Escherichia coli, una vieja amigacon nuevos trucos
Dr. Rafael Camacho-Carranza
Facultad de Ciencias-UNAM, 20 de enero de 2011
Planteamiento del Problema
Ancestro
Escherichia coli
Salmonella typhimurium
100-150 x 10 años6
m in 50
m in 25m in 75
m in 100/0
thrA 0araA 1.5
lon 9.8
aroA 20.5
potA 25.5
pnc A 39
dadA 26.6
dif 34.2
guaA 56.5
oriC 84.5
glyT 89.9
tdcB 70.3
rec A 60.8
m in 50
m in 25m in 75
m in 100/0
thrA 0araA 2.4
lon 11
aroA 19.9
potA 27.3
pnc A 28.9
dadA 41.1
dif 34.6
guaA 54.4
oriC 84.9
glyT 84.9
tdcB 70.9
rec A 62.2
51 52% GC
lac
cob
VS
7.8 Eco
43.7 Sty
INV
28.5
41.2
Planteamiento del Problema
Perseverancia de la estructura genómica, no de la secuencia
Sin embargo, los mecanismos recombinogénicos para lograr rearreglos en el cromosoma están presentes.Con peculiaridades
Science. 1988 Sep 9;241(4871):1314-8
Segall A, Mahan MJ, Roth JR.
Mapa de rearreglos con un punto fijo
Primer Hipótesis: Letalidad
La inversión de los diferentes intervalos no permisivos es letal
Ori
No Permisivo
Permisivo
NP
Los limites de la inversión del cromosoma
Ori
84.8’
Terminus
TER 35’
his 44.6’ trp 38.1
No permisivo
Posic ión de his-trp, intervalo no permisivo
Fra g m ent 1 Fra g m ent 2
Fra g m ent 2 Fra g m ent 1
Cepa donadora
Cepa receptora
Cepa invertida
a b c d e f
b c d e fa
b c d e fa
b c d e fa
bcde fa
inverted interval
Eventos transducc ionales
Forzando la inversión
Genetics. 1994 Aug;137(4):919-32.
Miesel L, Segall A, Roth JR.
Letalidad no es la explicación
Segunda Hipótesis: Mecánica
La inversión es no permisiva por un mecanismo que la evita
Si Natura no responde; muta
La nitrosoguanidina es tu amiga
Ori
84.8’
Terminus
TER 35’
his 44.6’ trp 38.1
No permisivo
Posic ión de his-trp, intervalo no permisivo
Permisivo
pin
¿Quien es ?pin
Mapeo de tus por ligamiento y posterior secuencia
Ori
84.8’
Terminus
TER 35’
his 44.6’ trp 38.1
No permisivo
Posic ión de his-trp, intervalo no permisivo
Permisivo
pin
¿Quien es ?pin
tus 31.3’
TerA ATTAA TA AAGCG TGTTGTAACTA
Tus
Horquillas de replicac ión
OriTER
¿Que rayos hace Tus?
Ori
TER
?
SOS
Tiempo generacional
Medios
Hipermutac ión
5’
¿Cuál es el fenotipo del su mutación?
¿Por qué tus?
Herramientas de trabajo
DEL lacZ'
Tn10d-tet
lacAYZ
p-trp
p-his
min 44.6
min 38
Fabricando inversiones
D’ G OE IlacZ’ trp
Mu ’d
his reg ion
P’ hisD'EA B C D'E
trp lac Z Y A am p
Mu Ad
trp reg ion
p’ trp
Tn dTc10
Antes de la inversion
ED' C B AE IlacZ’ trp
Mu ’d
his reg ion
P’ his
D'EO G D' trp lac Z Y A am p
Mu Ad
trp reg ion
p’ trp
Tn dTc10
Despues de la inversion
Lac -
Lac +
his reg iontrp reg ion
¿Un mecanismo que involucre a Tus?
Sitios ter
Ori
84.8’
Terminus
TER 35’
his 44.6’ trp 38.1
No permisivo
Posic ión de his-trp, intervalo no permisivo
Siti
o t
er
en
am
yA
Inserciones en región fli
His amyA trp
NP-INV
P-INV
42.5’
ter-amyA, el portero de las inversiones
540pb 1172pb
Letalidad
¿Realmente descartada?
¿Selección espontánea de tus-?
Experimento de inversión bloqueada
D’ G OE Ilac Z’ trp
Mu ’d
his reg ion
P’ h isD'EA B C D'E
trp lac Z Y A am p
Mu Ad
trp region
p ’ trp
Tn d Tc10
75%
ED' C B AE Ilac Z’ trp
Mu ’d
his reg ion
P’ h is
D'EO G D'trp lac Z Y A am p
Mu Ad
trp region
p ’ trp
Tn d Tc10
Inverted strain
Lac -
Lac +
his reg iontrp region
D’ G OE Ilac Z’ trp
Mu ’d
his reg ion
P’ h isD'EA B C D'E
trp lac Z Y A am p
Mu Ad
trp region
p ’ trp
Tn d Tc10
25%
Lac -
flip-back
D’ G OE Ilac Z’ trp
Mu ’d
his region
P’ hisD'EA B C D'E
trp lac Z Y A am p
Mu Ad
trp region
p’ trp
Tn dTc10
ED' C B AE Ilac Z’ trp
Mu ’d
his region
P’ his
D'EO G D' trp lac Z Y A am p
Mu Ad
trp region
p’ trp
Tn dTc10
Lac-
Lac+
his regiontrp region
Kn
tonB
Kn
tonB? ?
DEL1956; DEL1957
Before inversion
After inversion
and Bochner selection
Poniendo un candado a la inversión
Primeras observaciones:
La letalidad del evento no explica la restricción en la inversión
Existe un sistema mecánico involucrado que requiere a la proteína Tus
La construcción de un modelo
Tres conceptos para un marco teorico
Gary Smith
Andre Kuzminov
Tokio Kogoma
Ori PriA
Chi 9:1
Recombinación replicativa
de largo alcance
Direccion de la reparación
del colapso de la replicación
Nuevo replicosoma en
condiciones de estres,
priA un puente en
replicación y recombinación
Annu Rev Genet. 2001;35:243-74.
Smith GR.
Mol Microbiol. 1995 May;16(3):373-84.
Kuzminov A.
9:1 en dirección a terminus las secuencias Chi
Replicación estable
Microbiol Mol Biol Rev. 1997 Jun;61(2):212-38.
Kogoma T.
J Mol Biol. 1970 Sep 14;52(2):143-64.
Kogoma T, Lark KG.
Poniendo reglas al juego
Hacia un modelo
A) Los rompimientos de cadenas, con la consecuente invasión a segundas cadenas,
induce crecimientos replicativos de largo alcance
B) Las nuevas horquillas de replicación se desplazan en dirección Ori-TER, por lo cual,
en un rompimiento de cadena el extremo 3’ del lado cercano a Ori, es el extremo
caliente para invadir, mientras que el extremo 3’ del lado de TER es el extremo frio.
C) La horquilla replicativa-recombinogénica es mas susceptible a Tus-ter que la
horquilla replicativa proveniente de Ori.
D) La invasión de cadenas induce un rompimiento que a su ves inicia una segunda
invasión reciprocua.
Modelando una explicación
Lo que falta
¿Donde se localizan los sitios ter?, ¿y sus derivados?
¿Todos los sitios ter ac túan con la m isma eficienc ia?
En sentido contrario, his-Ori, ¿funciona Tus?
¿Se pueden generar nuevas fronteras?
¿Tenemos dos diferentes horquillas?
Demasiadossitios ter
Primeras aproximaciones
Busqueda de nuevos sitios ter
Ori nadB cysA nuo glpT his
NP
P- tus- dependiente
Mismos números
pero colonias enfermas, o sanas
según el estatus de tus.
¿Como estudiar a un moribundo?
Captura con recA
ca mR
Resistenc ia a cloramfenic ol
ter-amyA
Construcción de un transposón derivado de Tn10dGn-teramyA-Cm
Cadáveres en el armario
Efecto de tus en eventos entre secuencias repetidas directas
Como funciona la replicación estable en presencia de Tus
Tendencia a la reversión de la inversión
“Free variability is found only in a limited portion of the genotype. Most genes are tied together into balanced complexes that resist change. The fitness of genes tied up in these complexes is determined far more by the fitness of the complex as a whole than by any functional qualities of individual genes”.
Ernst Mayr
Dos caras de un mismo problema
La inestabilidad de la duplicación: una herramienta
Segregación de la duplicacion
MudA
Segregante
Perdida de la amplificación
Funcionamiento del sistema de segregac ión
Mud AleuA'leuA'
Mud AnadC'nadC'
min 3.6
min2.9
Donadores
leuA'leuA'
leuA nadC
leuA nadC
nadC'
Mud A
leuA'
leuA nadCnadC' leuA'
Mud A
Receptor
Rep licación
Transd ucción P22
Producto amplificado
Resolución
Construcc ión de la amplificac ión cromosomal
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