DIAGNOSTICO MOLECULAR DE LA INFECCIÓN POR HPVNUEVAS TECNOLOGIAS DETECCIÓN HPV
Juan José Terrádez RaroAnatomía PatológicaH. Arnau de Vilanova
BASES MOLECULARES DEL CANCERAPLICACIÓN A LA PATOLOGIA TUMORALHospital Luis AlcanyísXATIVA. Valencia
Situación de la detección precoz en EUROPASituación de la detección precoz en EUROPA1959 ( Ostfold County,Norway )1960 ( Región de Grampian. Scotland)1963 Programas de cribado organizado en países nórdicos: Finlandia, Islandia y Suecia No se introduce en Noruega Éxito del Programa Finlandés: Cribado a mujeres de 30-60 años Pauta: Cada 5 años. Suecia: Valoración de la eficacia del cribado basado en el análisis de lesiones preinvasivas.1965: Programa de cribado organizado en Paises Bajos (BENELUX) 1980: Programa de cribado organizado en una provincia de Dinamarca1980/ 1989: Programa de cribado organizado en InglaterraAustria, Alemania y Luxemburgo en año 2000. Tendencia ineficaz de sus cribados1990: “ European commission, “ Europe Aganist cancer”. Red Europea de cribado Grupo de Epidemiología de la Red E. de cribado CC. VARIABILIDAD entre los Pr. De Cribado: Organización/Aplicación Metodología de Cribado2008 España: Cribado oportunista Evaluación / Manejo clínico1993: European Commision´s Quality Assurance Guidelines for CC screening 1995-2005 Numerosos Estudios multicéntricos y Planes Pilotos con N.Tecnologías
Miller AB. The inefficiency of cervical screening in Europe. European J Cancer 2002;38:321-326A.Linos, E.Ariza. Introduction Cervical Cancer Screening. European J of Cancer 36 (2000) 2175-2176
Recomendación
Límites de edad(años)
Intervalo
(años)
% con detección selectiva regular
Mortalidad del cáncer de cuello
uterino/100.0004
Incidencia de cáncer de cuello
uterino/ 100.0004
Bélgica1 25-64 3 58 3,4 9,3
Dinamarca2 23-59 3 75 5,0 12,6
Inglaterra2 20-64 3 a 5 83 3,1 8,3
Finlandia2 30-60 5 93 1,8 4,3
Francia2 25-65 3 69 3,1 9,8
Alemania2 20-85 1 50 3,8 10,8
Italia2 25-64 3 53-74 2,2 8,1
Países Bajos2 30-60 5 77 2,3 7,3
España2, 3 20-64 3 a 5 49,6 2,2 7,6
Suecia2 23-60 3 83 3,1 8,2
*Grupo de edad 0->651- Van Ballegooijen y cols. Eur J. Cancer. 2000; 36: 2177-2188. 2- Anttila y cols. Brit. J. Cancer. 2004; 91: 935-941. 3- Luengo Matos y cols. Aten Primaria. 2004; 33(5):229-36. 4- Ferlay J y cols. GLOBOCAN 20023- Quinn et al. BMJ 1999; 318: 904-908
A pesar del cribado, el cáncer de cuello A pesar del cribado, el cáncer de cuello uterino sigue siendo demasiado frecuenteuterino sigue siendo demasiado frecuente
Segundo cáncer en frecuencia Segundo cáncer en frecuencia en mujeres jóvenes europeasen mujeres jóvenes europeas
UE, mujeres (edad 15–49)
Casos nuevos de cáncer cada año: 106,906Cuello uterino
Mama
Melanoma cutáneo
Ovario
Colon/Recto
Enfermedad de Hodgkin
Tiroides
SNC cerebro
Linfoma no hodgkiniano
Estómgao
Leucemia
Cuerpo uterino
Pulmón
Otros cánceres
1. Ferlay y cols., editores. Globocan 2000: Cancer incidence, mortality and prevalence worldwide, version 1.0 IARC Cancer-Base No.5. Lyon. IARC Press, 2001
Impacto del VPH y SIL en España (1996-2000)Impacto del VPH y SIL en España (1996-2000)
MUJERES (1)
(15 - 74 años) 15.640.00015.640.000
VPH + (2) 655.000655.000
ASCUS/LSIL (2) 497.000497.000
HSIL (3)
16.00016.000
Cáncerinvasor (1)
2.0002.000
(1) Estimación basada en Globocan 2000.(2) Estimación basada en estudios de población general estratificados por edad en 2 áreas urbanas de Cataluña (rango: 2-7%).(3) Estimación de un 0.1% de prevalencia de HSIL basado en (2)
Cerca de 1000 muertes/ año 2008
ESTUDIO AFRODITA 2007ESTUDIO AFRODITA 2007Informe sobre la situación de la Patología Cervical en España Informe sobre la situación de la Patología Cervical en España
Encuesta poblacional6852 mujeres (18-65)19 C. Autónomas
XVII Reunión AEPCDr. J. CastellseguéServ. EpidemiologiaI.C.O. 2006.
Análisis de cobertura en dif. Comunidades Autónomas (58%-85%)
51% no saben ¿HPV?38% conocen su existencia
25% no PAP en su vida
• Cribado oportunista poco eficiente / NO equitativo Ausencia de un cribado poblacional organizado
• Diferencias respecto de la frecuencia de realización de la toma
Sanjose S et al. Eur J Obstet Gynecol and Reprod Biol 2008, May 20Puig Tintoré LM; J Low Genit Tract Dis 2008; 12:82-9
Mortalidad por Cáncer de Cérvix en España Mortalidad por Cáncer de Cérvix en España (1975-2004) (1975-2004) Tasas ajustadas por edad ( Pobl. Europea)Tasas ajustadas por edad ( Pobl. Europea)
Hitos en el Screening del Cáncer Hitos en el Screening del Cáncer de Cérvixde Cérvix
ThinPrep® SurePath®
1996 19991949
LBC: Citología líquida
2003
Revisión de las pautas de screening
1990s LBC 2000sTest de Papanicolau
VHP– 99,7% Cánceres de Cérvix1
1Walboomers et al., Journal of Pathology 189:12-19,1999 ( Modificado )
PCR
1980
P16 CINTecCervatec p16 ELISA
L1Ag CytoactivONCOTEC mRNA E6/E7Screening 1º basado en
DNA HPV
HC-2 / H VentanaAmplicor* RocheDNA Invader* WD
2008PREVENCION PRIMARIA
ESCENARIO POSTVACUNAL
Prevención SecundariaProg. Base PoblacionalFinlandia 1963-2008
Meisels and Fortin 1976Purola and Savia 1977Coilocito / Efecto citopatico HPV
Dürst et al. 1983
Filogenia
Chan et al., J Virology, 69:3074-83 (1995)
31
1635
4518
39
116
33VP Humanos (mucosa genital)
Beta HPV
VP Animales
VP Humanos (cutaneos)
Alfa HPV
HPV Prevalence and Cervical Cancer HPV Prevalence and Cervical Cancer Incidence by AgeIncidence by Age
15-19
20-24
25-29
30-34
35-39
40-44
45-49
50-54
55-59
60-65
Age (Years)
HP
V P
reva
len
ce (
%)
HPV (HC2)HPV (HC2)
CancerCancer
1. Sellors JW, et al. CMAJ, 2000;163:503. Ries, et al. 2000 SEER Cancer Stats NCI, 1973-1997. Sellors JW, et al. CMAJ, 2002;167:871.
0
5
10
15
20
25
30
0
5
10
15
20
25
30
Can
cer
inci
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00,0
00
Historia natural de la Infección por HPVHistoria natural de la Infección por HPV
• La infección por HPV-HR produce una lesión morfológíca con fuerte tendencia a la regresión y muy baja a la progresión ( Moscicki 2004; Castle 2005)
• La resolución de la infección confiere inmunidad.
• Una inf. posterior por el mismo genotipo debe atribuirse a una reactivación de una infección latente lo que podría explicar el aumento de prevalencia observado en mujeres mayores de 60 años ( Silvia de Sanjosé 2006)
• En el proceso de carcinogénesis los eventos moleculares no se correlacionan con las categorias morfológicas. ( Gran variabilidad interobservador del CIN II)
• La probabilidad de que un HSIL regrese a LSIL es 3 veces mayor de que suceda lo• contrario. (Cantor et al 2005)
• Pueden aparecer lesiones de alto grado en ausencia de LSIL. (Schiffman et al 2005)
• La carcinogenesis precisa de una infección persistente Inf. 7-15 a. CIN III 10 a. C. E. I. ( Bosch y Sanjose , 2003)
Historia natural de la Infección por HPVHistoria natural de la Infección por HPV
Sylvia MichelinaFernandes Brenna; Kari Juhani SyrjänenSao Paulo Med. J. vol.121 no.3 Sao Paulo 2003• Sobreexpresión de E5,E6 y E7
• Alteración en los oncogenes y genes supresores de la célula infectada: Alt. Genéticas: Pérdidas en 3p,6q,10p,11p,13q y 18q Ganancias en 3q,7q,8q,9q y 20q Alteraciones estructurales en 10,18 y 20. (Cottage et al 2001)
Oncogenes: Gen del EGFR, c-myc, neu/c-erB2, MDM2 y Ras Genes supresores: CDH1, DAPK,FHIT,HIC-1,p16,RAR-beta,RASSFIA,TIMP-2 TSLC1. Hipermetilación de genes supresores entre el 20-40% de CEI (Steeenbergen et al 2005)
• Activación de la telomerasa: subunidad catalítica hTERT. (Snijders et al 1998)
World Health Organization Classification World Health Organization Classification
Nuestro problema: Lesión escamosa atípicaNuestro problema: Lesión escamosa atípica
Metaplasia transicionalMetaplasia transicional
METAPLASIA ESCAMOSA INMADURA ATÍPICA: METAPLASIA ESCAMOSA INMADURA ATÍPICA: Grupo heterogéneo cuyo aspecto morfológico Grupo heterogéneo cuyo aspecto morfológico
no se correlaciona con el estatus de expresión de HPV no se correlaciona con el estatus de expresión de HPV
Metaplasia papilar inmaduraMetaplasia papilar inmadura
ATIPIA ESCAMOSA EN POSTMENOPAUSIA ATIPIA ESCAMOSA EN POSTMENOPAUSIA Espectro de lesiones que incluye cambios psedocoilocíticos Espectro de lesiones que incluye cambios psedocoilocíticos
Diagnóstico diferencial con SILDiagnóstico diferencial con SIL
EL PAPILOMAVIRUS
EL VIRUS: ORGANIZACIÓN GENÓMICA
• Consta de varios genes u “Open Reading Frames” (ORF) de dos tipos diferentes:
• Hasta 8 genes de expresión temprana o “early” (E1-E8) cuya expresión se traduce en proteínas para la regulación y replicación viral
• 2 genes de expresión tardía o “late” (L1, L2) que generan las proteínas para la unión de la cápside
• Una región URR ó LCR que controla la expresión de los genes tempranos E6 y E7
REGION EARLY: Funciones proteínas
E1 (Factor Replicación ADN
viral)
E2 (Regulador de la replicación ADN y
transcripción ARN)
Target: CRA-UBF (Upstream Binding Factor)
Domínio: 5H 216-255C
E7 (Ruptura ciclo celular). Rb / P16
E6 (Degradación p53)
Antiapoptotic / BAK
Activ. TELOMERASA
Mecanismos reguladores crecimiento
Membrane associated epitelial hiperplasia
Activation EGFR / Inhibition Vascular ATPase
Inhibition MHC-I and MHC-II
E5B
Patogenia del cáncer de Cérvix
1. Bosch FX, et al. Journal of Clinical Pathology, 2002,55: 244-265.
HPV infection
HPV infection
Persistent HPV infection
Persistent HPV infection
Cellular dysregulation
Cellular dysregulation
High-grade CIN
High-grade CIN
Invasive cancer
Invasive cancer
Immunologic factors
Immunologic factors Co-carcinogensCo-carcinogens
RESPUESTA INMUNE:
• Enmascaramiento antigénico
• MHC-II En células dendríticas POLIMORFISMOS VARIANTES APLOTÍPICAS
• TOll like Receptors
REGION LATE: Funciones proteínas
L1 Proteina mayor cápside 57 KDa
Virion formation
Interactua con L2
Interactua con receptores de la célula
L2 Proteina menor cápside de 43-53 KDa
Genome encapsidation / Membrana penetration / Entry / Traficking
72 capsómeros
Capsómero de L1
5 x L1
Partícula viral
Virus HPV
Proteina L1
VARIABILIDAD GENÉTICAY DETECCIÓN
• Los genes de expresión tardía “Late” presentan secuencias muy semejantes entre los diferentes tipos de VPH.
gen L1 principal diana “consenso” de detección.• Los genes de expresión temprana “Early”
presentan secuencias muy variables por lo que se han utilizado para la detección específica del tipo. – genes E6 y E7.
Changes in protein expression patterns in PRODUCTIVE INFECCTIONChanges in protein expression patterns in PRODUCTIVE INFECCTION
Clin. Sci. (2006) 110, 525-541 ( modificado J.J. Terradez )Clin. Sci. (2006) 110, 525-541 ( modificado J.J. Terradez )
Infección productiva HPVInfección productiva HPV
Changes in expression patterns that Changes in expression patterns that accompany progression to cervical cancer accompany progression to cervical cancer
Clin. Sci. (2006) 110, 525-541 ( modificado JJTerradez )Clin. Sci. (2006) 110, 525-541 ( modificado JJTerradez )
Decresing epitelial diferentationVirus producing Non productive
¿Cómo se transforma una ¿Cómo se transforma una infección HPVinfección HPV en en un carcinoma? Integración del ADN viral en un carcinoma? Integración del ADN viral en
el ADN huéspedel ADN huésped
Adaptado de 1. Phelps y Alexander. Ann Intern Med. 1995;123:368–382. 2. Syrjänen y Syrjänen. Papillomavirus infections in human pathology. Wiley & Sons, Chichester; 2000. págs.11–46.
LCRE7
E6
E1L1
L2
E2
E4E5
Punto de rotura e integración
+
–
LCR E7E6 E1L1L2E2 E4 E5
ADN del VPH integradoAND huéspedADN huésped
E2
ADN episomal del VPH
La integración aumenta el riesgo de La integración aumenta el riesgo de cáncer - Icáncer - I
PA
p53E6
Después de laintegración
Episoma
Asociación de E6 con p53 y PA
Efecto
• Expresión del gen E6 controlada por E2
• La expresión de E6 deja de estar controlada
• Bloqueo de la actividad de p53
• Resistencia a la apoptosis
• Aumento de la inestabilidad cromosómica
Syrjänen y Syrjänen. Papillomavirus infections in human pathology. Wiley & Sons, Chichester; 2000. págs.11–46.
Forma del VPH en la célula
E2F
pRBE7
Después de laintegración
Episoma
Libre
Forma del VPH en la célula Efecto
• Expresión del gen E7 controlada por E2
• La expresión de E7 deja de estar controlada
• Generación de múltiples cromosomas
• Inmortalización celular
• Oncogénesis
+
Syrjänen y Syrjänen. Papillomavirus infections in human pathology. Wiley & Sons, Chichester; 2000. págs.11–46.
La integración aumenta el riesgo de cáncer - IILa integración aumenta el riesgo de cáncer - II
DETECCIÓN DEL HPVDETECCIÓN DEL HPV
1.El HPV no puede cultivarse in vitro.
2.No hay tests serológicos lo suficientemente sensibles y seguros para la detección de la presencia del HPV.
3.Los tests utilizados en la actualidad se basan en la detección de ácidos nucleicos del virus ( DNA, RNA).
Proposed new screening algorithmProposed new screening algorithmWomen aged 25-64 y
HPV Test
Normal 5 year recall
CYTOLOGY
HPV test and Cytology at 6-12 months
Colposcopy
Normal 5 Year Recall
Cyto NegHPV Neg
Colposcopy
NegativePositive
=/> Mild
Normal or Borderline
Cyto=/> Mild
HPV and Cytology at 6-12 months
HPV+ and Cyto >mildHPV – and Cyto
Borderline
EUROGIN November 2008
Métodos de detección del HPVMétodos de detección del HPV y uso clínicoy uso clínico
1. Citología Papanicolau / citología líquida Automatización de la lectura.
2. Colposcopia / Microcolposcopia Colposcopia computarizada
3. Métodos moleculares basados en la detección de ADN / RNA viral
4. Métodos basados en la detección de patrones de expresión de proteínas: p16 INK4 CERVATEC-ELISA / Cit/ Tej.
5. Métodos SEROLOGICOS de detección de Ac. contra HPV
Pendiente de estandarizar.
Tecnologías patentadas.
Requieren experienciay dotación costosadel laboratorio.
Tecnología flexible (carga viral y genotipo).
Sensibilidad muy alta.
Análisis múltiple.
Amplificación de la diana
Tecnologías patentadas y costes elevados.
Genotipado en grupos.
Comercializaday estandarizada.
Semicuantitativa.
Señal amplificada
Baja sensibilidad, laborioso, y el SB no puede utilizar tejido con ADN degradado.
SB es el estándar y el FISH permite ver el VPH asociado con la lesión histológica.
Sonda directa
InconvenientesVentajasMétodo
Carácterísticas de las técnicas de Carácterísticas de las técnicas de detección de ácidos nucleicosdetección de ácidos nucleicos
Carácterísticas de las técnicas de Carácterísticas de las técnicas de detección de ácidos nucleicosdetección de ácidos nucleicos
Principios usados en las técnicas mas Principios usados en las técnicas mas comunes de detección del HPVcomunes de detección del HPV
1- Hibridación in situ (ISH): (Sonda directa) Hibridación de DNA Disponible en prueba coktail. ( Comercial)
2- Hibridación seguida de “amplificación de la señal”
Hybrid Capture 2 (HC2 R ,Qiagen): RNA probe Coktail. (Comercial).
Invader Tecnology: Third Wave invader HPV test. ( Comercial).
3- PCR de amplio espectro: “Amplificación de DNA con primers
consenso” o formato múltiplex ( Disponibles comercialmente)
Real time HR-HPV ( Aboot)
AMPLICOR R ( Roche)
4- PCR tipo específicas: Linear Array / Secuenciación
1- Hibridación in situ sobre tejido: 1- Hibridación in situ sobre tejido: sondas HPV HR Poca sensibilidad sondas HPV HR Poca sensibilidad
• Hibridación ADN/ARN.
• Cóctel de sondas:
- Alto riesgo: 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 y 68.
- Bajo riesgo: 6, 11, 42, 43 y 44.
• Sensibilidad adecuada a procesos de cribado de VPH (1 pg/mL).
• Aprobado por la FDA.
• Posibilidad de semicuantificar.
• Estandarizada y automatizable.
• Detecta de forma cruzada otros genotipos.
(Poljak et al. J Clin Virol 2002; 25: S89-97.)
2- Detección del VPH mediante amplificación de la señal. Tecnología de captura de híbrido (HC2)
2- Detección del VPH mediante amplificación de la señal. Tecnología de captura de híbrido (HC2)
• LIMITACIONES:• Prueba dependiente del estado de conservación del DNA viral• La semicuantificación de la Carga Viral solo indica el nº de copias• No distingue los diferentes tipos virales• No detecta infecciones múltiples• Se dan reacciones cruzadas entre las sondas de alto riesgo y
ciertos tipos virales de bajo riesgo. La mayoría de las muestras discordantes HCII+ están relacionadas con un valor bajo de RLU y reactividad cruzada con genotipos de bajo riesgo
2- Detección del VPH mediante amplificación de la señal. Tecnología de captura de híbrido (HC2)
2- Detección del VPH mediante amplificación de la señal. Tecnología de captura de híbrido (HC2)
Método de captura de híbrido (HC2)Método de captura de híbrido (HC2)Método de captura de híbrido (HC2)Método de captura de híbrido (HC2)
• DESNATURALIZACIÓN
• HIBRIDACIÓN CON SONDAS ARN DE
ALTO Y BAJO RIESGO
• CAPTURA DEL HÍBRIDO ADN/ARN MEDIANTE
ANTICUERPOS ANTI-ADN/ARN
• FIJACIÓN AL HÍBRIDO DE ANTICUERPOS ANTI-
ADN/ARN MARCADOS CON FOSFATASA
ALCALINA
• DETECCIÓN DE LA ENZIMA FIJADA MEDIANTE SUSTRATO QUIMIOLUMINISCENTE
• Es la técnica molecular más sensible y flexible.
• Puede ser utilizada para la detección, la cuantificación, la secuenciación y el análisis mutacional.
• La cuantificación del producto resulta compleja (estándares internos).
• Exige del laboratorio y del personal una normas y unas condiciones especiales.
E6E7 E1
E2 E5
E4L2
L1
1 2 3 4 5 6 7 7,9 kb
CGTCCMARRGGAWACTGATC
GCMCAGGGWCATAAYAATGG
primers 450 bpMY09/11 PGMY
GP5+/6+ 150 bp
65 bpSPF10165 bpAMPLICOR ROCHE ®
3- Detección del VPH por PCR3- Detección del VPH por PCR3- Detección del VPH por PCR3- Detección del VPH por PCR
GPMY09/11
Description of main primer sets Description of main primer sets used in PCR amplification 1used in PCR amplification 1
Description of main primer sets Description of main primer sets used in PCR amplification 2used in PCR amplification 2
• El genotipado es importante en tres situaciones:- El potencial oncogénico y el riesgo de progresión a CIN III difieren de forma importante según el genotipo.
- Es necesario monitorizar la eficacia de las vacunas multivalentes.
- Estudios epidemiológicos.
• La incidencia acumulativa de CIN III en pacientes seguidas durante diez años e infectadas con VPH-16 y 18 es muy superior (17,2/13,6) a la de las infectadas por otros tipos oncogénicos (3%) o sin detección de VPH (0,8%). Estos datos se refuerzan en mujeres con más de 30 años.
VPH-16VPH-18
(Schiffman et al. Virology 2005; 337: 76-84. Khan et al. JNCI 2005; 97: 1072-9.
Castle et al. J Clin Microbiol 2006; 44: 3915-7)
Genotipado del VPH ¿aporta información útil?Genotipado del VPH ¿aporta información útil?
Hibridación reversaRFLP SecuenciaciónArray
PCR en tiempo real
Estrategia para el genotipado del VPHEstrategia para el genotipado del VPHEstrategia para el genotipado del VPHEstrategia para el genotipado del VPH
PCR
Primersde consenso
GP5+/6+ PGMY SPF10 MY09/11
primers específicos
LIPA (INMUNOENSAYO LINEAL)
• Amplifica pequeños fragmentos de 65 bp en la región L1 (primers SPF).
• Detecta 25 tipos de VPH e infecciones múltiples.
LINE-BLOTTING (PGMY-LB)
• Amplifica la región L1 con mezclas de primers (PGMY09/PGMY11) y el gen de la betaglobina humana, ambos biotinados.
• El producto amplificado se hibrida con sondas de 37 tipos de VPH fijadas a una membrana de nitrocelulosa.
(Kleter et al. J Clin Microbiol 1999; 37: 2508-17.Gravitt et al. J Clin Microbiol 1998; 36: 3020-7.
Kornegay et al. J Clin Microbiol 2003; 41: 1080-6.Van Hamont et al. J Clin Microbiol 2006; 44: 3122-9.)0,79Valor kappa
8,2Discordancia
11,2Compatibilidad
80,6Concordancia
LIPA Vs. LINE-BLOTTING
Hibridación reversaHibridación reversaHibridación reversaHibridación reversa
Hibridación reversaRFLP SecuenciaciónArray
PCR en tiempo real
Estrategia para el genotipado del VPHEstrategia para el genotipado del VPHEstrategia para el genotipado del VPHEstrategia para el genotipado del VPH
PCR
Primersde consenso
GP5+/6+ PGMY SPF10 MY09/11
primers específicos
• Método que permite combinar la
sensibilidad de la PCR con el
poder discriminatorio de las
endonucleasas de restricción.
• Es un sistema poco laborioso
y menos costoso que LIPA
y secuenciación.
• Resulta difícil detectar
infecciones mixtas.Bernard et al. J Infect Dis 1994; 170: 1077-85.
Wang et al. J Med Virol 1999; 59: 536-40. Kay et al. J Virol Meth 2002; 105: 159-70.
RFLP (patrón de restricción con RFLP (patrón de restricción con endonucleasas)endonucleasas)
RFLP (patrón de restricción con RFLP (patrón de restricción con endonucleasas)endonucleasas)
Hibridación reversaRFLP SecuenciaciónArray
PCR en tiempo real
Estrategia para el genotipado del VPHEstrategia para el genotipado del VPHEstrategia para el genotipado del VPHEstrategia para el genotipado del VPH
PCR
Primersde consenso
GP5+/6+ PGMY SPF10 MY09/11
primers específicos
• Tras una PCR de la región L1, que marca el producto amplificado, se hibrida con oligonucleótidos dispuestos en microarray.
• Se generan sondas a cada tipo de VPH y se fijan a los pocillos de reacción.
• Se amplifica la muestra con primers genéricos marcando con Cy5 el producto amplificado.
• Hibridación y lectura.
(An et al. Cancer 2003; 97: 1672-80. Oh et al. J Clin Microbiol 2004; 42: 3272-80.
Gheit et al. J Clin Microbiol 2006; 44: 2025-31.)
Hibridación con microarraysHibridación con microarraysHibridación con microarraysHibridación con microarrays
Hibridación reversaRFLP SecuenciaciónArray
PCR en tiempo real
Estrategia para el genotipado del VPHEstrategia para el genotipado del VPHEstrategia para el genotipado del VPHEstrategia para el genotipado del VPH
PCR
Primersde consenso
GP5+/6+ PGMY SPF10 MY09/11
primers específicos
1980 1990 2000
TESTS PARALA DETECCIÓNDE ADN-VPH
SOUTHERN
FISH
HC I HC II HC IIITS.PCR; L1.PCR GP.PCR
realtime-PCR
SENSIBILIDAD- +
ADN-VPH EN CÁNCER
CERVICAL30%-60% 75% 95% 99%
Evolución de la tecnología diagnóstica del VPH y relación de causalidad con el cáncer de cérvix
Evolución de la tecnología diagnóstica del VPH y relación de causalidad con el cáncer de cérvix
(Bosch et al. J Clin Pathol 2002; 55: 244-65.)
- +
SENSIBILIDAD
Hibridación in situ
Southern blot
HC II PCRreal time
PCR
Sonda directa
Señal amplificada
Amplificación de la diana
Hibridación Hibridación In situIn situ (ISH) (ISH)Reacción en Cadena de Polimerasa (PCR)Reacción en Cadena de Polimerasa (PCR)
Captura Híbrida 2 (HCII, Digene)Captura Híbrida 2 (HCII, Digene)
Tests VPH hoy… VPH-ADNTests VPH hoy… VPH-ADN
• Valor predictivo negativo– Si test VPH positivo , NO significa que desarrollará cáncer, la mayoría
de mujeres que están infectadas no lo desarrollan– Si test VPH negativo, es muy difícil que se desarrolle el cáncer
• El verdadero valor del test está en muestras negativas (Cribado 3 a 5 años) • Sólo detectan infecciones muy prevalentes, de las cuales 70% de las
infecciones desaparecen en 1 año, y un 91% en dos años (sin ningún tipo de tratamiento)
• Sólo las infecciones persistentes tienen riesgo de desarrollar lesiones precancerosas de alto grado y cáncer ( aprox. 10% de mujeres con el virus.)
Por tanto, estos tests presentan limitaciones que las tecnología basada en la determinación de proteínas virales pretende resolver
• No se correlaciona bien con el nivel
de lesión histológica.
• Hay que distinguir la alta carga
vírica previa al aclaramiento del
virus y la que es consecuencia de
la persistencia del virus.
• Únicamente se ha demostrado que
tiene valor en las infecciones
simples por HPV 16.
Gravitt et al., Int J Cancer, 2007,121,2787.Briolat et al., Int J Cancer, 2007,121,2198.
Determinación de la carga víricaDeterminación de la carga víricaDeterminación de la carga víricaDeterminación de la carga vírica
Carga viral total / Carga viral relativaCarga viral total / Carga viral relativa1- Celularidad de la toma 2- Distribución superficial de la lesión3- Tasa de infección por célula 4- Conservación de la muestra ( DNA, Inhibidores)
CVR= CVT : nº cel.
Hibridación reversaRFLP SecuenciaciónArray
PCR en tiempo real
Estrategia para el genotipado del VPHEstrategia para el genotipado del VPHEstrategia para el genotipado del VPHEstrategia para el genotipado del VPH
PCR
Primersde consenso
GP5+/6+ PGMY SPF10 MY09/11
primers específicos
La CARGA VIRAL Y LA INTEGRACION La CARGA VIRAL Y LA INTEGRACION valor en la predicción de Progresiónvalor en la predicción de Progresión
PCR a tiempo real: • Asigna valores cuantitativos reales a los amplificados• Usa sondas específicas marcadas con fluorocromos (Taqman, Scorpions)• Se mide la excitación lumínica ciclo a ciclo ( Laser + Cámara CCD)• Análisis de regresión de las variaciones de niveles lumínicos con elaboración de línea gráfica donde extrapolar los valores iniciales cuantitativos para cada gen estudiado.Carga viral:• Permite la comparación de las cantidades de un determinado gen viral con un gen celular constitutivo.• Permite determinación de CV Total• Determinación de CV Relativa: CVR = CVT : nº de cel. ( Gen Constitutivo)Estado de integración: Análisis de la proporción de E6-7 con el gen susceptiblede pérdida de E2•,Episomal: E6-7 = E2• Integración total: E2 = 0• Formas episomales e integradas: E6-7> E2
• La integración del ADN vírico conduce a la sobreexpresión de E6 y E7
• Utiliza técnicas de hibridación in situ (FISH) con sensibilidad
incrementada (HPV-CARD)
• El ADN integrado ó episómico presenta diferentes patrones de
visualización
chimnich et al., Cancer Cytopath,2007,111,330.
Integración del ADN vírico en el Integración del ADN vírico en el cromosoma celularcromosoma celular
Integración del ADN vírico en el Integración del ADN vírico en el cromosoma celularcromosoma celular
Tests de detección de RNATests de detección de RNA
Métodos de amplificación de RNA isotérmicosMétodos de amplificación de RNA isotérmicos
PreTec HPV-Proofer ( Norchip): 5 genotipos HR-HPV APTIMA GenProbe: 13 Genotipos HR-HPV.
Detección mRNA sin destrucción celular:Detección mRNA sin destrucción celular:ONCOTECONCOTEC Hibridación in situ con fluoresceina ( FISH)+ citometría de flujo
• La expresión de E6 y E7 puede medirse por sus niveles de ARNm.
• Es un marcador indirecto de integración vírica.
(Lie et al. Gynecol Oncol 2005; 97: 908-15.)
• Tiene mayor valor predictivo positivo que otras técnicas moleculares en lesiones de bajo grado.
• Existen comercializadas en formato de NASBA y FISH.
Detección de ARNm de E6/E7 del VPHDetección de ARNm de E6/E7 del VPHDetección de ARNm de E6/E7 del VPHDetección de ARNm de E6/E7 del VPH
• Amplificación de diana ARN (NASBA)
• Utiliza sondas específicas (molecular beacons)
• Determina 5 genotipos: 16, 18, 31, 33 y 45
• Correlaciona con otros marcadores de progresión histológicos (p16INK) pero no con la carga vírica.
Molden et al., J Virol Meth, 2007,142,204.
Andersson et al., Int J Oncol, 2006,29,705
Detección de ARNm de E6/E7 del VPH: Detección de ARNm de E6/E7 del VPH: PreTect HPV- ProoferPreTect HPV- ProoferDetección de ARNm de E6/E7 del VPH: Detección de ARNm de E6/E7 del VPH: PreTect HPV- ProoferPreTect HPV- Proofer
• Técnica de FISH
• Directamente de citología
líquida.
• Se realiza en menos de 3 horas
• Lectura en citómetro de flujo
• En muestras de LSIL:
- Sensibilidad 83.3%
- Especificidad 91.3%Narimatsu y Patterson, Am J Clin Pathol,2005,123,716.
101 102 103 104
Probe 1- FITC -->10
20
30
40
50
60
Nu
mb
er
101 102 103 104
Probe 1- FITC -->10
20
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Nu
mb
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Detección de ARNm de E6/E7 del Detección de ARNm de E6/E7 del VPH: HPV OncotectVPH: HPV Oncotect
Detección de ARNm de E6/E7 del Detección de ARNm de E6/E7 del VPH: HPV OncotectVPH: HPV Oncotect
XVIII Congreso Nacional de la SEC. XVI Reunión de la SPC. XIII Reunión Iberoamericana de citología. Mayo del 2008.
CÉLULAS exocervicales con secuencia diana
Etiqueta anticuerpos
CITÓMETRO DE FLUJO
101 102 103 104
Probe 1- FITC -->
10
20
30
40
50
60
Nu
mb
er
HPV E6, E7 ARNm+ Cels (%)
HPV E6, E7 ARNm - Cels
FIJAR/PERMEABILIZAR(R1, R2, R3)
+ CALOR/LAVADO (R6/R7)
OLIGONUCLEÓTIDOSmarcados con fluorocromo (R5)
ARNm E6/E7
Fluorocromo unido a sonda de ADN complementaria a ARNm
ATTAGAAT
Método HPV OncoTectMétodo HPV OncoTect
R1
R2
R8R11
PMNsCélulas
endocervicalesCélulas
exocervicales
Debris
Distribución de poblaciones celularesDistribución de poblaciones celulares
según expresión de E6/E7según expresión de E6/E7
Narimatsu R, Patterson BK. High-throughput cervical cancer screening using intracellular human papillomavirus E6 and E7 mRNA quantification by flow cytometry. Am J Clin Pathol. 2005 May;123(5):716-23.
Sobrexpresión E6/E7 presente
(doble pico)
No expresión E6/E7detectada
Hibridación In situ (ISH)Reacción en Cadena de Polimerasa (PCR)Captura Híbrida 2 (HCII, Digene/Quiagen)
VPH negativoLa mujer no se
encuentra infectada por VPH.
Es muy difícil que se desarrollen lesiones
severas o cáncer
Alto Valor predictivo negativo (VPN)(cribado 3 a 5 años)
VPH positivo
La mujer esta infectada por VPH
NO significa que desarrollará cáncer, la
mayoría de mujeres que están infectadas no lo
desarrollan
Bajo Valor predictivo positivo (VPP)
Un 90% de las infecciones se aclaran en 2 años
Test VPH - ADN significación diagnósticaTest VPH - ADN significación diagnóstica
Test VPH -ARNm significación Test VPH -ARNm significación diagnósticadiagnóstica
HPV OncoTect
HPV OncoTect negativo
No hay expresión de oncoproteínas
Aunque el virus este presente no hay actividad
oncogénica
Alto Valor predictivo negativo (VPN)
HPV OncoTect positivo
Presencia de oncoproteínas en el
exocervix.
Existe actividad celular anormal, integración viral
y alta probabilidad de progresión.
Alto Valor predictivo positivo (VPP)
Alta correlación con progresión
Utilidad clínica mRNA HPV-HRUtilidad clínica mRNA HPV-HR • VPH ARNm E6/E7 como marcador clínico para la detección precoz del cáncer
de cérvix1:detección de VPH mRNA E6/E7 indica la actividad oncogénica del VPH y no sólo la
presencia de una infección frecuente (tests de VPH ADN)
Es el indicador clínico más relevante para el desarrollo del cáncer de cérvix, y puede ser usado como un marcador clínico predictivo para identificar aquellas mujeres con riesgo alto de desarrollar lesiones displásicas de alto grado y cáncer
Debido a la integración del VPH y la fragmentación del ADN, en muchos casos los tests basados en detección de ADN darán resultado negativo 2: 4-25% casos
• Sería un método de cribado ideal³ aquel que incidiera en la detección de la transcripción activa de oncogenes VPH-AR o de las proteínas resultantes de su expresión
(1) HPV HandBook: "Human Papillomavirus and Cervical Cancer", edited by Professor Walter Prendiville and Dr Philip Davies, supports detection of oncogenic activity (page 75 and 76):(2) Sankaranaryanan et al., Accuracy of human papillomavirus testing in primary screening of cervical neoplasia: results from a multicenter study in India. International Journal of Cancer 112: 341-347, 2004(3) Documento de consenso SEGO: “La infección por papilomavirus”.
Métodos basados en la detección de Métodos basados en la detección de patrones de expresión de proteínas: patrones de expresión de proteínas: p16 INK4 CERVATEC-ELISA en fluido p16 INK4 CERVATEC-ELISA en fluido vaginal vaginal P16 en citología / Tejido parafinadoP16 en citología / Tejido parafinado
Diseño general del Estudio CERVATEC:
• Estudio prospectivo, comparativo multicéntrico y multinacional Se inicia como proyecto piloto en 2007
• Duración de la participación: Alta de la primera paciente: Enero 2007 Baja de la última paciente: Mayo de 2007 Cierre de la Base de Datos: Junio 2007• Numero de pacientes: 12000 pacientes en España, Italia y Francia• Se realiza paralelamente un estudio en Alemania ( 12000 )
• Población a Estudio: Criterios de inclusión y de exclusión• Condiciones del muestreo y seguimiento de la paciente• Se establecen medidas de control de calidad• Se documentan y definen las bases científicas del estudio• Con los resultados se realizará análisis estadístico
Resumen del protocolo Cervatec. Versión final del 04.12.06 nº de protocolo:9502-06-REG-EP-002
Cervatec TM p16INK4a ELISA
• Es un ensayo Sanndwich con enzimas unidas a un inmunoadsorvente.
• El dispositivo de inmunoensayo está basado en el uso de Ac. monoclonales específicos marcados con cromógeno para p16 ( la proteína solubilizada de muestras cervicales lisadas en pocillos de microplacas).• Se obtiene una señal cromogénica proporcional a la concentración de p16.
• El kit ELISA proporciona los reactivos para la estandarización de la señal del ensayo así como los controles apropiados.
Tecnología aplicada en el Estudio CERVATECTecnología aplicada en el Estudio CERVATEC
Objetivo principalObjetivo principal
• Identificación de mujeres que sufren HSIL en Cuello Uterino
• Demostrar que CERVATEC p16 junto con el test de Pap mejora la sensibilidad para identificar mujeres con HSIL ( CINII-CIN III )
Objetivos secundarios:
• Comprobar el valor límite predefinido ( Punto de cohorte a partir del cual la prueba se considera positiva.
• Comparar la sensibilidad de la detección de lesiones CIN II y CIN III con CERVATEC versus citología convencional.
• Comparar la idoneidad del test para identificar de forma correcta a las mujeres sin HSIL frente a la citología convencional
Resumen del protocolo Cervatec. Versión final del 04.12.06 nº de protocolo:9502-06-REG-EP-002
Estudio CERVATEC. Conclusiones preliminares:
• Alta sensibilidad (93%) para identificación de HSIL en mujeres < 35 años
• Especificidad del (92%)
• La especificidad se incrementa al 97% cuando se combina con test de HPV
Satellite Symposium. EUROGIN 2007
Determinación de p16:Determinación de p16:
Citologías y Biopsias:• Aumenta la concordancia inter-observador• Aumenta la sensibilidad y especificidad de los resultadosrespecto de HC-II para detectar lesiones de alto grado (HSIL).
Fluido vaginal: Cervatec p16 ELISA Estudio CERVATEC. Conclusiones preliminares:Alta sensibilidad (93%) para identificación de HSIL en mujeres < 35 añosEspecificidad del (92%)La especificidad se incrementa al 97% cuando se combina con test de HPV
Expresión de P16Expresión de P16Expresión de P16Expresión de P16
Infección HPV
Infección HPV
Infección HPV
Persistente
Infección HPV
Persistente
DesregulaciónCelular
DesregulaciónCelular
CINAlto
grado
CINAlto
grado
Cancer InvasivoCancer
Invasivo
HPV test (HC2 o PCR)
Nuevo biomarcador (p16INK4a )
Pap test
Individuos en riesgo Pacientes con Enfermedad
Utilidad del estudio Utilidad del estudio de patrones de expresión de p16de patrones de expresión de p16
Criteria for assessment of p16 INK4 aCriteria for assessment of p16 INK4 a POSITIVE CELLSPOSITIVE CELLS• Nuclear size and nuclear-cytoplasmic ratio: nucleus significantly enlarged >50%• Hipercromasia and nuclear texture: coarse and inhomogeneous cromatin• Nuclear shape and membrana structure: Irreg. of the nuclear shape/or border.
• Anisonucleosis
Cancer cytopatology 2005; 105: 465-7
SCORE 1
SCORE 2
p16 INK4 Inmunocytochemistryp16 INK4 Inmunocytochemistry on liquid-based cytologyon liquid-based cytology
Cancer cytopatology 2005; 105: 465-7
SCORE 3
SCORE 4
p16 INK4 Inmunocytochemistry p16 INK4 Inmunocytochemistry on liquid-based cytologyon liquid-based cytology
Cancer cytopatology 2005; 105: 465-7
Muchas Gracias
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