Determinación de leghemoglobina
BIOGEOQUÍMICA
BIOQUÍMICA, FACULTAD DE FARMACIA Y BIOQUÍMCIA-UBA
DRA. MARÍA FLORENCIA IANNONE
2014
Desarrollo de la clase
1- Introducción teórica2- Explicación del protocolo a desarrollar3- Hacer extractos vegetales4- Centrifugación de extractos- Cálculos para
concentración de curva de calibración5- Discusión de paper (Durante el calentamiento
con ácido oxálico) 6- Espectrofluorómetro7- Análisis de resultados8- Informe individual
Ciclo del nitrógeno
Planta de soja infectada por Bradyrhizobium japonicum.
Interacción selectiva entre especie de Rhizobium y planta leguminosa a infectar
Objetivo del TP
Determinar el contenido de leg-hemoglobina en
nódulos de plantas de soja sometidas a estrés
salino y de esta manera, evaluar la fijación de N2.
Material vegetalPlantas de Soja de 45 días de crecimiento
Inoculadas con un cultivo líquido (medio de cultivo basal de extracto de
levadura-MBL) de Bradyrhizobium japonicum 10 8 bacterias/ml
Inóculo
Regadas con N
NO3- y NH4
+
Refuerzo de inóculo
Regadas sin N 200 mM NaCl.Sin N
0 7 35 45 días
Cosecha
Observaciones a realizar
• Planta entera: diferencias fenotípicas
• Nódulos: morfología
• Interior de nódulos: color rojo (presencia de Leg-Hb)
Pesar 0,5g de nódulo y agregar 5ml de Solución A
¿Qué contiene dicha solución?
¿Por qué creen que se realiza el extracto con esa solución?
• Centrifugar 15000 rpm durante 20 min
• 40 µl de sobrenadante lo llevan a 200µl con
solución A + 2ml de ácido oxálico
TRIPLICADO
2 tubos (olla a presión 0.75 atm, 40 min)
1 tubo (temperatura ambiente)
2 curvas de calibración Temp amb.
Olla a presión
Estándar: Hemoglobina
¿Por qué creen que los tubos que dejan a temperatura ambiente son los blancos?
Determinación de Leg-hemoglobina se
fundamenta en la técnica descripta por:
LaRue y Child (1979)
Producto fluorescente estableLegHb
Ác oxálico + calor
Hierro
¿Es una técnica selectiva?
Si debido a que casi todas las
hemoproteínas solubles en el nódulo son Leg-Hb
• Medición en el espectrofluorómetro a λexcitación 405nm y
λemisión 650nm
• Cálculos de concentración de legHb.
• Expresión de los resultados como mg de LegHb/g PF de
nódulo
• Nos juntamos a discutir los resultados obtenidos
• Finalmente, realizaran el informe individual
¿Dudas?
Bibliografía
Guía de Trabajos Prácticos de Biogeoquímica, Cátedra de Química Biológica Vegetal, Facultad de Farmacia y Bioquímica-UBA (2014).
Bothe H, Ferguson SJ y Newton WE (2007). Biology of the Nitrogen Cycle, ISBN:978-0-444-52857-5.
Udvardi M y Poole PS (2013) Transport and Metabolism in Legume-Rhizobia Symbioses. Annu. Rev. Plant Biol. 64:781–805.
Xu G, Fan X y Miller AJ (2012) Plant Nitrogen Assimilation and Use Efficiency. Annu. Rev. Plant Biol. 63:153–182.
Oldroyd GED y Downie JA (2008) Coordinating Nodule Morphogenesis with Rhizobial Infection in Legumes. Annu. Rev. Plant Biol. 59:519–546.
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