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Tesis de Posgrado
Estudio funcional del receptorEstudio funcional del receptordopaminérgico D2 en el sistemadopaminérgico D2 en el sistema
nervioso central de ratonesnervioso central de ratonesmodificados genéticamentemodificados genéticamente
Gelman, Diego Matías
2003
Tesis presentada para obtener el grado de Doctor en CienciasBiológicas de la Universidad de Buenos Aires
Este documento forma parte de la colección de tesis doctorales y de maestría de la BibliotecaCentral Dr. Luis Federico Leloir, disponible en digital.bl.fcen.uba.ar. Su utilización debe seracompañada por la cita bibliográfica con reconocimiento de la fuente.
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Cita tipo APA:Gelman, Diego Matías. (2003). Estudio funcional del receptor dopaminérgico D2 en el sistemanervioso central de ratones modificados genéticamente. Facultad de Ciencias Exactas yNaturales. Universidad de Buenos Aires.http://digital.bl.fcen.uba.ar/Download/Tesis/Tesis_3579_Gelman.pdf
Cita tipo Chicago:Gelman, Diego Matías. "Estudio funcional del receptor dopaminérgico D2 en el sistema nerviosocentral de ratones modificados genéticamente". Tesis de Doctor. Facultad de Ciencias Exactas yNaturales. Universidad de Buenos Aires. 2003.http://digital.bl.fcen.uba.ar/Download/Tesis/Tesis_3579_Gelman.pdf
Universidad de Buenos AiresFacultad de Ciencias Exactas y Naturales
Estudiofuncional del receptordopaminérgico DZ en el sistema nervioso
central de ratones modificadosgeneticamente.
Tesis de Doctorado:
Diego M. Gelman
Director:
Dr Marcelo Rubinstein
Instituto de Investigaciones en Ingeniería Genética y Biología Molecular(lNGEBl-UBA-CONICET)
Mayo 2003
Abreviaturas
AccAMPTAOBCélulas ESCOMTD2CD2LDADA'I‘DOPACEPGPcGPi6-OHDAhPLAPHVAHypLCL-DOPAMAONSTPKCSNCSNPSNpcSNprSTTHVMATVTA
Núcleo acumbens
ot-metil-p-tirosinaBulbo olfatorio accesorioCélulas totipotenciales embrionariascatecol O-metiltransferasaReceptor D2 cortoReceptor D2 largoDopaminaTransportador de dopaminaácido 3,4-dihidroxifenilacéticoEnfermedad de ParkinsonGlobo pálido externoGlobo pálido interno6-hidroxidopaminafosfatasa alcalina placentaria humanaácido homovainillínicoHipotálamoLocus coeruleusL-3,4-dihidroxifenilalaninaMonoamina oxidasaNúcleo subtalámicoProteína quinasa CSistema nervioso centralSistema nervioso periféricoSustancia nigra pars compactaSustancia nigra pars reticulataCuerpo estriadoTírosina hidroxilasaTransportador vesicular de monoaminasÁrea tegmental ventral
Tesis Doctoral. Diego M. Gelman.
Indice.
Introducción.
I. La Dopamina.l. l. Síntesis, Liberación y Degradación dela Dopamina.1.2. Sistemas Dopaminérgicos Centrales.l .3. Receptores Dopaminérgicos.
I.3. l. Clasificación.I.3.2. Estructura Genómica.I.3.3. Estructura Aminoacidica.1.3.4. Localización.
I.3.5. Segundos Mensajeros.¡.3.6. Propiedades Farmacológicas.
1.4. Receptor DZ.1.5. Anatomía yfisiología de los ganglios de la base.I.6. Enfermedad de Parkinson.I. 7. Modelo animal: lesión cerebral con 6-hidroxidopamina.1.8. Respuestas conductuales. Interacción Dl/D2.I.9. Otras Fisiopatologías Asociadas a la Neurotransmisión Dopaminérgica.
1.9.] Esquizofrenia.2. Sistema Cre-loxP.3. Animales transgénicos como herramienta de estudio.
Objetivos.
Resultados y Discusión.
Parte 1.1. Modelo animal para el estudio de lafimción dopaminérgica.
I. l. Establecimiento del modelo de lesión estriatal con 6-hidroxidopamina.I.2. Desarrollo de supersensibilidad conductual en ratones mutantes para el receptor DZ.
1.2.]. Establecimiento de Ia lesión estriatal.1.2.2. Desarrollo de supersensibilidad en ausencia del receptor DZ.I.2.3. Papel del receptor DI en la respuesta locomotora en ausencia de receptores D2.1.2.4. Efecto del bloqueo inespecífico de receptores "tipo D2 " sobre las respuestas
supersensibles.I.3. Análisis de las interacciones entre receptores de "tipo DI ”y “tipo DZ
Parte 2.i. Ratón transgénico TH-Cre.
l. I. Construcción de un transgén que expresa recombinasa Cre bajo el promotor detirosina hidroxilasa.
I.2. Producción de animales con el transgén —9THCre.1.3.Patrón de distribución de la proteína transgéncia Cre
1.3.¡Expresión de tirosina hidroxilasa y recombinasa Cre en cerebro.I.3.2. Colocalización de tirosina hidroxilasa y recombinasa Cre.l. 3.3. Detección de tirosina hidroxilasa y recombinasa Cre por inmunojluorescencia.
2. Linea reportera Z/AP.2. I. Genotipi/ïcación de animales.
43
45
46464649495]54
5557
Tesis Doctoral. Diego M. Gelman.
2.2. Expresión de LacZ.3. Ratones doble transgénicos.
3. l. Actividad de recombinasa Cre en cerebro de animales doble transgénicos.3.2. Expresióny actividad de la recombinasa Cre en retina.3.3. Expresióny actividad de recombinasa Cre en la médula a'e la glándula adrenal.3.4. Expresión de recombinasa Cre en estadio embrionario.
Parte 3.l. Introducción de una mutación condicional nula en el gen del receptor
D2 de ratón.l. l. Construcción de un vector de recombinación homóloga dirigido al exón 2
del gen del receptor de dopamina DZ.¡.2. Preparación defibroblastos y determinación de la presencia de Micoplasma.1.3. Preparación y titulación de mLIF. Puesta a punto del cultivo de células ES.1.4. Electroporación de células ES con el vector de recombinación homóloga pCON3.
Seleccióny determinación de clones positivos por Southern blot.1.5. Trans/¡accióntransitoria de clones positivos con un plásmido que expresa
recombinasa Cre para escindir a los marcadores de selección.I.5. l . Determinación de clones positivos por PCR y Southern blot.
1.6. Microinyección de blastocistos y obtención de quimeras.
Conclusiones.
Parte l.Parte 2.Parte 3.
Materiales y Métodos.
Parte l. Modeloanimal para el estudio de lafunción dopaminérgica.Animales y Bioterio.Lesión estriatal unilateral con 6-()HDA.Drogas y tiempos de inyecciónprevios alos análisis conductuales.Pruebas conductuales. Determinación de las rotaciones.Determinación del contenido de monoaminas y sus metabolitos.
Parte 2. Línea de animales TH-Cre.Construcción del transgén —9THCre.Técnicas de biologia molecular empleadas.Preparación del transgén para la microinyecciónpronuclear.Animales y bioterio.Obtención de embriones.Microinyecciónpronuclear.Transferencia embrionaria a hembras pseudopreñadas.Identificación de ratones transgénicos. Análisis de la presencia del transgén.Localización de Tirosina hidroxilasa y Cre por inmunohistoquimica.lnmunofluorescencia contra THy Cre.Obtención de animales doble transgénicos.Detección del gen LacZ en animales transgénicos reporteros Z/APy doble transgénicos.Determinación de la actividad de Cre evidenciadopor actividad de lafosfalasa alcalina.Determinación de TH, Cre y hPLAP en embriones de ¡3.5 d.p. c.
74
74
76
77
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8]
84
858687
Tesis Doctoral. Diego M. Gelman.
Parte 3. Ratón D2fl0x 108Clonado de unfragmento genómico que contiene al exón 2 del receptor dedopamina D2 de ratón. l 08Construcción del vector de recombinación homóloga del receptor de dopamina D2. ¡10Preparación defibroblastos embrionarios murinos resistentes aG4¡8. lllDetección de Micoplasma en cultivo defibroblastos embrionarios murinos (MEFs). 1/3Preparación de LIF. ll 4Titulación de LlF. Il 5Cultivo de células totipotenciales embrionarias murinas. [/6Electroporación de células ES. ll7Selección. repique, amplificación y almacenamiento de clones resistentes. [/8Transfección transitoria de células ES con un plásmido que expresa la recombinasa Cre. l l 9Congelada, almacenamiento y descongelado de células ES. II 9Diseñoy puesta a punto de una PCRpara la identificación de clonesportadoresde la recombinación. ¡20
Referencias. l 21
INTRODUCCION —
Tesis Doctoral. Diego M. Gelman. Introducción.
Introducción.
I. La Dopamina.
l,a función de la dopamina (DA) como un potencial neurotransmisor en vías
neuronales específicas del sistema nervioso central fue sugerida a fines de la década del 50
por el neurofarmacólogo Arvid Carlsson, que por este descubrimiento recibió el premio
Nobel de medicina en el año 2000. En sus trabajos demostró la existencia de Ia dopamina,
su distribución, locali7ación celular y posibles funciones fisiológicas de las catecolaminas
en el sistema nervioso central (Carlsson 1958, 1959). Posteriormente, Carlsson propuso la
existencia de receptores específicos para este neurotransmisor luego de anali7ar los efectos
de los neurolépticos clorpromazina y haloperidol en el cerebro de ratones (Carlsson y
l.indquist, ¡963). lla dopamina, la noradrenalina y la adrenalina, son las tres catecolaminas
con función biológica más estudiadas en vertebrados. El sistema catecolaminérgico central
se compone de 12 grupos de cuerpos celulares designados desde Al hasta A12, además de
los grupos Cl, C2 y C3 que producen adrenalina como neurotransmisor final (Dahlstrom y
Fuxe, 1964). Más de la mitad del contenido de catecolaminas del sistema nervioso central
está representado por la dopamina dentro de los grupos celulares de la sustancia nigra (A9),
el área tegmental ventral (AIO) y el hipotálamo (A12). El sistema dopaminérgico central ha
sido objeto de estudio no sólo por su relación con los efectos motores adversos producidos
en la enfermedad de Parkinson o por su asociación con desordenes psiquiátricos como la
esquizofrenia, sino también por la relación de la dopamina con comportamientos apetitivos,
de recompensa y de consumo compulsivo de sustancias adictivas.
Tesis Doctoral. Diego M. Gelman. Introducción.
I. I. Síntesis, Liberación y Degradación de la Dopamina.
La neurotransmisión dopaminérgica, como la totalidad de los neurotransmisores
dentro del sistema nervioso central, se encuentra regulada en múltiples pasos. En las
diferentes etapas de síntesis, almacenamiento en vesículas, liberación, recaptación y
degradación, existen variados puntos de control que permiten regular la neurotransmisión
dopaminérgica según los distintos requerimientos fisiológicos. El proceso de liberación al
espacio sináptico se produce de manera controlada, dependiendo de los potenciales
sinápticos de las neuronas y de la consiguiente entrada de Ca2+en los terminales. Por
último, la extinción de la señal de neurotransmisión dopaminérgica está regulada mediante
mecanismos de degradación y recaptación que limitan su accionar sobre la postsinapsis.
El primer paso de síntesis comien7a cuando el aminoácido L-tirosina es convertido
en el intermediario L-3,4-dihidroxifenilalanina (L-DOPA) por intermedio de la enzima
tirosina hidroxilasa (TH) (Figura l). La actividad hidroxilasa de esta enzima depende de la
presencia de tirosina y oxígeno como sustrato y de la acción de la tetrahidrobiopterina como
cofactor esencial (Daubner et aL, 1992, Zigmond 19893). La tirosina hidroxilasa catali7a el
paso limitante en la síntesis de catecolaminas, hidroxilando la tirosina a
dihidroxifenilalanina quien es subsecuentemente convertida a dopamina, norepinefrina y
epinefrina. Por lo tanto, TH es crítica para la adquisición del fenotipo catecolaminérgico.
En adultos TH es expresada en dos grupos importantes en el sistema nervioso periférico
(SNP) y en regiones discretas del sistema nervioso central (SNC) que son extremadamente
diversas. TH está presente en muchos sitios a nivel embrionario que no se mantienen a nivel
adulto como la médula espinal entre otros (Teitelman el a1., 1981; Price et aL, 1983;
Jonakait el a1., 1984; Foster e! aL, 1985; Katz er aL, 1990). Por lo tanto el patrón de
expresión en estadios embrionarios es diferente al que se observa en adultos. TH pudo ser
detectada en embriones de 8.5 días post coito en ratones (Thomas e! aL, 1995). Estudios en
grupos de células, como por ejemplo en la médula espinal ventral lateral de animales
neonatos, determinaron que TH está presente, pero no las catecolaminas, pues las otras
enzimas de la vía biosintética están ausentes (Foster et aL, 1985).
Tesis Docroral. Diego M. Gelman. Introducción.
l,a importancia de TH durante la gestación ha sido desestimada hasta que fue
demostrado que el 60 a 70% de los animales mutantes nulos para el gen de TH, mueren
entre los días de gestación embrionaria F, l 1,5 y E ¡4,5 con mas de 90% de letalidad al día
del nacimiento (Kobayashi e! aI., 1995; Zhou el aL, 1995). Como la inervación
catecolaminérgica de sus células blanco no se establecen hasta el nacimiento, el papel de
TH durante el desarrollo es diferente al de la vida adulta. La regulación espacial y temporal
de la transcripción de TH es regulada por una compleja interacción de proteínas y factores
de transcripción, actuando en sitios 5' del gen de TH de rata para activar la maquinaria de
expresión basal. Análisis mutacionales determinaron la presencia de regiones
amplificadoras que median en la expresión basal: un sitio AP-l en -205 pb y un sitio que
responde a AMPc (CRE) en —45pb (Wong e! aL, 1994). Además de los mencionados se
encontró una región entre la caja TATA y el sitio de iniciación de la transcripción. Las
secuencias AP-l , Cre y la del promotor proximal están conservadas en la región S'de todos
los genes de TH de mamíferos estudiados (O'Malley el aL, 1987; D'Mello el aL, 1988;
Patankar er aL, 1997). Para producir una expresión tejido especifica de genes reporteros
bajo el promotor de TH se hicieron animales transgénicos con longitudes variables del
promotor. Los estudios demostraron que aquellos animales con regiones del promotor
menores de 4 kb no producían un patrón de expresión comparable al gen de TH (Banerjee
et aL, 1992; Sasaoka et aL, 1992; Min et aL, 1994; Liu e! aL, ¡997). Sólo con regiones
mayores a 4,5 kb, se logró obtener una expresión comparable a la endógena con un mínimo
de expresión ectópica (Banerjee et aL, 1994; Liu el aL, ¡997;Min e! aL, 1994; Trocme e!
aL, 1998).
Como fue mencionado anteriormente, la hidroxilación de la tirosina es el paso
limitante en la biosíntesis de catecolaminas debido a la baja actividad relativa de esta
enzima. La reacción está regulada por dos procesos, uno que involucra la síntesis de nuevas
moléculas de TH y otro que involucra la activación de la enzima ya formada. La inducción
de la transcripción y traducción del gen de TH ocurre lentamente y es un proceso de larga
duración dependiente de la síntesis de ARNm y proteínas. Por el contrario, la fosforilación
de cuatro residuos de serina en la enzima es un proceso rápido, fácilmente reversible y es
Tesis Doctoral. Diego M. Gelman. Introducción.
dependiente de quinasas activadas por AMP-cíclico o por Ca2+(PKC o Ca-Calm-quinasa)
(Zigmond e! aL, l989b).
La fosforilación de la serina 40 de la enzima TH humana produce un cambio
conformacional que incrementa su actividad (Haavik el aL, 1990). Otro de los mecanismos
de control está determinado por la acumulación de producto final, capaz de frenar la vía de
síntesis. Las catecolaminas libres son capaces de inhibir competitivamente de manera
rápida y reversible a la enzima TH. Por el contrario, la liberación dopaminérgica a través
del terminal disminuye los niveles citoplasmáticos de dopamina y produce la desinhibición
de la enzima que transforma la tirosina en L-DOPA. La síntesis de L-DOPA se produce en
el citoplasma y puede ser fácilmente inhibida con drogas análogas de la tirosina, como la a
metil-p-tirosina (AMPT) que inhibe competitivamente a la enzima TH (Figura 2). El
siguiente paso lo produce la enzima DOPA-descarboxilasa que, utilizando como cofactor al
piridoxal fosfato, posee una alta eficiencia para rápidamente transformar a la I.-DOPA en el
producto final dopamina mediante la eliminación del grupo carboinO (Figura l).
L-Tlmlm
TlmlnlMi"...(Tohhldcoblopm'lmmxlgono)
HO
r4.
H0 CHJ':— coonH
L A Figura l:Camino biosintético de la dopamina. La
no” L-tlrosma‘es convertidaa L-pOl’A por Intermedio("Mon¡w) de la accron de la enzrma tirosma hidroxflasaen
presencia del cofactor tetrahidrobiopterina yoxígeno. Posteriormente, Ia L-DOPA estransformada por la enzima DOPA-decarboxilasa en
m W presenciade piridoxalfosfato para generar elneurotransmisor dopamina.
Tesis Docloral. Diego M. Gelman. Introducción.
Luego de ser sinteti7ada, la dopamina es almacenada en vesículas para asegurar la
liberación controlada (Figura 2). Este almacenaje disminuye la posibilidad de que sea
degradada en el citoplasma y de la posible difusión fuera de la célula. F,n las neuronas, la
dopamina es incorporada en las vesículas a través del transportador vesicular de
monoaminas 2 (VMATZ), un transportador de alta afinidad constituido por una bomba
dependiente del pH que introduce una molécula de dopamina por cada dos protones
eliminados, requiriendo de la hidrólisis de ATP (Schuldiner er aL, 1994). Cuando un
potencial de acción produce la despolarización del terminal sináptico, se abren canales de
Ca2+ dependientes del voltaje con el consecuente influjo de iones, lo que promueve la
fusión de las vesículas con la membrana sináptica, produciéndose la descarga del
neurotransmisor al espacio sináptico (Figura 2). La anfetamina es una potente droga
simpaticomimética que estimula al sistema nervioso central y periférico mediante la
liberación de las catecolaminas de las vesículas almacenadas dentro de los terminales
sinápticos resultando en una difusión masiva del neurotransmisor fuera del terminal (Figura
2).
Los mecanismos de degradación de la dopamina involucran la deaminación
oxidativa por intermedio de la monoamina oxidasa A y B (MAO A y B), la O-metilación
mediante la catecol O-metiltransferasa (COMT) y la conjugación llevada a cabo por
sulfotransferasas y glucuronidasas. Los productos conjugados pueden ser eliminados en la
bilis o en la orina. Esta multiplicidad en los caminos de degradación permite una rápida
eliminación del neurotransmisor. Las vías de degradación dependen de la
compartimentalización de las enzimas metabólicas que se encuentran en diferentes células y
tejidos. Las MAO se encuentran dentro de las neuronas catecolamine'rgicas, existiendo dos
isoenzimas capaces de degradar a la DA: la MAO-A y la MAO-B. Ellas se diferencian por
la especificidad celular y de tejido, por sus propiedades immunológicas y por que su acción
es bloqueada por diferentes inhibidores (Figura 3). Ambas isoenzimas son expresadas por
diferentes genes que evolucionaron de un ancestro común y se encuentran fijadas a la
membrana externa de las mitocondrias (Zhu el aI., 1992). Aunque estas dos enzimas
comparten un 60% de identidad de secuencia a nivel del promotor, presentan grandes
POOOOOOOOOOOOOOOOOOO...OOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOI
Tesis Doctoral. Diego M Gelman. Introducción.
diferencias en la expresión espacio-temporal y tejido específica (Zhu et al., 1992). La
degradación de la dopamina por intermedio de la COMT se produce de manera extracelular.
Esta enzima se expresa en las membranas de prácticamente todas las células (Figura
3). Un solo gen de COMT codifica para la forma soluble (S-COMT) y para la enzima que
está sujeta a las membranas (M-COMT), que posee una extensión adicional de 50
aminoácidos con residuos hidrofóbicos (Lotta et al., 1995).
Presinapsis Cocaína Postsinapsis-OHDA
DA
AMPT %DA
NSD-1015\¿Tisma g. DAL-DOPA O. DA
DA . 4.DAnfetamina
D!T2 DADA 0%
o DA
DA
Reserpina DOPACDA
Figura 2: Sinapsis dopaminérgica. La dopamina sintetizada en el terminal es vesiculizada a través deltransportador VMAT-2. La liberación controlada de DA se produce por el influjo de Ca2+lo que provoca launión de las vesículas a Ia membrana externa. La DA, una vez liberada, puede actuar en los receptores pre- opost- sinápticos. La síntesis puede ser bloqueada por AMPT que inhibe a la TH. El VMAT-2 es bloqueadoirreversiblemente por la reserpina. El DAT produce una rápida ¡nternalización de la DA. El agente neurotóxico6-hidroxídopamina (6-OHDA) ingresa dentro del terminal a través del DAT y produce muerte celular poroxidación. La cocaína bloquea la acción del transportador.
Tesis Doctoral. Diego M. Gelman. Introducción.
Los principales productos de degradación de la dopamina son la 3-metoxitiramina, el ácido
3.4-dihidroxifeniIacético (DOPAC) y el ácido homovainillínico (HVA). Estos compuestos
finales pueden ser conjugados con sulfato y glucuronato para facilitar su eliminación.
(Clarke e! aL, 1994, Weinshilboum y Aksoy, 1994).
El proceso más eficiente de eliminación de la dopamina del espacio sináptico para
detener la transmisión dopaminérgica sobre la postsinapsis se produce a través del
transportador de dopamina (DAT) presente en el terminal presináptico (Figura 2). Este
transportador específico incorpora la dopamina extracelular dependiendo de un gradiente de
Na+ (Amara y Kuhar, 1993). Debido a que el transportador posee secuencias consenso de
fosforilación por proteína quinasa C (PKC) es sugerido que la fosforilación mediante PKC
produce la activación del mismo (Kitayama et aL, 1994). El receptor dopaminérgico D2
presináptico es capaz de sensar la dopamina presente en el terminal y su actividad permite
modular la acción del transportador, incrementando su actividad cuando el receptor detecta
grandes cantidades de dopamina extracelular (Dickinson e! aI., 1999). Una vez recaptada
del espacio extracelular la dopamina puede ser nuevamente almacenada en vesículas para
su reutiliïación o degradada por la MAO (Figura 2).
m m <3“0‘:- "N.
J-O-Metildopnmina HVAldeidoon 0-0'.
f’”ooou
Dopanin o... HVA|— °" °"__i——_>no con
f"¿no ooou
DOPAldeído DOPAC
Figura 3: Camino metabolico de degradación de la dopamina. lntracelulannente, la dopamina esdegradada por la enzima MAO generando el metabolito DOPAC. De fonna extracelular. por la enzima COMTque Ia transforma en 3-O-metildopamina y posteriormente es convertida en HVA.
Tesis Doctoral. Diego M. Gelman. Introducción.
1.2. Sistemas Dopamine'rgicos Centrales.
El estudio de los sistemas dopaminérgicos centrales ha tomado gran relevancia
durante las últimas décadas por estar involucrado en numerosas funciones fisiológicas
como la regulación del movimiento y la postura, la relación con los comportamientos
apetitivos, de recompensa y el abuso de estimulantes y las asociaciones con varios
desórdenes psiquiátricos (Civelli el al., 1993, Graybiel, 1990, Moore el al., 1987).
El sistema dopaminérgico central de los mamíferos está comprendido por cuatro
vías neuronales principales: la vía nigroestriatal (A9), la vía mesocortical (A10), la vía
mesolímbica (A10) y la vía tuberoinfundibular (A12) (Figura 4). Las funciones mediadas
por la neurotransmisión dopaminérgica pueden ser subdivididas en los diferentes circuitos
neuronales. F,sasí como las funciones motoras están principalmente reguladas através de la
vía nigroestriatal. La vía mesolímbica participa en la regulación de los aspectos
motivacionales y emocionales mientras que la vía mesocortical participa de la integración
de información del medio ambiente y de procesos cognitivos. Por último, la vía
tuberoinfundibular está relacionada con el control de la liberación de hormonas hipofisarias.
El tracto tuberoinfundibular es un sistema neuroendócrino compuesto por neuronas
cortas ubicadas en el núcleo arcuato del hipotálamo que proyectan hacia el lóbulo
intermedio de la hipófisis y hacia el final de la eminencia media donde se encuentran los
vasos portales que irrigan la hipófisis anterior (Figura 4). Así, la dopamina liberada por este
núcleo actúa como una hormona sobre la hipófisis anterior. El lóbulo intermedio recibe
inervación directa de neuronas provenientes del grupo de células dopaminérgicas A12 que
regulan la síntesis y liberación de prolactina (Moore et al., 1987). Alteraciones de esta vía
neuroendócrina modifican la liberación de hormonas hipofisarias como la prolactina
determinando problemas metabólicos, de fertilidad y lactancia, y además pueden conducir
al desarrollo de tumores hipofisarios y adenomiosis uterina (Kelly er al., 1997, Diaz-Torga
el al., 2002).
ÏOOOOOOOOOOOOOOOOOOOO0.0COOCOOOÓOOOOOOOOOOOOOOl
Tesis Doctoral. Diego M Gelman. Introducción.
Sistema:DopaminétgicoNr'groem'iaml y:
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Figura 4: Vías dopaminérgicas centrales. Las neuronas del sistena dopaminérgico nigroestríatal (A9)poseen los cuerpos celulares en la sustancia nígra en el cerebro medio y proyectan sus axones hacia el cuerpoestriado. Esta neuronas estan involucradas en la regulación del planeamiento, la iniciación y coordinación delos movimientos voluntarios. El sitema mesocortícolímbico posee los cuerpos celulares en el área tegmentalventral (AIO) y proyecta hacia el núcleo accumbens, el hipocampo, el tuberculo olfatorio, la corteza prefrontaly entorrinal controlando funciones emocionales, motivacionales y cognitivas. La vía más corta (A12) seorigina en el núcleo arcuato del hipotálamo e inerva sobre vasos portales de la hipófisis.
F,l tracto mesocorticolímbico (AlO) se origina en el área tegmental ventral del
cerebro medio y se divide en las vías dopaminérgicas mesocortical y mesolímbica (Figura
4). F,l sistema mesocortical proyecta principalmente hacia la corte7a prefrontal, la corte7a
cingulada y la corteza entorrinal; áreas corticales relacionadas con funciones emocionales,
motivacionales y cognitivas cuya disfunción se vincula a la etiología de la esquizofrenia
(Civelli el al., 1993). El sistema mesolímbico proyecta hacia otras zonas del cerebro
anterior como el núcleo accumbens, el tubérculo olfatorio, la amígdala y la corte7a
piriforme. Este sistema despertó un gran interés al demostrarse su participación en mediar
los efectos eufori7antes y de refuerzo producidas por drogas de abuso como la cocaína, el
alcohol, las anfetaminas y los opioides (White, 1996, Di Chiara, 1995).
La vía dopaminérgica central restante y de mayor interés para este trabajo es la
nigroestriatal. Se origina en las neuronas que se ubican en la sustancia nigra pars compacta
(A9) y proyectan hacia el cuerpo estriado, una estructura asociada con el planeamiento,
iniciación y coordinación de movimientos voluntarios, así como también con un repertorio
de conductas complejas. (Graybiel, 1990) (Figura 4). Todo movimiento voluntario resulta
de estimulaciones e inhibiciones neuronales reguladas a nivel central. La posibilidad de
reali7ar movimientos coordinados siguiendo un objetivo planeado depende de estructuras
neuronales interconectadas que incorporan los estímulos externos o claves del entorno
ambiental para estimar la distancia a los objetos que nos rodean y traducir esa imagen
espacial con movimientos precisos. Las neuronas dopaminérgicas de la sustancia nigra
juegan un papel principal en el control de los movimientos mediante la correcta
estimulación de las neuronas estriatales.
En ratones, el sistema dopaminérgico mesencefálico esta determinado en el cerebro
medio ventral alrededor del día 12 de gestación embrionaria. El compromiso de esta región
para generar neuronas dopaminérgicas depende de la presencia de factores tempranos que
provienen de neuronas progenitoras de esa zona del cerebro y requiere de cascadas de
señali7ación particulares para la especificación de la identidad de neurotransmisor y para
desarrollar Ia integración adecuada del cerebro.
Tesis Doctoral. Diego M. Gelman. Introducción.
Aunque son conocidos una cantidad de genes, como engraíled l y 2, pax 2 y 5,
wm], shh y fgf8, que participan como organizadores tempranos del patrón general del
desarrollo del cerebro medio, poco se conoce acerca de los factores que participan en el
desarrollo del sistema dopaminérgico mesencefálico. Dentro de ellos se cuenta al factor de
transcripción Ptx3, cuya expresión se encuentra restringida a esta zona del cerebro y está
involucrada en determinar neuronas dopaminérgicas en la sustancia nigra, el receptor
nuclear Nurrl, miembro de la familia de receptores hormonales esteroideos-tiroideos, que
es esencial para la diferenciación terminal de las neuronas dopaminérgicas que se originan
en la sustancia nigra y el área tegmental ventral y el factor melb, quien constituye una
cascada molecular independiente de Nurrl y es esencial para el desarrollo de las neuronas
de esta región (Zetterstróm e! aL, 1997; Castillo et aL, l998;Smidt et aL, 2000; Nunes et
aL, 2003).
La proyección de las neuronas nigroestriatales se dividen en las que proyectan hacia
los estriosomas del caudado putamen, o las que hacen sinapsis sobre la matriz del estriado
(Graybiel et aL, 1994). Esta vía aporta el 70 % del contenido total de dopamina del cerebro
y su importancia está demostrada porque su degeneración conduce a la fisiopatología de la
enfermedad de Parkinson cuyos síntomas motores comien7an a hacerse evidentes una vez
que el contenido de dopamina disminuye por debajo del 25% de sus valores normales
(Homykiewicz, 1966).
Además de las mencionadas, existen intemeuronas dopaminérgicas cortas en el tallo
encefálico, el ganglio cervical superior, la retina, el bulbo olfatorio y los cuerpos carotídeos
(Mc Geer el aI., 1978).
Tesis Doctoral. Diego M. Gelman. Introducción.
1.3. Receptores Dopamine'rgicos
1.3.I. Clasificación
La primera clasificación sugirió la existencia de dos subpoblaciones de receptores
dopaminérgicos según su capacidad o no de estimular a la enzima adenilato ciclasa. Los
receptores DI estaban positivamente ligados a la activación de la adenilato ciclasa y los
receptores D2 no estaban ligados a esta enzima o lo hacían de una manera inhibitoria
(Kebabian y Calne, ¡979). Sin embargo, se hacía cada vez más dificil acomodar las nuevas
funciones atribuidas a la dopamina en la antigua clasificación Dl/D2. La utilización de
técnicas de biología molecular expandió los conocimientos con el clonado de nuevos
receptores para dopamina. El receptor D2 fue el primer receptor dopaminérgico clonado
mediante una técnica para descubrir nuevos receptores homólogos que se acoplan a proteína
G. Realizando hibridaciones con una sonda de receptores B-adrenérgicos a partir de una
biblioteca genómica de rata, en condiciones de baja rigurosidad, se obtuvo una secuencia
genómica parcial con una significante homología a los receptores B-adrenérgicos (Bunzow
etu1., ¡988). Esta secuencia fue uti|i7ada para obtener, a partir de una biblioteca de cerebro
de rata, el ADNc completo del receptor dopaminérgico D2 que codifica para una proteína
de 415 aminoácidos. Posteriormente, fue clonado el homólogo humano del receptor DZ
mostrando un 96 % de identidad presentando solo la eliminación de un aminoácido (Grandy
et aL, 1989). El conocimiento de esta secuencia permitió el clonado del receptor Dl de rata
y humano con una expresión tan abundante en el cerebro como la del receptor D2 (Zhou e!
aL, ¡990, Dearry el aL, 1990, Sunahara et aL, 1990). Luego se clonaron nuevos genes de
receptores dopaminérgicos menos abundantes. Así, se clonó el gen del receptor D3 de rata y
humano (Sokoloff e! aL, 1990, Giros et aL, 1990), el gen humano del receptor D4 (Van Tol
el aL, 1991) y el gen del receptor D5 humano y su contrapartida de rata (Sunahara el aL,
¡991, Tiberi el aL, 199]). El descubrimiento de S subtipos de receptores dopaminérgicos
necesitó replantear una nueva clasificación de los receptores que fueron divididos en los de
“tipo Dl” y los de “tipo DZ” (Tabla l). Esta clasificación se basa en la estructura genómica,
la secuencia primaria, el acople a segundos mensajeros y el perfil farmacológico de los
diferentes receptores.
l.0.00...0.00.0....O...OOOOCOOOOOOOOOOOOOOOOOO1
Tesis Doctoral. Diego M Gelman. Introducción.
Actualmente los receptores de “tipo D1” comprenden al receptor D1 y D5, codificados
en humanos por genes que carecen de intrones (Sunahara et al., 1990 y 1991, Zhou et al.,
1990) (Tabla 1). También, existen en humanos dos pseudogenes del receptor D5 (Nguyen et
al., 1991). Los receptores de “tipo D2” incluyen al D2, D3, y D4. Estos tres genes comparten
características comunes como la presencia de intrones y exones (Tabla 1). El receptor D2 se
caracteriza por poseer principalmente dos variantes, D2 corto (D2C) y D2 largo (D2L)
producidas por la inclusión alternativa del 6toexón (Dal Toso et aL, 1989). El receptor D3 está
constituido por un gen que codifica para una proteína de 400 aminoácidos y también presenta
una variante corta D3gly9de 342 aminoácidos (Rietschel et al., 1995). El receptor D4 posee
múltiples variantes polimórficas que se encuentran en diferentes porcentajes dentro de las
distintas etnias (Líchter et al., 1993, Van To] et al, 1991, 1992). Todos los receptores
dopaminérgicos clonados pertenecen a la superfamilia de receptores que interactúan con la
proteina-G. La estructura de estos receptores predice, basados en el análisis de hidrofobicidad,
7 pasajes transmembrana con el grupo amino-terminal del lado extracelular y el carboxi
terminal dentro del citoplasma (Figura 5) (Sibley y Monsma, 1992). La presencia en todos los
subtipos de un residuo de aspartato en la región extracelular del 3erdominio transmembrana]
junto a 2 residuos de serína en el quinto, son candidatos importantes para explicar la unión de
los grupos amino y catecol de la dopamina al receptor (Javitch et al. , 1995).
Tabla l: Propiedades de los Receptores Dopaminérgicos
Cantidades de Homologla Localización Aeople a segundos Localización Propiedadesnmiotcidos de mensajeros farmacológicas
secuencia orgmiucionHumano Raton Dl Dz “0mm” m. vm General Selectiva Agonis- Anmgo
G efectoras las nisus
DI 446 446 - 44% cr. 5 Gs incrementa Cuerpo estriedo Amlgdala SKF 38393 SCH 23390carece de AMPc Núcleo ucumbens R (+) SKF SKF83566intrones Tuberculo . 8 l297
olfnorloD5 477 475 80% 46% cri4 Gs incrementa Hipocempo Núcleo dihidrexedina SCH 39166
carecede AMPc Hipotílemo pmfusiqlarintrones
2
D25/D2L 414/443 4 l5/444 44% ‘ cr. l l Gi/Go disminuye Cuerpo estrth SNpe (+) PHNO Rnelopride7 intrones AMPc Núcleo ¡cumhens VTA Pergolide Domperidone
2 ¡sofa-ms activa Tuberculoolfflorio Hipófisisemp canales K
altemetivo bloqueaanales Ce
D3 400 446 4l% 75% cr. 3 Gi/Go disminuye Núcleo ncumbens Isla de PD ¡28907 (+) S ¡42975 intrones AMPc Tuberculoolfehorio Calleja 7-0H-DPATvarimtes Hipotállmo SNpc 'd'une-dm VTA
D4 387 385 41% 53% cr. ll (ii/Go disminuye Cortez: prefiomal Corazon (+) PHNO Cloupina3 intrones AMPc Hipocampo CP 226269 PNU ¡01387
Dll] cantidad Cerebelo CP 2930l9de
14
Tesis Doctoral. Diego M. Gelman. Introducción.
1.3.2. Estructura Genómica.
El clonado de los cinco receptores dopaminérgicos permitió establecer similitudes y
diferencias que llevaron a agrupar a los receptores DI y D5 como los de “tipo Dl” y a los
D2, D3 y D4 como de “tipo D2”. Los genes de los receptores Dl y D5 humanos están
codificados en los cromosomas 5 y 4 respectivamente. La ausencia de intrones y la
conservación de sus secuencias indican un origen evolutivo común y diferente al de los
receptores de “tipo DZ”. El gen del receptor D] humano locali7ado en el cromosoma 5
posee al menos dos sitios potenciales de inicio de la transcripción y tres sitios posibles
fueron observados en el gen de rata (Monsma et aL, 1990, Zhou et aL, 1990). Existen dos
pseudogenes del receptor D5 que se encuentran en los cromosomas humanos l y 2, y
codifican para formas incompletas de ¡54 aminoácidos (Nguyen e! aL, 1991, Grandy et aL,
199]). En ambos casos un sitio de terminación prematura se encuentra luego del tercer
fragmento transmembrana. Se ha descripto una expresión muy baja de estos genes pero
hasta el momento se desconoce si estos péptidos cumplen algún papel fisiológico (Nguyen
et al. l99l, Grandy e! aL, 199]). La emergencia de dichos pseudogenes es un evento
reciente en la evolución de los mamíferos debido a que éstos no han sido encontrados en
diferentes especies de monos y sólo uno de ellos está presente en los gorilas (Marchese et
al.,l995). Los tres genes que codifican para los receptores de “tipo D2” poseen exones e
intrones. El gen del receptor D2, compuesto por 8 exones codificados en el cromosoma l l,
presenta dos variantes, una corta y otra larga, que se producen por empalme alternativo (Dal
Toso et aL, 1989). Este mecanismo de empalme permite eliminar o incorporar 29
aminoácidos del tercer dominio intracitoplasmático, una zona involucrada en el acople a
segundos mensajeros. Ambas variantes del receptor D2 son generadas en los mismos
tejidos tanto en humanos como en rata, ratón y bovino lo cual no predice un mecanismo de
regulación diferencial, sin embargo, la relación exacta entre las dos isoformas puede variar
significativamente (O’Malley el aL, 1990; Snyder el a1., 199]; Gandelman e! aL, 1991).
Ambas isofonnas poseen capacidades similares de inhibir la adenilato ciclasa (Di Marzo e!
(11..¡993), activar los canales de K+(Einhom el aL, 199]), potenciar la liberación de ácido
araquidónico (Kanterman e! aL, |99|) y mediar la represión transcripcional del gen de
prolactina de rata (McChesney el aL, 1991).
Tesis Doctoral. Diego M Gelman. Introducción.
Sitios de unióndel
E ¿grupoamino
Sitios deglicosilación
grupo catecol
Pegado a proteínaG
largo en Dl y DS
Lado
Figura 5: Topología de los receptores dopaminérgicos. Estructura de 7 pasos transmembrana de losreceptores dopaminérgicos con el extremo carboxi-terminal del lado intracitoplasmático y el amino-terminaldel lado externo. El tercer dominio intracitoplasmático interactúa con la proteína G. Se muestran también lossitios de glicosilacíón externos y de fosforilación internos que regulan la actividad de los receptores. Tambiénse muestran las posiciones en los dominios transmembrana que son importantes para la unión a la dopamina.
El gen del receptor D3 también tiene múltiples exones y se encuentra en el
cromosoma 3 humano. El gen humano presenta una homología del 88% en su estructura
con respecto al de rata. El receptor humano carece de 46 aminoácidos en el tercer dominio
intracitoplasmátíco, resultando en una proteína de 400 residuos de largo. Existen por lo
menos dos variantes del receptor D3 que son producidas por empalme alternativo de exones
(Giros et aL, 1991). El gen del receptor D4 consta de 4 exones y está localizado en el
cromosoma humano 11 a] igual que el receptor D2. Sin embargo, se diferencia de los genes
de los receptores D2 y D3 por estar codificado por un menor número de exones y a su vez,
estos exones, estar comprendidos en una menor extensión del genoma (4 kb).
l,a homologia a nivel genómico con el receptor D2 es del 41% y del 39% con la del
receptor D3. El receptor D4 humano consiste de una proteína de 387 residuos que puede
cambiar debido a la presencia de diferentes variantes polimórficas que se locali7an en
secuencias codificantes (Van Tol et aI., 1992).
1.3.3. Estructura Aminoacídíca.
Los receptores dopaminérgicos pertenecen a la superfamilia de receptores de
neurotransmisores y hormonas que realizan funciones efectoras específicas acoplándose a
distintas proteínas reguladoras G. Los receptores de “tipo Dl” activan a la adenilato ciclasa
incrementando los niveles de AMPc intracelulares mientras que los receptores de “tipo D2”
ejercen una influencia inhibitoria sobre esta enzima (Andersen el aL, 1990) (Tabla l). Los
receptores de “tipo D2” se encuentran también ligados a la activación de canales de K+,a la
inhibición de canales de Ca2+y la reutilimción de fosfatidilinositol (Vallar y Meldolesi,
¡989). La secuencia de aminoácidos de los receptores dopaminérgicos revelan una
estructura de 7 segmentos transmembranales compuestos por aproximadamente 20 a 25
residuos hidrofóbicos cada uno que separan 3 dominios intracelulares y 3 extracelulares
compuestas por residuos altamente hidroñlicos (Figura 5). La región N-terminal es
extracelular y la C-terminal es intracelular. Las secuencias aminoacidicas de los receptores
dopaminérgicos dentro de sus segmentos transmembranales mantienen un 31% de
homología entre los 5 subtipos. Si se comparan entre si los receptores de “tipo Dl” este
porcentaje aumenta hasta el 75%, y hasta el 52% comparando entre si los receptores de
“tipo DZ” (Civelli e! aL, ¡993). El tercer dominio intracitoplasmático, importante para el
acople a proteína G, es mayor en los receptores de “tipo D2” quienes también tienen una
porción C-terminal más corta. Los mecanismos de regulación incluyen un sitio de
palmitoilación en un residuo de cisteína conservado en la porción C-terminal de los
receptores dopamine’rgicos, que le permite el anclaje a la membrana (O’Dowd e! aL, 1989),
y también la presencia de residuos de serina y treonina que pueden servir como sitios de
fosforilación regulatoria (Figura 5). Los cinco subtipos de receptores dopaminérgicos
presentan secuencias consenso para sitios de glicosilación en el dominio N-terminal y en
otras regiones extracelulares (Figura 5).
Tesis Doctoral. Diego M. Gelman. Inlroducción.
1.3.4. Localización.
Los estudios de loca|i7ación de los receptores dopaminérgicos en el cerebro
involucran técnicas de biología molecular como hibridación de Northern e hibridación in
situ que determinan la presencia de ARNm pero no necesariamente la expresión de proteina
en la membrana. Además, debido a que muchas neuronas dopamine’rgicas poseen sus
cuerpos celulares muy distantes de sus proyecciones axonales es importante discriminar la
presencia de ARNm de la expresión proteica en la membrana. Para observar la expresión en
la membrana se explotaron técnicas de farmacología realizando unión de ligandos marcados
y autoradiografia. Las primeras generaciones de ligandos no permitían una buena
discriminación entre los 5 diferentes subtipos de receptores dopaminérgicos, pero el
desarrollo posterior de nuevos fármacos y la utili7ación de técnicas de sustracción
permitieron estimar la localización y los niveles de expresión de los receptores (Tarazi e!
aL, 1997, Defagot et aL, 2000). Un aporte importante a la determinación exacta de la
ubicación de los receptores fue alcanzado con el desarrollo de técnicas inmunológicas y la
utili7ación de anticuerpos específicos contra diferentes subtipos de receptores (Ariano el
aL, 1997, Defagot el aI., 1997).
La distribución del ARNm del receptor Dl, determinada por hibridación de
Northem e hibridación in situ, mostró que las zonas de mayor expresión corresponden al
caudado putamen, al núcleo accumbens y al tubérculo olfatorio y ,en menores niveles, en la
corteza cerebral, el hipocampo, la amígdala, el hipotálamo y el tálamo (Fremeau et aL,
l99l ). No se detectó ARNm del receptor Dl en sustancia nigra pars reticulata, globo pálido
y núcleo subtalámico, aunque si una cantidad importante de sitios de unión, determinando
que estos receptores estarian expresados en neuronas aferentes de otras áreas del cerebro
(Le Moine el aL, 199]). Por otra parte no se detectó expresión de ARNm ni de proteína en
las dos áreas dopaminérgicas más importantes como la sustancia nigra pars compacta y el
área tegmental ventral, lo que descartaría una función de autoreceptor presináptico para el
receptor Dl (Fremeau et aL, l99l) (Tabla l).
La distribución del receptor DS es distinta de la del receptor D], presentando una
locali7ación acotada a estructuras limbicas dentro del sistema nervioso central (Tiberi et aL,
l99l). El ARNm del receptor DS se encuentra en el núcleo mamilar lateral y en el núcleo
Tesis Doctoral. Diego M. Gelman. Introducción.
GABAérgicas y también en neuronas piramidales de la corte7a prefrontal (Mrzljak e! aL,
1996) (Tabla l). Experimentos de inmunomarcación realizados en ratas también
determinaron una alta expresión de proteína en corte7a frontal y parietal y niveles menores
en el tálamo, globo pálido e hipocampo y niveles aún más bajos en el caudado-putamen
(Ariano el al. , 1997).
1.3.5.Segundos Mensajeros
Una de las grandes incógnitas que rodea a los receptores dopaminérgicos consiste en
determinar la existencia o no de una activación individuali7ada en la cascada de segundos
mensajeros. Los experimentos de transfección de células son una herramienta importante
para determinar las propiedades de transducción de señales de los diferentes subtipos de
receptores. Mediante esta técnica se puede expresar un único tipo de receptor en alta
densidad para estudiar los mecanismos de activación. Sin embargo, presenta la desventaja
de que los sistemas de transducción de señales intracelulares presentes en estas células
pueden no coincidir con los existentes en los distintos tipos neuronales que expresan a cada
receptor. Es sabido que los receptores de “tipo Dl” se acoplan de manera positiva a la
adenilato ciclasa, es decir que su estimulación induce el aumento de los niveles
intracelulares de AMPc (Grandy el a1., 199] , Sunahara e! aI., 1990). Los receptores de “tipo
D2” son menos uniformes en su actividad, si bien todos tienen la capacidad de inhibir la
formación de AMPc, el receptor D2 lo hace en todas las líneas celulares mientras que los
receptores D3 y D4 inhiben con menor eficiencia y sólo en algunas líneas. El receptor DZI,
es capaz de aumentar el inositol fosfato sólo en una línea celular de fibroblastos (Tang e!
aL, 1994). Otros estudios determinaron que el receptor D2 y el D4 pueden aumentar Ia
liberación de ácido araquidónico pero por vías diferentes. El primero lo hace por intermedio
de Ia activación de la proteína quinasa A y el segundo por intermedio de la proteína quinasa
C (Chio eta1., 1994; Di Marzo el aL, 1993).
20
Tesis Doctoral. Diego M. Gelman. Imroducción.
parafascicular del tálamo, como así también en algunas áreas del hipocampo (Tiberi et aL,
199]). En estudios realizados con anticuerpos se ha localizado la presencia del receptor D5
en intemeuronas colinérgicas dentro del cuerpo estriado de monos (Bergson e! aI., 1995)
(Tabla l). La ausencia de sitios de unión del receptor D5 en zonas donde se encuentra la
expresión del ARNm permite suponer que este receptor es sinteti7ado en los cuerpos
neuronales y transportado hasta los terminales sinápticos. Esto indicaría una localización
presináptica de los receptores D5 que rara ve7. se superponen o coexpresan con los
mensajeros del receptor Dl.
El otro receptor ampliamente expresado en el sistema nervioso central es el receptor
D2, cuyo ARNm se encuentra predominantemente en el caudado putamen, el tubérculo
olfatorio y en el núcleo accumbens (Gerfen et aL, 1990, Bunzow et aL, 1988). Otras zonas
de expresión de los receptores D2 son la sustancia nigra pars compacta y el área tegmental
ventral. La expresión en estas áreas posiciona al receptor D2 como el más importante en la
regulación presináptica de la actividad de las neuronas. El ARNm del receptor D2 ha sido
localizado en el lóbulo anterior e intermedio de la hipófisis cumpliendo un papel principal
en la regulación de la liberación de la prolactina y a-MSH, respectivamente (Rene el aL,
1994) (Tabla l).
La expresión del receptor D3 esta confinada a estructuras mesolímbicas inervadas
por neuronas dopaminérgicas del área tegmental ventral. F,l tubérculo olfatorio, las lslas de
Calleja y la cubierta del núcleo accumbens expresan el ARNm del receptor D3, indicando
que este receptor participa en funciones límbicas y podría ser un blanco primario de los
neurolépticos y antipsicóticos. Bajos niveles de expresión de ARNm fueron hallados en el
caudado putamen y a la vez altos niveles se encontraron en la sustancia nigra pars compacta
y en el área tegmental ventral (Tabla l). Aún no ha sido determinado si existe coexpresión
con las neuronas que expresan el receptor D2 aunque la expresión del receptor D3 es de un
orden de magnitud menor que la del D2 (Levant, 1997).
l.a mayor expresión del receptor D4 se observa en la corteza frontal, el mesencéfalo,
el hipotálamo y la amigdala; todas estas áreas inervadas por las neuronas dopaminérgicas
provenientes del área tegmental ventral (Van Tol et aL, 1991). Utili7ando anticuerpos
contra el receptor D4 en monos se determinó su localización específica en neuronas
Tesis Doctoral. Diego M. Gelman. Introducción.
1.3.6. Propiedades Farmacológicas.
Debido a la alta homología de secuencia existente entre los segmentos
transmembranales de los receptores dopaminérgicos dentro de una misma subclase, se
pueden observar similares propiedades farmacológicas. Estos sitios de gran identidad están
involucrados en la unión al ligando. En el caso de los receptores de “tipo Dl”, presentan
características distintivas como la alta afinidad por las benzacepinas (SCH 23390, SKF
38393) y baja afinidad por butirofenonas (espiperona, haloperidol) y ben7amidas sustituidas
(sulpirida). Una característica sobresaliente es que el receptor DS posee 3 veces mayor
afinidad por la dopamina que el receptor Dl. Las propiedades principales de los receptores
de “tipo D2” están determinadas por una alta afinidad por las butirofenonas, fenotiazinas
(clorpromazina) y las ben7amidas (raclopride, sulpirida y nemonapride) y presentan
también una baja afinidad por las benzacepinas. El receptor D4 presenta la particularidad de
desarrollar menores afinidades por la mayoría de los antagonistas dopaminérgicos. Sin
embargo, revela una afinidad lO veces superior por el neuroléptico atípico clozapina. Esta
característica condujo a la especulación de que el receptor D4 podría ser el mediador
principal de la acción de este neuroléptico (Van Tol el aL, 199]). La farmacología clásica
aún no ha podido generar herramientas para poder discriminar la acción de un solo subtipo
de receptor dopaminérgico. La existencia de reactividad cruzada en la acción de las drogas
específicas imposibilita determinar el aporte individual de los receptores a un
comportamiento observado. Sin embargo, se han desarrollado y generado modelos de
genética molecular para producir animales deficientes en la expresión de un solo subtipo de
receptor dopaminérgico. En estos ratones genéticamente modificados es posible estimar las
funciones específicas de los receptores eliminados, estudiando las alteraciones
comportamentales y neurofisiológicas producidas.
1.4. Receptor DZ.
Debido a que el presente trabajo involucra principalmente al receptor dopaminérgico
D2, a continuación se presenta una descripción más detallada de sus características y
propiedades.
2|
Alteraciones en el sistema dopaminérgico D2 han sido implicadas en una variedad
de desórdenes psiquiátricos y neurológicos que incluyen a la esquizofrenia, la enfermedad
de Parkinson, Huntington, hiperactividad y déficit de atención (ADHD) y la adicción a
drogas de abuso. Las drogas utilizadas habitualmente para el tratamiento de Parkinson o
esquizofrenia son agonistas o antagonistas D2 respectivamente, lo que sugiere que ese
receptor está desempeñando un papel muy importante en esas dos enfermedades.
Como fue mencionado anteriormente, existen dos isoforrnas del receptor
dopaminérgico D2: D2L y D2C (Bunzow et aI., 1988; Dal Toso e! aL, 1989; Giros el aL,
¡989; Monsma er aL, 1989; Chio el aL, 1990; Mack er aL, 1991). l-lllos son generados a
partir del mismo gen por empalme alternativo del sexto exón. El receptor DZL tiene una
inserción de 29 aminoácidos en su secuencia en la tercera porción intracitoplasmática, la
que está ausente en el D2C. La tercera porción intracitoplasmática de los receptores
acoplados a proteínas G es crítica para la interacción con efectores intracelulares (O'Dowd
el aL, 1988). En líneas de células transfectadas se demostró que el D2L y D2C se acoplan a
distintas proteínas G inhibitorias mostrando una afinidad diferente cada una de ellas (Dal
Toso e! aI., 1989; Senogles, 1994; Guiramand e! aI., ¡995; Boundy el a1., 1996). Las dos
isofonnas del receptor coexisten en el cerebro pero sin embargo la relación de expresión de
uno y otro varía en cada región. El D2L comprende el 80% del total del receptor D2 en todo
el cerebro, pero si se toma sólo el estriado ese valor llega al 90% del total (Mack el aL,
1991). Las diferencias en la estructura de la proteína, el patrón de expresión y la interacción
con efectores intracelulares, sugieren que las dos isofonnas tienen funciones particulares.
Por otro lado, la etiología de los déficits motores y las psicosis, involucran a diversas
regiones del cerebro y la relación de la expresión de cada isoforrna del receptor D2 en cada
una de ellas varía. Se ha demostrado por medio del uso de animales deficientes para el
receptor D21, que cada una de las variantes tiene funciones específicas y que ellas no se
superponen. La actividad presináptica del receptor D2, examinada por medio de la
administración de quinpirole, sigue siendo funcional en estos mutantes mientras que la
catalepsia mediada por haloperidol se pierde, sugiriendo que esta droga actúa,
principalmente, por medio de los receptores D2L (Wang et aL, 2000; Usiello el aL, 2000).
Tesis Doctoral. Diego M. Gelman. Introducción.
Por lo tanto, existe la posibilidad de que el D2], y D2C desempeñen papeles diferenciales
en las terapias anti psicóticas y anti Parkinsonianas.
l.a liberación y recaptación de la dopamina está severamente afectada por drogas de
abuso como cocaína y anfetamina y se postuló que niveles anómalos de dopamina son los
responsables de alteraciones vistas en enfermos psiquiátricos como los esquizofrénicos. Los
receptores de tipo 2, principales blancos de drogas antipsicóticas, se expresan como
receptores postsinápticos así como autoreceptores presinápticos. Como receptores
presinápticos están regulando los niveles extracelulares de dopamina. Los autoreceptores de
tipo 2 de dopamina que inhiben la liberación estímulo dependiente del neurotransmisor se
encuentran en las dendritas así como en las regiones terminales del axón (Cooper el al.,
1996; Saller y Salama, 1984; Nissbrandt et al., 1985; el Mestikawy y Hamon, 1986; Strait y
Kuczenski, 1986; Goldstein el al., 1990; Tepper y Groves, 1990; Westernik e! al., 1990;
Chen et al., l99l; Mercuri et al., 1992; Sesak et al., 1994). Debido a que se postuló que ese
tipo de autoreceptores participa en la acción de antipsicóticos (Hetey et al., 1991), drogas
psicoestimulantes (Brodie y Dunwiddie, 1990; Bemardini era1., 1991; Zhang et al., 1992;
Pitts el aI.. 1993; Silvia e! al., ¡994; Xue el al., 1994), y comportamiento sexual (Hull el
al., 1990) entre otros, los mecanismos por los cuales los autoreceptores están mediando la
liberación de dopamina han recibido gran atención. Los receptores presinápticos proveen un
importante control negativo durante la liberación de dopamina actuando sobre el nivel de
disparos de potenciales de acción de la neurona, la síntesis y la liberación (Roth, 1984;
Starke e! al., 1989). La inhibición presináptica previene la excesiva liberación de
neurotransmisor en condiciones normales y patológicas (Thompson el al., 1993) y juega un
papel muy importante en ajustar la fuer7a sináptica (lsaacson et al., 1993; Wu y Saggau,
1997). Además de regular la tasa de disparos, la síntesis y liberación de dopamina, se ha
propuesto en diversos trabajos que existe una interacción entre el autorreceptor de
dopamina y el transportador de dopamina posiblemente provocando efectos a largo plazo en
la expresión de dicho transportador (Meiergerd et al., 1993; Cass y Gerhardt, 1994;
Batchelor y Shenk, 1998; Kimmel e! al., 2001; Mayfield y Zahniser, 200]).
Tesis Doctoral. Diego M. Gelman. Inlroducción.
l. 5. Anatomía yfisiología de los ganglios dela base
El te'rmino ganglios de la base hace referencia a un grupo de estructuras
subcorticales que incluye los núcleos caudado, putamen, pallidum, núcleo subtalámico y la
sustancia nigra (pars compacta y pars reticulata; SNpc y SNpr). El caudado y el putamen
son dos estructuras separadas en primates, aunque en roedores están unidos en un conjunto
al que se denomina neostriatum, o simplemente estriado. El pallidum consta de dos partes,
globo pálido interno (GPi) y externo (GPe).
Estas estructuras se relacionan anatómicamente constituyendo un complejo circuito
que involucra además gran parte de la corte7a cerebral y varios núcleos talámicos (para
revisión ver Kawaguchi, 1997; figura 6). Pese a que poseen una compleja participación en
aspectos cognitivos y motivacionales de la conducta, la función más clara y mejor
comprendida de los ganglios basales está relacionada con el control del movimiento
incluyendo las etapas de adquisición, planeamiento, ejecución y coordinación del mismo.
Los ganglios de la base establecen un circuito de entrada y salida (loop) con la
corte7a cerebral. El estriado recibe aferencias de todas las regiones del córtex, y aún de
estructuras filogenéticamente antiguas como el hipocampo y la amígdala. Las fibras
corticales tienen un efecto excitatorio sobre las neuronas estriatales, mediado por el
glutamato a través de receptores tipo AMPA/kainato y NMDA (para revisión ver Calabresi
e! aL, 1996). La otra aferencia estriatal de gran relevancia funcional está constituida por los
axones dopaminérgicos provenientes de la SNpc. El 95% de las neuronas estriatales
pertenece a una misma categoría; se las conoce como neuronas espinosas estríofugales. Se
trata de células GABAérgicas con numerosas espinas dendríticas sobre las que terminan las
aferencias corticales y nigrales, que ejercen su acción inhibitoria fuera del estriado (para
revisión ver Chevalier y Deniau, 1990). Se reconocen dos subcategorías: a) un 50% que
proyecta sobre el GPe, expresa el receptor dopaminérgico D2 y uti|i7a como cotransmisor
del GABA una encefalina y b) el restante 50% envía sus axones al GPi o a la SNpr, expresa
el receptor dopaminérgico Dl, y utili7a como cotransmisor a los péptidos sustancia P y
dinorfina (para revisión ver Kawaguchi, 1997; figura 6). El restante 5% de las neuronas
estriatales son intemeuronas, entre las que se destaca un subtipo de grandes células
colinérgicas sin espinas dendríticas.
24
TesisDoctoral. Diego M Gelman. Introducción
CORTEZA CEREBRAL
l Frontal0 II A
ESTRIADO
YA (NúcleoAferente) LV02' ‘ V D1
VíaDirecta
sustancia P
V
GPe ’ __ o Tálamoo o iSNpc
NSTV GPiISNpr Y
TaIIo Cerebral (NúcleosEferentes)Médula Espinal
Figura 6. Diagrama de las conexiones entre los ganglios de la base y estructuras talamocorticales. Enrojo se representan neuronas GABAérgicas, en negro glutamatérgicas y en azul las dopaminérgicas de la víanigroestriatal. Los núcleos eferentes (globo pálido interno y sustancia nigra pars reticulata) se representanjuntos por su relación funcional, aunque constituyen estructuras anatómicamente separadas.
Mientras el estriado funciona como la estructura de entrada de información de los
ganglios de la base (núcleo aferente), el GPi y la SNpr conforman los núcleos de salida
(núcleos eferentes). El GPi y la SNpr también están constituidos por neuronas
GABAérgicas, que en este caso proyectan sobre núcleos talámicos y del tronco encefálíco.
Los núcleos eferentes reciben información del estriado a través de dos circuitos: el circuito
directo, representado por la proyección de las neuronas estriofugales que contienen
receptores D1, sobre el GPi y la SNpr; y el circuito indirecto, formado por las proyecciones
del estriado que poseen receptores D2, hacia el GPe, de éste al NST, y por fin del NST
25
Tesis Doctoral. Diego M. Gelman. Introducción.
hacia los núcleos de salida (para revisión ver Gerfen y Wilson, 1996; Wichman y Del.ong,
1996; figura 6). La composición de estos circuitos hace que el resultado de la aferencia
dopaminérgica hacia el estriado sea el mismo para las vías directa o indirecta: el tálamo es
liberado del tono inhibitorio y aumenta la liberación de glutamato cn la corteza.
Como ya mencionamos, prácticamente toda la corte7a cerebral tiene proyecciones
sobre el estriado. La proyección corticoestriatal está ordenada topográfica y
somatotópicamente, de tal modo que las regiones corticales motoras (áreas motora primaria,
premotora y motora suplementaria) se conectan con el putamen (distrito motor del estriado),
mientras las regiones asociativas de la corteza frontal, parietal y témporo-occipital lo hacen
con el núcleo caudado (distrito cognitivo). La segregación anátomofuncional observada a
nivel estríatal parece extenderse a los núcleos eferentes y a los territorios talámicos sobre
los que éstos se proyectan. La corteza frontal recibe el ‘resultado‘ del procesamiento de
información reali7ado en los ganglios basales (figura 6).
Cada neurona espinosa estríofugal recibe unos 10.000 contactos sinápticos
provenientes de más de 1.000 neuronas corticales. Los axones corticoestriatales terminan en
la cabeza de las espinas dendrítica y la liberación de glutamato es capaz de provocar la
descarga de potenciales de acción. Las sinapsis dopaminérgicas nigroestriatales se locali7an
en el cuello de las espinas dendríticas de las neuronas estriofugales, una posición desde la
que pueden regular selectivamente la influencia de las aferencias corticales (figura 7). La
DA no es capaz de producir por si sola grandes cambios de potencial postsináptico pero
ejerce un control aumentando o reduciendo la probabilidad de disparo de las neuronas
estríofugales, al actuar sobre receptores Dl o D2 respectivamente (Smith y Bolam, 1990;
Gerfen et a1., 1990).
Tesis Doctoral. Diego M Gelman. Introducción.
Aferencias
pyglutamatérgicascorticales
Neuronaespinosaestriofugal Neuronas
dopaminérgicasnigroestriatales
lnterneuronascolinérgicas
Figura 7. Contactos sinápticos sobre las neuronas espinosas estríofugales. Las fibras corticalesdescendentes (glutamatérgicas, en rojo) hacen sinapsis en la cabeza de las espinas dendríticas distales. Encambio, las aferencias dopaminérgicas nigroestriatales (en azul) terminan en el cuello de estas espinasdendríticas. Las intemeuronas colinérgicas hacen contactos en posiciones más proximales al soma. (Adaptadode Feldman et al., 1997).
En cuanto a las proyecciones sobre los núcleos eferentes, el NST posee un tono
glutamatérgico excitatorio sobre las neuronas del GPi y la SNpr (figura 6), provocando una
descarga espontánea tónica de potenciales de acción (Robledo y Féger, 1990). Esto produce
una inhibición sostenida de los núcleos talámicos de relevo. Cuando las neuronas
GABAérgicas estriatales de la vía directa descargan una salva de potenciales de acción, las
neuronas del GPi y la SNpr son inhibidas, y consecuentemente, liberan al tálamo de esta
influencia inhibitoria tónica. Así, por desinhibición se produce la activación de un grupo de
neuronas talámicas, y de las neuronas corticales que ellas inervan. La activación de
Tesis Doctoral. Diego M. Gelman. Introducción.
diferentes grupos de neuronas talámicas y corticales se refleja en acciones conductuales o
fenómenos cognitivos. Los receptores D] estriatales actúan reforzando la activación de esta
vía directa.
La excitación de las neuronas estríofugales de la vía indirecta tiene un efecto
inhibitorio sobre el GPe, resultando en una liberación del NST y por lo tanto en una mayor
activación de los núcleos eferentes (para revisión ver Wichmann y DeLong, 1996). Esto
conduce a una inhibición más fuerte del tálamo, y menor activación de la corte7a frontal.
Los receptores D2 se oponen a este resultado por su efecto inhibitorio sobre la vía indirecta.
Por último, cabe recordar que los ganglios de la base poseen también funciones ‘no
motoras’. El núcleo caudado (el distrito cognitivo del estriado) está estrechamente
relacionado funcional y anatómicamente con la corte7a frontal asociativa, participando de
forma coordinada en procesos como la memoria de trabajo, la memoria de hábito y la
atención (Knowlton et aL, ¡996). También se ha implicado a los ganglios de la base, y en
particular al núcleo caudado, en las alteraciones obsesivo-compulsivas del comportamiento.
I.6. Enfermedad de Parkinson
En 1817 el me’dico londinense James Parkinson describió un grupo de pacientes con
desórdenes en la función motora en su “Essay on the shaking palsy”. La sintomatología
identificada incluía temblor, una postura contraida y dificultades en la iniciación de
movimientos voluntarios. El nombre usado por el médico inglés para designar por primera
vez este conjunto distintivo de síntomas clínicos fue más adelante reemplazado por el de
enfermedad de Parkinson, por iniciativa del neurólogo francés Charcot (para una revisión
histórica ver Kopin, 1993).
La enfermedad de Parkinson (EP) es un desorden neurológico degenerativo
progresivo e incapacitante que afecta predominantemente a individuos de más de 55 años
de edad, provocando una desmejora motora significativa. Me refiero específicamente al
Parkinson idiopático (de origen espontáneo o desconocido), relacionado con el
envejecimiento, que explica más del 90% de los casos. Su prevalencia aumenta
dramáticamente al analizar grupos de edad creciente; en individuos de más de 65 años es de
alrededor de 100 casos cada 100.000 habitantes. Sin embargo, no es infrecuente encontrar
Tesis Docloral. Diego M. Gelman. Inlroducción.
pacientes con un comienzo de enfermedad a una edad por debajo de los 40 años (Parkinson
juvenil). La etiología de la EP es diversa y compleja. Algunos casos pueden ser atribuidos a
factores genéticos y en los últimos años se han descripto ciertos genes que, en caso de estar
mutados, conducen a una EP familiar (Dunnett el aL, 2000). Mutaciones en los genes que
codifican para parkina y UCH-Ll conducen a una enfermedad que es clínica y
patológicamente diferente a los casos de EP idiopática y la manera en que se relaciona a la
enfermedad clásica es poco clara aún. Ha sido demostrado que la parkina puede proteger a
las neuronas de la agresión provocada por la a-sinucleína, de disfunciones proteosomales y
de la citotoxicídad inducida por kainato. Una tercera mutación es la de a-sinucleína. una
proteína sináptica que se probó que forma parte de los cuerpos de Lewy. En ratones, la
sobreexpresión de a-sinucleína, resulta en una función motora disminuida, degeneración
neuronal y conduce a la formación de agregados de proteína, aunque estos no son
filamentosos como en los casos de los cuerpos de Lewy (Masliah e! aL, 2000; Van der
Putten el aL, 2000).
Los síntomas motores de la EP son temblor, rigidez muscular, movimientos
involuntarios. bradikinesia (movimientos lentos) y alteraciones posturales. Por tratarse de
una enfermedad progresiva, se pueden reconocer distintas etapas a lo largo de las cuales se
evidencia un deterioro de la función motora, hasta el establecimiento completo de la
neurodegeneración. En esta etapa los pacientes han perdido la capacidad de valerse por si
mismos. Pero no se trata sólo de alteraciones del movimiento; acompañando a los
anteriores síntomas existen diversos grados de disfunción cognitiva. Los problemas
alcanzan capacidades como la memoria, el pensamiento abstracto y el lenguaje, y en casos
extremos se arriba a diagnósticos de demencia subcortical.
Desde el punto de vista neuropatológico se observa una pérdida selectiva y severa de
neuronas pigmentadas de la SNpc, en donde los cuerpos neuronales (A9) degeneran junto
con las fibras nigroestriatales provocando un severo déficit de dopamina en los ganglios de
la base. Esta sería la base de los trastornos motores (Marsden, ¡982). Además se observa
una pérdida de DA en estructuras límbicas, el neocortex y el hipotálamo. Otros grupos de
neuronas también se ven afectados, como por ejemplo las fibras noradrenérgicas en el locus
ceruleus y en el núcleo dorsal del vago, neuronas serotoninérgicas del rafe dorsal, y
29
Tesis Doctoral. Diego M. Gelman. Introducción.
colinérgicas en el núcleo basal de Meynert y otros núcleos subcorticales. Estos cambios
patológicos estarían asociados a la aparición de algunos síntomas no-motores de la
enfermedad. F,ldiagnóstico patológico de la EP idiopática está acompañada por la presencia
de cuerpos de Lewy (Gershanik, 1997), inclusiones eosinófilas citoplasmáticas compuestas
de proteínas, ácidos grasos, esfingomielina y polisacáridos (Fomo e! aL, 1986).
Los trastornos motores no se manifiestan hasta que los niveles de DA estriatal
declinan al menos en un 70 u 80% (Agid et aL, ¡987). Esta ausencia de síntomas enmascara
el progreso de la enfermedad, y es debida en parte a la capacidad del sistema nigroestriatal
de sobrellevar el déficit, y a la aparición de mecanismos compensatorios en las postsinapsis
estriatales y en las fibras dopaminérgicas remanentes. La caida leve de los niveles de HVA
en comparación con la pérdida masiva de DA, es un reflejo de compensaciones metabólicas
que se interpretan como actividad aumentada de las neuronas aún funcionales (Hefti el a1.,
1980; Zigmond et aL, 1984). Esta hipótesis fue confirmada utilizando modelos animales de
Parkinson experimental, que muestran una relación HVA/DA aumentada. En dichos
modelos, el grado de compensación presináptica varía en función de la severidad de la
lesión. Los mecanismos de compensación postsináptica entran en juego luego de una
desnervación superior al 90%, por medio de aumentos en la sensibilidad y/o densidad de
receptores. A este fenómeno se lo denomina supersensibilidad postsináptica desnervatoria
(Homykiewicz, 1979 y l998). Existen evidencias en favor de un aumento de sitios de unión
D2 a pesar de la pérdida de los receptores presinápticos (Brooks, 1992), aunque lo mismo
no está aclarado para los receptores Dl.
Se puede comprender, dadas las caracteristicas fimcionales de los ganglios de la
base, de que’ manera la pérdida de inervación dopaminérgica en el estriado favorece la
aparición de síntomas parkinsonianos. Experimentos electrofisiológicos y de actividad
metabólica en modelos animales de la EP muestran un incremento en la activación de la vía
indirecta (cuerpo estriado-GPe-NST-GPi/SNpr-tálamo) y una disminución en la activación
de la vía directa (cuerpo estriado-GPi/SNpr-tálamo) (ver figura 6). Estos cambios, en
conjunto, resultan en un incremento en la actividad de los núcleos eferentes de los ganglios
basales (GPi/SNpr) hacia el tálamo, lo cual se traduce en un aumento de la inhibición de las
30
Tesis Doctoral. Diego M. Gelman. Introducción.
neuronas tálamocorticales que sería la responsable de uno de los signos principales de la
EP, la bradikinesia.
Existen diversas hipótesis para explicar la patogénesis de la F,P. Muchas de ellas
postulan mecanismos de estrés oxidativo en el origen de la neurodegeneración, aunque las
auténticas fuentes no hayan sido identificadas. l,os agentes oxidativos putativos incluirían
peróxido de hidrógeno producto de la MAO, productos de autoxidación de catecolaminas
en presencia de oxígeno molecular, y especies reactivas de oxígeno generadas en reacciones
de tipo Fenton que involucran iones del hierro. Otras explicaciones se basan en evidencias
indirectas que señalan a la mitocondria como productora del daño neuronal, o evidencias
directas acerca de la influencia de agroquímicos ampliamente utilizados. Una cantidad de
grupos demostraron que la administración en dosis bajas de ciertos agroquímicos como la
rotenona o el paraquat inducen Parkinson en roedores (Betarbet el aL, 2000; Thiruchelvam
et aL, 2000). La degeneración de la dopamina proveniente de la sustancia nigra inducida
por rotenona no es solo el resultado de la actividad disminuida o totalmente abolida del
complejo l mitocondrial , sino que participan también células del sistema inmune del
cerebro y la microglia (Gao e! aI., 2002). Recientemente se demostró que la actividad de la
NADPH-oxidasa de la microglia juega un papel fundamental, al ser el principal productor
del ion superóxido, en los efectos neurotóxicos de los agroquímicos como la rotenona y los
agentes inflamatorios como el lipopolisacárido (Gao et aL, 2003). Ninguna de estas teorías
es capaz de explicar la selectividad de la pérdida de células nerviosas. Probablemente, algún
tipo de agresión ambiental o externa contribuya a la pérdida natural, relacionada con la
edad, de fibras dopaminérgicas, llevando al individuo al desarrollo de la EP. Factores
genéticos podrían sentar las bases de la predisposición individual. Altemativamente, la
enfermedad se podría deber a mecanismos que nada tengan que ver con el envejecimiento
normal del cerebro (para revisión ver Gershanik, 1997).
El tratamiento farmacológico de la enfermedad de Parkinson está dirigido
actualmente al alivio de la sintomatología sin influenciar la historia natural de la
enfermedad. La mejoría en la calidad de vida de los pacientes determina indirectamente un
aumento de su expectativa de vida. La compensación del déficit dopaminérgico de los
pacientes parkinsonianos se persigue administrando precursores de DA (levodopa),
3l
Tesis Doctoral. Diego M. Gelman. Introducción.
derivados sintéticos o semisintéticos que mimeti7an las acciones de la DA sobre los
receptores (agonistas dopaminérgicos) y drogas que potencian, directa o indirectamente, la
transmisión dopaminérgica (agentes liberadores de DA, inhibidores de la recaptación
neuronal, inhibidores de la degradación enzimática de levodopa o DA). El progreso de la
enfermedad, más la administración prolongada de agentes poco selectivos, modifican la
sensibilidad de los receptores y hasta inducen expresión ectópica de algunos de ellos
(Schwartz et al., 1998). Esto conduce a cambios en el estado de equilibrio (interacciones)
entre los distintos receptores de DA y provoca fallas en el control motor, que se manifiestan
como efectos colaterales indeseables tales como los movimientos involuntarios anormales
(diskinesias). Es por ello que la comprensión detallada de la fimción dopaminérgica puede
conducir al desarrollo de herramientas terapéuticas más selectivas, que permitan restablecer
el delicado equilibrio de la estimulación dopaminérgica normal, con menores efectos
secundarios.
I. 7. Modelo animal: lesión cerebral con 6-hidr0xid0pamina.
Los modelos experimentales de la enfermedad de Parkinson cumplen dos filnciones
importantes. Por un lado, constituyen una herramienta fundamental en el desarrollo y el
ensayo de estrategias terapéuticas. En segundo lugar pueden realimr un aporte a la
dilucidación de los mecanismos desencadenantes de la enfermedad.
El presente trabajo comprende la utilización de un modelo de neurodegeneración en
ratones relevante a la F,P porque reproduce condiciones patológicas en los ganglios de la
base de enfermos parkinsonianos. Se utiliza una sustancias neurotóxica cuyo mecanismo de
acción puede arrojar lu7.sobre la posible etiología de la enfermedad.
El análogo de la DA, 6-hidroxidopamina, es captado por neuronas
catecolaminérgicas a través del recaptador presináptico y provoca la destrucción de
terminales nerviosas y de cuerpos neuronales (ver figura 2). El tratamiento con desipramina
provoca un bloqueo del recaptador de noradrenalina y favorece la desnervación
dopaminérgica selectiva. La inyección estereotáxica unilateral de 6-hidroxidopamina (6
OHDA) en el cuerpo estriado (Ungerstedt y Arbuthnott, 1970; Goodale e! al., 1985), la
substantia nigra (During el al., 1992) o el haz nigroestriatal (Gershanik et al., l983b)
Tesis Docloral. Diego M. Gelman. Introducción.
constituye un modelo de EP descripto inicialmente en la rata, y que luego fue extendido al
ratón y otras especies de animales no roedores.
Los animales con esta lesión unilateral de las neuronas dopaminérgicas
nigroestriatales muestran una conducta motora asimétrica por un período corto de tiempo
post-cirugía, pero pronto recuperan su conducta normal. Sin embargo, la administración de
agonistas dopaminérgicos directos (L-DOPA, apomorfina) provoca rotaciones
contralaterales al sitio de la lesión; los agonistas indirectos como la anfetamina o la cocaína
producen rotaciones hacia el lado de la lesión (ipsilaterales). Esta conducta rotatoria puede
ser cuantificada en cajas de rotación (Ungerstedt y Arbuthnott, 1970). Su aparición se
explica por la pérdida de dopamina del lado lesionado, que al llegar al 80 o 90%
desencadena mecanismos neuroquímicos compensatorios (para revisión ver Zigmond et aL,
1990). Por un lado, los terminales presinápticos remanentes incrementan la producción de
DA y la liberación ante la llegada de un potencial de acción. Por su parte, en la postsinapsis,
se desarrolla el fenómeno de supersensibilidad dopaminérgica, que involucra un aumento
en la densidad de receptores y en la eficiencia de la transducción de señales (Zhen et aL,
2002). Los mecanismos compensatorios que entran en acción en este modelo animal
recapitulan aquellos que permiten que la sintomatología parkinsoniana se manifieste sólo
cuando la pérdida de neuronas de la vía nigroestriatal alcanza el 90%. La inducción de la
respuesta rotatoria en ratas o ratones con este tipo de lesión sigue siendo la prueba más
importante en la evaluación de agentes terapéuticos para la EP.
l,a administración sistémica de agonistas dopaminérgicos directos permite evaluar
conductualmente (por cuantificación de la actividad rotatoria) estos mecanismos de
compensación a nivel de receptores postsinápticos. La disponibilidad de herramientas
farmacológicas selectivas ha permitido dilucidar algunas bases del desarrollo de
supersensibilidad; sin embargo quedan dudas acerca de las atribuciones de cada miembro
de la familia de receptores dopaminérgicos, sus interacciones entre si y con otras familias
de neurotransmisores. Las drogas liberadoras de dopamina (agonistas indirectos) son
capaces de contribuir a la comprensión del funcionamiento del hemisferio no desnervado
(Gerlach y Riederer, 1996).
33
Tesis Doctoral. Diego M. Gelman. Inlroducción.
F,lmecanismo de la neurotoxicidad ejercida por la 6-OHDA no está suficientemente
aclarado. Por sus sustituciones dihidroxi en orto- y en para- la molécula es inestable en
solución acuosa y reacciona con el oxígeno formando especies químicas de alta reactividad.
Algunos de sus productos de oxidación son la quinona de la 6-OHDA, el radical
superóxido, el radical hidroxilo y el peróxido de hidrógeno (Heikkila y Cohen, ¡972), que
aparentemente interfieren con la cadena de transporte de electrones mitocondrial
conduciendo al daño neuronal irreversible. l.a conducta rotatoria sólo se manifiesta ante
pérdidas severas del contenido de DA estríatal, lo que sugiere que es necesaria una
desnervación significativa para poner en acción los mecanismos postsinápticos de
supersensibilidad (Heikkila el aL, 198] ).
I.8. Respuestas conductuales. Interacción DI/D2.
Hasta hace 15 años aproximadamente, el receptor D2 fiJe considerado como el único
subtipo de receptor dopaminérgico responsable de todas las respuestas mediadas por la DA
en el SNC. Mediante ensayos de unión de ligandos radiactivos se describió una fuerte
correlación entre la afinidad de ciertas drogas por los receptores D2 con la potencia de estos
compuestos en distintas pruebas conductuales y su grado de efectividad en la terapia clínica
vinculada a enfermedades extrapiramidales o a desórdenes psiquiátricos (Amt, ¡982). El
receptor Dl fue descripto por diversos autores como un “receptor en busca de función”
(Laduron, ¡983; Stoof y Kebabian, 1984). Sin embargo, gracias al desarrollo de drogas
selectivas Dl se encontraron evidencias incontrovertibles de la participación de los
receptores Dl en la mediación de respuestas conductuales y motoras (para revisión ver
Waddington el aL, 1994). Más aún, parte de estos hallazgos sugiere un papel crucial para el
receptor DI en las respuestas fisiológicas estudiadas, considerándose que el
restablecimiento de la función dopaminérgica se realiza a través de la estimulación de
ambos subtipos de receptores. A partir de entonces surgieron múltiples observaciones
demostrando una interacción funcional muy cercana entre los receptores Dl y D2 (para
revisión ver Waddington y Daly, 1993; Waddington e! aL, 1994).
Por un lado, la estimulación simultánea de ambos subtipos de receptores muestra
propiedades aditivas o sinérgicas en estudios de comportamientos estereotipados o conducta
34
Tesis Doctoral. Diego M. Gelman. Introducción.
locomotora. Gershanik y colaboradores (¡9833) demostraron en ratones akinéticos por una
dosis aguda de reserpina que la administración separada de agonistas selectivos Dl o D2
fue incapaz de revertir la akinesia. Sólo la inyección conjunta de ambos agonistas o de un
agonista mixto Dl/D2 permitió la expresión de respuestas locomotoras. Por otra parte, el
uso de agonistas y antagonistas selectivos reveló la existencia de efectos opuestos de los
receptores Dl y D2 en ciertas conductas en roedores. Estos hallazgos experimentales
podrían representar la contrapartida conductual de los efectos opuestos descriptos para los
receptores Dl y D2 en cuanto a la formación de AMPc. Existe un enorme volumen de
resultados de interacciones de tipo cooperativo (aditivo y sinérgico) u opuesto en todos los
frentes de abordaje en el estudio de la función de los receptores dopaminérgicos (para
revisión ver Rubinstein, 1989; Waddington y Daly, ¡993; Waddington y col., 1994).
Este campo se ha complicado aún más luego del reconocimiento de un número de
receptores dopaminérgicos superior al propuesto originalmente. Aún no contamos con
drogas totalmente capaces de diferenciar los subtipos de receptores dopaminérgicos dentro
de cada subfamilia pero sí existen agentes capaces de diferenciar entre las subfamilias Dl y
D2. Por lo tanto, este concepto clásico de “interacciones Dl/D2” no ha caído en desuso; por
el contrario, dicho concepto necesita ser readaptado, delineando los papeles relativos de
cada subtipo de receptor en estas interacciones.
I. 9. Otras Fisiopatologías Asociadas ala Neurotransmisío’n Dopamine'rgica
1.9.] Esquizofrenia.
Asi como la disfunción de las neuronas nigroestriatales producen un déficit en el
control de la ejecución y la motivación de los movimientos voluntarios evidenciada en la
enfermedad de Parkinson, desórdenes en el sistema corticolímbico están involucrados en
los desbalances perceptuales observados en la esquizofrenia.
Las neuronas dopaminérgicas mesencefálicas que se originan en los núcleos AlO
conforman el sistema dopaminérgico mesolímbico y mesocortical involucrados en la
regulación de funciones emocionales y cognitivas. Durante los 20 años anteriores al
descubrimiento de los 5 subtipos de receptores dopaminérgicos, numerosos estudios habían
establecido que la esquizofrenia estaba asociada con una transmisión dopaminérgica
35
Tesis Doctoral. Diego M. Gelman. Introducción.
anormal en la vía mesocorticolímbica sugiriendo que esta enfermedad se encontraba
acompañada de un aumento del tono dopaminérgico (Creese el aL, 1976; Seeman el aI.,
1976; Snyder, 1974). Esta hipótesis se basó en que el grado de mejoramiento de los
síntomas psicóticos producidos por neurolépticos está en correlación directa con la potencia
de estas drogas como antagonistas de receptores dopaminérgicos D2 (Seeman el aL, 1975).
Los síntomas de la esquizofrenia más característicos son la aparición de alucinaciones
visuales y auditivas, paranoias, comportamientos excéntricos o violentos, alteraciones del
habla, depresión y retracción social. Si una manipulación farmacológica de los receptores
puede modular la transmisión dopaminérgica y reducir los síntomas psicóticos, se puede
especular con una anomalía tanto estructural como de expresión de dichos receptores con
prevalencia en la determinación de la esquizofrenia. lla esquizofrenia se caracteriza
principalmente por alteraciones emocionales y deficiencias cognitivas más que por
deficiencias motoras. La potencia terapéutica de las drogas antipsicóticas sin sintomatología
negativa (alteraciones motoras) correlaciona directamente con la afinidad de bloqueo de los
receptores DZ (Creese et a1., 1996, Seeman el aL, 1975). Con el clonado de los restantes
subtipos de receptores dopamínérgicos se generaron nuevas incógnitas acerca de la
participación de los receptores D2, D3 y D4 en este desorden. La observación de que la
clozapina, uno de los antipsicóticos más potentes, tiene una alta afinidad selectiva por el
receptor D4 y mejora los síntomas positivos y negativos de la esquizofrenia (alucinaciones,
paranoias, retracción social, etc.) sin producir efectos motores negativos permitieron
postular a este receptor como actor preponderante en la progresión de este desorden (Van
Tol el aL, 1991). Actualmente, se reconoce que los efectos antipsicóticos de los
neurolépticos se deben al bloqueo de los receptores de “tipo D2” corticales más que a los
receptores estriatales que estarían involucrados en los efectos colaterales motores adversos
(Broich e! aL, 1998). Ha sido demostrado que el tratamiento crónico con neurolépticos,
resulta en un incremento en la densidad de receptores D2 y de receptores D4 en cerebro de
rata (Seeman e! aL, 1993; Schoots e! aL, 1995). Los síntomas negativos de la esquizofrenia
están determinados por comportamientos de abstinencia social, apatía crónica, depresión y
deficiencias cognitivas (Moller, 1993; Buchanan era1., ¡994). Nuevos trabajos postulan que
estas deficiencias podrían ser producidas por una desensibilización de los receptores Dl
Tesis Doctoral. Diego M. Gelman. Introducción.
presentes en la corte7a como ha sido observado en pacientes esquízofrénicos no tratados
(Okubo et aL, 1997). Estos estudios sugieren que cambios en la estimulación
dopaminérgica y en los receptores de la cone7a cerebral deben ser tenidos en cuenta cuando
se evalúan las acciones en los tratamientos con drogas antipsicóticas. Es necesario
comprender las alteraciones al nivel de estimulación y funcionalidad de los receptores para
comprender la implicancia del sistema dopaminérgico en la determinación de la patología
de la esquizofrenia y en el mejoramiento de las estrategias terapéuticas.
Tesis Doctoral. Diego M. Gelman. Introducción.
2. Sistema Cre-onP.
La recombinación homóloga en células totipotenciales embrionarias de ratón
(células ES) y la generación de ratones mutantes se ha convertido en los últimos años en
una metodología muy popular y poderosa para el estudio de la función de genes in vivo.
Este abordaje, combinado con análisis anatómicos, electrofisiológicos y comportamentales
ha permitido comprender como ciertos genes participan en funciones tan complejas, como
el aprendizaje y la memoria (Fletcher, 1997; Mayford el.al., 1997). Sin embargo, ciertos
problemas restringen la utilidad de ésta técnica. Si el gen de interés está expresado de
manera temprana, su mutación puede resultar en defectos del desarrollo o incluso puede ser
letal. Mas aún, la ausencia de un gen puede llevar a mecanismos de compensación a nivel
génico o a nivel celular.
Para sobrepasar estos problemas se han desarrollado estrategias de recombinación
génica tejido específicas (Gu et.al., 1994) y mutaciones inducibles (Kuhn el.al., 1995).
Estos sistemas se desarrollaron utili7ando la actividad de la recombinasa Cre del
bacteriófago Pl (Abremski el.al., 1984; Hoess eta], 1982; Kilby el.al., l993) que permiten
evitar defectos durante el desarrollo, minimi7ar el período durante el cual se desencadenan
los mecanismos compensatorios y también la evaluación del comportamiento de un animal,
antes y después de que la mutación haya sido inducida, evitándose así, interpretaciones
derivadas de las diferencias existentes en la genética de los ratones mutantes y sus controles
(Silva et.aI., l997).
El bacteriófago Pl codifica para la proteína recombinasa Cre de 38 kDa que cataliza
la recombinación sitio específica del ADN entre secuencias de 34 pb repetidas llamadas
loxP (Stemberg el.al., l98l). Cre es un miembro de la familia de integrasas dentro de las
recombinasas, las que reconocen secuencias de nucleótidos específicos y funcionan a través
de una unión covalente transitoria del ADN con la proteína (Argos et.a1., 1986; Craig,
1988). Los sitios loxP son palindrómicos excepto por una secuencia central que le provee a
cada sitio una orientación unidireccional (Hoess et.al., 1986). Repeticiones directas de dos
sitios loxP provocan la escisión del fragmento contenido entre ellos, mientras que
repeticiones invertidas provocan una inversión (Abremski el.aL, 1983).
l,a actividad de la recombinasa Cre se desarrolla en ausencia de cofactores de alta
energía, actividad topoisomerasa, y/o replicación del ADN (Abremski et.al., 1983;
Abremski et.al., ¡984) lo que puede estar explicando su gran eficacia para producir la
escisión y recombinación del ADN tanto en bacterias (Stemberg, ¡990), levaduras (Sauer,
1987), células de mamífero (Sauer el.a1.,1988) como plantas (Odell et.al., 1990). F.n 1992
Orban y colaboradores desarrollaron el primer ratón que sufrió una recombinación tejido y
sitio específica, comprobando que el sistema era eficiente y reproducible. Ello ha sentando
las bases para la generación de mutantes con deleciones espaciales más finamente
controladas.
Múltiples laboratorios han ido desarrollando animales transgénicos que expresan la
recombinasa Cre con diferente especificidad tisular y temporal (consultar la pagina web:
http://www.mshri.on.ca/develop/nagy/Cre.html. Estos animales permiten llevar a cabo
alteraciones específicas del genoma, como knock ouls, aberraciones cromosomales
inducidas y activación condicional de transgenes de manera tal que las alteraciones sean
restringidas a tejidos específicos y a tiempos predeterminados.
Para determinar la utilidad de los ratones transgénicos que expresan Cre bajo el
control transcripcional de los distintos promotores, se crearon ratones reporteros que
permiten una lectura real de la expresión y actividad de la recombinasa Cre. Una de estas
líneas fue utilizada en nuestros estudios y es la llamada Z/AP (Lobe et aL, 1999) para el
análisis de la actividad de Cre. Este animal transgénico Z/AP (LacZ/fosfatasa alcalina
placentaria humana, hPLAP) utiliza un sistema de doble reportero que proporciona un
ensayo preciso y sencillo para la excisión a nivel celular. Antes de la excisión por parte de
la recombinasa Cre, las células expresan el gen ,B-galaclosidasa cuya actividad es
fácilmente detectable por medio de un ensayo utilizando el cromógeno X-gal. Al existir
actividad de Cre, el gen ,B-galactosidasa es escindido debido a que se encuentra flanqueado
por sitios loxP y comienza a expresarse el gen de la fosfatasa alcalina placentaria humana,
la cual no lo hacia antes de la actividad de Cre debido a que los tres sitios de
poliadenilación existentes luego de la secuencia del gen de B-galactosidasa no permiten su
expresión. Por lo tanto, en aquellas regiones en donde existe actividad de la recombinasa
Cre se ve un cambio en la expresión de marcadores, excisión dependiente, mediada por la
39
Tesis Doctoral. Diego M. Gelman. Introducción.
recombinasa Cre. Estudios detallados sobre esta línea mostraron que el transgén Z/AP se
expresa en todos los estadios embrionarios, lo cual permite analizar la ontogenia de la
expresión génica mediada por el promotor utilizado (Figura 8).
Amplificador
CMV LOXP. ' LOXP' '.————. —l [Tromotor3-. "a l pA l g"Actina Pollo
Amplificador vCMV hPLAP—_—->_
Promotor BActina Pollo
Figura 8: Genética del ratón reportero Z/AP. El esquema muestra la construcción que expresa Z/AP. Elamplificador de CMV, junto con el promotor de B actina de pollo, dirijen la expresión de los genes reporteros.El primer gen, B Geo, se expresa en ausencia de recombinasa Cre (a). Este reportero está seguido por trescopias de señal de poliadenilación y flanqueado por sitios LoxP, por lo que es removido por acción de larecombinasa. El segundo reportero, fosfatasa alcalina placentaria humana (hPLAP, de sus siglas en inglés) seexpresa sólo luego de la excisión de B Geo por Cre (b).
40
3. Animales transgénicos como herramienta de estudio.
Hacia fines de la década del 80 todos los efectos mediados por la dopamina eran
atribuidos únicamente a dos subtipos de receptores dopaminérgicos. La farmacología
clásica, mediante el diseño de drogas y la observación de sus efectos, proponían la
existencia de dos receptores dopaminérgicos, Dl y D2, en base a los efectos opuestos sobre
la adenilato ciclasa. Sin embargo, el desarrollo de técnicas de biología molecular, utili7ando
el clonado por homología de receptores con 7 pasos transmembrana, permitió entre el año
1988 y el 199] el descubrimiento de los 5 subtipos de receptores dopaminérgicos conocidos
actualmente. La ampliación de la familia de receptores dopaminérgicos mantuvo la
subdivisión de los receptores en los de “tipo Dl” y los de “tipo D2” según su estructura
genómica, aminoacídica y el acople a segundos mensajeros. Sin embargo, aún hoy, no
existen agentes farmacológicos que permitan activar o bloquear selectivamente a cada
subtipo de receptor dopaminérgico. La similitud estructural existente entre los receptores de
cada una de las 2 subfamilias, tipo DI y tipo D2, indica que tal situación ideal demore
muchos años más en alcan7arse. Debido a que cada receptor dopaminérgico está codificado
por genes y unidades transcripcionales independientes, se han podido desarrollar en los
últimos años nuevas herramientas que permiten eliminar específicamente un subtipo de
receptor y estudiar, in vivo, los efectos producidos por su pérdida. La generación de ratones
mutantes derivados de la mutagénesis dirigida en células embrionarias totipotenciales
permite estudiar los mecanismos moleculares y celulares que regulan los comportamientos
como la coordinación motora, el aprendizaje y la memoria, la agresión y los ritmos
circadianos, entre otros. Con el objetivo de descubrir las funciones de los diferentes
subtipos de receptores dopaminérgicos en este laboratorio se estudian, desde hace ya más de
6 años, ratones deficientes en la expresión del receptor D2 y D4. Los resultados presentados
en la primera parte de esta tesis corresponden particularmente al estudio de la función del
receptor D2 en aspectos relacionados con la conducta motora. A mediados de la década del
noventa se desarrollaron, independientemente, dos líneas de mutantes nulos para el receptor
dopaminérgico D2. Su análisis inicial mostró que presentan una marcada akinesia y un
menor número de movimientos espontáneos y fue presentado como un modelo de
Parkinson experimental (Baik et aL, 1995). Un estudio más detallado en linajes genéticos
4|
Tesis Doctoral. Diego M. Gelman. Introducción.
uniformes, mostró que la actividad motora está determinada por la carga génica, la
uniformidad génica de la cepa en estudio y adaptaciones del desarrollo (Kelly el aL, 1998) y
que los fenotipos motores observados poco se parecían a los presentes en la enfermedad de
Parkinson. Los ratones mutantes para el receptor dopaminérgico D2 mostraron también una
reducción en el consumo y sensibilidad al etanol (Phillips et aL, 1998) y la ausencia de
efectos de recompensa por el consumo de opiáceos (Maldonado el aI., 1997). Utili7ando
estos animales mutantes se demostró la participación del receptor D2 en la autoinhibición
de la liberación de dopamina (Benoit-Marand el aI., 2001).
Este modelo de animal mutante nulo ha sido de gran utilidad para la determinación
de la participación del receptor dopaminérgico D2 en funciones motoras y límbicas pero su
uso está limitado debido a que sufre compensaciones adaptativas durante el desarrollo. Por
lo tanto, es deseable contar con un animal que pueda evitarlas. Una manera de lograrlo es
por medio del uso del sistema Cre-loxP. De esa manera se puede inducir la mutación en el
animal adulto luego de que completó su desarrollo.
OBJETIVOS
Tesis Doctoral. Diego M. Gelman. Objetivos.
Objetivos.
La variada gama de funciones reguladas por la dopamina y las patologías asociadas
a desbalances del sistema dopaminérgico, como la enfermedad de Parkinson, hacen que
exista un grán interés por caracteri7ar acabadamente cada uno de los receptores
participantes en estos sistemas. Uno de ellos es el receptor dopaminergico DZ.
Para contribuir al esclarecimiento del papel que desaiTolla dicho receptor, los
objetivos de este trabajo son:
o Evaluar la participación de los diferentes subtipos de receptores
dopaminérgicos en el desarrollo de supersensibilidad conductual en
ratones deficientes en receptores D2.
o Generar una línea de ratones transgénicos que dirijan la expresión de
la recombinasa Cre bajo el control transcripcional del promotor de 9
kb de tirosina hidroxilasa de rata.
o Generar una línea de ratones mutantes que lleven sitios loxP a los
lados del exón 2 del gen del receptor dopaminérgico D2.
Finalmente, a partir del cru7amiento de las dos líneas generadas, obtener
una línea de ratones que sean mutantes nulos para el receptor de dopamina
DZ presináptico.
RESULTADOS Y DISCUSION -—
Tesis Doctoral. Diego M. Gelman. Resultados y Discusión.
Resultados y Discusión.
Parte I.
I. Modelo animal para el estudio de Iafunción dopaminérgica.
1.1. Establecimiento del modelo de lesión estricta! con 6-hidr0xíd0pamina.
Para evaluar la función dopaminérgica nigroestriatal en ratones, se estableció un
modelo de animales rotatorios por medio de lesiones unilaterales intraestriatales con el
agente neurotóxico 6-hidroxidopamina (6-OHDA), que entra a los terminales sinápticos
dopaminérgicos a través del transportador de dopamina y promueve la muerte neuronal por
inducir un estado hiperoxidativo. Cinco días después de la inyección de 25 ug de 6-OHDA
en el cuerpo estriado derecho, los ratones fueron examinados y se detectó conducta
rotatoria espontánea en sentido ipsilateral al lado lesionado. Estas rotaciones se
interpretaron como locomoción inducida por una mayor cantidad de dopamina endógena
actuando sobre receptores nonnosensibles del hemisferio no lesionado. Los animales
respondieron de manera dosis dependiente con rotaciones contralaterales luego de la
administración aguda del agonista dopaminérgico mixto apomorfina (Figura 9). La pérdida
de terminales dopaminérgicos de la vía nigroestriatal fue confirmada por
inmunohistoquímica contra tirosina hidroxilasa (TH). La densidad de terminales TH
positivos fue sensiblemente menor en los estriados lesionados comparado con el lado sin
lesionar (Figura 10a). Un análisis inmunohistoquímico de la substantia nigra por medio de
un anticuerpo anti-tirosina hidroxilasa en secciones coronales de animales lesionados,
mostró la pérdida significativa de cuerpos neuronales dopaminérgicos (Figura lOb).
Los ratones lesionados recuperaron su postura y peso normal poco tiempo después
de ser sometidos a la cirugía, mantuvieron una sobrevida normal y continuaron exhibiendo
rotaciones al ser tratados con apomorfina hasta seis meses después de la operación.
El contenido de dopamina, dos meses después de la lesión, fue significativamente
menor en los estriados lesionados comparado con los contralaterales intactos (Figura ll).
Determinaciones por llPLC, indicaron 7772 i 577,2 pg/mg de tejido de DA para los
hemisferios control y de 3909 i 493,2 pg/mg para los lesionados (p=0.0006, test t de
46
Tesis Docmral. Diego M. Gelman. Resultados y Discusión.
Student). En los tres genotipos (Drd2+/+, Drd2+/', Drd2'/') se observó una disminución
comparable de los niveles estriatales de dopamina debido a la lesión. Los niveles de
dopamina en el lado intacto mostraron un contenido similar al existente en ratones
nonnales no lesionados. La disminución en los valores del metabolito de la dopamina
DOPAC en estriado de cerebro de animales lesionados, también mostró una disminución
respecto a los valores de DOPAC del lado no lesionado.(Figura l l).
Conlralalcralcs
¡25
¡001
0
.25Nro.rotaciones/5min.
-50lpsilalerales
0 0.25 0.37 0.50
Apomorfina (mg/kg, s.c.)
Figura 9: Evaluación conductual de la lesión. El número de rotaciones en animales lesionados con 6OHDA fue determinado 5 minutos después de la administración del agonista mixto apomorfina (0 a 0.5mg/kg). Las barras representan Ia media i el error estándar de 4 experimentos.
La inmunohistoquímica contra tirosina hidroxilasa demuestra que la acción de la
toxina se extiende desde el estriado hasta los cuerpos neuronales de la substantia nigra
produciendo la muerte de dichas neuronas. Esta desnervación es el origen del desarrollo de
supersensibilidad en el modelo de enfermedad de Parkinson del ratón rotatorio. La
disminución de la cantidad de dopamina en el lado lesionado, y no su desaparición total,
podría estar representando lesiones locales dentro del estriado lo que demuestra una
limitación del molde utili7ado para generar las lesiones cerebrales o una difusión despareja
de la toxina al momento de la operación.
47
ÏOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOÓÓOOOOOOOOOOOOOOC
Tesis Doctoral. Diego M. Gelman. Resultados y Discusión.
La medida conductual de la desnervación es congruente con estos resultados pues
las rotaciones espontáneas ipsilaterales son interpretadas como locomoción unilateral
producida por activación del lado no lesionado.
La obtención de este modelo experimental de la enfermedad de Parkinson nos
permite estudiar el desarrollo de supersensibilidad postsínáptica en ratones salvajes para el
receptor de dopamina D2 o con la mutación nula para dicho receptor.
Control Lesionado
a
Figura 10: Lesión estriatal con 6-OHDA. Detección inmunohístoquímicade tirosina hidroxilasa en un cortecoronal a. del cuerpo estriado (A=]0X) y b. la sustancia nigra (A=100X) de ratones control y lesionados con6-OHDA.
48
Tesis Docloral. Diego M. Gelman. Resullados y Discusión.
sus, :soo
4250
7500 oïa —|000e 8su zz 5000 n, - 450 aO o:
-500 32500
—250
0- <2DA oomc
-l,ado control :1 Ladolesionado
Figura ll: Determinación del contenido de DA y DOPAC. El contenido de DA y DOPAC en estriadoscontrol y lesionados con 6-OHDA proveniente de ratones operados (n=5) fue determinado mediante HPLC.Las barras representan el promedio i el error estándar. *" vs control: p< 0.005, " vs control: p< 0,05
¡.2. Desarrollo de supersensíbilidad conductual en ratones mutantes para el receptor
dopamine'rgico D2.
1.2.I. Establecimiento dela lesión estriatal.
Una vez puesta a punto la lesión intraestriatal para la generación del modelo de
animales rotatorios, fueron operados ratones de la cepa congénica C57BL/6J (n=8),
normales (+/+), mutantes heterocigotas (+/-) y mutantes nulos homocigotas (-/-) (Figura 12)
con una inyección de 25 pg de 6-OHDA en el estriado derecho. La existencia de
alteraciones en la vía dopaminérgica nigroestriatal fue evaluada por medio de ensayos
bioquímicos y conductuales.
a s A A Ï ¡lt blocus. Drd 2. t B FI
endógeno ¡_ 22a, _+ ./. -t-/- -t/+
I ' 2.2kbv d p s s s A s A P ' /ccmrc ' -="' ¡Skbdirecciona- - -\ i
miento-‘ uzEn‘- nz EIC
s s A s A ‘- "'° - Rccombinanlc 1 |homólogo 4-1334
Figura l2: Ratones mutantes para el receptor dopaminérgico D2. a. Se muestra un esquema de larecombinación homóloga en el locus del receptor DZ. b. Fotografia de un gel de agarosa expuesto a luz UVconteniendo los productos de PCR para los alelos normales (2,2 kb) y mutado (1,8 kb) obtenidos con losprimers esquematizados en a.
49
Tesis Docloral. Diego M. Gelman. Resultados y Discusión.
Seis días después de haber sido operados, los animales de los tres genotipos
exhibieron niveles moderados, aunque sostenidos, de rotaciones espontáneas ipsilaterales
(Figura l3). El menor nivel de rotación de los ratones mutantes en comparación con los
normales está en coincidencia con el déficit motor que afecta a estos ratones (Kelly et.al.,
1998), pero hay que destacar que en este caso usamos una cepa congénica C57BL/6J n=8
para los estudios mientras que en el citado trabajo se hicieron con animales F2 (129sv x
C57BL/6J). A pesar de existir una clara tendencia en todos los animales de iniciar
rotaciones espontáneas ipsilaterales, la comparación por ANOVA de una vía reveló que las
diferencias entre los tres genotipos no son estadísticamente significativas (p=0,l 79).
¡0.07.s’EIn 7.5mtud)EE 5.0OQ.md)
8 2.5l:O
'GSe 0.0
e‘ —/— +/- +/+Z Drd 2
Figura ¡3: Rotaciones espontáneas ipsilaterales. El número de rotaciones espontáneas ipsilaterales enanimales lesionados de los tres genotipos (-/-. n=9; +/-, n=30; +/+,n=23) fue detenninado 6 días después degenerarse la lesión. Las barras representan el promedio i el error estándar.
En animales de los tres genotipos se evidenció una disminución en la
inmunomarcación de tirosina hidroxilasa al comparar el hemisferio lesionado con la toxina
6-OHDA y el hemisferio control (Figura lO). Existe asimismo una disminución en los
niveles de dopamina y DOPAC en animales de los tres genotipos cuando se compara el
lado lesionado del cerebro con respecto al no lesionado (Figura ll). Estos resultados
demuestran que la 6-OHDA actúa sobre los terminales presinápticos independientemente
de la dosis génica del receptor de dopamina D2 provocando perdidas significativas de la
dopamina estriatal.
1.2.2.Desarrollo de supersensibilidad en ausencia del receptor D2.
La administración del agonista mixto Dl/DZ apomorfma (0,5 mg/kg) 7 días después
de la operación provocó rotaciones contralaterales en animales Drd2i/+ y Drd2+/', pero no
tuvo efectos locomotores en los ratones knock oul (Drd2m', n=6; Drd2+/', n=l7; Drd2'/',
n=8) (Figura 14). Existe diferencia significativa (p<0,005) entre los animales knock out con
respecto a los +/+ y a los +/- pero no entre estos dos últimos según el análisis post-hoc de
Tukey. Inicialmente, esto fue interpretado como ausencia de mecanismos compensatorios
postsinápticos luego de la lesión desnervatoria en animales mutantes nulos para el receptor
D2.
La repetición del mismo ensayo el día 20 luego de la operación reveló la aparición
de rotaciones contralaterales en los portadores de los dos alelos nulos (Figura l4) en
comparación con el día 7 y se produjo, además, un aumento en el número de rotaciones de
los animales Drd2+/+y Drd2+/' y se detectaron diferencias significativas entre genotipos
(p=0,001 por ANOVA, Drd2*’*,n=5; Drd2+", n=l 7; Drd2'l', n=8), que se interpreta como la
existencia de distintos niveles de compensación postsináptica. Sin embargo, no hubo
diferencias en las comparaciones individuales entre los animales Drd2'l' y los Drd2“+ ni
tampoco entre estos últimos y los Drd2+/' (p>0,05 por post-hoc de Tukey). Cuando se hizo
nuevamente la prueba 17 días más tarde, es decir 37 días luego de operados, la respuesta
rotatoria de los animales Drd2"' se mostró aún más alta y ya no se registraron diferencias
entre genotipos (p=0,l42 por ANOVA; Drd2m, n=5; Drd2+/', n=16; Drd2'/', n=6) (Figura
l4).
El test con apomorfina fiJe repetido en distintos puntos temporales a lo largo de los
tres meses siguientes a la operación, con el fm de determinar la evolución de la respuesta
supersensible para cada genotipo. A partir de los valores obtenidos en dichas pruebas, se
realizaron ajustes a funciones polinómicas de tercer orden (Figura ¡5). Cada punto
representa el promedio de una prueba realizada con 4 a 7 animales Drd2+/+,14 a l7 Drd2H'
y 6 a 8 Drd2'/'. Existen diferencias significativas entre los tres conjuntos (ANOVA de dos
vías) explicadas por el genotipo (p=0,0001) y por el tiempo (p<0,000] ).
5|
Tesis Doctoral. Diego M Gelman. Resultados y Discusión.
l 00
- +/+
Nro.rotacionescontralaterales/lOmin.
Día7 Día 20 Día 37
Figura 14: Evolución de la respuesta supersensible. 7, 20 y 37 días después de la operación, animales delos tres genotipos fueron inyectados con apomorfina (0,5 mg/kg). El número de rotaciones contralaterales enestos animales fue determinado luego de lO minutos de la administración de la droga. Las barras representanel promedio i el error estándar de grupos de animales de entre 5 y 17 individuos (ver texto).** vs +/+ día 7, p<0,01, ns vs +/+, p> 0,05
Rotacionesconnalaterales/IOmin
Dim después de operados
Figure 15: Evolución del desarrollo de supersensibilidad conductual. El test con apomorfina fue repetidoen distintos puntos temporales a lo largo de los tres meses siguientes a la operación. Cada punto representa elpromedio de una prueba realizada con animales de los tres genotipos (+/+, n=4 a 7; +/-, n= 14 a 17; —/-,n=6 a8). Las funciones se obtuvieron por el mejor ajuste para regresiones no lineales (funciones polinómicas detercer orden; +/+, R2=0,9827; +/-, R2=0,9918; -/-, R2=0,9679).
52
Tesis Doctoral. Diego M. Gelman. Resulrados y Discusión.
Globalmente estos resultados demuestran que los ratones deficientes en receptores
D2 son capaces de desarrollar una respuesta compensatoria luego de la lesión de la vía
dopaminérgica nigroestriatal. Los ratones Drd2'l' exhibieron una respuesta supersensible
comparable a la de los normales al ser tratados con el agonista mixto apomorfina a partir
del día 37 posterior a la operación. La diferencia existente con los controles en las
mediciones previas sugiere la existencia de un período compensatorio temprano en el que la
presencia de receptores D2 sería esencial para la expresión de una máxima
supersensibilidad. Durante el período de máximo desarrollo de supersensibilidad, entre los
días 20 y 50 (Figura 15) la actividad rotatoria es menor en los animales Drd2'/',
probablemente porque en los ratones Drd2+/+y Drd2+/', la interacción sinérgica entre los
receptores Dl y D2 supera ampliamente a los mecanismos compensatorios de los mutantes.
A partir de la semana lO, los ratones de los tres genotipos mostraron una respuesta
supersensible estabili7ada en un nivel similar. Estas observaciones experimentales sugieren
que el componente Dl de la respuesta supersensible es de desarrollo más tardío con
respecto al D2, pero, una vez instalado, sería predominante. Estos resultados contrastan con
las explicaciones del desarrollo de supersensibilidad basadas únicamente en un aumento de
la densidad de receptores D2 estriatales (Creese et.al., 1977; Rogue et.al., 199]; Martres
et.al., 1992) y/o en el aumento de la eficiencia de la transducción de la señal de este subtipo
de receptor.
El comportamiento de los animales heterocigotas para el receptor D2, que poseen la
mitad de los sitios de unión D2 que los animales normales (Kelly et.al., 1997), revela que
un menor número de receptores D2 no perjudica el desarrollo de respuestas locomotoras
supersensibles y que por el contrario, permite la manifestación de rotaciones contralaterales
desde el primer desafío agudo con apomorfina en el día 7. En el período de respuesta
máxima, que abarcó desde el día 20 al 50, el nivel de rotación de los ratones heterocigotas
fue, aún superior a los controles (Figura 15).
Este resultado implica que el desarrollo de supersensibilidad conductual es un
proceso plástico sujeto a una dinámica temporal dependiente de la dosis génica del receptor
D2, como se puede observar en la figura 15.
53
Tesis Doctoral. Diego M. Gelman. Resultados y Discusión.
1.2.3. Papel del receptor DI en Ia respuesta locomotora en ausencia de receptores D2.
Para estudiar el mecanismo subyacente a la respuesta supersensible de ratones
deficientes en receptores D2, se sometieron a animales de los tres genotipos a diferentes
dosis del antagonista Dl SCH23390 previo a la administración de apomorflna 0,5 mg/kg.
Este experimento, al igual que el de las secciones siguientes, fue reali7ado luego del día 40
después de la lesión con 6-OHDA, es decir, cuando la supersensibilidad postsináptica ya
había alcan7ado la respuesta máxima en los tres genotipos y había comen7ado a
estabilizarse. En el día l del experimento, los animales de los tres genotipos fueron
testeados con una dosis de apomorfina para seleccionar a los rotadores y establecer un valor
de referencia del 100%. Dos días después se pretrataron con dosis diferentes del antagonista
SCH23390, 30 minutos antes de la inyección de apomorfina. Los resultados se expresaron
como porcentaje de las rotaciones respecto del día l (Figura 16). El día 4 se repitió la
inyección de apomorfina para verificar la recuperación de la respuesta inicial (del día l).
Cuando se utilizó una dosis baja (0,01 mg/kg) del antagonista Dl SCH23390, la
respuesta rotatoria de los animales Drd2'l' descendió casi un 60% en promedio respecto del
día l, mientras que la de los controles bajó menos de un 25%, aunque ésta disminución no
representó una diferencia estadísticamente significativa (p=0,059, Drd2+/+ n=4, Drd2'/'
n=5). Con una dosis más alta del antagonista (0,05 mg/kg), la respuesta de los animales
Drd2"' fue prácticamente anulada, llegando a un 10% respecto del día l, mientras que la de
los controles fue un 50% de la original resultando significativamente distinta respecto del
día l (p<0,001, Drd2+/+n=5, Drd2-'/' n=6, prueba t de Student). Los heterocigotas (Drd2+/')
se comportaron en ambos casos de manera similar a los controles Drd2+l+(p>0,05, n=l4).
Estos resultados demuestran que en ausencia de receptores D2, la estimulación de
los receptores dopaminérgicos Dl, es esencial para la expresión conductual de
supersensibilidad. El bloqueo del componente Dl en ratones normales provocó un descenso
parcial en las rotaciones, pero las dosis de antagonista empleadas no anularon la expresión
de supersensibilidad. Los mutantes nulos fueron incapaces de mantener una respuesta
rotatoria supersensible por mecanismos independientes del receptor D].
IOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOCÓOOOOOOOOOOOOOOOOOG
Tesis Doctoral. Diego M Gelman. Resultados y Discusión.
150—
214.|25- 7 _+/.
T —+/+
Nro.rotacionescontralaterales/10min
(%delcontrol)
Dial Día3 Día3 Día4Apo 0,50 SCH 0,01 SCH 0,05 Apo 0,50
Apo 0,50 Apo 0,50 (Recuperación)
Figura 16: Efecto del antagonista Dl SCH23390 en las rotaciones inducidas por apomorfina. Luego deldía 40 después de la operación, animales lesionados de los tres genotipos fueron sometidos a diferentes dosisdel antagonista D] SCH23390 previo a la administración de apomorfina 0,5 mg/kg. El número de rotacionescontralaterales en estos animales fue determinado luego de lO minutos de la administración de apomorfina.Las barras representan el promedio i el error estándar de grupos de animales de entre 4 y 14 individuos (vertexto).*, p<0,05; **, p<0,01; ***, p<0,001 vs día l del mismo genotipo.-/- vs +/+ día 3 SCH 0,01, p=0,059; -/- vs +/+ día 3 SCH 0,05, p<0,01
1.2.4. Efecto del bloqueo inespect’fico de receptores “tipo D2” sobre las respuestas
supersensibles.
Para determinar el efecto del bloqueo de los receptores dopaminérgicos de “tipo
D2” sobre la conducta rotatoria, se administró raclopride a los animales de los tres
genotipos, un antagonista tipo D2 con preferencia por receptores D2 y D3. Raclopn'de a una
dosis de 2 mg/kg produjo un descenso en la respuesta a apomorfina en los tres genotipos
(Figura 17). La inhibición promedio fue superior al 75% en ratones Drd2+/+ y Drd2+/'
(p<0,05, n=4 y p<0,0001, n=9 respectivamente, prueba t de Student) y superó el 50% para
los Drd2"" (p<0,05, n=5) en todos los casos con respecto al valor de referencia de 100% del
día 1. Los tres genotipos recuperaron la respuesta al ser tratados con apomorfina sola (0,75
mg/kg) 5 días después, luego del lavado completo del antagonista.
55
DOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOÓOCOOOOOOOOOOOOI
Tesis Doctoral. Diego M Gelman. Resultados y Discusión.
El efecto del raclopride en ratones deficientes para el receptor D2 es un resultado
sorprendente que sugiere la participación de otro u otros receptores de la subfamilia en la
respuesta supersensible. El estudio del receptor D3, tanto fisiológico como por respuestas
de knock out o knock down, señala su papel inhibitorio sobre respuestas de actividad en
locomoción (Daly y Waddington, 1993; Accili et.al., 1996; Menalled et.al., 1999), aunque
existen evidencias de su expresión estriatal ectópica relacionada con la sensibilización a L
DOPA que le atribuyen un papel opuesto (Schwartz et.al., 1998). Por otra parte, existen
niveles detectables de expresión D4 en el cuerpo estriado, aunque su importancia fiincional
no ha sido aclarada (Tarazi et.al., 1998; Cohen et.al., 1992; Van Tol et.al. 1991). Si bien el
raclopride es un antagonista con mucha mayor afinidad por receptores D3 (Ki<0.5 nM) que
D4 (500 nM<Ki<5 nM) la dosis empleada en nuestros experimentos podría estar afectando
a ambos subtipos de receptores.
.Ea 1502 :I-/E -+/E -+/+3 A7‘: g 100J: aa og Omg 75o atS:.3 V8 50O‘
- üo ¡til!|z 25
0..Dial Día 3 Día 8
Apo 0.75mg/kg Rac 2mg/kg Apo 0.75mg/kgApo 0.75mg/kg (Recuperación)
Figura ¡7: Efecto del antagonista tipo D2 raclopride en las rotaciones inducidas por apomorfina. Luegodel día 40 después de la operación, animales lesionados de los tres genotipos fueron sometidos al antagonistatipo D2 raclopride (2 mg/kg) previo a la administración de apomorfina 0,75 mg/kg. El número de rotacionescontralaterales en estos animales fue determinado luego de 10 minutos de la administración de apomorfina.Las barras representan el promedio i el error estándar de grupos de animales de entre 4 y 9 individuos (vertexto).*, p<0,05; ***, p<0,0001 vs día 1 del mismo genotipo.
56
Tesis Doctoral. Diego M. Gelman. Resultados y Discusión.
1.3.Análisis delas interacciones entre receptores de "tipo DI ”y “tipo DZ”.
Ratones de los tres genotipos fueron tratados con el inhibidor reversible de la
tirosina hidroxilasa a-metil-p-tirosina (AMPT) en dosis de 200 mg/kg i.p. tres horas antes y
100 mg/kg i.p. una hora antes de la administración de agonistas. Este tratamiento, produce
una disminución severa de los niveles de catecolaminas (Dziewczapolski et.al. 1997). Al
momento de la administración de los diferentes agonistas, los animales mostraron una
profunda akinesia. En ese momento fueron sometidos a la prueba l, en la que les fue
suministrada una dosis del agonista Dl SKF 38393 (SKF) (Figura 18). Los ratones+/+normales Drd2 (n=lO) no exhibieron conducta rotatoria inducida por la estimulación Dl
en ausencia de dopamina endógena, mientras que los Drd2+/' y los mutantes nulos Drd2'/'
rotaron de manera pobre y despareja (Drd2+/': 8,1 i 2,6 rotaciones / lO min, n=15; Drd2'/':
9,1 i 6,5 rotaciones / lO min, n=8). El número de rotaciones para cada genotipo no
representó diferencias significativas (p>0.05, ANOVA seguido de test de Dunnett).
Transcurridas tres horas del primer experimento realizamos la prueba 2 (Figura l8). Se
reasignaron los animales a dos grupos de los cuales el primero recibió nuevamente SKF
38393 lO mg/kg más una inyección de solución salina mientras que el segundo recibió SKF
38393 lO mg/kg más una inyección del agonista tipo D2 quinpirole 0,6 mg/kg i.p. Al tratar
ratones Drd2“, Drd2+/'y Drd2"' con SKF y solución salina, se obtuvo un resultado similar
al de la prueba l, comprobando que en el intervalo de tiempo entre los experimentos, no se
había producido una recuperación de la dopamina endógena. Los animales Drd2“+ y
Drd2+/' experimentaron aumentos significativos de la actividad rotatoria al recibir SKF y
quinpirole (Drd2+/+:62,0 j: 5,6 rotaciones / lO min, n=5; Drd2“? 85 i- lO rotaciones / lO
min, n=9; p<0,0001 según prueba de t). En cambio, los animales Drd2'l' no fueron
afectados por la administración conjunta de SKF y quinpirole (¡4,4 i- 8,2 rotaciones / lO
min, n=5; p>0,3 comparando con la prueba l por el test de t)
En este experimento, la estimulación conjunta Dl y D2 fue capaz de revertir la
akinesia, inducida por el tratamiento con el inhibidor de la síntesis de catecolaminas
AMPT, en ratones normales y heterocigotas para la mutación en el locus D2, pero no así en
los mutantes nulos. La medida de reversión de la akinesia utili7ada fue la inducción de
conducta rotatoria en condiciones de supersensibilidad que se manifestó en un aumento
Tesis Doctoral. Diego M. Gelman. Resultados y Discusión.
sinérgíco en animales Drd2+/+y Drd2+/' tratados con una combinación de SKF 38393 y
quinpirole.
Por otro lado, el comportamiento de los Drd2’/' resultó paradójico. Si bien estos
animales fueron capaces de manifestar una respuesta dopaminérgica supersensible
comparable a la de sus hermanos normales, que depende del receptor D1, según los
resultados descriptos anteriormente, se observó que la estimulación tipo D1 fue incapaz de
revertir la akinesia inducida por AMPT. Incluso cuando se aumentó la dosis de quinpirole a
15 mg/kg, los animales Drd2'/' no iniciaron una respuesta rotatoria apreciable (n=5, datos
no exhibidos). La administración simultánea de SKF y quinpirole produjo una respuesta
minima que no difirió significativamente del resultado nulo obtenido con SKF solo.
100-1 “i I:l-/-+/
2 -+l+\ 75"éa:ES
g 508.5ée 25e'z
0
SKF(lOmg/kg) + + + + + + + + +SALINA + + +QUlNPlROLE + + +(I mg/kg)
prueba l prueba 2 prueba l prueba 2 prueba l prueba 2
Figura 18: Análisis de interacciones Dl/D2 en ausencia de dopamina endógena. Ratones lesionados delos tres genotipos fueron tratados con el inhibidor reversible de la TH, AMPT, previo a la administración deagonistas. En la prueba l, los animales fueron sometidos a una dosis del agonista D1 SKF 38393 y al cabo de10 minutos se determinó el número de rotaciones contralaterales. En la prueba 2, se les suminstró a un grupode animales, SKF más solución salina, mientras que otro grupo recibió SKF más un agonista tipo DZ,quinpirole, y al cabo de 10 minutos se determinó el número de rotaciones contralaterales. Las barrasrepresentan el promedio i el error estándar de grupos de animales de entre 5 y 15 individuos (ver texto).** vs prueba 1 del mismo genotipo, p<0,0001, * vs +/+ mismo tratamiento, p<0,05
58
P0000000.0000000000000.00000000ÓOOOOOO0.0.0.0.1
Tesis Doctoral. Diego M Gelman. Resultados y Discusión.
Para evaluar las interacciones Dl/D2 en presencia de catecolaminas endógenas, es
decir, sin el pretratamiento con AMPT, se sometieron a ratones de los tres genotipos a una
dosis del mismo agonista D1 utilizado anteriormente, SKF 38393, a una concentración de 6
mg/kg. Los resultados se muestran en la figura 19. Ninguno de los grupos respondió con
rotaciones contralaterales a este tratamiento, hasta 40 minutos luego de la inyección del
agonista (DrdÏ/Jr n=4; Drd2+/' n=8; Drd2'/' n=5). Luego se trataron a los animales con SKF
6 mg/kg más una dosis de quinpirole de 0,6 mg/kg. Este tratamiento produjo niveles de+/+ +/
rotación considerables en los Drd2 y en los Drd2 y nuevamente la respuesta rotatoria
de estos últimos fiJe mayor con respecto a los animales normales, pero fue incapaz de
producir rotaciones en los ratones Drd2'/' (p<0,05, ANOVA). Sin embargo, al aumentar la
dosis de quinpirole a 3 mg/kg, administrado junto con el SKF 6 mg/kg, se observó una
respuesta supersensible en los tres genotipos. Los animales Drd2+/+ y Drd2+/' no
aumentaron la respuesta observada con la dosis inferior de quinpirole, sugiriendo que ella
ya era la máxima. Los heterocigotas se diferenciaron de los normales (p<0,01), reforzando
la idea de que la dosis génica D2 cumple un papel crucial en las interacciones Dl/DZ. Los
knock out alcanzaron un nivel de rotación similar al de los ratones normales (p>0,05,
ANOVA seguido de test de Dunnett).
2 |00\ l: -/¿”3 — +/e 75% su - +/+Tu
Eo 50oU)fl)3:.9fé 25- ns80'hZ 0-_____ — ....__..._
SKF 6 mg/kg SKF 6 mg/kg SKF 6 mg/kgQP 0,6 mg/kg QP 3 mg/kg
Figura 19: Evaluación de interacciones Dl/D2 en presencia de catecolaminas endógenas. Un grupo deratones lesionados de los tres genotipos file tratado con una dosis del agonista Dl SKF 38393 mientras queotro grupo fue tratado conjuntamente con SKF y el agonista tipo D2 quinpirole. Al cabo de 10 minutos de laadministración de los agonistas se determinó el número de rotaciones contralaterales. Las barras representanel promedio i el error estándar de grupos de animales de entre 4 y 8 individuos (ver texto).ns vs +/+ mismo tratamiento, p>0,05** vs +/+ mismo tratamiento, p<0,0]
59
Tesis Doctoral. Diego M. Gelman. Resultados y Discusión.
En conjunto, estos resultados apoyan una explicación basada en la necesidad de
estimulación de “tipo D2” para la expresión de conducta rotatoria en ausencia del receptor-/
D2. La akinesia inducida por AMPT en los ratones Drd2 , resistente al tratamiento con
dosis elevadas de SKF 38393, señala concluyentemente que la estimulación dopaminérgica
Dl no basta para la inducción de rotaciones. La incapacidad del SKF 38393 para inducir
rotaciones en condiciones normales, es decir sin el pretratamiento con AMPT, nos obliga a
descartar una explicación basada en el déficit de otras catecolaminas. La administración de
SKF fue incapaz de inducir rotaciones en los knock out incluso a dosis de 12 mg/kg (datos
no exhibidos). La inducción de respuesta rotatoria se produjo sólo cuando al agonismo Dl
se agregó una fuerte estimulación “tipo D2” que favorece la activación de receptores D3
y/o D4.
Tesis Doctoral. Diego M Gelman. Resultados y Discusión.
Parte 2.
1. Ratón transgénico TH-Cre.
1.1. Construcción de un transgén que expresa recombínasa Cre bajo el promotor de
tirosina hidroxilasa.
Para dirigir la expresión de la recombínasa Cre del bacteriófago Pl hacia células
catecolaminérgícas se construyó un vector portando el transgén que contiene la secuencia
codificante de la recombínasa Cre bajo el control transcripcional del promotor de 9 kb de la
tirosina hidroxilasa de rata. Este transgén, denominado —9THCre(Figura 20) fue purificado
y luego liberado del vector por medio de doble digestión con las enzimas SalI y NotI. El
inserto fue finalmente preparado para microinyección pronuclear.
Región 5’ flanqueante. Promotor de TH de rata.
Cre
S Sonda Nl l
l kb Creó Cre2
327 pb
Figura 20: Estructura del transgén TH-Cre. La línea roja representa el promotor de la tirosina hidroxilasade rata de 9 kb de longitud, la azul, al gen de la recombínasa Cre del bacteriófago Pl y la verde, la secuenciade poliadenilación. Cre 6 y Cre 2 son los primers a partir de los cuales se hace la genotipificación de animalestransgénicos amplificando una banda de 327 pb. S (Sall) y N (NotI) son las enzimas utilizadas para laliberación del transgén del plásmido. Sonda indica el fragmento de ADN utilizado para la genotipificación porDot Blot.
6]
Tesis Doctoral. Diego M Gelman. Resultados y Discusión.
1.2. Producción de animales con el transgén —9THCre.
El transgén —9THCrese microinyectó en el pronúcleo de ovocitos fertilizados de
ratón. Éstos se transfirieron al oviducto de hembras pseudopreñadas y a las tres semanas del
nacimiento se analizaron las crías en búsqueda del transgén. En total nacieron 23 animales
de embriones microinyectados resultando dos hembras transgénicas. La presencia del
transgén fue detectada por Dot Blot hibridando con un fragmento BamHI y BglII del gen de
la recombinasa Cre marcado radioactivamente y también por medio de PCR al amplificarse
una banda de 327 pb que abarca parte del gen de la recombinasa Cre (Figura 21).
Para establecer una colonia de animales transgénicos, las hembras transgénicas
obtenida por microinyección (F0), fueron apareadas con ratones no transgénicos. Una de las
hembras resultó ser estéril. El ADN de las crías de la hembra fértil se analizó por PCR y
Dot Blot para detectar la presencia del transgén. El transgén se transmitió a la filiación 1
(Fl), indicando que este se integró en los embriones de la F0 en un estadio que aseguró la
presencia del transgén en las células germinales y el evento de integración fue anterior a la
primera división mitótica de la cigota microinyectada, debido a que el porcentaje de
transgénicos Fl es cercano al 50%.
Por lo tanto, se obtuvo una línea de animales portadora del transgén que contiene la
recombinasa Cre del bacteriófago Pl bajo el promotor de la tirosina hidroxilasa. A
continuación, se describe la determinación del patrón de distribución de la proteína
transgénica Cre, comparándola con la endógena TH.
SinADN Control #90)
Figura 21: Genotipificación de animales transgénicos TH-Cre. En la figura a se muestran las señalescorrespondientes a animales positivos para Cre y la correspondiente al control positivo (ADN plasmídico) enun Dot Blot. El ADN de esos animales transgénicos fue sometido a una PCR (b) para determinar la presenciade una banda amplificada de 327 pb correspondiente a un fragmento interno del gen de la recombinasa Cre.
62
Tesis Doctoral. Diego M. Gelman. Raw/lados y Discusión.
1.3.Patr0’nde distribución dela proteína transgéncia Cre
El animal transgénico producido es portador del transgén construido puesto que éste
se detectó por los métodos indicados anteriormente, pero fue necesario determinar si el
promotor de la tirosina hidroxilasa era capaz de dirigir la expresión de la recombinasa Cre
de manera correcta en dicha línea.
1.3.¡Expresión de tirosina hidroxilasa y recombinasa Cre en cerebro.
Primeramente, se analizaron cerebros de animales transgénicos TH-Cre. Secciones
coronales y sagitales de 30 a 50 um de espesor obtenidas por cortes en vibrátomo o
micrótomo fueron sometidas a inmunohistoquímica para determinar el patrón de expresión
de la proteína endógena tirosina hidroxilasa y la transgénica Cre.
La expresión fue analizada en la sustancia nigra y el área tegmental ventral, en el
bulbo olfatorio y en el núcleo arcuato del hipotálamo en cortes coronales de cerebros de
animales transgénicos TH-Cre. En la figura 22 puede verse que el patrón de expresión de la
recombinasa Cre es plenamente coincidente con el de la proteína endógena tirosina
hidroxilasa. Puede verse que TH, al ser una proteína citoplasmática, se distribuye en toda la
célula marcándose las proyecciones hacia el cuerpo estriado correspondientes a las fibras
ascendentes del sistema nigroestriatal. Por el contrario, la recombinasa Cre cuenta en su
secuencia con una señal de anclaje al núcleo lo que implica que su inmunomarcación sea
más puntual y ceñida al núcleo celular. Por otro lado, se hizo una inmunohistoquímica
contra TH y Cre en secciones sagitales para determinar la distribución de la expresión de
cada una de estas proteínas en el locus coeruleus. Una vez más se observó que el patrón de
expresión de Cre es coincidente al de TH en este núcleo.
En resumen, el análisis de la expresión de la proteína recombinante Cre en cerebro
de animales transgénicos indicó que el transgén es activo en los núcleos neuronales que
expresan tirosina hidroxilasa. Se observó la expresión de Cre en las neuronas de la
sustancia nigra del sistema dopaminérgico nigroestriatal. También en las neuronas del área
tegmental ventral del sistema corticolímbico y en las neuronas del núcleo arcuato del
hipotálamo del sistema tuberoinfundibular. Asimismo, se determinó la expresión de Cre en
la capa periglomerular del bulbo olfatorio y en el núcleo A6 (locus coeruleus) compuesto
principalmente por células TH positivas noradrenérgicas.
63
rOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOÓOOOOÓOOOOOOOOO0.0.01
TesisDoctoral. Diego M Gelman. Resultados y Discusión.
Figura 22: Localización de TH endógena y recombinasa Cre transgénica en diferentes áreas. Seccionesseriadas de 50 pm de espesor de cerebros de animales transgénicos TH-Cre a nivel del locus coeruleus(células A6, a y b), sustancia nígra pars compacta y área tegmental ventral (A9 y A 10, c y d), núcleo arcuatoy periventrícular del hípotálamo (A12 y A14, e y f) y en la capa periglomerular del bulbo olfatorio (A16, g yh), fiieron sometidas a inmunohistoquímíca utilizando anticuerpos anti-TH (paneles de la izquierda) o antiCre (paneles de la derecha) como primer anticuerpo. A=100X.
64
ÏCOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOCOOCOOOÓOOOO0.00.0.0001
Tesis Doctoral. Diego M Gelman. Resultados y Discusión.
1.3.2. Colocalizacio'nde tirosina hidroxilasa y recombinasa Cre.
Para determinar si las células que expresan tirosina hidroxilasa también expresan
recombinasa Cre, se hizo un ensayo de colocalización con anticuerpos policlonales
específicos contra cada una de las proteínas. En una doble inmunohistoquímica en
secciones sagitales de cerebros de animales transgénicos se observo que, a bajo poder, el
patrón de expresión es coincidente en la sustancia nigra y área tegmental ventral, locus
coeruleus, bulbo olfatorio y núcleo arcuato del hipotálamo mientras que si se hace una
observación en alto poder, aquellas células que expresan tirosina hidroxilasa en su
citoplasma también expresan recombinasa Cre en sus núcleos (Figura 23).
La coexpresión de TH y Cre a nivel celular fue confirmada por la doble
inmunomarcación y así, la observación de un patrón coincidente a bajo poder fue
confirmada también a alto poder. La tirosina hidroxilasa muestra un patrón de expresión
citoplasmático mientras que la recombinasa Cre lo hace de manera nuclear.
Figura 23: Colocalización de tirosina hidroxilasa y recombinasa Cre. Secciones sagitales de cerebros deanimales TH-Cre fueron sometidos a una doble inmunohistoquímica utilizando como primeros anticuerposanti-TH y anti-Cre. Panel a: la sustancia nigra y área tegmental ventral A=200X, b: sustancia nigra A=1000Xc: núcleo arcuato del hipotálamo A=1000X.
65
1.3.3.Detección de tirosina hidroxilasa y recombinasa Cre por inmunofluorescencia.
La expresión de la tirosina hidroxilasa y la recombinasa Cre también fue evaluada
por inmunofluorescencia. Cuando se hace una observación a bajo poder a nivel de la
sustancia nigra y área tegmental ventral, locus coeruleus (Figura 24 d-j) y bulbo olfatorio
(Figura 24 j-I), se ve nuevamente los patrones de expresión coincidentes. Sin embargo, por
este método es posible detectar que en el caso del bulbo olfatorio, más precisamente en el
bulbo olfatorio accesorio, existe una región en la cual no existe coexpresión de las proteínas
(Figura 24 j-o). A nivel celular, puede confirmarse esa observación ya que se vió
claramente (Figura 24 o) que existen neuronas que expresan recombinasa Cre pero que no
están expresando tirosina hidroxilasa o neuronas que expresan tirosina hidroxilasa pero que
no expresan recombinasa Cre. Esto no ocurre en la sustancia nigra y área tegmental ventral
(Figura 24 a-c) o en el locus coeruleus (Figura 24 d-i) en donde más del 95% de las
neuronas TH positivas son Cre positivas.
Una posible explicación para el fenómeno observado en el bulbo olfatorio, es que
mecanismos post-transcripcionales pueden estar controlando el nivel de traducción de ARN
mensajero de TH en este tejido y que esos mecanismos no son extensivos al mensajero de
la recombinasa Cre en el animal transgénico. Por otra parte, puede estar ocurriendo que la
secuencia de 9 kb, que dirige la expresión de TH a este área durante un estadio del
desarrollo, lo haga normalmente, pero le falten secuencias inhibitorias que hacen que no se
siga expresando cuando adulto. Cabe destacar que se han encontrado neuronas productoras
de TH en varias regiones del cerebro de muchas especies de mamíferos fuera de las
tradicionales regiones catecolaminérgicas (Gaspar et al., 1987; Gouras et a|., 1992). Este
mismo fenómeno fue observado en un animal transgénico que expresa I.acZ bajo el
promotor de 9 kb de rata (Min et.al., 1994). La detección de la expresión de Cre en esta
región puede estar indicando una zona de expresión auténtica de TH pero no detectable por
tratarse de una expresión muy basal. Sin embargo, fue posible observar expresión de TH en
el bulbo olfatorio accesorio por medio del anticuerpo monoclonal empleado.
66
P.OOOOOOOOOCOOOOOOOOOOOOOOOÓOOOOOOOOOO0.0.0.0.1
Tesis Doctoral. Diego M. Gelman. Resultados y Discusión.
a
GL
AOB M)
Figura 24: Detección de tirosina hidroxilasa y recombinasa Cre por inmunofluorescencia. Seccionessagitales seriadas de cerebros de animales TH-Cre fueron sometidos a una doble inmunofluorescenciautilizando como primer anticuerpo monoclonal anti-TH (paneles a, d, g, j y m) y policlonal anti-Cre (panelesb, e, h, k y n). Se muestran microfotografias superpuestas en los paneles c, f, i, l, y 0. Panel a-c: la sustancianigra y área tegmental ventral, A:1000X; d-i: locus coeruleus, A=40X y lOOOX;j-0: bulbo olfatorio, A=40Xy lOOOX.AOB: Bulbo olfatorio accesorio, GL: Capa periglomerular.
67
ÏOOOOOOOOOO0.00.0000...OOOOOOOOÓOOOOOOOOOOOOOOI
Tesis Doctoral. Diego M. Gelman. Resultados y Discusión.
2. Línea reportera Z/AP.
Los animales transgénicos Z/AP fueron utilizados para cruzamientos con la línea
transgénica TH-Cre para determinar la actividad de la recombinasa Cre. Luego del
cruzamiento, fueron obtenidos los cuatro genotipos en proporción mendeliana. Por medio
de tinción de biopsias de orejas y PCR de ADN de colas se determinaron los animales
doble transgénicos portadores del gen Z/AP y TH-Cre, los que fueron utilizados para
ensayos de actividad de la proteína transgénica.
2.1. Genotipificacio'n de animales.
La línea transgénica Z/AP es genotipificada por medio de tinción de biopsias de
orejas. Luego de ser fijadas, las biopsias fueron sumergidas en una solución de coloración y
aquellas que fueron portadoras del transgén Z/AP se tomaron de color azul, mientras que
las que no lo portaban permanecieron inalteradas (Figura 25).
La determinación por PCR y la coloración de biopsias de orejas fue una técnica
adecuada para la determinación e identificación inequívoca de animales que fueron
sometidos a estudios posteriores.
Figura 25. Genotipificación de ratones de la línea Z/AP. Para identificar a los ratones transgénicos Z/AP,se hizo una tinción con el cromógeno X-Gal sobre biopsias de orejas. Aquellas provenientes de animalesportadores del transgén se tomaron azules (b), mientras que las demás permanecieron inalteradas (a).
2.2. Expresión de LacZ.
La expresión de LacZ fue evaluada en animales Z/AP para comprobar la ubicuidad
de la expresión de dicho transgén en la linea reportera. Para ello se sometieron a tinción a
embriones de 10,5 y 13,5 días post coito (d.p.c.). Se obtuvo expresión de B-galactosidasa en
todos los tejidos del animal, evidenciada por la coloración azul del embrión, lo que indica
68
TesisDoctoral. Diego M Gelman. Resultados y Discusión,
que el transgén que portan se está expresando de manera ubicua debido al promotor que la
dirige (Figura 26). Asimismo, se hicieron cortes de cerebro para comprobar la expresión de
dicho transgén, evidenciándose una coloración azul en todas las secciones estudiadas (datos
no exhibidos).
13,5 d.p.c
Figura 26: Expresión embrionaria del transgén Z/AP. Embriones de 10,5 (a) y 13,5 (b) días postcoitumfueron sometidos a tinción para [3galactosidasa utilizando X-Gal como cromógeno.
3. Ratones doble transgénicos
La evidencia de la presencia de la recombinasa Cre en cada una de las áreas
estudiadas no garantiza que ella fuera enzimáticamente activa. Por ello fue necesario
determinar si era capaz de escindir un fragmento de DNA que se encontrara entre dos sitios
loxP. Con dicho objetivo se aparearon animales transgénicos TH-Cre con ratones de la
linea reportera Z/AP (ver Materiales y Métodos) y las crías dobles transgénicas (portadores
del transgén THCre y del transgén Z/AP) fueron sometidas a tinciones para fosfatasa
alcalina.
3.1. Actividad de recombinasa Cre en cerebro de animales doble transgénicos.
En un corte sagital de cerebro de un animal doble transgénico puede verse, luego de
la tinción para fosfatasa alcalina, que las áreas marcadas son aquellas en donde existe
actividad de la recombinasa (Figura 27). Cre file quien indujo la excisión del fragmento de
DNA que expresaba B-galactosidasa permitiendo que comience a expresarse hPLAP puesto
69
Tesis Doctoral. Diego M Gelman. Resultados y Discusión.
que los patrones de coloración son coincidentes con las regiones catecolaminérgicas en
estudio. Nuevamente se observa que existe actividad en el bulbo olfatorio, en el área
tegmental ventral y sustancia nigra, en el locus coeruleus y asimismo puede observarse
marca en las fibras ascendentes del estriado, puesto que la fosfatasa alcalina es una enzima
citoplasmática que puede desplazarse de forma anterógrada. Fue observada una baja
expresión del transgén hPLAP sin que se observara su contraparte de TH. Esta expresión
ectópica se detectó en la corteza piriforme, en el coliculo inferior, en el tálamo y en el
núcleo interpeduncular (Figura 27).
Figura 27: Actividad de Cre en cerebro de animales doble transgénicos. Secciones sagitales seriadas decerebro de animales TH-Cre Z/AP fueron sometidas a inmunohistoquímica utilizando anti-TH como primeranticuerpo (a) y a tinciones contra hPLAP (b). A= 10X . AOB: Bulbo olfaton’o accesorio, GL: Capaperiglomerular, VTA: área tegmental ventral, LC: locus coeruleus, SNpc: sustancia nigra pars compacta, St:cuerpo estriado, Acc: núcleo acumbens, Hyp: hipotálamo.
70
Tesis Doctoral. Diego M. Gelman. Resultados y Discusión.
Gracias a la herramienta generada por Lobe y colaboradores es posible testear
prácticamente cualquier animal portador de un transgén que dirija la expresión de la
recombinasa Cre bajo algún promotor específico. En nuestro caso fue posible detectar la
actividad de la recombinasa Cre, que se encuentra bajo el control transcripcional del
promotor de 9 kb de la tirosina hidroxilasa de rata, evidenciada por la presencia de la
fosfatasa alcalina placentaria humana detectada por la coloración en secciones de cerebros
de animales dobles transgénicos. A continuación se detalla la actividad de la recombinasa
Cre, evidenciada por la actividad de la fosfatasa alcalina, en tejidos extra cerebrales.
3.2. Expresión y actividad dela recombinasa Cre en retina.
Un tejido extracerebral en donde se evaluó la expresión de la proteína endógena y
transgénica fue la retina, ya que las neuronas amácrinas expresan tirosina hidroxilasa.
En primer lugar se evaluó la expresión de tirosina hidroxilasa y recombinasa Cre en
preparados de retina de ratón transgénico por inmunohistoquímica. Puede verse que la
tirosina hidroxilasa forma un cordón debido a la distribución citoplasmática de la misma a
lo largo de las fibras (Figura 28a). Asimismo, puede verse claramente el cuerpo de la
célula. En el caso de Cre se detectó sólo el núcleo de la neurona amácrina (Figura 28h). A
continuación, se realizó una detección por inmunofluorescencia y nuevamente se observó el
mismo patrón de expresión, tanto para TH como para Cre (Figura 28d,e). Cuando se hizo
una superposición de las imágenes, puedo determinarse que existe colocalización a nivel
celular en las neuronas amácrinas de la retina. (Figura 280.
También se hizo una determinación de la actividad de la recombinasa Cre en
animales dobles transgénicos. En la figura 28c se puede observar la actividad de la fosfatasa
alcalina luego de la tinción específica evidenciada por una coloración azul violácea en las
neuronas amácrinas. Por lo tanto, la recombinasa Cre, además de estar presente, es
funcionalmente activa en neuronas amácrinas de la retina de animales trangénicos.
7l
Tesis Doctoral. Diego M Gelman. Resultados y Discusión.
Figura 28: Expresión y actividad de Cre en retina. Preparados de retina de ratones doble transgénicosfueron sometidos a inmunohistoquímica utilizando como primer anticuerpo anti-TH (a) ó anti-Cre (b) ótinción contra hPLAP (c). Los paneles inferiores muestran la localización de TH (d), Cre (e) porinmunofluorescencia. En el panel f se muestra la colocalización de ambas proteínas. A: 400X.
3.3. Expresión y actividad de recombinasa Cre en Ia médula dela glándula adrenal.
Otro tejido extracerebral en donde fue evaluada la expresión de las proteínas en
estudio fiie la glándula adrenal. La zona periglomerular de la médula adrenal expresa
tirosina hidroxilasa. Por ello se hicieron tinciones por inmunohistoquímica contra TH y
recombinasa Cre en este tejido. La expresión de tirosina hidroxilasa fue clara en la médula
adrenal y la de la recombinasa Cre fue menos evidente pero, sin embargo, detectable en un
área coincidente (Figura 29a,b). Asimismo se realizaron ensayos de actividad para la
recombinasa Cre y se determinó que fue capaz de producir la escición del gen de [3
galactosidasa evidenciado por la actividad de la fosfatasa alcalina (Figura 29c).
Reportes bibliográficos indican que la expresión de transgénes en la zona
periglomerular de la glandula adrenal es muy variable y dependiente del nivel de expresión
del transgén en particular. En nuestro caso puede estar ocurriendo que la baja expresión se
deba específicamente a la línea obtenida del animal transgénico. Con un número mayor de
líneas para el mismo transgén podría hallarse alguna con una expresión más elevada en la
médula adrenal. Sin embargo, la presencia de recombinasa Cre en este tejido pudo ser
determinada por inmunohistoquímica y por actividad enzimática.
72
l.OOOOOOOOOOOOOOOOOO...OOOOOOOCOOOOOOOOOOOOOOOC
Tesis Doctoral. Diego M Gelman. Resultados y Discusión.
Figura 29: Expresión y actividad de Cre en la médula de la glándula adrenal. Seccionesde la glándulaadrenal fueron sometidas a inmunohistoquimica utilizando anti-TH (a) o anti-Cre (b) como primer anticuerpoo a tinciones contra hPLAP (c). A= ZOOX.
3.4. Expresión de recombinasa Cre en estadio embrionario.
Para evaluar si el transgén introducido en esta línea de animales es capaz de
expresarse de igual manera que el gen de TH desde el comienzo del desarrollo, se
determinó la expresión de TH y recombinasa Cre y la actividad de esta última en embriones
de 13,5 dias post coito (Figura 30). La expresión de Cre es coincidente con la de TH al
analizarse por medio de inmunohistoquímica en secciones de embriones. Por medio del
ensayo de actividad, se demuestra que la recombinasa Cre es activa en cerebro medio y
también en sistema nervioso periférico, evidenciado por la coloración en el ganglio cervical
superior y en el estelar. En la periferia se detectó inmunomarcación y actividad para Cre en
los ganglios de la raíz dorsal.
La expresión y actividad de la recombinasa Cre en la línea transgénica generada, se
superpone de manera similar a la del gen endógeno tirosina hidroxilasa aún desde las
primeras etapas del desarrollo.
Figura 30: Expresión yactividad de Cre en estadoembrionario. Secciones deembriones de 13,5 días post coitofueron sometidas ainmunohistoquímica utilizandocomo primer anticuerpo anti-TH(a y d) ó anti-Cre (b) ó a tincionescontra hPLAP (c y e). En lospaneles a, b y c se muestran losganglios de la raíz dorsalmientras que en d y e el gangliocervical superior. A=40X
73
Tesis Docloral. Diego M. Gelman. Resultados y Discusión.
Parte 3.
I. Introducción de una mutación condicional nula en el gen del receptor DZ
de ratón.
I. I. Construcción de un vector de recombinacío'n homólogo dirigido al exón 2 del gen del
receptor de dopamina D2.
Para producir ratones con mutaciones nulas en el gen del receptor D2, se eligió
flanquear al exón 2 debido a que en él reside el sitio ATG de iniciación traduccional. Para
ello clonamos de una biblioteca genómica de la cepa de ratones 129 sv/ev un fago
conteniendo al exón 2 y regiones flanqueantes que permitieron construir un vector de
direccionamiento. Este vector consta de secuencias de homología 5’, de 5.5 kb de longitud
(brazo largo), y 3’, de 2.2 kb de longitud (brazo corto), que corresponden a secuencias que
flanquean al exón 2 del gen del receptor de dopamina DZ. Este vector de recombinación fue
llamado pCON3 y se preparó una purificación por gradiente de Cle y luego fue
linealizado con la enzima de restricción Sall (Figura 31).
l .2. Preparación deflbroblastos y determinación dela presencia de Micoplasma.
A partir de embriones de ratón de 13,5 días post coito se prepararon fibroblastos
siguiendo los procedimientos descriptos en la sección Materiales y Métodos. Los cultivos
de fibroblastos embrionarios murinos deben estar libres de micoplasma pues ellos pueden
interferir reduciendo o anulando por completo la participación de las células ES que han de
ser microinyectadas en blastocistos para producir ratones quime'ricos.
Por ello se determinó la presencia de micoplasma en los cultivos primarios de
fibroblastos. Utilizando la técnica de PCR anidada en dos etapas no fue posible comprobar
la presencia de marcadores genéticos de dicho microorganismo en cultivos que fueron
mantenidos libres de cualquier agente de selección durante dos pasajes consecutivos y
utilizando DNA control proveniente de Micoplasma pirum y Acholeplasma Iaidlawii. Los
fibroblastos fueron entonces inactivados con radiación gama o por un medio de cultivo
74
ÏOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOCOOOOOOOOOOOOOOO0.0.0....
Tesis Doctoral. Diego M Gelman. Resultados y Discusión.
conteniendo mitomicina C, fraccionados en criotubos de a 1 ml y almacenados en nitrógeno
liquido para su posterior utilización.
aExon2
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Figura 31: Esquema del vector de recombinacíón homóloga y del locus endógeno. En la figura se muestra(a) el locus endógeno para el receptor dopamínérgíco D2 en la región del exón 2, el vector de recombinacíónhomóloga (b) con las secuencias que le confieren resistencia (PGK Neo y HSV-TK) y el locus luego de larecombinacíón (c). También se muestran las deleciones de tipo I (e) y Ii (d) debidas a la acción de larecombinasa Cre. A, B y C son las sondas utilizadas para la hibridación de los Southern blots.
75
D.OOOOOOOOOOOOOOOOOO...OOOOOOOOOOOOOCOOOCOOOOOG
Tesis Doctoral. Diego M Gelman. Resultados y Discusión.
1.3. Preparación y titulación de mLIF. Puesta a punto del cultivo de células ES.
El factor inhibitorio de la leucemia murina (mLIF) es utilizado para el
mantenimiento in vitro del fenotipo pluripotencial de las células embrionarias (ES) y
debido a su muy alto costo decidimos producirlo en nuestro laboratorio.
Luego de la preparación y purificación por los métodos descriptos en la sección
Materiales y Métodos, se corrieron una serie de fracciones en un gel de poliacrilamida para
comprobar la pureza de la proteína. En la figura 32a se muestra el gel en el que las bandas
de peso molecular de 20 kDa corresponden a la proteína recombinante mLIF en cantidad de
masa creciente. Puede verse que es la banda de presencia mayoritaria en el preparado
aunque existen otras inespecificas que corresponden a otras proteínas. El preparado se pasó
por filtros estériles de 22 um, se fraccionó y se congelaron las muestras a —20°Cpara su
almacenamiento.
43 kDa
29 kDa
18,4 kDa
¡4,3 kDa
Q". A ¡ii«¿y? Anf“?. , c- ; t," 4 ¡Thai ‘ A ‘ fl 4‘
Figura 32: Preparación de mLIF y cultivo de células ES. En a se muestra un gel de poliacrilamida en elque se sembraron diferentes diluciones del preparado de la proteína recombinante mLIF de aproximadamente20 kDa. Se observan bandas que corresponden a otras proteínas que copurificaron con la preparación. En elpanel siguiente pueden verse colonias de células ES sin diferenciar (b) y diferenciadas (c) sobre un cultivo defibroblastos.
76
DOOOOOOOOOCOOOOOOOO000......OOOOOOOOOOOOOOOOOOG
Tesis Doctoral. Diego M Gelman. Resultados y Discusión.
Rec.—>6,5 kb
Wt.—> í2,8 kb
Figura 33: Detección de clones resistentes por Southern blots. ADN genomico de clones resistentestransfectados con el vector de recombinación homóloga pCON3 fue digerído con BamHI (a), KpnI (b) y SmaI(c) y luego sometido a Southern blot. Se utilizaron las sondas B, C y A respectivamente (ver Figura 31). En lafigura se muestran las bandas correspondientes al alelo salvaje y al recombinante homólogo.
El porcentaje de recombinación homóloga es variable y depende de las secuencias
de los brazos de recombinación y, en definitiva, del locus en el cual se quiere hacer blanco.
En este caso, obtuvimos solo un recombinante homólogo de un total de 217 clones
analizados en la primera electroporación y uno entre 189 en la segunda, es decir 0.46% y
0.53% respectivamente. Estos porcentajes de recombinación se encuentran dentro de los
valores publicados en la bibliografía para la generación de otros animales mutantes.
1.5. Transfeccio'n transitoria de clones positivos con un plásmido que expresa
recombinasa Crepara escindir a los marcadores de selección.
Utilizando cultivos de 80% de confluencia de los clones Hl y BIO portadores de la
recombinación homóloga adecuada, se electroporó el vector pCAGGS-Cre, el cual expresa
la recombinasa Cre de manera constitutiva. En este caso, donde se busca expresar
78
Tesis Doctoral. Diego M Gelman. Resultados y Discusión.
transitoriamente a la recombinasa Cre, el vector fue electroporado en la forma
superenrollada. Nuevamente, se plaquearon las células y se siguieron los pasos descriptos
en la sección Materiales y Métodos hasta obtener las colonias resistentes al agente de
selección, que en esta segunda etapa es el Ganciclovir. Se obtuvieron en total 121 colonias
con la morfología adecuada para el clon H1, de las cuales crecieron solo 105 luego de ser
repicadas y 93 del clon B10. A continuación se preparó ADN de cada uno de ellos,
siguiendo los métodos descriptos, para detectar clones positivos.
1.5.1.Determinación de clonespositivas por PCR y Southern blot.
Para determinar rápidamente clones positivos se utilizó la técnica de PCR. A partir
de ella se detectaron 4 clones puros y 3 mixtos para los provenientes del clon H1 y sólo uno
puro positivo para aquellos provenientes del B10 (Figura 34). Estos tres clones mixtos
pueden ser causa de una segregación diferencial del plásmido que expresa la recombinasa
Cre entre células al dividirse, lo que provocó que en células hermanas exista una escición
heterogénea del cassette de resistencia dentro del mismo clon. La figura 34 muestra el
patrón de bandas del gel en donde se observan los clones positivos A8, E10, El l, G12 y los
mixtos A10, F7 y G8 entre otros clones negativos.
Del. Tipo IDel. Ti o II
> Wt. p
Figura 34: Detección de deleción de tipo I o ll por PCR. Luego de ser transfectados transitoriamente conun plámido que expresa recombinasa Cre, el ADN de los clones que sobrevivieron a la selección conganciclovir en el medio de cultivo fue sometido a una reacción de PCR. En la figura se ven las bandascorrespondientes al alelo wt (234 pb), al que contiene la deleción de tipo l (450 pb) y al de tipo II (369 pb),corridas en un gel de agarosa con bromuro de etídio. Se puede ver que en el caso del clon mixto existen lastres bandas. Como control positivo se utilizó el vector de recombinación homóloga pCON3.
79
Tesis Doctoral. Diego M Gelman. Resultados y Discusión.
A continuación, dichos clones positivos fueron testeados por Southern blot. El ADN
de cada uno de ellos fue digerido por separado con las enzimas de restricción BamHI, KpnI
y SmaI. Utilizando las sondas correspondientes (ver sección anterior) se hibridaron y la
figura 35 muestra el patrón de bandas obtenido. En el gel se incluyeron controles positivos,
negativos, un clon mixto y un revertante.
Wt.10,5kb
4- Del.TipoII 6,1kb
4- De].TipoI 5,1kb
Figura 35: Hibridación de Southern de clones positivos por PCR. ADN genómico de clones positivos porPCR que contienen la deleción de tipo II fue digerido con KpnI y luego sometido a Southern blot. Se utilizó lasonda C para la hibridación. Se incluyó ADN control y uno conteniendo la deleción de tipo I. En la figurapueden verse las bandas correspondientes al alelo wt (10,5 kb), al que lleva la deleción de tipo I (5,1 kb) y alos que llevan la deleción de tipo II.
Hasta aqui entonces, hemos obtenido 5 clones positivos para la introducción de los
sitios loxP flanqueando el exón 2 del gen del receptor de dopamina D2. Dichos clones
provienen de dos clones madre obtenidos de manera independiente, el H1 y el B10, y de
ellos se desprenden los clones definitivos. De] H1 se obtuvieron el A8, E11, E12 y 612
mientras que del B10 solo uno, al cual lo llamamos de la misma manera.
Cada uno de los clones fue amplificado y finalmente fraccionado en diferentes
criotubos y almacenados en nitrógeno liquido hasta el momento de su descongelado para la
microinyección de blastocistos.
80
Tesis Docloral. Diego M. Gelman. Rem/lados y Discusión.
1.6. Microinyección de blastocistos y obtención de quimeras.
Los clones positivos obtenidos fueron microinyectados en blastocistos provenientes
de hembras C57BL/6J. Hasta el día de la escritura de esta tesis se reali7aron 7
microinyecciónes sobre un total de ¡68 blastocistos, los que fueron transferidas a l l madres
adoptivas. De ellas nacieron un total de 28 crías. En la tabla que se muestra a continuación
se detallan los datos de inyeccion de blastocistos y el registro de nacimientos.
Según puede verse (Tabla 2) la proporción de crías según el grado de quimerismo es
variado. Sólo se obtuvo una cría con un porcentaje de quimerismo mayor del 90%
proveniente del clon El l (Figura 36), pero la proporción de crías con porcentaje de
quimerismo entre el 60 y 90% es mayor. De aquellas dos provenientes del clon BIO, sólo
nacieron crías de pelaje negro, indicando que no portaban el gen de dopamina con los sitios
loxP flanqueantes. Las correspondientes a los clones El l y E12 debe esperarse a que estén
en edad de apareo y a que tengan crías para el análisis de la mutación.Tabla 2:
Tesis Doctoral. Diego M Gelman. Resultados y Discusión.
Figura 36: Quimeras. A partir de clones de células ES microiyectadas en blastocistos de ratones C57BL/6Jse obtuvieron animales quiméricos con el característico pelaje. En la foto se muestran tres ratones, uno negroC57BL/61, un agoutí y uno quime’rico.
A partir de dos animales quiméricos, un macho y una hembra, se hizo un análisis de
ADN por medio de la técnica de PCR, para detectar la presencia del alelo mutado en
diferentes tejidos. Los animales utilizados provenían de la microiyección de blastocistos
con el clon B10, los que fileron dejados en apareo y se aguardó por lo menos tres camadas
para sacrificarlos y extraer los diferentes tejidos. No se detectaron crias agoutí en ninguna
de las camadas, indicador de la transmisión de la mutación. En la figura 37 se muestra un
gel de agarosa en el que se corrieron los productos de PCR proveniente de cada tejido y se
puede observar que en cada uno de ellos existen las bandas correspondientes al alelo salvaje
y al que contiene la deleción de tipo II.
82
TesisDoctoral. Diego M Gelman. Resultados y Discusión.
Quimera macho Quimera hembra
:2 =©=°E 08°=:.2Ee =seEéfis‘ñüsgássüumoemoomuom
Figura 37: Detección del alelo mutado en tejidos provenientes de animales quimericos. ADN provenientede cola, riñón, corazón, cerebro, hígado y testículo, en el caso del macho, fue sometido a PCR para detectar lapresencia del alelo portador de los sitios loxP. En la figura se ve que todos los tejidos estudiados sonportadores del alelo Wt.y el que sufi‘íó la deleción de tipo II.
83
CONCLUSIONES —
Tesis Doctoral. Diego M. Gelman. Conclusiones.
Conclusiones.
Parte I.
A partir de los resultados obtenidos en esta primera parte del trabajo se puede concluir que:
l- Se obtuvo un modelo de inducción de enfermedad de Parkinson experimental en ratones
a través de un dispositivo especialmente diseñado para producir lesiones unilaterales en
el cuerpo estriado de ratón. Éste permite administrar la neurotoxina 6-OHDA en uno de
los cuerpos estriados e inducir la destrucción de una vía dopaminérgica nigroestriatal,
dejando intacta la vía contralateral.
2- La administración de 6-OHDA es igualmente eficaz en la destrucción de neuronas
dopaminérgicas de la vía nigroestriatal de ratones normales y de ratones deficientes en
el receptor D2.
u l Los ratones deficientes en el receptor D2 son capaces de desarrollar respuestas
supersensibles a agonistas dopaminérgicos luego de la desnervación nigroestriatal
evidenciada por medio de una conducta rotatoria cuantificable en sentido contralateral
al sitio lesionado.
4- A más largo plazo, los ratones deficientes en el receptor DZ, alcanzan niveles de
actividad locomotora supersensible comparables a los de los animales normales o
heterocigotas para la mutación. Estos resultados sugieren que la respuesta supersensible
temprana tendría un componente principalmente de tipo DZ, hecho que se ve reflejado
en la demora de la aparición de conducta rotatoria en los ratones con la mutación nula
para el receptor D2.
5- La estimulación del receptor dopaminérgico Dl es necesaria para la expresión de
supersensibilidad postsináptica en ausencia de receptores D2, hecho que ha quedado en
evidencia al utilizar antagonistas Dl y luego tratar animales con el agonista mixto
apomorfina. Bajo dichas condiciones, la conducta rotatoria de los animales Drd2'/'
disminuyó prácticamente en su totalidad.
6- La estimulación de receptores tipo DI no es suficiente para la expresión de respuestas
motoras en condiciones de supersensibilidad, siendo necesaria la estimulación
concurrentedereceptorestipoD2. M/ WDr. Marcelo RuÜIÏIsteln
INGEBI (UBA-CONICEI')
Tesis Doctoral. Diego M. Gelman. Conclusiones.
Parte2.
A partir de los resultados obtenidos en esta parte del trabajo se puede concluir que:
l- Se produjo una línea de ratones transgénicos que expresan la recombinasa Cre del
bacteriófago Pl bajo el control transcripcional del promotor de 9 kb de tirosina hídroxilasa
de rata.
2- El patrón de expresión de la proteína transgénica Cre es coincidente con el de la TH
endógena en las áreas del sistema nervioso central estudiadas, incluidas la sustancia nigra
pars compacta, el área tegmental ventral, el locus coeruleus y el núcleo arcuato del
hipotálamo.
3- En todas estas regiones se ha demostrado que existe colocali7ación de recombinasa Cre y
tirosina hídroxilasa a nivel celular, mediante el uso de doble inmunohistoquímica y
confirmación por inmunofluorescencia.
4- La recombinasa Cre en los ratones transgénicos es funcionalmente activa, puesto en
evidencia a través del uso de la línea reportera Z/AP, por la aparición de actividad de
fosfatasa alcalina placentaria humana, en animales dobles transgénicos THCre-Z/AP.
5- Se determinó que las neuronas amácrinas de la retina expresan la recombinasa
funcionalmente activa.
6- De la misma manera se determinó la presencia y actividad de la recombinasa Cre en la
médula de la glándula adrenal de ratones transgénicos.
7- La recombinasa Cre mostró niveles de expresión ectópica en células del hipotálamo
lateral, núcleo subincerto, septum, corteza piriforme, cuerpo estriado y colículo inferior.
8- F,l animal transgénico TH-Cre generado constituye una herramienta valiosa para
introducir mutaciones restringidas a neuronas catecolaminérgicas en ratones que porten
¿2,4%Dr.Marcelo Rublnsteln
lNGEBl (UBA-CONlCET)
alelos flanqueados por sitios loxP.
86
Tesis Doctoral. Diego M. Gelman. Conclusiones.
Parte 3.
A partir de los resultados obtenidos en esta última parte del trabajo se puede concluir que:
l- Se ha puesto a punto en nuestro laboratorio las técnicas necesarias para obtener cultivos
de células embrionarias totipotenciales (ES) no diferenciadas.
2- Se ha puesto a punto en nuestro laboratorio las técnicas necesarias para obtener cultivos
fibroblastos embrionarios murinos libres de micoplasmas, soporte fundamental para el
crecimiento de células embrionarias totipotenciales (ES), asi como la preparación,
purificación y titulación del factor inhibidor de la leucemia (LIF) de ratón, suplemento
fundamental para el cultivo de células ES, el cual inhibe la diferenciación de esta línea
de ce'lulas.
3- Se construyó un vector de recombinación homóloga para introducir sitios loxP a los
lados del exón 2 del receptor de dopamina D2.
4- Utilizando dicho vector , se electroporaron células ES y se detectaron clones resistentes
a G418 que incorporaron al vector por recombinación homóloga.
5- Por medio de una transfección transitoria con un plásmido que expresa la recombinasa
Cre, se eliminaron las secuencias que aportaban la resistencia de selección para
finalmente obtener clones de células ES donde dos sitios loxP flanquean al exón 2 del
gen del receptor dopaminérgico D2.
ONI Cuatro clones independientes fueron microinyectados en blastocistos de ratones
C57BL/6J y se obtuvieron ratones con distintos grados de quimerismo. Debido a que
hasta el momento de la escritura de esta tesis, ningún raton logró transmitir la mutación
a la línea germinal, el mismo vector de direccionamiento está siendo electroporado en
otras células ES.
A partir de uno de estos clones se obtendrá una línea de animales que porten sitios
loxP en el gen del receptor de dopamina D2 y se pondrán a aparear con los transgénicos
TH-Cre, para obtener ratones que sean deficientes en el receptor presináptico de dopamina.
El estudio de estos ratones mutantes contribuirá al esclarecimiento del papel desempeñado
por dicho receptor.
Dr. arcelo Rublnsteln
INGEBl (UBACOtÉlgET)
MATERIALES Y METODOS —
Tesis Doctoral. Diego M. Gelman. Materiales y Métodos.
Materiales y Métodos.
Parte I. Modelo animal para el estudio de lafunción dopaminérgica.
Animales y Biolerio.
Los ratones utilizados para experimentación se encuentran en una sala exclusiva del
bioterio del Instituto de Biología y Medicina Experimental (IBYME-CONICET). En esta
sala. los animales se mantienen con un sistema de ventilación permanente, un ciclo
luz/oscuridad de 12 hs (7:00 AM-7:00 PM) y una temperatura controlada que se mantiene
entre 19 y 23°C. Los ratones reciben una dieta comercial de mantenimiento. salvo las
madres en período de lactancia que reciben una dieta más rica en proteínas y grasas.
Para los experimentos de lesión y conductuales utilizamos la cepa de ratones
C57BL/6J con una mutación nula para el gen del receptor de dopamina D2. Estos animales
congénicos fueron generados mediante recombinación homóloga (Kelly et al, 1997) y
posteriormente retrocruzados ocho veces a la cepa C57BL/6J (Jackson Lab, USA) (n=8)
para unificar la carga genética de los animales salvajes y mutantes.
Lesión estriatal unilateral con 6-0HDA.
Para las lesiones se utilizaron animales adultos de entre dos y tres meses de edad
cuyo peso oscilaba entre los 20 y 25 g. Los ratones se anestesiaron con 2,2,2
tribromoetanol (300 mg/kg; Aldrich Chemical Company, Wi., USA) y se les suministró una
dosis i.p. de desipramina (12,5 mg/kg; Sigma Chemical C0., St. Louis, MO, USA) un
inhibidor del recaptador de noradrenalina. Entre 20 y 30 min después, los animales fueron
puestos en un molde de acrílico especialmente diseñado para la lesión. Este molde es un
dispositivo estereotáxico que permite inyecciones precisas y reproducibles en el núcleo
estriado de ratón. Fue diseñado para realizar lesiones en las coordenadas anteroposterior
+0,5 y lateral izquierdo o derecho +1,9 de acuerdo con el atlas de Franklin y Paxinos (1997)
y a una profundidad de 4 mm debajo de la calota. A cada animal se le inyectó l pl de 6
hidroxidopamina (6-OHDA hidrobromuro; Sigma) disuelto en ácido ascórbico 0,02% o l
ul de vehículo (Acido Ascórbico 0,02%) utilizando una jeringa de vidrio de lO ul
(Hamilton Company, Reno, Nevada, USA) acoplada por una cánula plástica a una aguja
89
Tesis Doctoral. Diego M. Gelman. Materiales y Métodos.
Carpul de 0.3 x 25 mm (30G long; Bayer. Alemania) y a una velocidad de l ul/min La
aguja fue dejada en el lugar hasta un min después de la inyección para evitar el reflujo y
favorecer la difusión de la toxina. Se ensayaron diferentes concentraciones de 6-OHDA de
entre lO mg/ml hasta 50 mg/ml para finalmente utilizar la de 25 mg/ml basándonos en el
grado de lesión alcanzado. Luego de 4 dias los animales fueron separados de acuerdo a una
conducta rotatoria espontánea ipsilateral respecto al sitio de la lesión para los ensayos
conductuales y bioquímicos.
Drogas y tiempos de inyecciónprevios a los análisis conductuales.
Agonistas.
Apomorfina clorhidrato (Sigma) fue disuelta en solución fisiológica conteniendo 0,1% de
ácido ascórbico e inyectada de manera subcutánea 5 min antes del primer período de
medición.
SKF 38393 clorhidrato (Sigma) fue disuelto en solución fisiológica e inyectado
intraperitonealmente 5 min antes del primer período de medición.
(-)-Quinpirole clorhidrato (Sigma) fue disuelto en agua hexadestilada e inyectado
intraperitonealmente 5 min antes del primer período de medición.
Antagonistas.
SCH 23390 clorhidrato (Sigma) fue disuelto en agua hexadestilada e inyectado l h antes de
la administración de agonistas.
S(-)-Raclopride L-Tartrato (RBI) fue disuelto en agua hexadestilada e inyectado 25 min
antes de la administración de agonistas.
El inhibidor de la sintesis de catecolaminas a-metil-DL-p-tirosina metilester
hidrocloruro (AMPT; Sigma) fue disuelto en agua hexadestilada e inyectado dos veces: 3
hs y l h antes de la primera prueba conductual (200 mg/kg y 100 mg/kg i.p.
respectivamente).
Pruebas conductuales. Determinación de las rotaciones.
Luego de cinco días de la inyección de 6-OHDA los ratones fueron puestos
individualmente en jaulas circulares de 20 cm de diámetro inferior y 30 cm de diámetro
superior para cuantificar la actividad rotatoria espontánea en campo abierto, durante 5 min,
90
Tesis Doctoral. Diego M. Gelman. Materiales y Mémdos.
por observación directa. Se consideró una vuelta completa a un giro de 360°. A partir del
día 7 luego de la operación se registró otro período previa administración de drogas que
poseen diversos mecanismos de acción relacionados con la función dopaminérgica. En este
caso se registró la actividad rotatoria entre el minuto 5 y lO y entre el 20 y 25 luego de la
inyección de la droga. Para los cálculos se consideró el mayor número de vueltas obtenido
en cada período o la suma de ambos. Para cada droga utilizada, se controló la actividad
rotatoria a lapsos mayores que 30 min, comprobándose que el pico de acción de la droga ya
había pasado. Los ratones fueron analizados regularmente con el agonista dopamine’rgico
mixto apomorfina para evaluar el progreso de la supersensibilidad a lo largo de los cuatro
meses post-cirugía.
Una curva dosis respuesta determinó que la dosis efectiva del 75% (DE75)
correspondía a 0,5 mg/kg (s.c.) y utilizamos ésta dosis en la mayoría de los experimentos.
Aquellos animales que en ninguna prueba superaron las 10 rotaciones contralaterales en lO
min fueron excluidos de los análisis. Antes de la realización de cada experimento
involucrando el uso de más drogas, se analizaron nuevamente a los animales con
apomorfina y se siguió el mismo criterio de selección. El valor obtenido en estas
selecciones fue tomado como la medida de referencia para evaluar el efecto de
antagonistas.
Determinación del contenido de monoaminas y sus metabolitos.
Se siguió una técnica similar a la descripta por Hall e! al. (1989). Brevemente, se
extrajo el cerebro de animales que habian sido operados con dos o más meses de
anterioridad y se disecaron el cuerpo estriado izquierdo y derecho. Ambos estriados se
homogeneizaron separadamente en ácido perclórico 0,3 N en frío y se centrifugaron a
10.000 X g por lO min utilizando el sobrenadante para realizar inyecciones de diferentes
volúmenes en un cromatógrafo de alta performance (HPLC). A partir de curvas estándar se
calcularon los valores incógnita de cada muestra los que fueron expresados como pg/mg de
tejido.
9l
Tesis Doctoral. Diego M. Gelman. Materia/es y Métodos.
Parte 2. Línea de animales TH-Cre.
Construcción del transgén —9THCre.
Para la construcción del transgén, fueron llevados a cabo los siguientes pasos:
l.
b)
Un plásmido pBluescript SK (Stratagene, California, USA) conteniendo una secuencia
de poliadenilación del gen del antígeno T del virus SV40 fue digerido con la enzima de
restricción SmaI. (Vector l)
El plásmido pMCCrePGK-Hyg, conteniendo la secuencia codificante del gen de la
recombinasa Cre. fue digerido con la enzima Mlul. Se aisló el fragmento de 1,2 kb que
corresponde a dicho gen. (Inserto l)
El inserto fue tratado para generar extremos romos mediante una reacción de fill in y
luego ligado al vector previamente desfosforilado con fosfatasa alcalina.
El plásmido ligado en la orientación correcta fue digerido con la enzima Hindlll.
(Vector 2)
El plásmido pTH9,0 (Min e! aL. 1994), conteniendo 9 kb del promotor de tirosina
hidroxilasa de rata. fue digerido con Hindlll. Se aisló un fragmento de 9 kb. (lnserto 2).
Vector 2 e inserto 2 fueron ligados dando como resultado el plásmido pBS-9THCre.
El transgén —9THCre fue liberado del vector por doble digestión con las enzimas de
restricción Sall y Notl obteniéndose un fragmento de 10,5 kb. Este contiene 9 kb del
promotor de tirosina hidroxilasa de rata fusionado a la secuencia codificante completa del
gen de la recombinasa Cre del bacteriófago Pl.
Las técnicas de biología molecular utilizadas para la obtención de este plásmido
fueron las que se describen a continuación.
Técnicas de biología molecular empleadas.
Cortes con enzimas de restricción y aislamiento por electroelución.
La preparación de fragmentos y vectores para reacciones de ligación, fue realizada
mediante cortes con enzimas de restricción de acuerdo a las instrucciones del proveedor,
partiendo de 5 ug a 20ug del fragmento o vector deseado, y posterior electroelución en
geles de agarosa.
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El aislamiento por electroelución de fragmentos y vectores fue llevado a cabo
mediante una electroforesis preparativa del ADN digerido, en geles de agarosa con 0,1
ug/ul de bromuro de etidio, utilizando TBE 0,5X (Tris borato 45 mM. EDTA l mM, pH-8)
como buffer de corrida. Luego de efectuada la separación, se identificaron las bandas con
un transiluminador de luz UV y se cortó, con una hoja de afeitar, el bloque de agarosa
conteniendo la banda deseada. Este fue colocado dentro de un tubo de diálisis de 6.25 mm
de diámetro (Gibco BRL, Bethesda, MD, USA) con buffer TBE 0,5X, se cerraron los
bordes con agarraderas y se realizó una electroforesis, orientando la membrana de forma tal
que el campo eléctrico generado sea perpendicular a la longitud máxima de la bolsa de
diálisis. La electroforesis se desarrolló durante 30 min a 10—l2V/cm; luego se extrajo el
medio líquido y se hizo una extracción con l vol. de fenol equilibrado con Tris—HCl.pH-8
cloroformo-isoamílico 25:24:] (PIC), seguida de una extracción con l vol. cloroformo
isoamílico 24:1 (IC) La fase acuosa se precipitó con 0,] vol. de acetato de sodio 3 M, pH
5.2 y 2,5 vol. de etanol 100%. Se mantuvo a -70°C durante 10 min y luego se centrifugó a
máxima velocidad durante 10 min. El precipitado se lavó con etanol 70% y se resuspendió
en 10-20 ul de TE (Tris-HCl 10 mM, pH-8, EDTA l mM) de acuerdo a la masa inicial.
Generación de extremos ramos.
Para generar extremos romos o blunr a panir de cortes con enzimas que dejan
extremos cohesivos. se utilizó el fragmento mayor (Klenow) de la polimerasa de ADN de
tipo I de E. coli (Gibco BRL). En el caso de extremos 5’ salientes, se hicieron reacciones de
rellenado ofill in, utilizando la actividad polimerasa de la Klenow, como se especifica a
continuación. En un tubo eppendorjf se agregó 0,5-l pg del fragmento de ADN con
extremos 5’ salientes, 0,5 mM de cada dNTP, el buffer apropiado y l UE de Klenow. Se
llevó a 30 pl con HzO y se incubó 15 min a temperatura ambiente. La reacción fue
terminada por extracción con l vol. de PIC incubándose por 5 min a temperatura ambiente
y luego se centrifugó a máxima velocidad. Se tomó la fase acuosa y, para eliminar trazas de
fenol. se hizo una extracción con l vol. de IC. Nuevamente, se volvió a centrifugar a
máxima velocidad por l min y se tomó la fase acuosa. El ADN fue precipitado agregando
0,1 vol. de una solución 3 M de acetato de sodio, pH-5,2 y 2,5 vol. de etanol 100%. Se
93
Tesis Doctoral. Diego M. Gelman. Materiales y Mélodos.
incubó por 10 min a —70°Cy se centrifugó a máxima velocidad. El precipitado fue lavado
con etanol 70% y resuspendido en TE.
Los extremos 3'salientes fueron digeridos utilizando la actividad 3’—) 5’
exonucleasa de la enzima Klenow. como se detalla a continuación. En un tubo eppendorf se
agregó O,5—lug del fragmento de ADN con extremos 3’ salientes, el buffer apropiado y 5
UE de Klenow. Se llevó a 30 pl con H20 y se incubó 30 min a temperatura ambiente. La
reacción fue terminada y el ADN precipitado de la misma forma que para los extremos 5’
salientes.
Defosforilación de vectores.
Las reacciones de defosforilación se realizaron con la enzima fosfatasa alcalina
intestinal de ternero (ClAP; del inglés: Calf]ntestinal Alkaline Phospharase; Gibco BRL),
incubando en el buffer provisto por el proveedor, 0,01 UE de CIAP por pmol de ADN con
extremos 5’ salientes. a 37°C durante 30 min, ó l UE por pmol de ADN con extremos
romos. a 50°C por una h. La inactivación de la CIAP se realizó por medio de una doble
extracción con un volumen de PIC. Posteriormente se eliminaron las trazas de fenol y se
precipitó el ADN como se especificó anteriormente.
Reacciones de Iigación
Para realizar las reacciones de ligación se utilizaron 20 a 50 ng de vector. El inserto
se agregó en una proporción molar, con respecto al vector, de 3:1 (estas proporciones
fueron calibradas corriendo previamente inserto y vector en un gel de agarosa). La mezcla
de vector e inserto se incubó con l UE de la ligasa de ADN del fago T4 (Gibco BRL) en el
buffer de ligación provisto, que contiene ATP, en un volumen final de lO pl. Los tubos se
incubaron durante la noche a temperatura ambiente y luego se procedió a realizar la
transformación de bacterias competentes.
Preparación de bacterias competentes.
A partir de un stock de glicerol se obtuvieron colonias independientes de la cepa
DHSa de E. Cali. Con una de estas colonias se realizó un inoculo en 3 ml de medio LB
(1% de bactotriptona, 0,5% de extracto de levadura y 1% de NaCl) y fueron crecidas a 37°C
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Tesis Doctoral. Diego M. Gelman. Mamriales y Mérodos.
con agitación hasta alcanzar una OD550 de 0,3. Con este cultivo se inocularon 100 ml de
medio LB y se creció con agitación a 37°C hasta alcanzar una OD550 de 0,48. El cultivo se
enfrió en hielo y se centrifugó a 3000 r.p.m. en rotor GSA (Sorvall, USA) durante 5 min a
4°C. El medio fue descartado y el precipitado resuspendido cuidadosamente en hielo con 40
ml de be l (30 mM acetato de potasio, 100 mM de KC], lO mM de CaClz, 50 mM de
MnC12 y 15% glicerol, pH-S,8 -ajustado 0,2 M de ácido acético—). Las muestras se
dejaron reposar brevemente en hielo y se centrifugan en tubos tipo Corex de 30 ml,
nuevamente a 3000 r.p.m. por 5 min a 4°C. El precipitado se resuspendió cuidadosamente
en hielo con 4 ml de be II (lO mM MOPS, 75 mM CaClz, lO mM KC], 15% glicerol. pH
6.5—ajustado l M de KOH—). Las células se dejaron reposar en hielo por 15 min y se
fraccionaron en tubos eppendorf estériles. Por último se guardaron a —70°Chasta su uso.
Transformación de células competentes.
Las bacterias competentes se descongelaron en hielo y se fraccionaron de a 50 pl en
tubos eppendorfestériles. Se agregó a las bacterias 5 pl del producto de la ligación y, sin
sacar las bacterias del hielo. se mezcló suavemente con una punta de pipeta estéril. Las
células se dejaron reposar en hielo por 30 mín y luego se procedió a realizar un shock
térmico. que consistió en colocar las bacterias a 42°C durante 90 seg. y luego enfriarlas en
hielo rápidamente. Las bacterias se recuperaron con 0,7 ml de LB fresco durante 30 min
con agitación y a 37°C. Posteriormente, se centrifugaron a 4000 r.p.m. durante 2 min, se
descartó el medio y se resuspendieron en 100 ul de LB fresco. Las células recuperadas se
plaquearon en medio LB ágar con 50 pyul de ampicilina y se incubaron al menos 16 hs a
37°C.
Identificación de colonias con el producto de Iigación deseado.
Para identificar las colonias que llevan el producto de ligación deseado, se procedió
a realizar un inóculo con colonias aisladas crecidas a partir de la transformación en 3 ml de
medio LB suplementado con 50 pg/ml de ampicilina. El cultivo se creció durante la noche
a 37°C y luego se procedió a aislar ADN plasmídico de los mismos como se describe a
continuación. Se repartieron los 3 ml de cultivo en 2 tubos eppendorf y las bacterias se
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Tesis Doctoral. Diego M. (ie/man. Materiales y Métodos.
centrifugaron durante 30seg. a máxima velocidad. Ambos precipitados fueron
resuspendidos en 200 pl de solución Pl (Tris-HCI 25 mM, pH-8, EDTA 10 mM, 0,1 mg/ml
de RNAsa A (Sigma). Luego se agregó 200 ul de solución P2 (NaOH 0,2 N, SDS 1%) y se
mezcló suavemente por inversión, seguido de otros 200 pl de solución P3 (acetato de
potasio 3 M, pH-8), que se mezcló fuertemente por inversión. Los tubos se centrifugaron a
máxima velocidad durante 10 min. Se recuperó el sobrenadante y se le hizo una extracción
con l vol. de PIC seguido de una extracción con l vol. de IC. La fase acuosa se precipitó
con 0.8 vol. de 2-propanol con una suave agitación, se dejó reposar 5 min a temperatura
ambiente y se centrifugó a 14000 r.p.m. durante lO min. El precipitado fue lavado con
etanol 70%, secado y resuspendido en 40 ul de TE.
La identificación de las construcciones deseadas se realizó mediante cortes con
enzimas de restricción, como fue detallado más arriba, y por posterior visualización en
geles de agarosa con bromuro de etidio.
Preparación del transgén para la microinyeccio'npronuclear.
El transgén —9THCre a microinyectar se obtuvo a partir de la digestión de una
maxípreparación de ADN plasmídico. Esta preparación se realizó a partir de un cultivo de
500 ml en medio Terri/ic Brolh (bactotriptona 1,2%, extracto de levadura 2,4%, glicerol
0.4%), en presencia de ampicilina 50 pg/ml, crecido por 20 hs a 37°C. Una vez saturado, el
cultivo se enfrió durante 5 min en hielo, fue separado en dos mamaderas de 400 ml y
centrifugado en rotor Sorvall GS-3 a 5000 r.p.m. durante 5 min y 4°C. Luego se descartó el
sobrenadante y las células se resuspendieron en 50 ml de solución Pl. Posteriormente. se
agregaron otros 50 ml de solución P2, se mezclaron suavemente por inversión, seguido de
otros SO ml de solución P3 preenfriado, el cual también se mezcló por inversión, y se
incubó en hielo durante 30 min. Los tubos se centrifugaron durante 20 min a 7000 r.p.m. a
4°C y el sobrenadante fue filtrado a través de un embudo con una malla de lana de vidrio.
Posteriormente, se precipitó el ADN plasmídico con el agregado de 0,7 vol. de isopropanol
con una suave agitación, se dejó 20 min a temperatura ambiente y se centrifugó, en dos
mamaderas de 250 ml. en rotor Sorvall GSA a 10.000 r.p.m. durante 30 min a 4°C. El
precipitado se lavó con etanol 70%, se dejó secar y fue resuspendido con un total de 8 ml
de TE (4 ml por mamadera).
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Tesis Doctoral. Diego M. Gelman. Materiales y Métodos.
Para obtener una preparación limpia del ADN plasmídico, se hicieron dos
extracciones en gradiente de CsCl como se detalla a continuación. Al ADN plasmídico
resuspendido en TE le fueron agregados 50 pl de bromuro de etidio (10 mg/ml), y luego
CsCl sólido en una cantidad en peso equivalente al peso de la solución de ADN en TE. Se
disolvió a 37°C y se ultracentrifugó en tubos Beckman a 55.000 r.p.m. durante 20 hs en
rotor Sorvall T-865.l a 18°C.
Al finalizar la corrida, la posición de la banda de ADN plasmídico se ubicó en el
gradiente de CsCl con la ayuda de una lámpara de UV y se extrajo cuidadosamente con una
jeringa. El material extraído fue mezclado con una solución nueva de TE-CsCl (lg de CsCl
cada l ml de TE) y se volvió a ultracentrifugar como se explicó anteriormente. La banda se
extrajo nuevamente con jeringa, se colocó en tubos Corex y el bromuro de etidio fue
eliminado mediante extracciones sucesivas de butanol saturado en agua. Luego, la solución
de ADN obtenida se colocó en tubos eppendorf y, para eliminar las sales de cesio, se
precipitó, al menos dos veces, con 2,5 vol. de etanol 100%. El precipitado, luego de lavarlo
con etanol 70%. y secarlo, fue resuspendido en 500 ul de TE. Finalmente, el ADN se
cuantificó por espectrofotometría a 260 nm y en un gel de agarosa con bromuro de etidio.
El transgén —9THCrefue liberado de la secuencia plasmídica con las enzimas Notl y
Sall y aislado por electroelución, como se especificó anteriormente. Luego de la
precipitación, se resuspendió en 400 ul de solución de baja sal (Tris-HCl 20 mM, pH-7,4;
NaCl 0,2 M; EDTA l mM). Posteriormente, se pasó por una minicolumna de intercambio
iónico tipo elutíp (Schleicher & Schuell, Keene, NH, USA) y se eluyó, de acuerdo a las
instrucciones del proveedor, con buffer alta sal (Tris-HCl 20 mM, pH-7,4; NaCl l M;
EDTA l mM). Finalmente, el producto eluído se precipitó con 2 vol. de etanol 100%, se
centrifugó 10 min a máxima velocidad, se lavó con etanol 70% y se resuspendió en TE
microinyección (Tris-HCl 5 mM, pH-7,4; EDTA 0,1 mM). Fue cuantificado por
espectrofotometría a 260 nm y por gel, y se llevó a una concentración de 500 moléculas/pl
con el mismo buffer.
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Tesis Docloral. Diego M. Gelman. Materiales y Métodos.
Animales y bioterio.
Las cepas endogámicas de ratones necesarias para la obtención de embriones
(C57BL/6J y CBA/J). la cepa exogámica de ratones Swiss Webster para la obtención de
hembras pseudopreñadas, la línea de ratones transgénicos híbridos THCre y la reportera
Z/AP se encuentran en una sala exclusiva del bioterio del Instituto de Biología y Medicina
Experimental (lBYME-CONICET) descripta anteriormente.
Obtención de embriones.
Para obtener embriones aptos para la microinyección se aparearon hembras
C57BL/6J con machos CBA/J y se obtuvieron híbridos de primera generación (Fl)
BóCBFl. Los machos Fl se mantuvieron en jaulas individuales y se los utilizó como
padrillos para fecundar hembras Fl superovuladas. La superovulación se indujo en hembras
BóCBFl jóvenes (entre 4 y 5 semanas de edad) mediante un tratamiento hormonal que
comenzó tres días antes de la recolección de óvulos fecundados con una inyección de 5 UI
i.p. de PMS (pregnant mare ’s serum) a las 2 PM. Dos días más tarde los animales
recibieron 5 Ul i.p. de hCG (human chorionic ganadolrophin) a la l PM. Inmediatamente
estas hembras fueron colocadas en jaulas individuales con machos BóCBFl. A la mañana
siguiente, las hembras que fueron copuladas por el macho (se verificó mediante la presencia
de un tapón vaginal de semen) se sacrificaron por dislocacíón cervical y mediante una
incisión abdominal se expusieron los tractos reproductivos. Los oviductos se aislaron y
colocaron en una placa de 35 mm con medio Whittens precalentado en un incubador a 37°C
y 5% C02. Mediante el uso de una lupa de disección, un par de fórceps y un par de agujas
de ZSG. se disociaron los oviductos para liberar los ovocitos fertilizados rodeados por una
masa de células del cumulus. Estos se aspiraron con una pipeta Pasteur previamente
estirada sobre una llama y se colocaron en una gota de medio Whittens con 1% de
hialuronidasa (Sigma) por 5 min para separar los embriones de las células del cumulus.
Posteriormente los ovocitos se pasaron a través de 4 o 5 gotas de medio Whittens y fueron
guardados en incubador en grupos de 20 hasta el momento de la microinyección. La
cantidad obtenida de ovocitos fertilizados aptos para ser microinyectados es, por lo general,
de aproximadamente 20 por hembra superovulada.
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FOOOOOO0.0.0.0.0...OOOOOOOOOOOOOOOO...00.0.0001
TesisDoctoral. Diego M Gelman. Materiales y Métodos.
Microinyecciónpronuclear.
Para la microinyección pronuclear se utilizaron micropipetas sujetadoras e
inyectoras preparadas a partir de capilares de borosilicato y estiradas con un estirador
vertical de micropipetas.
Los ovocitos fueron colocados en una gota de medio Whittens equilibrado con Hepes
ubicada en el centro de una depresión semiesférica convexa de un portaobjetos, se
observaron bajo un microscopio y se seleccionaron aquellos que tenían ambos pronúcleos
bien visibles. Con la ayuda de la pipeta sujetadora y un micromanipulador se introdujo la
pipeta microinyectora en los embriones y se descargó 1-2 pl de la solución de ADN
(aproximadamente 500 moléculas del transgén/pl) dentro del pronúcleo más visible (figura
38). Los embriones microinyectados fueron colocados en el íncubador hasta el momento de
la transferencia. Se calcula que entre el 50 y el 70% de los embriones sobrevive a la
microinyección.
Figura 38: Microinyección pronuclear de ovocitos fertilizados. Fotografía de un embrión de ratón conambos pronúcleos bien visibles en el instante previo a la microinyección pronuclear. A la derecha se observala pipeta sujetadora que sostiene el embrión por presión negativa. A la izquierda la pipeta microinyectoracargada con una solución de ADN. Esta fotografia fue tomada en nuestro microscopio del INGEBI duranteuna sesión de microinyección.
Transferencia embrionaria a hembras pseudopreñadas.
Para obtener hembras pseudopreñadas se pusieron en contacto la noche anterior a la
recolección de embriones varias hembras jóvenes (de 6 y 9 semanas) con machos
vasectomizados. A la mañana siguiente se seleccionaron las hembras con tapón vaginal,
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Tesis Doctoral. Diego M. Gelman. Materiales y Métodos.
signo de copulación. Las hembras pseudopreñadas fueron anestesiadas con 2.2,2,
tribromoetanol (Avertina, Sigma) 300 mg/kg, i.p..
Luego de una incisión lateral de aproximadamente 1 cm y con la ayuda de una lupa, se
expuso el oviducto a transferir. Se rompió la membrana que recubre el oviducto. se
identificó la ámpula y se insertó a través de ella una pipeta Pasteur fina cargada con los
embriones. Se descargaron en total unos 10 a 15 embriones por oviducto. Luego de la
transferencia se cerró la incisión con sutura.
Identificación de ratones transgénicos. Análisis dela presencia del transgén.
Extracción de ADN.
Los ratones nacidos de embriones inyectados se apartaron de sus madres adoptivas a
los 18-20 días y fueron separados por sexo. Luego de ser anestesiados con 2,2,2
tribromoetanol (Sigma) 300 mg/kg i.p., se cortó la porción terminal de la cola (0,5-1 cm)
con un bisturí y se la cauterizó. Los ratones fueron marcados en las orejas para su posterior
identificación. Los segmentos de cola se incubaron a 55°C en buffer de digestión (Tris-HC]
50 mM, pH-8; EDTA 100 mM; SDS 0,5%; 0,5 myml proteinasa K, Gibco BRL) durante
12-14 hs. El ADN se extrajo por el método descripto por Low (1992). Brevemente, el
producto de 1adigestión se centrifugó para eliminar los pelos, se hizo una extracción con l
vol. de PIC seguida de 1 vol. de IC, y se precipitó con 0,7 vol. de isopropanol. El ADN fue
resuspendido en TE y se cuantificó espectrnfntnméïu' ‘ La presencia del transgén se
detectó por hibridación del ADN genómico con una sonda radioactiva, que reconoce
selectivamente al ADN foráneo (dot blot hybridization y Southern bIot hybridization) o
utilizando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) con oligonucleótidos específicos
de las secuencias transgénícas.
Southern Blot.
Para realizar los Southern blots, 20 ug de ADN genómico fueron digeridos con 50
UE de 1a enzima de restricción deseada por 12-14 hs. Luego se realizó una digestión
adicional por 2 hs, agregando 20 UE de la misma enzima. Las digestiones se precipitaron
con 2.5 vol. de etanol 100%, se resuspendieron en TE y luego fueron sembradas en geles de
agarosa 0,8% a 3-5 V/cm. Al finalizar la corrida, se le tomó una foto en la que se incluyo
100
Tesis Doctoral. Diego M. Gelman. Materiales y Métodos.
un centímetro alineado en el punto de siembra y posteriormente los geles se depurinizaron
en una solución de HCl 0.25 M. luego se desnaturalizaron por 40 min (NaOH 0,5 N; NaCl
1.5 M), con agitación suave. Posteriormente. fueron sumergidos en una solución
neutralizante (Tris-HCl 0,5 M pH-8; NaCl 1,5 M; EDTA l mM), 2 veces por 30 min y se
transfirieron por capilaridad (Sambrok et aL, 1989) a membranas de nylon no cargadas.
Luego de la transferencia, el ADN se fijó a las membranas con luz UV (120 mJ/cmz) y
posteriormente se hibridó como se especifica más adelante.
Dot blot.
Para realizar los dot blots, se desnaturalizaron lO pg de ADN genómico obtenido de
la cola de cada ratón a 100°C y luego, las muestras se sembraron sobre una membrana de
nylon en forma manual o mediante una cuba de tipo mini fold conectada a una trampa de
vacio. Una vez sembradas todas las muestras, la membrana se pasó en forma sucesiva sobre
papeles Whattman 3MM embebidos en solución desnaturalizante (8 min) y luego en
solución neutralizante (2 x 7 min). El ADN fue fijado con luz UV (120 mJ/cmz) y se
hibridó como se detalla a continuación.
Hibridación de ADN.
Todas las sondas radioactivas para hibridar Southern blots y Dot blots, fueron
preparadas a partir de fragmentos de ADN mayores de 200 pb, aislados de los plásmidos
que los contienen, por digestión con enzimas de restricción seguida de electroelución, tal
cual se especificó anteriormente, o por PCR seguido de electroelución. Las sondas
radioactivas se marcaron por el método de iniciación al azar (random priming), utilizando
el kit comercial Rod-Prime (Gibco BRL) como se detalla a continuación. Se hirvieron 25
ng del fragmento a marcar en lO pl de agua en un tubo eppendorf durante 5 min, y luego se
colocó rápidamente en hielo. El fragmento se incubó en una mezcla de marcación
(preparada con reactivos e instrucciones provistas por el proveedor), que contiene
hexanucleótidos. dNTPs (excepto dCTP) y la enzima Klenow, conjuntamente con 5 ul de
a[32P]dCTP 10 pCi/ul (DuPont-NEN, Boston, MA, USA), durante 30 min a 37°C. La
reacción se detuvo con 5 pl stop buffer (provisto por el proveedor) y se precipitó agregando
lOl
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l pl de ARN de transferencia 10 mg/ml, 50 pl de NH4Ac 5 M y 2,5 vol. de etanol 100%. Se
dejó a —70°Cdurante 30 min y luego se lo centrifugó a máxima velocidad. El sobrenadante
fue descartado y el precipitado se lavó con etanol 70% preenfriado y se lo volvió a
centrifugar a máxima velocidad por 15 min. Nuevamente se descartó el sobrenadante y se
dejó secar el precipitado que luego se resuspendió en agua con 1% de SDS. Finalmente se
guardó en hielo hasta ser utilizada.
Las prehibridaciones e hibridaciones se realizaron en botellas rotatorias dentro de un
horno de temperatura controlada. Las membranas fueron prehibridadas entre 1 y 2 hs en
una solución conteniendo 25 mM buffer fosfato, pH-7,2; SSC 6 X; EDTA 1 mM; Denhardt
5 X (0,1% ficoll, 0,1% polivinilpirrolidona, 0,1% seroalbúmína bovina); SDS 0,5% y 100
mg/ml de ADN de esperma de salmón. Las hibridaciones se llevaron a cabo en la misma
solución de prehibridación durante 16 hs con el agregado de la sonda, previamente hervida
por 5-10 min y enfriada otros 2 min en hielo. Al finalizar la hibridación, la membrana fue
sometida a una serie de lavados. Los mismos se realizaron de la siguiente manera: 2
lavados iniciales de 15 min cada uno con SSC 2 X. SDS 0,1%, a temperatura ambiente, y
dos lavados finales de alta rigurosidad con SSC 0,1 X, SDS 0,1%, a 65°C. Una vez
finalizados los lavados. las membranas se expusieron sobre películas autorradiográficas,
junto con pantallas intensificadoras de señal, a —70°C.El tiempo de exposición de las
películas autorradiográficas varió según la marca radiactiva detectada en los filtros luego de
los lavados.
Reacción en cadena dela polimerasa (PCR).
La detección de animales transgénicos TH-Cre se llevó a cabo mediante la
amplificación de una región interna del transgén de 327 pb (figura 9), utilizando los
primers Cre-2 (5' GCA TAA CCA GTG AAA CAG CAT TGC TG 3') y Cre-6 (5' AAA
ATT TGC CTG CAT TAC CG-3'). Las condiciones de reacción fueron: 200 ng de ADN
genómico, buffer PCR (Tris-HCI 20 mM; KCl 50 mM), dNTPs 0,2 mM; 2,5 mM de cada
primer, MgClz 3,3 mM y 1 UE de Taq polimerasa (Gibco BRL) en un vol. final de 30 pl.
Las muestras fueron amplificadas en un terrnociclador MJ Research (Waltham,
MA.. USA) como se detalla a continuación: un paso de desnaturalización inicial a 94°C por
5min. 20 ciclos que constaron de 1 min de desnaturalización a 94°C, 1 min de aparcamiento
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TaxisDoctoral. Diego M. Gelman. Materiales y Métodos.
a 65°C bajando 0,5"C por ciclo y l mín de elongación a 72°C seguido de 20 ciclos que
constaron de l min de desnaturalización a 94°C, l min de aparcamiento a 55°C y l min de
elongación a 72°C seguidos de una elongación final a 72°C por 10 min. Los productos de
elongación fueron corridos en un gel de agarosa 1,5% con bromuro de etídio (0,1 ug de
bromuro de etidio/ul de agarosa) y se visualizaron a la luz UV.
Localización de Tirosina hidroxilasa y Cre por inmunohistoquímica.
La detección de las proteínas TH y Cre se realizó por inmunohistoquímica,
utilizando antisueros anti-TH o anti-Cre. Los animales utilizados para obtener los tejidos
fueron perfundidos, luego de hacer una punción cardiaca, con solución salina y a
continuación con 4% paraformaldehído en PBS. Las muestras extraídas se guardaron
durante la noche a 4°C con 4% paraformaldehído en PBS, en el caso que fueran destinadas
a cortes en vibrátomo. o con 4% paraformaldehído en PBS y 10% sacarosa, cuando fueran
destinadas a congelamiento y cortes en micrótomo. Las que fueron destinadas a micrótomo
también fueron sometidas a soluciones de concentración creciente de sacarosa para
deshidratarlos llegando a una solución de 30% de concentración final máxima. Las
muestras que fueron destinadas a vibrátomo se incluyeron en agarosa 2%. Luego de estar
equilibrados. los tejidos destinados a ser cortados en micrótomo se guardaron en un taco de
sacarosa 30% a -20°C. Los tejidos en tacos de agarosa o congelados se cortaron en
vibrátomo o micrótomo respectivamente y se colectaron en placas multipocíllo conteniendo
KPBS (NaCl 0,9%, K2HP04 16 mM y KH2P043,6 mM). Luego los cortes se sometieron a
2 lavados de 20 min en KPBS. Posteriormente se incubaron en H202 1% en KPBS por 60
min. se volvieron a lavar en KPBS (2 veces por 20 min) y se preincubaron por 2 hs en
Tritón X-IOO 0.3% y 2% de suero normal de cabra en KPBS. Luego se incubaron durante
toda la noche a 4°C con la dilución apropiada del antisuero anti-TH (Rabbit anti-Tyrosine
Hydroxylase policlonal, Chemicon Intl. Inc., USA, dilzl/SOO) o anti-Cre (Policlonal
Antibody, Cre Recombinase, Babco, USA, dil: 1/3000) en Tritón X-lOO 0,3% y 2% suero
normal de cabra en KPBS con agitación suave. El antisuero se lavó en KPBS (2 x 20min) y
los complejos antígeno-anticuerpo se incubaron con una solución de inmunoglobulinas
biotilinadas anti-conejo hechas en cabras (Biotinylated Anti-Rabbit lgG, BA 1000, Vector
Laboratories. USA) (1/200 en 0,3% Tritón X-100 en KPBS) por 2 hs a temperatura
103
Tesis Doctoral. Diego M. Gelman. Materiales y Métodos.
ambiente. y luego de dos lavados de 20 min en KPBS se incubaron por l h con avidina
peroxidasa (Vectastain ABC Kit, Vector Laboratories. USA) (1/1000 en Tritón X—100
0.3%, 0,1% BSA en KPBS). Finalmente se lavaron 20 min en KPBS y 20 min en TBS
(Tris-HC] 50 mM pH-7.2 a 7.6, NaCl 150 mM) y se incubaron en una solución conteniendo
0.25 mg/ml de diaminobencidina (DAB, Sigma) en TBS conteniendo H202 0,05%. La
reacción fue detenida sumergiendo las secciones de tejido en KPBS y luego de ser
montadas en portaobjetos se dejaron secar al aire. A continuación se deshidrataron en una
serie de alcoholes con concentraciones crecientes (70, 95 y 100 %) y xileno y fueron
cubiertos con cubreobjetos utilizando Permount (Fisher, New Jersey, USA) como adhesivo
y se miraron al microscopio con campo claro.
Para aquellas secciones que fueron sometidas a doble marcación primero les fue
hecha la inmunohistoquímica contra Cre y a continuación, las muestras fueron incubadas en
una solución conteniendo anticuerpo primario policlonal anti TH hecho en conejo (12500) y
suero normal de cabra al 2% en KPBS 0.3% TritonX-lOO con agitación suave a 4°C durante
toda la noche. Al día siguiente se lavaron 2 veces en KPBS a temperatura ambiente para
luego incubar durante 2 hs con el anticuerpo secundario anti IgG de conejo hecho en cabra
(1:200) en KPBS 0,3% TritonX-lOO también a temperatura ambiente y con agitación suave.
Luego se lavaron 2 veces con KPBS durante 20 min y posteriormente se incubaron durante
1 h a temperatura ambiente con avídina-peroxidasa (Vector Lab). Al cabo de la incubación
se lavaron dos veces con TBS por Smin y tres veces con buffer fosfato de sodio 10 mM pH
6.0 por 5 min. Para fijar las secciones se incubaron por S a 10 min en 0,1% glutaraldehído
en buffer fosfato de sodio 10 mM pH-6,0. Para el revelado de la señal, se incubaron las
secciones durante 10 min a temperatura ambiente en una solución conteniendo 10 mg/ 100
ml de cloruro de bencidina (BDHC, Sigma) y 25 mg/ 100 ml de nitroprusiato de sodio en
buffer fosfato de sodio 10 mM pH-6,0, seguido de una solución conteniendo 10 mg/ 100 ml
de cloruro de bencidina (BDHC), 25 mg/ 100 ml de nitroprusiato de sodio y 0,005% de
“202 en buffer fosfato de sodio 10 mM pH-6,0. La aparición de color azul se observó entre
los 10 a 15 min posteriores. Las secciones fueron lavadas en KPBS y montadas en
portaobjetos. Se las dejó secar y luego se deshidrataron como se describió anteriormente
para finalmente ser cubiertas con cubreobjetos y observadas al microscopio.
104
Tesis Doctoral. Diego M. Gelman. Materiales y Métodos.
Inmunofluorescencia contra THy Cre.
La preparación de los tejidos para ser sometidos a inmunofluorescencia se realizó de
la misma manera que se describió en la sección anterior.
Las secciones de tejido fueron sometidas a 2 lavados de 20 min en KPBS.
Posteriormente se incuban en H202 1% en KPBS por 60 min, se volvieron a lavar en
KPBS (2 veces por 20 min) y se preincubaron por 2 hs en 0,3% de Tritón X-100 y 2% de
suero normal de cabra en KPBS. Luego se incubaron durante toda la noche a 4°C con la
dilución apropiada del antísuero anti-TH (monoclonal) o anti-Cre (Policlonal Antibody,
Cre Recombinase. Babco) (1/500 o 1/3000 respectivamente) en 0,3 % de Tritón X-lOO y 2
% de suero normal de cabra en KPBS con agitación suave. El antísuero se lavó en KPBS (2
x 20 min) y los complejos antígeno-anticuerpo se incubaron por 2 hs. a temperatura
ambiente con agitación suave, con una solución de ínmunoglobulinas acopladas a
fluorógenos, Rhodamina (Anti-Rabbit lgG-Rhodamine from Goat, dil:1/200. Vector Lab.)
o Fluoresceina (Anti Mouse IgG-Fluorescein, dil:1/200, Vector Lab.). Dichos compuestos,
bajo luz ultravioleta, producen una coloración roja y verde respectivamente. Transcurrida la
incubación se lavó dos veces en KPBS por 20 min y luego se montaron en portaobjetos con
PBS. se dejó secar parcialmente, se cubrió con Fluorosave (FluorosaveTM Reagent,
Calbiochem. USA) y se miró en microscopio bajo luz ultravioleta.
Obtención de animales doble transgénicos.
Los animales de la línea transgénica THCre fueron apareados con los de la línea
reportera Z/AP para obtener animales doble transgénicos.
Detección del gen LacZ en animales transgénicos reporteros Z/APy doble transgénicos.
Para la detección del gen LacZ de animales reporteros Z/AP y doble transgénicos se
colectaron en una placa multipocillo biopsias de orejas de ratón y se las fijó en una
solución de glutaraldehído 0,25% en PBS durante 30 min. A continuación se lavaron 3
veces con PBS durante 5 min cada una para lavar el fijador. Por ultimo se tiñó con 0,5
mg/ml de 5-bromo-4-cloro-3-indolil-B-D-galactósido (X-gal) previamente disuelto en
diemtilsulfóxido (DMSO, Sigma), ferrocianuro de potasio 5 mM, ferricianuro de potasio 5
mM en una solución de lavado de LacZ que contiene MgClz 2 mM, deoxicolato de sodio
l05
Tesis Doctoral. Diego M. Gelman. Materiales y Métodos.
0.01%. Nonidet P-40 0.02%, en fosfato de sodio 100 mM pH-7,3 o PBS. Una coloración
azul fue usualmente evidente a los 5 min de iniciada la tinción.
Determinación dela actividad de Cre evidenciadapor actividad de Iafosfatasa alcalina.
La actividad de la recombinasa Cre fue evidenciada por medio de una coloración
violácea producto de la actividad de la fosfatasa alcalina placentaria humana (hPLAP).
Para la tinción de fosfatasa alcalina se fijaron los tejidos en 0,25% de
glutaraldehido, 0,02% de Nonidet P-40, 0,01% de deoxicolato de sodio por 10 min a 4°C.
Las secciones se lavaron 3 veces en PBS y luego se inactivaron las fosfatasas endógenas
incubando en PBS a 75°C durante 30 min. Luego se dejaron enfriar a temperatura ambiente
por 1 o 2 min y se lavaron en PBS. A continuación ellas fueron incubadas en buffer AP
(Tris-HCl 100 mM pH-9,5; NaCl 100 mM, MgClz 10 mM) por 10 min. Los tejidos se
pusieron en una solución de coloración (Tris-HCl 100 mM pH-9,5, NaCl 100 mM,
MgC1210mM, deoxicolato de sodio 0,01%, Nonidet P-40 0,02%, 337 ug/ml de Nitro Blue
Tetrazolium (NBT, Sigma), 175 ug/ml de BClP (Sigma)) por 30 a 60min en oscuridad a
temperatura ambiente. Finalmente se lavaron en una solución MgCl; 2 mM en PBS. se
montaron en portaobjetos, se dejaron secar por 24 hs, se deshidrataron en una serie
creciente de alcoholes (70, 95 y 100%) y xileno cubriéndose con cubreobjeto utilizando
Per-mount(Fisher) como adhesivo.
Determinación de TH, Cre y hPLAP en embriones de 13.5 d.p.c.
Para determinar la expresión del transgén y su actividad durante el desarrollo
embrionario. se determinó el patron de expresión de TH y Cre en embriones de 13.5 dias
post coito.
Para ello se puso en apareo un macho y una hembra y los días subsiguientes se
chequeó durante horas de la mañana la presencia de un tapón de semen indicativo de la
actividad copulatoria nocturna que, cuando se observó, fue considerado día 0.5. A los 13
días después de la detección del tapón seminal, se mató a la hembra por dislocación
cervical. se humedeció el abdomen con etanol 70% y se expusieron las trompas uterinas por
medio de una disección abdominal. Se extrajeron los embriones y se los dejo en una
solución de fijación (4% PFA en PBS, pH-7,2) durante toda la noche. Posteriormente se los
106
Tesis Doc/oral. Diego M. (¡e/man. Materia/es y Métodos.
equilibró en soluciones de concentración creciente de sacarosa lO. 20 y 30%. Finalmente se
los embebió en sacarosa 30% para formar un taco congelándolo a —20°Cy se los cortó de
forma sagital y parasagital en micrótomo de congelación en secciones de 30 pm de espesor.
La presencia de TH y Cre se realizó por inmunohistoquímica según se describió
anteriormente así como también la actividad de la fosfatasa alcalina.
Taxis Doctoral. Diego M. Gelman. Materiales y Métodos.
Parte 3. Ratón D2flox
Clonado de un fragmento genómico que contiene al exón 2 del receptor de dopamina DZ
de rato'n.
Amplificación de una sonda homóloga para el exón 2 del receptor DZ.
Para la amplificación de una sonda capaz de reconocer secuencias genómicas del
receptor D2 se diseñaron dos adaptadores especificos (primers) correspondientes al exón 2
obtenido a partir de una búsqueda de secuencias del ARN mensajero (Mus musculus
mRNA. receptor dopaminérgico D2A, Número de acceso: X55674 NID g50648, Borrelli
E.) Esta reacción permitió obtener un fragmento de aproximadamente 300 pb. Para obtener
dicho fragmento se llevo a cabo una reacción de PCR utilizando los adaptadores D2ed-2.l (
5’-TCC ACT GAA CCT GTC CTG- 3’) y D2ed-2.2 ( 5’-CTC CAG ATA GAC GAC
CCA- 3’) en una concentración final de 1.25 uM cada uno, con 200 ng de ADN genómico
de ratón salvaje como molde, MgCl; 2 mM, dNTP’s 200 uM y 0,25 U Taq en un
termociclador de capilares Idaho 1605 (Idaho Technologies, Idaho, USA). La reacción
constó de 30 ciclos de amplificación con períodos de desnaturalización a 94°C durante lO
segundos, de apareo de los adaptadores a 64°C durante IO segundos y por último de
amplificación a 72°C durante 30 segundos. Los ciclos fueron precedidos por una etapa de
desnaturalización a 94°C durante 4 min. Se realizó una etapa de amplificación final a 72°C
por 4 min al finalizar los ciclos. El fragmento amplificado fue corrido en gel de agarosa
1.6% en TBE 0.5 X y eluido utilizando membrana de diálisis para su purificación según se
detalló en la sección Técnicas de biología molecular en la parte 2.
Rastreo de una biblioteca genómica de ratón.
El rastreo de los clones del gen del receptor D2 para la construcción de un vector de
recombinación en células embrionarias se realizó a partir de una biblioteca genómica de
ratón de la cepa l29/Sva construida en un derivado del fago A (Fago X-Dash, Stratagene)
que tenia un título de 3,5 x IO5 fagos/ul. La amplificación de los fagos fue realizada
utilizando la cepa bacteriana LE 392 donde la presencia de receptores para el fago A fue
inducida mediante el agregado de maltosa en el medio de crecimiento bacteriano. Las
bacterias susceptibles a la infección fueron crecidas en medio FRM (NaCl 85 mM, MgSO4
108
Tesis Doctoral. Diego M. Gelman. Materiales y Métodos.
l mM. lO mg/ml de Peptona, 5 mg/ml de extracto de levadura, 2 mg/ml de maltosa) hasta
una OD600=O,5,centrifugadas a 2000 r.p.m. por 10 min, resuspendidas en MgSO4 lO mM y
mantenidas a 4°C hasta el momento de la incubación con los fagos. Las placas de 15 cm
donde se sembró la biblioteca de fagos fueron preparadas con LB + 1,5% ágar (LBA) y el
número de placas necesarias para tener representado 4 veces el gen buscado fue estimado
según: (n° bases del genoma de ratón /n° bases promedio del inserto)x n° genomas, esto es:
(3 x 109 bases / 1.8 x 104 bases)x 4= 12 x 105/ 1.8. Fueron sembrados 6x105 clones en 10
placas de 15 cm. Se incubaron 5x104 ufp con 600 pl de bacterias resuspendidas en MgSO4
10 mM (por cada placa de 15 cm a sembrar) durante 30 min a 37°C de forma de obtener
60.000 placas de lísis en cada una. El incubado de las células y fagos fue agregado a 10 ml
de top ágar (FRM + 0.7% agarosa) fundido a 55°C, homogeneizado por inversión e
inmediatamente distribuido de forma homogénea sobre cada placa de LBA manteniendo las
condiciones de esterilidad. Las placas permanecieron a temperatura ambiente durante 1 h
hasta que solidificó el top ágar y luego fueron incubadas a 37°C por 7 hs controlando el
crecimiento para evitar la confluencia de las placas.
Una vez crecidas a la densidad deseada, las placas fueron mantenidas por 2 hs a 4°C
antes de ser transferidas a los filtros. La transferencia se realizó durante 1 y 5 min, en los
filtros originales y duplicados respectivamente, utilizando membranas de nylon (Magna
NT. MSI. Micron Separation Inc.. USA). Durante la transferencia los filtros fueron
orientados respecto de las placas para permitir su posterior identificación mediante
perforaciones hechas con una aguja. Los filtros fueron inmediatamente desnaturalizados
por 7 min sobre un papel Wathmann 3 MM embebido en una solución desnaturalizante
(NaOH 0.5 M; NaCl 1,5 M) y luego neutralizados 2 veces durante 3 min en solución
neutralizante (Tris-HCl 0,5 M pH-7,5; NaCl 1,5 M, EDTA l mM). Después de la
neutralización las membranas fueron fijadas con UV por 30 seg a 120 mJ/cm2 (UV
Stratalinker 1800. Stratagene). Para identificar los clones del receptor D2 se utilizó la sonda
de 300 pb aproximadamente, descripta en la sección anterior, purificada luego de la
reacción de amplificación por polimerización en cadena correspondiente al exón 2. La
marcación con fósforo radioactivo del fragmento de ADN fue realizado mediante un ensayo
de iniciación al azar (Random priming, Gibco BRL). Los filtros fueron puestos
individualmente en el recipiente donde se realizó la hibridación con 100 ml de solución
109
Tesis Doctoral. Diego M. Gelman. Materiales y Mélodos.
(Denhardt’s 5 X, ADN esperma de salmón 100 ug/ml, SSC 6 X, EDTA l mM, SDS 10%,
Na2P04 25 mM pH-7,2, forrnamida 50%) y 105-106 cpm de sonda por ml de solución de
hibridación. La hibridación se realizó durante 18-20 hs en un baño a 42°C. Los lavados
correspondieron a 2 cambios de solución (SSC 2 X, SDS 0,1%) a temperatura ambiente
durante 20 min y 2 lavados con cambio de solución (SSC 0,1 X, SDS 0.1%) durante 25 min
a 65°C. Las membranas fueron expuestas con una pantalla amplificadora por 48 hs a -70°C
y reveladas para evaluar la presencia de clones positivos que fueron reconocidos por el
aspecto de “cometa” en el film. Los clones identificados como positivos se tomaron de la
placa con un tip azul con el extremo cortado dejando un diámetro de 0,3 cm (taco de agar).
Los tacos de ágar se ubicaron en tubos de 1,5 ml con 200 ul de SM (MgSO4 10 mM, NaCl
100 mM, Tris-HCl pH-7,5 100 mM, gelatina 0,5%) y 10% de cloroformo por 12 hs a 4°C
para permitir la elución de los fagos al medio. Los tacos se titularon y replaquearon a una
densidad de 300 ufp por placa de 8 cm para el rastreo secundario. El plaqueo, la
transferencia y la hibridación se realizaron siguiendo los mismos pasos anteriores y
utilizando la misma solución de hibridación. Los clones positivos obtenidos fueron también
incluidos en SM-10% cloroformo para el rastreo terciario y aislamiento definitivo del clon.
Los tacos cuyo rastreo terciario mostraron la totalidad de las placas positivas fueron
considerados como clones aislados. Estos clones fueron sometidos a una maxipreparación
cuantitativa para determinar el mapeo, la caracterización y el posterior subclonado en
plásmido. Finalmente al clon conteniendo la secuencia del gen del receptor de dopamina
D2 fue llamado p6AD2.
Construcción del vector de recombinación homólogo del receptor de dopamina D2.
Para la construcción del vector de recombinación homologa se partió del plásmido
p6AD2 obtenido por el rastreo de la biblioteca de fagos, descripto anteriormente, que
contiene las secuencias que flanquean al exón 2 del receptor de dopamina D2.
El procedimiento seguido fue:
l- Un fragmento de 1,2 kb se liberó del plásmido p6AD2 por doble digestión parcial con
Xbal y EcoRl subclonandolo en un plásmido pBS (Stratagene) digerido con las mismas
enzimas. Dicho plásmido fue llamado pBSD2-l .2.
I|0
Tesis Doctoral. Diego M. Gelman. Materiales y Métodos.
2- Se digirió el plásmido pflox (Priatel el aL, 1997) con la enzima de restricción BamHl y
luego se rellenaron los extremos salientes con Klenow. Por otro lado se libero el fragmento
de 1.2 kb del pBSD2-l.2 con las enzimas Xbal y EcoRV. se rellenaron los extremos
salientes con Klenow y se ligaron obteniéndose el plásmido pCONl.
3- Un fragmento de 2,6 kb se liberó del plásmido p6AD2 por doble digestión con EcoRI y
BamHl subclonandolo en un plásmido pBS abierto con las mismas enzimas. Dicho
plásmido fue llamado pBSD2-2.6.
4- El plásmido pCONl fue digerido con la enzima de restricción Xbal y luego se rellenaron
los extremos salientes con Klenow. Fue ligado con un fragmento de 2,2 kb proveniente del
plásmido pBSD2-2.6 digerido con las enzimas de restricción EcoRI y BamHl cuyos
extremos fueron tratados también con Klenow para rellenar los extremos salientes. Dicho
plásmido fue llamado pCON2.
5- Un fragmento de 5,5 kb se liberó del plásmido p6AD2 por digestión con la enzima de
restricción Xbal y se subclonó en un plásmido pBS abierto con la misma enzima. Dicho
plásmido fue llamado pBSD2-5.5+/-.
6- El plásmido pCON2 fue digerido con la enzima de restricción Xhol y se rellenaron los
extremos con Klenow. Fue ligado con el fragmento de 5,5 kb proveniente del plásmido
pBSD2-5.5+/- luego de haber sido digerido con Xbal al que se le rellenaron los extremos
salientes. Esta construcción final es la utilizada como vector de recombinación y fue
llamada pCON3.
Preparación defibroblastos embrionarios marinos resistentes aG4I8.
Los fibroblastos fueron preparados a partir de embriones de ratón de 12,5 a 13,5
días post coito provenientes de animales que portaban el gen de resistencia a neomicina
(Neor) bajo el promotor constitutivo de la enzima fosfogliceroquinasa.
Para ello se puso en apareo un macho y una hembra y los días subsiguientes se
chequeó durante horas de la mañana la presencia de un tapón de semen indicativo de la
actividad copulatoria nocturna que, cuando se observó, fue considerado día 0,5. A los l3
días después de la detección del tapón seminal, se mató a la hembra por dislocación
cervical. se humedeció el abdomen con etanol 70% y se expusieron las trompas uterinas por
medio de una disección abdominal. Ellas fueron puestas en un tubo de 50 ml de capacidad
Tesis Doctoral. Diego M. Gelman. Materiales y Métodos.
conteniendo PBS con Penicilina y Streptomicina (Penicilina 50 U/ml; Estreptomicina 0,05
mg/ml, abreviado Pen/Strep). Se invirtió el tubo de manera de lavar las trompas. Luego la
disección continuó en un flujo laminar para garantizar la esterilidad de las células a
preparar. Las trompas uterinas fueron pasadas a una placa de cultivo conteniendo PBS
Pen/Strep. Utilizando tijeras de punta fina se abrieron las paredes del útero y cada embrión
fue liberado en su placenta. Los embriones con su placenta fueron nuevamente lavados en
PBS-Pen/Strep en un tubo de 50 ml de capacidad. A continuación se liberó cada embrión de
su placenta utilizando tijeras de punta fina y se volvieron a lavar. Se eliminaron los tejidos
blandos de cada embrión (hígado, pulmón, vísceras, etc.) y las carcasas remanentes se
cortaron con tijeras en pequeños pedazos en una solución de Tripsina-EDTA. Se dejó
actuar a la enzima durante 5 min y luego se agregó DNAsa I (Deoxyribonuclease I ,
Invitrogen) al medio y, con el auxilio de una jeringa con una aguja ZlG se aspiraron y
eyectaron los agregados celulares de manera de obtener células independientes. Una vez
que los agregados celulares fueron desarmados se inactivó la Tripsina por el agregado de
medio de cultivo (DMEM (Gibco BRL) +2,2 g/l NaHCO; pH-7,2, 10% suero de temero
neonato, Penicilina 50 U/ml; Estreptomicina 0,05 mg/ml) y se plaquearon en placas de 15
cm gelatinizadas (pretratadas con una solución de gelatina 0,1% estéril) y se dejaron crecer
a confluencia. Una vez crecidas a confluencia se hizo un repique y pasaje en una relación
1:4 a 4 nuevas placas. Esto se repitió hasta llegar al cuarto pasaje (p4). Por ultimo los
fibroblastos fueron inactivados por uno de los dos siguientes métodos:
a- Utilizando Mitomicina C (Sigma) l ug/ml como suplemento del medio de cultivo por
un lapso de 3 hs y luego lavando 3 veces con PBS pH-7,2, Pen/Strep para eliminar
cualquier traza del compuesto o.
b- Por medio de irradiación gama durante 40 min con rotación de las placas.
Una vez inactivados. los fibroblastos fueron cosechados y resuspendidos en medio
de congelación (DMEM (Gibco BRL), 2,2 g/l NaHC03, pH-7,2, 20% suero de ternero
neonato. Penicilina 50 U/ml; Estreptomicina 0,05 mg/ml, DMSO 10% (Dimethyl
Sulphoxide, D-2650, Sigma), cuantificados, fraccionados en criotubos y guardados a —70°C
hasta su utilización.
II2
Tesis Doctoral. Diego M. Gelman. Materiales y Métodos.
Detección de Micoplasma en cultivo defibroblastos embrionarios marinos (MEFs).
La contaminación de cultivos con micoplasmas es de ocurrencia común. Los
micoplasmas pueden ser introducidos en cultivos de células por diferentes vias como por
ejemplo otros cultivos de células, personal de laboratorio, reactivos o tejido usado para
cultivos primarios. Su reducido tamaño les permite pasar por filtros de esterilización de 22
um y son resistentes a los antibióticos comunes. A diferencia de la contaminación con
bacterias u hongos, la contaminación con micoplasma es dificil de detectar y no produce
turbidez del medio. Sin embargo su presencia puede causar efectos adversos en los cultivos
llevando a resultados no reproducibles o dudosos. Por ello es de vital importancia la
determinación de la presencia de micoplasma en el cultivo de MEFs preparado para evitar
su uso. Dicha determinación se realizó por medio de una PCR anidada.
La muestra de células del cultivo primario de MEFS fue crecida durante por lo
menos dos pasajes en medio libre de antibióticos y luego se aspiró todo el medio excepto
lO ml. Con la ayuda de una varilla plástica estéril se removieron las células del fondo de la
placa y se resuspendieron en el medio de cultivo remanente sin el agregado de Tripsina o
EDTA. Se pasó l ml de la suspensión de células a un tubo de 1,5 ml de capacidad y se
centrifugó a máxima velocidad por 20 min a 4°C. Se descartó el sobrenadante y se
resuspendió en bufler de lisis (Tris-Acetato, pH-7,6 40 mM, EDTA l mM, lgepal 0,5%) y
se calentó por 10 min a 95°C. Esta solución final se utilizó como molde en las etapas de
PCR.
Para la reacción de PCR se utilizaron 5 pl de DNA muestra ó DNA control
proveniente de otras cepas de micoplasma, 45 pl de buffer PCR (Tris-HCl, pH-8,4 22 mM,
KCl 55 mM, MgClz 2,2 mM, 0,22 mM de la mezcla de dNTPs) 1 pl de adaptadores de
primera ronda (ATCC Mycoplasma Detection Kit) y 0,2 ul (l U) de polimerasa Taq. El
protocolo de PCR utilizado fue como se indica a continuación: 2 min a 94°C, luego 30
ciclos que constan cada uno de 30 seg. de desnaturalización a 94°C, 30 seg. de apareo de
los adaptadores a 55°C y 60 seg. de extensión a 72°C y por ultimo se mantuvo a 40C. El
producto de PCR de esta primera amplificación se utilizó como molde para una segunda
ronda utilizando los adaptadores de segunda ronda (ATCC Mycoplasma Detection Kit) y
siguiendo los mismos pasos descriptos mas arriba. Por ultimo, el producto de PCR de la
segunda ronda de amplificación se sometió a un corte con la enzima de restricción Vspl,
ll3
Tesis Doctoral. Diego M. Gelman. Materia/es y Métodos.
para identificar la variante de Mycoplasma de acuerdo a un patrón de restricción
determinado, y se corrió en un gel de agarosa 2,5% con bromuro de etidio.
Preparación de LIE
El LIF (Ieukemía inhibitory factor) es un suplemento del medio de cultivo de las
células ES que tiene el fin de inhibir la diferenciación de dichas línea celular. Para la
preparación del LIF se partió del plásmido pGEX-ZT-MLIF cedido gentilmente por el Dr.
John Heath el cual consta de una proteína fusión entre Glutatión S-transferasa y el LIF bajo
un promotor inducible por un isopropil tiogalactosido. Con e'l, se transformaron y luego
plaquearon bacterias competentes de la cepa JM109 y una colonia aislada se la creció en
lml de LB ampicilina durante toda la noche. A continuación se diluyó ese cultivo en un
Erlen Mayer con 50 ml de LB ampicilina y nuevamente se lo dejó crecer durante la noche.
Al día siguiente se pasó ese cultivo a un Erlen Mayer con 500 ml de LB ampicilina y se lo
dejó crecer hasta una densidad óptica (OD) de 0,6 a l. Cuando se alcanzó la OD adecuada
se le agregó al medio IPTG para inducir la producción de la proteína fusión y se lo dejó
por un lapso de 3 hs. Se centrifugó 5 min a 5.000 r.p.m. y 4°C, se descartó el sobrenadante
y se resuspendió el precipitado en 5 ml MTPBS (NaCl 150 mM, NazHPO4 16 mM,
NaH2P04 4 mM) Se sonicó cuatro veces por un lapso de 15 segundos cada vez en frío para
romper las células y luego se agregó Tritón X-lOO a una concentración final de 1% y se
agitó vigorosamente. Se dejó en hielo 5 mín y se lo traspasó a un tubo Corex para
centrifugarlo a 10.000 r.p.m. por 5 min a 40€. El precipitado se descartó y el sobrenadante
se pasó a tubos de polipropileno y se congelaron en N2 liquido. En este paso ese
sobrenadante pudo ser almacenado si era necesario. Paralelamente debió equilibrarse la
resina de Glutatíon-Sefarosa (Glutathione Sepharose, Pharmacia) tomando
aproximadamente 5 ml de la misma por cada 500 ml de cultivo original y centrifugando por
2 min a 2.500 r.p.m. A continuación se lavó la resina 3 veces con 5 volúmenes de MTPBS,
se la resuspendió como una solución 50% (v/v) y se la guardó a 4°C hasta su uso.
Para la purificación se agregó 5 ml de solución de resina por cada 10 ml de
sobrenadante conteniendo la proteína fusión y se la dejó agitando 2 hs a 40C. A
continuación se depositó cuidadosamente la mezcla de resina en un tubo conteniendo una
solución 20% de sacarosa y se centrifugó por 5 min a 2.500 r.p.m. a temperatura ambiente.
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Tesis Doctoral. Diego M. Gelman. Maleriales y Métodos.
También cuidadosamente se tomó el sobrenadante el que fue descartado. El precipitado se
lavó una vez con lO ml de solución de lavado l (1% de Tritón X-lOO en MTPBS), una vez
con 10 ml de solución de lavado 2 (Tris-HCl pH-8,5 50 mM, NaCl 150 mM) se lo eluyó
con lO ml de solución de elución (Tris-HCl pH-8,5 50 mM, NaCl 150 mM, CaClz 2,5 mM)
y se lo resuspendió en 750 ul de solución de elución. Luego, se agregó Trombina
(Thrombin, Sigma) a la resina en una relación final enzima : proteína fusión de 1:200 y se
lo incubó agitando o bien 6 hs a temperatura ambiente o durante toda la noche a 40C. La
digestión se centrifugó a 6.500 r.p.m. a 4°C y fue lavada 5 veces con 2 ml de solución de
elución guardando el sobrenadante y todos los lavados. Se hizo una centrifugación final
para eliminar la resina residual. La resina puede ser regenerada en este momento. La
proteína se concentró utilizando tubos concentradores Centricon Plus 10 (Amicon INC.
Beverly, Ma., USA). Finalmente se corrió una fracción de la proteína en un gel de
poliacrilamida de 15% para chequear tamaño y pureza, se filtró en esterilidad utilizando
filtros de 0.2 um, se prepararon fracciones y se congelaron a —20°Chasta el momento de su
utilización en los medios de cultivo previa titulación de su actividad.
Titulación de LIF.
Para comenzar la titulación. se descongeló la línea celular que fue utilizada como
prueba sobre una monocapa de fibroblastos (Feeder). Los siguientes dos pasajes fueron
plaqueadas en placas que habían sido previamente gelatinizadas utilizando una solución
0.1% de gelatina (Sigma) por un lapso de 2 hs, pero no sobre fibroblastos. Las células
fueron pasadas generalmente cada día de por medio o hasta alcanzar una confluencia del
80%. Por lo tanto. cuando se llegó a esa densidad, las células se tripsinizaron, centrifugaron
y finalmente se resuspendieron en medio de cultivo (ver más adelante) sin LIF, se las lavó
una vez y se volvió a resuspender en medio de cultivo sin LIF. Se las contó y resuspendió a
una densidad de 4000 células/ml de medio de cultivo sin LIF. Se agregó 0,5 ml de esa
suspensión en 24 pocillos de una placa multipocillo estéril previamente gelatinizada. Se
prepararon tantos pocillos de manera de tener duplicados o incluso triplicados de cada una
de las diluciones del LIF para poder obtener resultados reproducibles. Se prepararon
también una serie de pocillos en los cuales se utilizó el LIF control con un mínimo de 4
diluciones. Por último, las diluciones del medio con el LIF preparado estaban en el doble de
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Tesis Doctoral. Diego M. Gelman. Materiales y Métodos.
la concentración dado que al agregar 0,5 ml del medio condicionado a cada pocillo se llegó
a una concentración final de l X de la proteína recombinante. En este punto, se dejó crecer
las ce'lulas por 5 días, cambiando el medio cada día respetando las diluciones empleadas.
Para la tinción. las células fueron lavadas con PBS y luego se agregó una solución de azul
de metíleno 0.1%, se la dejó por 15 min, y finalmente fueron lavadas dos veces con PBS
dejándose secar antes de la observación y del conteo. Las colonias fueron contadas
basándose en la morfología y la densidad, usualmente reflejada en la intensidad de la
tinción.
Cultivo de células totipotenciales embrionarias marinas.
Las células totipotenciales embrionarias murinas (Embryonic Stem cells, celulas
ES) son células derivadas de la masa celular interna de los blastocistos de ratón. Utilizando
condiciones de cultivo adecuadas esas células pueden mantener su potencial de desarrollo
embrionario incluso aun después de una elevada cantidad de pasajes.
Las células ES se cultivan sobre una monocapa de fibroblastos embrionarios
murinos (MEFs), libres de micoplasmas e inactivados mitoticamente, en placas
previamente tratadas con una solución de gelatina 1% para facilitar la adhesión.
Un día antes de plaquear las células ES, se debe plaquear un número suficiente de
MEFs de modo que una vez adheridos estén en confluencia y a su vez otorgarles tiempo
suficiente para que adquieran su morfología característica y de esta manera darle un
sustrato adecuado a las células ES. Sobre los MEFs inactivados se plaquearon las células
ES en un numero adecuado de modo tal que no estuvieran “muy diluidas”, pues crecen mas
lentamente. ni “muy concentradas”, pues crecen mas rápidamente y se facilita la
diferenciación por contacto. Estas células son sensibles a los cambios de pH, falta de
nutrientes. concentración elevada de metabolitos, temperatura y concentración de C02 y
cualquiera de esos factores puede provocar la diferenciación. Por ello el medio de cultivo
de las células ES debe cambiarse diariamente y las placas mantenerse en estufa de cultivo a
37°C y 5% de C02. Para el cambio del medio de cultivo se utilizaron pipetas Pasteur
acopladas a una bomba de vacío de modo de aspirarlo y vaciar la placa. Luego se lavaron
dos veces con una solución de PBS pH-7.2 suplementado con antibióticos Pen/Strep
(Penicilina 50 U/ml; Estreptomicina 0,05 mg/ml) descartándolo cada vez. Finalmente se
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agregó el medio de cultivo fresco. el cual esta formulado de la siguiente manera: DMEM
(Gibco BRL), 2,2g/l NaHCO3 pH-7.2; 15% Suero Fetal Bovino (HyClone Lab.); 50 U/ml
Penicilina; 0,05 mg/ml Estreptomicina; 10'6 M B-Mercaptoetanol (Sigma); Piruvato Sódico
(Gibco BRL) l mM; L-Glutamina (Gibco BRL) 2 mM; Aminoácidos no esenciales (Gibco
BRL) 0,1 mM; LIF (Gibco BRL o propio) 5000 U/ml.
Cuando las células ES crecieron formando colonias aisladas de un tamaño adecuado
debieron ser sometidas a un pasaje para seguir su amplificación. La dilución normal de este
tipo de ce'lulas ES de 1:4 o 1:5. Se debe registrar cada pasaje de las células ES pues este es
un índice de viabilidad de las mismas. Cuanto más alto sea el número de pasajes que hayan
sufrido. menor será la incidencia de ellas para contribuir en la línea germinal. Para el
pasaje, los cultivos fueron lavados dos veces con PBS pH-7.2 suplementado con Pen/Strep
y luego tratados con Tripsina-EDTA (0,25% de Tripsina; EDTA04Na en HBSS l mM,
Gibco BRL) durante 5 a 10 min en estufa a 37°C , 5% C02. Luego, la tripsina se inactivó
con medio fresco para Células ES, se pipeteó para disgregar los cúmulos celulares y se
plaqueó en 4 o 5 placas con fibroblastos inactivados crecidos a confluencia.
Electroporacio'n de células ES.
Porciones de ADN pueden ser introducidos en células ES por medio de la aplicación
de pulsos eléctricos de alto voltaje a una suspensión de células y ADN. Luego de la
aplicación de ese pulso, el ADN pasa a través de poros que transitoriamente se forman en la
membrana de las células. Ese procedimiento resulta, sin embargo, en una alta mortalidad
celular de alrededor del 50%. Los parámetros que influencian la eficiencia y la viabilidad
celular son el voltaje, la concentración de iones, la concentración de ADN y la
concentración de células.
Una placa de lO cm con células ES crecidas a un 80% de confluencia sobre MEFs
se lavó dos veces con PBS pH-7.2 suplementado con Pen/Strep y se tripsinizó en estufa por
lO min. Luego se inactivó la Tripsina con medio fresco y se colectaron las células
resuspendidas en un tubo cónico de 15 ml de capacidad. Se desagregaron los cúmulos
celulares pipeteando repetidas veces y se centrifugó por 5 min a 1.000 r.p.m. a temperatura
ambiente. El medio se descartó y el precipitado conteniendo las células ES se resuspendió
en OPTl-MEM (Opti-MEM reduced Serum Media, Gibco BRL) pipeteando suavemente
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Tesis Docloral. Diego M. Gelman. Materia/es y Métodos.
repetidas veces. Este paso se repitió una vez mas para garantizar tener todas las células
uniformemente en el medio OPTI-MEM. Se hizo un conteo de las células en cámara de
Neubawer, para resuspenderlas luego de una ultima centrifugación, a una densidad de 2 x
107células/0.8 ml. Se resuspendieron suavemente las ce'lulas y se transfirieron 0,8 ml a una
cubeta de electroporación que contiene 25 ug de vector de recombinación linearizado en 20
ul de agua estéril. A continuación se seleccionó en el electroporador (Cell Porator, Gibco
BRL) para 330 uF y en posición de carga y baja resistencia se llevó el capacitor a 290-320
V de carga. Se cambió a la posición de descarga y con la cubeta en la cámara se disparó
cuando el voltaje estuvo en las cercanías de los 280 V. El voltaje debe bajar
inmediatamente a menos de lO V. Se desconectó el equipo y se dejó reposar la cubeta por
lO min a temperatura ambiente. A continuación se agregaron 0,8 ml de medio de ce'lulas ES
fresco y el total de la suspensión de células se transfirió a un tubo cónico de 15 ml. de
capacidad conteniendo 2,4 ml de medio, haciendo un total de 4 ml. Por ultimo se
plaquearon 1 ml en cada una de cuatro placas conteniendo MEFs inactivados y se dejaron
en estufa a 37°C y 5% de C02. Con l ul de la suspensión se hizo un conteo de células para
calcular la supervivencia.
Selección, repique, amplificación y almacenamiento de clones resistentes.
Las placas con células transfectadas fueron mantenidas, durante la primera etapa, en
medio de cultivo de células ES bajo selección suplementadas con Geneticina (G418 sulfate,
Geneticin. Gibco BRL) 180 ug de droga activa por ml de medio de cultivo. Las células
resistentes formaran colonias clonales que luego de 8 días de selección fueron repicadas
utilizando tips estériles y con la ayuda de un microscopio invertido en flujo laminar de
seguridad. Cada una de las colonias resistentes fue depositada en una placa de 96
multipocillos con fondo en U conteniendo 30 pl de Tripsina-EDTA y, luego de haber
completado la placa, se dejó en estufa a 37°C y 5% de C02 por 10 min para disgregar cada
colonia. Una vez completada la disgregación de cada colonia, con la ayuda de una pipeta
multicanal se inactivó la Tripsina con 90 ul de medio de cultivo fresco y se pipeteo,
aspirando y expeliendo el medio para tener células aisladas. De los 120 ul totales finales
que existe en cada pocillo, 60 ul fueron pasados a una placa de 96 multipocillos con fondo
plano conteniendo MEFs para crecerlos y obtener ADN para análisis de Southern o PCR y
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Tesix Doctoral. Diego M. Gelman. Materiales y Métodos.
los 60 ul restantes fueron cubiertos con aceite mineral (testeado para Células ES), envueltos
en film transparente y congelados lentamente a —70°Chasta su nueva utilización.
Transfección transitoria de células ES con un plásmido que expresa Ia recombinasa Cre.
Dadas las características del vector utilizado para la recombinación homóloga fue
necesario realizar una transfección transitoria con un plásmido que exprese la recombinasa
Cre del bacteriófago Pl bajo un promotor fuerte con el fin de eliminar el par de genes de
selección (Neor y TK). Para ello se utilizó el plásmido pCAGGS-Cre que expresa la citada
recombinasa bajo un promotor de actina con una zona amplificadora de la expresión
proveniente de un citomegalovirus y con una señal de poliadenilación de B-Globina. Para la
transfección transitoria se siguieron los mismos pasos que se mencionaron en la sección
Electroporación de células ES pero en este caso se utilizaron lO ug del plásmido pCAGGS
Cre que debe estar superenrollado y no linearizado. Una vez plaqueadas las células en 4
placas independientes se las dejó crecer por 60 hs aproximadamente, para darle tiempo a las
células de que sintetice la recombinasa Cre para producir la excisión, luego de las cuales se
las pasa a nuevas placas con MEFs en concentraciones crecientes de células. Luego de un
día. se las empezó a seleccionar con medio de cultivo suplementado con 2 mM de
Ganciclovir (Cytovene lV, Ganciclovir sodium, Roche Laboratories Inc.) por un lapso de 5
dias. Después de ese período se observaron colonias aisladas de células ES las cuales
fueron repicadas a placas de 96 pocillos y siguiendose los mismos pasos citados
anteriormente para tener los clones aislados.
Congelado, almacenamiento y descongelado de células ES.
Las células ES fueron congeladas como cualquier otro tipo de línea celular en medio
de cultivo conteniendo 20% de suero fetal bovino en lugar de 15% como esta formulado
para cultivo normal y con el agregado de 10% de DMSO (Sigma) como agente
criopreservador. Luego los viales conteniendo las ce'lulas fueron almacenados en tanques de
nitrógeno liquido. Pueden ser mantenidos así de manera indefinida. Como regla general el
congelado se hizo lentamente y el descongelado rápidamente, para eliminar el DMSO
presente en el medio que, en estado liquido y en contacto prolongado con las células,
resulta tóxico. Las Células ES. así como los MEFs, se congelan mejor a una alta densidad,
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Tesis Doctoral. Diego M. Gelman. Materiales y Métodos.
aproximadamente de 5 a lO x lO6 células/ml. Para el conteo se utilizó una cámara de
Neubauer.
Diseño y puesta a punto de una PCR para la identificación de clones portadores de la
recombinación.
Para la genotipificación de las células ES con la recombinación homóloga final y
para la genotipificación de los animales con el exón 2 del receptor de dopamina D2
flanqueado por sitios loxp se diseñó una reacción de PCR. Esta reacción amplifica una
región 5’ del exón 2 de 234 pb en el caso del gen del animal salvaje, de 369 pb en el caso
que exista una deleción de tipo ll y de aproximadamente 450 pb en el caso que exista una
deleción de tipo I, utilizando los primers Type l del. (5’TGC AAG ACT GCA TCA TCC
TC3’), Type ll del. (S’TGC TCA ACA CAC TCA CAT GC 3’) y TypeI&II del. (5’GCA
TTT GGA GCA ACT GGA AT3’). Las condiciones para la reacción fueron como se
describe a continuación: 200 ng de ADN genómico en buffer PCR (Tris-HCl 20 mM, pH
8.4; KCl 50 mM), MgClz 2,1 mM. dNTPs 0,2 mM, 1,3 uM de los primers Type I y Type Il
del.. 2 pM del primer Type l&ll del. y l U de polimerasa Taq (Promega) en un volumen
final de 30 ul. Las muestras fueron amplificadas en un termociclador (MJ Reserarch) con el
siguiente protocolo: 5 min de desnaturalización inicial a 94°C. Luego 15 ciclos de
amplificación que constaron de l min de desnaturalización a 94°C, l min de aparcamiento
comenzando a 67°C y disminuyendo lo/ciclo y l min de elongación a 72°C. A continuación
una nueva serie de 15 ciclos que constaron de l min de desnaturalización a 94°C, 1 min. de
aparcamiento a 52°C y l min de elongación a 72°C para finalmente dejar 5 min de
elongación a 72°C y sostener la temperatura en 4°C.
En cada caso los productos de elongación fueron corridos en un gel de agarosa 1,5%
con bromuro de etidio (0,1 ug de bromuro de etidio/ul de agarosa) y visualizados a la luz
UV.
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