

Hibridación 55 1

Extensión 72 1Regresar

‘Desnaturalización’ por 35 ciclos




3. Visualizar con bromuro de etidio una vez finalizado el corrido (ver figuras 5 y 7). Revisar capítulo 3. Electroforesis horizontal en gel de agarosa.

4. Tomar 3 µL del producto de la primera amplificación y realice una segunda empleando el segundo par de cebadores Forward (HpF2) y Reverse (HpB5) para fragmento interno de gen UreA teniendo en cuenta la tabla 10:

Tabla 10. Reactivos y concentraciones necesarios para preparar un tubo de reacción Segmento Interno del gen Urea A para la PCR anidada (Segunda amplificación).

Reactivos Concentración inicial Concentración FinalCantidad por tomar (µL)


Cebador externo (Forward)

50 pm 1,0 pm 0,5

Cebador externo

(Reverse)50 pm 1,0 pm 0,5

ADN - - 3

Agua - 7,5 11

Volumen total 25



60

5. Colocar los tubos en el termociclador y programar los ciclos (ver tabla 11):

Tabla 11. Perfil de temperatura para PCR anidada del Segmento Interno del gen Urea A (Segunda amplificación).

Etapa Temperatura°CTiempo

(minutos)Ciclos

Desnaturalización inicial

94 5


Hibridación 55 1

Extensión 72 1Regresar ‘Desnaturali-zación’ por 30 ciclos



6. Correr los productos en gel de agarosa al 3,5 % (preparada en tampón TBE al 0,5X), tampón de corrido TBE al 1X, 90 voltios, 110 miliamperios y 50 minutos.


Determinación de la selectividad de los cebadores8. Amplificar diferentes productos de extracción de ADN genómico, pertenecientes

a microorganismos que compartan la actividad ureasa positiva. Ejemplo: Klebsiella pneumonie y Proteus mirabilis. Tener en cuenta las condiciones de PCR descritas en los puntos 1 y 2 del presente capítulo.

9. Correr los productos en gel de agarosa al 3,5 % (preparada en Tampón TBE al 0.5X), Tampón de corrido TBE al 1X, 90 voltios, 110 miliamperios y 50 minutos.


Determinación del límite de detección de la técnica11. Cuantificar la cantidad de ADN inicial obtenida luego de realizar extracción de

ADN a partir de un cultivo de H. pylori ATCC (29).

12. Realizar diluciones a partir de la muestra anterior para obtener en otros tubos las siguientes concentraciones fentogramos por microlitros (fg/µL): 100 fg/µL, 10 fg/µL, 5 fg/µL, 2.5 fg/µL y 1 fg/µL (26).

Guía Práctica

61

13. Amplificar las diluciones en el paso anterior teniendo en cuenta las condiciones de PCR descritas en los puntos 1 y 2 del presente capítulo.


15. Visualizar con bromuro de etidio una vez finalizado el corrido (ver figura 10). Revisar capítulo 3. Electroforesis horizontal en gel de agarosa

Determinación de la reproducibilidad de la técnica de PCR anidada

16. Evaluar la reproducibilidad de la prueba mediante la ejecución de los proce-dimientos de PCR por dos operarios ajenos a la estandarización de este (29). Procesar un CN deH2O TI, cepas de H. pylori ATCC 43526, 51652 y BAA-1606 (cagA +) y 2 controles negativos (ADN de Klebsiella spp, Proteus spp.)


18. Visualizar con bromuro de etidio una vez finalizado el corrido.

RecomendacionesA. Descontaminar las superficies utilizadas para preparar y dispensar la master mix

en los tubos de reacción de PCR, mediante radiación ultravioleta antes y después del procedimiento (15 a 30 minutos). Si hay sospechas de contaminación, limpiar las superficies con una solución de 0,5-1,0 % de hipoclorito de sodio y remover posteriormente con etanol al 70% una vez finalizado el trabajo.

B. Es recomendable incorporar los siguientes controles negativos para tener un mejor manejo de los contaminantes:

Control de extracción: agua estéril libre de nucleasas; procesarla como una muestra biológica más durante la extracción de ácidos nucleicos. Se trabaja siempre al final de las muestras.

Control Negativo de Reactivos (CNR): dispensar el reactivo en un tubo de reacción mantener el tubo cerrado durante el resto del proceso. Luego, incubarlo en el termociclador y realizar la electroforesis. Esto permite chequear los reactivos que se están utilizando para la preparación de las mezclas de PCR. Aplican para la master mix y el agua.


62

Control Negativo del Manipulador (CNM): agregar agua en un microtubo en lugar del ácido nucleico, cada 3-4 muestras dispensadas, durante el proceso de carga de las muestras en la preparación de la PCR. Permite chequear la manipulación, por parte del operador, de las muestras con ácidos nucleicos.

Control de réplica: trabajar cada muestra utilizando réplicas (mínimo en triplicado) para descartar posibles falsos positivos, dada la alta sensibilidad de la técnica.

Por cada set de muestras que se procesa, se deben incluir en la misma tanda controles negativos y positivos. También se deben visualizar en el mismo corrido electroforético en el siguiente orden: Carril 1. MP; Carril 2. Control de master mix; Carril 3. Control de agua; Carril 4. CNM I; Carril 5. Línea de muestras, último carril. Control positivo. Los controles se deben montar en cada línea de muestras.

C. Si bien ambos métodos para preparar la master mix son válidos, se propone utilizar el producto comercial, puesto que ahorra tiempo en el pipeteado y se reduce el riesgo de contaminación por manipulación de los reactivos.

D. En la PCR anidada el segmento externo no es observado al usar 100 copias de ADN muestra. Se gana sensibilidad para detectar el segmento interno al hacer el segundo ciclo de amplificación de este segmento externo que no pudo ser observado en el primer ciclo de amplificación.

E. Se recomienda enviar a secuenciación los amplicones del gen ureA obtenido de las muestras para validar el método (Ver anexo 2. Figuras 13 y 14).

Figura 8. Corrido electroforético de fragmento interno de muestras de saliva. Carril 1. MP; Carril 2. CN; Carriles 3, 6-8. Fragmento interno de 120 pb muestras de saliva; Carril 4. Control negativo y master mix de agua; Carril 5. Control negativo bacteria; Carril 9. Control positivo de Helicobacter

pylori ATCC BAA-1606.


Guía Práctica

63

Figura 9. Corrido electroforético de PCR realizada a partir de muestras de ADN de distintos orígenes. Carril 1. MP; Carriles 2. CNR de master mix y agua; Carriles 3 y 4. Helicobacter pylori

ATCC BAA-1606; Carriles 5 y 6. Helicobacter pylori ATCC 51652; Carriles 7 y 8. Helicobacter pylori ATCC 43526; Carriles 9, 14 y 15. Mezcla de ADN de las bacterias Helicobacter pylori ATCC 43526, 51652 y BAA-1606; Carriles 10 y 11. Klebsiella pneumonie, Carriles 12 y 13. Proteus mirabilis.


Figura 10. Curva del límite de detección de la PCR anidada a partir de soluciones de ADN de cantidades conocidas. Carril 1. MP; Carril 2. CN; Carril 3. ADN 100 fg/ µL; Carril 4. 10 fg/µL; Carril

5. 5 fg/µL; Carril 6. 2.5 fg/µL; Carril 7. 1 fg/µL, concentración mínima detectable por la PCR.


CAPÍTULO 7

AMPLIFICACIÓN DEL GEN Cag A EN Helicobacter pylori MEDIANTE

PCR CONVENCIONALAnahí María Barros Martínez, Aracely García Cuan.

El hallazgo del gen cagA ha permitido clasificar cepas de Helicobacter pylori en cagA+ y cagA-. Esta clasificación es importante porque las cepas cagA+ son más virulentas y están asociadas a patologías graves como el cáncer gástrico. El gen cagA se encuentra en un segmento de ADN de 40 kb que se conoce como isla de patogenicidad, por lo tanto, es un biomarcador de virulencia y de la presencia de esta isla de patogenicidad en la cepa de Helicobacter pylori.

Palabras clave: cagA, isla de patogenicidad, cáncer gástrico, Helicobacter pylori.


66

ObjetivoDescribir las pautas para amplificar el gen Cag A, puesto que es un marcador de la patogenicidad de H. pylori.

DefinicionesCag A: gen con 3500 pb en asociado, asociado a citotoxina (cagA), está presente en el 50-70 % de las cepas de H. pylori. Es un marcador de la presencia de la isla genómica de patogenicidad (cag PAI) (30-32).

Materiales, insumos y equipos• Tubos de reacción de PCR de 200µL

• Puntas de micropipetas con filtro Gradillas

• GoTaq® G2 Green Master Mix (Master mix) agua ultrapura tipo I (H2O TI).

• Cebadores Forward (D008 F Invitrogen) y Reverse (R008 R, Invitrogen)12

• Muestra de ácido desoxirribonucleico (ADN)

• Control de negativo del manipulador (CNM)

• Control negativo (CN)

• Control negativo de reactivo (CNR)

• Control positivo (CP)

• Control negativo (CN) Pipetas

• Cabina de flujo laminar tipo II termociclador

• Vórtex

• Mini Centrífuga (Spin)

Procedimientos1. Dispensar en un tubo de reacción de 200 µL o tubo de centrífuga de 1,5 mL,

el agua, la y los cebadores Forward (D008 F) y Reverse (R008 R) para obtener una solución final 17,5 µL aproximadamente. Este paso se debe realizar dentro de la cabina de flujo; tener en cuenta la tabla 12:

12 Ver secuencias en anexo 1, tabla 14.

Guía Práctica

67

Tabla 12. Reactivos y concentraciones necesarios para preparar un tubo de reación del gen Cag A para PCR convencional.

Reactivos Concentración inicial Concentración finalCantidad por tomar (µL)


Cebador externo (Forward)

30 pm 1,0 pm 0,833

Cebador externo (Reverse)

30 pm 1,0 pm 0,833

ADN 103 102 2,5

Agua - 7,5 10,83



2. Dispensar la muestra de ADN (ver cantidad en la tabla 12) en el tubo de reacción. Este paso se debe realizar fuera de la cabina de flujo.

3. Colocar el tubo en el termociclador programado con los parámetros descritos en la tabla 13:

Tabla 13. Perfil de temperatura para PCR convencional del gen Cag A.

Etapa Temperatura °C Tiempo (minutos) Ciclos

Desnaturalización inicial

94 5


Hibridación 55 1

Extensión 72 1Regresar a

desnaturalización 35 ciclos






68

RecomendacionesA. Revisar las recomendaciones de los procedimientos de PCR en los capítulos 4

y 5, pues para este capítulo también aplican.

Figura 11. Corrido electroforético de fragmento Cag A en muestras de saliva. Carril 1. MP; Carril 2. CNM; Carril 3. CNR de Master Mix; Carril 4. CNR deH2O TI; Carril 5. CN; Carriles 6, 8-14. Muestras negativas; Carril 7. Muestra positiva para Cag A 282pb; Carril 15. Control positivo de Helicobacter

pylori ATCC BAA-1606 cagA + (282 pb).


CAPÍTULO 8

APLICACIÓN DE LA TÉCNICA DE PCR ANIDADA PARA DETECCIÓN DE Helicobacter pylori EN PLACAS

ARTERIOESCLERÓTICASFranklin Enrique Torres Jiménez.

Agentes infecciosos como Chlamydia pneumoniae, Helicobacter pylori, Citomegalovirus, entre otros, pueden generar respuestas inflamatorias proateroscleróticas, en particular las infecciones latentes o persistentes. Por tal motivo, en el presente capítulo describiremos las técnicas de extracción de ADN a partir de tejido adiposo humano, haciendo énfasis en el tejido aterosclerótico (ateromas), el cual es la principal causa subyacente de las enfermedades cardiovasculares (ECV), cerebral y periférico, aplicando la técnica de PCR anidada para la identificación de H. pylori.

Palabras clave: ateroma, enfermedades cardiovasculares, manifestación extragástrica, Helicobacter pylori, citoquinas proinflamatorias.


70

ObjetivoDeterminar la presencia de Helicobacter pylori en placas arterioescleróticas utilizado la técnica molecular de PCR anidada.

DefinicionesPlacas arterioescleróticas: conglomerado de células acompañadas de cristales de colesterol oxidado y otras moléculas, tipo lipoproteínas de baja densidad (LDL), que se acumulan en el endotelio vascular (38-40).

Helicobacter pylori en formas extragástricas: se ha documentado que H. pylori podría participar en otras enfermedades extradigestivas; por ejemplo: patologías hematológicas, cardiovasculares, dermatológicas y neurológicas (41). En lo concerniente a las ECV, se ha demostrado científicamente que la infección por H. pylori podría influir en el origen y desarrollo de aterosclerosis, enfermedad coronaria, síndrome coronario agudo, ictus cerebral y trombosis venosa profunda (42, 43). Ayada y Cols evidenciaron (en modelos animales) que la infección por H. pylori condiciona un ambiente proinflamatorio a nivel endotelial que favorece la oxidación de las LDL y en consecuencia la aterogénesis (43).

Materiales, insumos y equipos• Materiales, insumos y equipos descritos en el capítulo 1. Extracción de ADN

genómico

• Solución de formaldehído al 4 %

• Materiales e insumos descritos en el kit “PureGenome™ Tissue DNA Extraction Kit”:

– Tampón de lisis (TG)

– Tampón de prelavado (PW1)

– Tampón de lavado (GW2)

– Tampón de elución G (G)

– Tampón de digestión 2X (BD)

– Proteinasa K (PK)

– Tampón para proteinasa PR (PR)

• Materiales, insumos y equipos descritos en el capítulo 2. Cuantificación de ADN por espectrofotometría

Guía Práctica

71

• Materiales, insumos y equipos descritos en el capítulo 3. Electroforesis horizontal en gel de agarosa

• Materiales, insumos y equipos descritos en: capítulo 4. Preparación de control interno para PCR anidada y capítulo 5. Determinación de parámetros de desempeño de la PCR anidada para la amplificación del producto externo e interno del gen ureA en Helicobacter pylori.

Procedimiento

Recolección de muestra: tejido aterosclerótico humanoLas muestras de ateromas deben ser tomadas por profesionales expertos en cirugía cardiovascular y angiología, por medio de técnicas de endarterectomía y/o disección del vaso afectado según la patología subyacente en cada paciente. Luego, los especímenes se deben en sumergir en tubos de 15 ml de tapa rosca con formaldehído al 4 % (ver figuras 12 y 13), para su transporte y análisis en el laboratorio.

Observación: el procedimiento descrito a continuación corresponde al protocolo de extracción de ácido desoxirribonucleico (ADN) disponible en el inserto del Kit comercial”. Para ver insertos originales en inglés, remitirse a los enlaces de las páginas en línea descritas en las recomendaciones

EXTRACCIÓN DE ADNLisis celular

1. Depositar hasta 25 mg del tejido fresco o congelado en el tubo de microcentrí-fuga y agregar los siguientes reactivos: 95 µl de agua ultrapura tipo I (H2O TI), 95 μl de BD y 10 μl de PK.

2. Mezclar por inmersión y luego incubar el tubo a 55 °C de 1 a 3 horas.

3. Agregar 700 μl de TG al tubo y mezclar vigorosamente con vórtex. Luego, centri-fugar a 10.000 x g por un minuto para remover los residuos insolubles.

Unión del ADN

4. Transferir el sobrenadante a una columna en un tubo de colección y centrifugar a 10.000 x g durante un minuto.


72


5. Agregar 200 μl de PW1 a la columna en un nuevo tubo de recolección y centri-fugar a 10.000 x g por un minuto.

6. Agregar 400 μl de GW2 a la columna y centrifugar a 10.000 x g durante un minuto.

7. Transferir la columna de centrifugado a un tubo nuevo de microcentrífuga.

Elución del ADN

8. Agregar de ≥ 50 μl de tampón de elución de ADN o agua estéril (por ejemplo, agregar 200 μl si se toman muestras de 25 mg de tejido) a la columna de cen-trifugación. Incubar de 2 a 5 minutos a temperatura ambiente.

9. Centrifugar a la velocidad máxima (golpe de centrífuga) durante 30 segundos para eluir el ADN.

Nota: la elución del ADN de la columna depende del pH y la temperatura. Si se utiliza agua, se debe ajustar el pH a > 6,0. Para mejorar el rendimiento total, se recomienda calentar el G o el agua a 60-70 ºC antes de su uso, y/o realizar eluciones secuenciales.

Almacenamiento del ADN

10. Cuantificar la cantidad de ADN (ver capítulo 2. Cuantificación de ADN por es-pectrofotometría) y distribuir en alícuotas.


PCR anidada para detección de H. pylori

12. Diluir el ADN muestra a una concentración de 102 copias (ver apéndice 6. Cál-culos para preparación de soluciones de ADN).

13. Determinar la técnica la presencia de H. pylori en las muestras, mediante la técnica de PCR anidada, siguiendo las instrucciones de: capítulo 4. Preparación de control interno para PCR anidada y capítulo 5. Determinación de parámetros de desempeño de la PCR anidada para la amplificación del producto externo e interno del gen ureA en Helicobacter pylori.

14. Revelar los productos de la PCR siguiendo las instrucciones del capítulo 3. Elec-troforesis horizontal en gel de agarosa.

Guía Práctica

73

RecomendacionesA. La extracción de ADN a partir de tejido aterosclerótico es un proceso com-

plicado por el alto contenido lipídico procedente de la muestra. Por ello, se recomienda ser estrictos al ejecutar al procedimiento descrito en el inserto, adicionar la cantidad correcta del tampón de lisis, completar los tiempos y velocidades de centrifugación indicados, etc. Esto evitara lavados incorrectos que puedan favorecer la elución de sales junto al ácido nucleico y afectar los procesos posteriores de cuantificación y PCR.

B. Procurar disponer de insumos libre de desoxirribonucleasa (DNasas) para evitar la contaminación y no afectar la calidad final del ADN.

C. Es conveniente realizar con frecuencia limpieza de equipos (pipetas, centrífuga, etc.) y las superficies para disminuir el riesgo de contaminación por DNasas.

D. Si las aplicaciones posteriores son sensibles a trazas de ARN, se recomienda realizar una digestión adicional con ribonucleasas A (RNasas A).

E. Los rendimientos típicos descritos en el inserto del kit comercial son: de 1-3 μg de ADN por mg de tejidos esqueléticos, cardiacos y cerebrales, y de 3-5 μg de ADN por mg de tejidos de hígado, riñón y pulmón.

F. Leer los insertos originales en inglés del kit MERK MILLIPORE “PureGenome™ Tissue DNA Extraction Kit”, en: http://www.merckmillipore.com/CO/es/pro-duct/PureGenome-Tissue-DNA-Extraction-Kit,EMD_BIO-72635

Anotaciones finales• El presente capítulo forma parte de los productos de investigación del programa

“CT-I en enfermedades infecciosas en todo el Departamento del Atlántico”, financiado por el Sistema General de Regalías. En especial forma parte de los esfuerzos en investigación del trabajo titulado “Identificación de la carga infecciosa, cuantificación de citoquinas proinflamatorias y caracterización de lesiones ateroscleróticas en pacientes que acuden al servicio de cirugía cardiovascular pertenecientes a la red hospitalaria del dpto. del Atlántico 2016-2017”.


74

Figura 12. Ateroma obtenido de arteria carótida interna. Se evidencia la forma tubular que adquie-re el tejido durante su desarrollo intravascular.

Fuente: Datos de proyecto.

Figura 13. Ateroma obtenido a partir de la arteria coronaria derecha.


Guía Práctica

75

Figura 14. Corrido electroforético de PCR realizada a partir de muestras de ADN extraídas de placas de ateroma, obtenidas de pacientes con diversas ECV. Carril 1. MP; Carril 2. Control negativo

(CN); Carriles 3-4 y 6-8. Helicobacter pylori negativo; Carril 5. CP; Carril 9. MP; Carriles 10-14. Helicobacter pylori negativo; Carril 15. Helicobacter pylori positivo. Paciente masculino de 61 años, con diagnóstico de dislipidemia, revascularización coronaria (bypass coronario) hace 16 años. Pa-

ciente hipertenso, con índice de masa corporal normal, sin diabetes, no alcohol, no tabaco. El tejido aterosclerótico fue obtenido a partir de arteria coronaria derecha.



76

Apéndice 1. Recomendaciones previas para preparar

medios de cultivo y soluciones

✓ Leer las instrucciones específicas en las etiquetas o insertos de cada reactivo comercial antes de su utilización en algún ensayo, con el fin de tener en cuen-ta las precauciones necesarias en relación con su almacenamiento, transpor-te, uso, fecha de vencimiento, etc.

✓ Utilizar una balanza analítica si la cantidad de un producto a pesar en menor a 0,1 g.

✓ Ajustar el pH de una solución de ser necesario. Realizar la calibración del pH metro con soluciones tampones frescas, siguiendo las instrucciones del fabricante del equipo.

✓ Limpiar cuidadosamente los recipientes de vidrio o plásticos que se usarán para biología molecular. Tubos sucios, contaminación bacteriana y residuos de detergentes pueden inhibir reacciones o degradar el ácido nucleico. Los reci-pientes de vidrio deberán ser enjuagados con agua destilada y esterilizados a 150 °C durante 1 hora.

✓ Esterilizar las puntas de micropipetas y tubos de microcentrífuga a 121 °C a 15 lb de presión mínimo durante 15 minutos.

✓ Las soluciones tampón fosfato salino (PBS), duodecilsulfato sódico (SDS), isopropanol y etanol deben ser almacenadas en refrigeración. Además, el iso-propanol debe guardarse en un recipiente ámbar o en su defecto ser forrado con papel Kraft para proteger el contenido de la exposición a la luz. La lisozi-ma se debe almacenar entre 2 a 8 °C. Las soluciones de NaCl, el tampón de lisis y el SDS se deben almacenar a temperatura ambiente (18-25 °C), pues a temperaturas más bajas puede causar precipitación de las sales.

Apéndice 2. Preparación de medios de cultivo

Caldo Mueller Hinton

✓ Infusión de carne 300 g/L

✓ Peptona ácida de caseína 17,5 g/L

Guía Práctica

77

✓ Almidón 1,5 g/L

✓ pH 7,3 ± 0,2

Esterilizar a 121 °C y 15 lb de presión durante 15 minutos.

Caldo infusión de cerebro corazón

✓ Infusión cerebro y corazón de (sólidos) 8,0 g/L

✓ Digerido péptico de tejido animal 5,0 g/L

✓ Digerido pancreático de caseína 16,0 g/L

✓ Cloruro sódico 5,0 g/L

✓ Glucosa 2,0 g

✓ Fosfato disódico de hidrógeno 13,5 g/L

✓ Agar 13,5 g/L

✓ pH 7,4 ± 0,2

Esterilizar a 121 °C y 15 lb de presión durante 15 minutos.

Apéndice 3. Cálculos para preparar soluciones

Soluciones molares

Una solución molar es aquella que contiene en 1 L de solución el número de gra-mos equivalentes al peso molecular de una sustancia deseada. Por ejemplo, para preparar 250 mL de cloruro de sodio (NaCl) al 5M:

Primero, se debe determinar la masa molar de la molécula, que resulta de la suma-toria del peso atómico de los átomos que hacen parte de ella y se expresa en g/mol, así

Elemento Peso atómico Átomos

Na (Sodio) 22,98976928 1

Cl (Cloro) 35,453 1

Masa molar /g/mol) 58,4428


78

Segundo, determinar cuántas moles de soluto se debe agregar a los 250 mL de la solución de NaCl:

5 moles 1000 mL

X 250 mL

Tercero, determinar la equivalencia de 1,25 moles de NaCl en g:

58,4428 g de NaCl 1 mol de NaCl

Así, para preparar 250 mL de solución de NaCl al 5M, se deben agregar 73,05g de NaCl a 250 mL de agua destilada.

Soluciones porcentualesUna solución porcentual es aquella cuya medida corresponde a la cantidad de mililitros (v/v) o gramos (p/v) por cada 100 mL de la solución total; de este modo, una solución de cualquier sustancia al 30% contendrá 30 g o 30 mL de solución aforados a 100 mL del solvente. Por ejemplo, para preparar 250 mL de dodecilsul-fato sódico (SDS) al 10% se realizan los siguientes cálculos:

10 g de SDS 100 mL de agua destilada

x 250 mL de agua destilada

El valor final se multiplica por 100% para que pueda ser expresado en porcentaje (25%).

Guía Práctica

79

Observación: una vez pesada la cantidad del reactivo, agregar al recipiente con H2O TI y, luego, aforar hasta 250 mL. No adicionar a 250 mL los 25 g de la sustancia, pues de este modo se obtendría una solución a una concentración diferente.

Apéndice 4. Preparación de soluciones para procedimientos

de biología molecular

Agarosa al 1%

(Para preparar 50 mL)

1. Pesar 0,5 g de agarosa y depositar en un beaker.

2. Aforar hasta 50 mL con tampón de corrido Tris/acetato/EDTA (TAE) o Tris/borato/EDTA (TBE) al 1X.

3. Calentar en termoagitador o en microondas hasta clarificar la solución.

Tampón TAE a 50X


1. Pesar los siguientes reactivos: 121 g de Tris base, 9,30 g de EDTA.

2. Disolver en 375 mL de agua destilada en un frasco Scott.

3. Agregar 28,55 mL de ácido acético glacial.

Tampón TBE a 10X

(Para preparar 1 Litro)

1. Disolver con agitador en 800 mL de agua destilada los siguientes reactivos: 108 g de Tris base, 55 g de ácido bórico.

2. Adicionar 40 mL de EDTA a 0,5 M (o 9,3 g de EDTA).

3. Aforar a 1L.

4. Ajustar pH a 8,3.

5. Almacenar a temperatura ambiente.

Nota: El tampón TBE toma tiempo para disolver. En caso de que se formase algún precipitado, la solución puede resuspenderse calentándola a 37 °C.


80

Tampón de lisis

1. Pesar los siguientes reactivos: 50 mM Tris, 50 mM de EDTA, 50 mM de sucrosa, 100 mM de cloruro de sodio (NaCl) y dodecilsulfato sódico (SDS) al 1%.

2. Diluir en agua destilada.

3. Esterilizar en autoclave a 121 °C a 15 lb de presión.

Tampón fosfato salino (PBS)

1. Pesar los siguientes reactivos: 8 g de NaCl, 0,2 g de KCl2, 0,1 g de cloruro de magnesio (MgCl2), 0,24 g fosfato de potasio monobásico (KH2PO4) y 1,44 g fosfato disódico (Na2HPO4).

2. Diluir el Na2HPO4 en 100 mL de agua.

3. Calentar en termoagitador a 150°C hasta disolver completamente.

4. Agregar 500 mL de agua en otro frasco Scott.

5. Adicionar las sales restantes.

6. Dejar calentar en un termoagitador hasta disolver.

7. Aforar con 500 mL de agua destilada.

8. Esterilizar en autoclave a 121 °C a 15 lb de presión.

Estabilización del fenol


1. Dejar reposar el fenol a temperatura ambiente y calentar hasta 68 °C.

2. Agregar 50 mL de Tris (0,5 M pH 8,0) y agitar 15 minutos con barra magnética hasta separación de fases.

3. Retirar toda la fase acuosa posible.

4. Agregar 50 mL de 0,1 M tris (0,1 M, pH 8,0) y agitar 15 minutos.

5. Remover la fase acuosa.

6. Repetir la extracción con 50 mL de tris (0,1 M, pH 8,0), hasta que el pH de la fase fenólica sea de 7,8 o mayor.

Guía Práctica

81

7. Se agrega 0,1 volúmenes de tris-HCl (0,1 M, pH 8,0) con 0,2% de beta-mer-captoetanol.

Nota: Se recomienda realizar este procedimiento en campana de extracción y es obligatorio el uso de guantes, bata y tapabocas. A 4 °C su vida útil puede durar 1 mes.

Fenol: Cloroformo: Alcohol isoamílico

1. Mezclar el fenol equilibrado, cloroformo y alcohol isoamílico en la proporción 25:24:1.

Apéndice 5. Preparación de los reactivos comerciales

Para los kits de extracción “ISOLATE II Blood DNA Kit” y “ISOLATE II Genomic DNA Kit”

1. Adicionar etanol (96-100%) al tampón de lavado GW2: 24 mL para el kit de 10 muestras, 48 mL para el de 50 muestras y 200 mL (por cada frasco) para el de 250 muestras.

2. Adicionar el tampón para proteinasa (PR) al vial de la Proteinasa K (PK) liofili-zada: 260 µL para un kit de 10 muestras, 1,35 mL para un kit de 50 muestras y 3,35 mL (por cada vial) para un kit de preparación de 250 muestras. Tener en cuenta que la PK es viable a -20 °C por hasta 6 meses.

3. Calentar el G a 70 °C.

Proteinasa K Promega (Catalogo: V3021)

1. Reconstituir en 50mM Tris-HCl (pH 8,0), 10mM CaCl2.

2. Preparar alícuotas y almacenar a -20 °C. En estas condiciones su vida útil pue-de durar de 2-3 meses.

Nota: Se sugiere leer detalladamente el inserto del producto en https://worldwide.promega.com/products/massspectrometry/protease s-and-surfactants/proteina-se-k-_lyophilized_/?catNum=V3021.

Evitar múltiples ciclos de congelación-descongelación o exposición a cambios fre-cuentes de temperatura. Estas fluctuaciones pueden alterar en gran medida la esta-bilidad del producto. Para ello se sugiere hacer alícuotas.


82

Apéndice 6. Cálculos para preparación de soluciones de ADN

Diluciones para límite de detección de la técnica

Se describen a continuación ejemplos para calcular y preparar las diluciones de ácido desoxirribonucleico (ADN); por ejemplo: si la concentración inicial de ADN en el tubo es de 73,8 ng/µL, se deben tomar a partir de ella 10 µL y llevar a un vial con 990 µL de H2O TI para un total de 1000 µL de la solución con una concentración de 0,73 pg/µL, lo que equivale a 730 fg/mL.

Ejemplo:

V1: ¿?; Volumen de la solución de ADN inicial

C1: 730 fg/ µl; Concentración de la solución de ADN inicial

C2: 100 fg/ µl; Concentración de la solución de ADN final

V2: 1000 µl; Volumen de la solución de ADN final

100 x 1000730

=137 μl de la solución de ADN inicial

completar con 862 ul de agua ultrapura Tipo I (H2O TI) =1000 μl a 100 fg/μl

Posterior a la obtención de la dilución se requiere obtener un vial de 100 µL con ADN una concentración de 10 fg/µL, el cual se obtiene de la siguiente manera:


C1: 100 fg/µl; Concentración de la solución de ADN inicial

C2: 10 fg/µl; Concentración de la solución de ADN final


100 x 1000100


completar con 900 ul de H2O TI =1000 μl a 10 fg/μl

Guía Práctica

83

Posterior a la obtención de la dilución se requiere obtener un vial de 100 µL con ADN una concentración de 5 fg/µL, el cual se obtiene de la siguiente manera:



C2: 5 fg/µl; Concentración de la solución de ADN final


5 x10010


completar con 950 de H2O TI =1000 μl a 5 fg/μl

Posterior a la obtención de la dilución se requiere obtener un vial de 100 µL con ADN una concentración de 2,5 fg/µL, el cual se obtiene de la siguiente manera:



C2: 2.5 fg/µl; Concentración de la solución de ADN final


2,5 x 10005


completar con 500 de H2O TI =1000 μl a 2,5 fg/μl

Posterior a la obtención de la dilución se requiere obtener un vial de 50 µL con ADN una concentración de 1,0 fg/µL, el cual se obtiene de la siguiente manera:


C1: 2.5 fg/µl; Concentración de la solución de ADN inicial

C2: 1.0 fg/µl; Concentración de la solución de ADN final



84

1,0 x 10002,5


completar con 950 ul H2O TI =1000 μl a 1,5 fg/μl

Preparación de solución del fago M13mp19

2.1 Para preparar el control interno se puede utilizar como plantilla el ADN del fago M13mp19 marca SIGMA REF: D4404 y lote 013H6734. El reactivo está a una concentración inicial de 10 µg/20 mL de solución y, por tanto, 0,5 µg/µL. Para obtener una solución del fago a 0,1 ng/µL, se sugiere preparar una solución de una concentración intermedia a 10 ng/µL, así:

2.1.1 Solución intermedia del fago

1 ug 1000 ng

0,5 ug 500 ng


C1: 500 ng/µl; Concentración de la solución de ADN inicial

C2: 10 ng/µl; Concentración de la solución de ADN final


10 x 500 μL500 ng/μl =10 μL de la solución madre del fago

completar con 490 ul de H2O TI =1000 μl a 10 ng/μL del fago

ngμl

2.1.2 Solución final del fago


C1: 10 ng/µl; Concentración de la solución de ADN inicial

C2: 0.1 ng/µl; Concentración de la solución de ADN final


Completar con de H2O TI = 1000 µl a 0,1 ng/µl

Guía Práctica

85

Obtención de soluciones de ADN A 100 copias (Cálculos para CI)

3.1 Para obtener una solución de ADN a 100 copias se debe preparar una solución inicial de 106 copias a partir de la cual se preparan las diluciones siguientes. Supóngase, que la concentración de ADN del Control Interno (CI) en un tubo es de 28,1 ng/μl, los datos serían los siguientes:

Concentración Inicial estimada del CI 28,1 ng/μl

Peso de CI 144 pb

Peso de 1 pb 650 g/mol

Concentración copias final 1x106

Número de Avogadro 6,02 x 1023 mol

Volumen ADN de CI para master mix 2.55 µl

3.2 Se calcula el peso de 106 copias de ADN

Peso de la molecula = (1 x 106) x (144 pb ) x (650g/mol) 6. 02 x 1023

= 1, 55 x10 -3g

3.3 Calcular en picogramos (pg)

1g 1 X 1012 pg 1,55 X 10-13 g ¿?

(1,55 X 10−13 g) x (1012) = 1,55 X 10-1 pg

1,55 X 10-1 pg ÷ 2,55 μl (Volumen ADN de CI que se adiciona a la master mix) = 0,062 pg/μl

3.4 Diluir el ADN del CI a una proporción 1:1000 y pasar la unidad ng a pg

Concentración inicial: 28,1 ng/μl Concentración diluida: 0,0281 ng/μl

ng 1000 pg

(0,0281μl) x 1000 = 28,1 pg/μl

3.5 Cálculo y preparación de la solución de ADN a 106 copias


C1: 28.1 pg/µl; Concentración de la solución de ADN inicial

C2: 0.062 pg/µl; Concentración de la solución de ADN final



86

0,062 pg x1000 μl

28,1 pg = 220 μl de la solución de ADN

completar con 997,7 ul de H2O TI =1000 μl de solución de 106 copias

3.6 Hacer las diluciones (a partir de la solución a 106/ 1.000.000 copias de ADN)

A. 10 μl (ADN 106 copias) + 90 μl H2O TI 105/100.000 copias.

B. 10 μl (ADN 105 copias) + 90 μl H2O TI 104/10.000 copias.

C. 10 μl (ADN 104 copias) + 90 μl H2O TI 10³/1.000 copias.

D. 10 μl (ADN 10³ copias) + 90 μl H2O TI 10²/100 copias.

E. 10 μl (ADN 10² copias) + 90 μl H2O TI 10¹/100 copias.

F. CN de H2O

3.7 Verificar diluciones mediante corrido electroforético. Correr los productos en gel de agarosa al 3,5 % (preparada en tampón TBE al 0,5X), tampón de corrido TBE al 1X, 90 voltios, 110 miliamperios y 50 minutos. Visualizar con bromuro de eti-dio una vez finalizado el corrido (ver figura 15). Revisar capítulo 3. Electroforesis horizontal en gel de agarosa.

Figura 15. Verificación de ADN CI. Carril 1. Marcador de peso (MP); Carril 2. ADN CI 10 copias; Carril 3. AND CIU 102 copias; Carril 4. ADN CI 10³ copias; Carril 5. ADN CI 104 copias; Carril 6. ADN

CI 105 copias; Carril 7. ADN CI 106 copias.


Guía Práctica

87

ANEXO 1. Secuencias de nucleótidos

de los cebadores

Tabla 14. Oligonucleótidos seleccionados para la estandarización de la prueba de PCR anidada para la detección de H. pylori.

Nombre Secuencia de Nucleótidos, 5’ A 3’ Blanco Bibliografía

HpF1 GATAAGTTGATGCTCCACTACGCTG F: Gen ureA seg. externo (32)

HpB25 CTCAATAGGGGTATGCACGGTTAC R: Gen ureA seg. externo (32)

HpF2 AAGCAGTAGCTTTGATTAGTGCCC F: Gen ureA seg. interno (32)

HpB5 CGCCATCCATCACATCATCTG R: Gen ureA seg. Interno (32)

CIHP F GATAAGTTGATGCTCCACTACGCTGGGCGGTTTGCGTATHpF1 + iniciadores del

fago M13mp19(33-34)

CIHP R CTCAATAGGGGTATGCACGGTTACTCTCTCAGGGCCAGGHpB2 + iniciadores del

fago M13mp19(33-34)

D008 F ATAATGCTAAATTAGACAACTTGACGA F: Gen CagA (35-37)

R008 R TTAGAATAATCAACAAACATCACGCAT R: Gen CagA (35-37)



88

ANEXO 2. Secuenciación de fragmento interno

PRIMERS: HpF2 y HpB5.

CON SENTIDO: 5´ a 3´

AANNNNNNNNNNNNNGCGNGNGCTGGTAAAAGACTGCGGCTGAATTG

ATCGCAAGAAGGGCGCACTCTTTTAAAACCAGANGNGGGGANGGATGG

CGAGGNAGATGATCCATGAAGTGGGAAANGAAGAGATGTTTCCTGATG

GGACCAAACTCGTAACCGTGCATACCCCTATTGAGAGAAAAAAGCATTT

TTTCTCAAAAAATGTCATTCCATGTCCCCCCCATAATTAGGGATTTTTTC

GTTCAACTTTAGAGGGGCAAAAAAAGCCCGGGGGGAGAGACCCGCCC

CCTACATTTTTTTTTCCGCCCGATCCTTTTACTCAACTCACCTAAAATAT

CAAAGGAACTTCTTCGTGTTTTATGACTTTGTTCAGTACAGCGGCGCGA

AGAAGCCCACCCCCTTTTTTTTGTTGAAGTCCCTTTCTCCCCCC

RESULTADO BLAST: 100% Helicobacter pylori

Guía Práctica

89

ANTISENTIDO: 3´ a 5´

TGNNNNNNNTTTTAANTNCTNCCTNTGCCTCNATTCAGCCGCAGTCTTT

TTACCAGCTCTCGCTTCTTCCATAATATGGGCNNNAATNAAAGCTACTG

CTTANGNGGGCGGGAGGCCCCCCTAANGANGGGACGAANGAGCAGAG

AGCAGAGCAGGAGCGAGGAGGGAGGACCGGCCCCCTTTCAGTGGTGT

CTAAAGTGAAAATGCGGNAGAGTGAAGAACACGGAGATANGGACGCTG

TAGAAGTGTGGGGGGAGNTTATTGTTAGTGTTGTTGTTTTGTTTGTTNA

ACCTTTGGGTGGCGGCCGGTCCGGCCCCGCCCCTCCCCGGGAGGGA

GNGNTGCCCCGGAGCANNCGCATCCAGTGAAAGGGGCAGGGGGGGT

ATAAACCGCGGTTATTTTTTTTTGCAGGGGGGGCGCTCCGTGGTGGGG

GGGGGGAAACCCCCCCCCCCGCAGACTGGNATATAAGACATTGCACC

ACCGCACGCGACAGGCAGAGTTGAAAACACGGGGGCATGGCCCGCG

TGTATCTTTTTCTATTAAACTCTTCTTAGACAAACTNATATTGGATTGTGTC

CCGCGCGCAGTTTTCTCGTTGTGCGTGAGGACTGGATAGGGGGTGGT

CACTGTGGCTATCAG

RESULTADO BLAST: 100% Helicobacter pylori. De 104 cepas de Helicobacter sp. identificadas, una (1) es Helicobacter acinonychis quien convive con H.pylori y adquiere segmentos del genoma vecino. Dailidiene, Daiva. 2004.

NOTA: Tomado formato fasta.


90

Figu

ra 1

6. C

rom

atog

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ecue

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ción

del

frag

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to in

tern

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ylor

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Guía Práctica

91

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