Asignatura: Microbiología de los alimentos
Docente: Dr. César Julio Cáceda Quiroz
Alumnos: José Sandoval Niebles
Franco Liñan Vigo
Códigos: -
- 2011-118 007
EL RECUENTO AERÓBICO EN PLACA
Autores: Larry Maturin y James T. Peeler
EL RECUENTO AERÓBICO EN PLACA
El recuento aeróbico en placa (APC) está destinado para indicar el nivel de
microrganismos en un producto. Procedimientos detallados para la determinación
de APC en comidas han sido desarrollados por la Asociación de Química Analítica
Oficial (AOAC) (3) y la Asociación Americana para la Salud Pública (APHA) (1). El
método convencional del recuento en placa para examinar alimentos congelados,
refrigerados, precocinados o preparados que se describen a continuación,están de
acuerdo a los Métodos de Análisis Oficial de la AOAC, sec. 966.23, con un cambio
de procedimiento (966.23C). El rango adecuado de recuento de colonias (10) es
25-250. El método de recuento en placa espiral automatizado para el examen de
los alimentos y cosméticos (5), que se describe a continuación, de acuerdo a los
Métodos de Análisis Oficial, sec. 977.27. Para más detalles de procedimiento del
recuento en placa estándar, ver la ref. 2.
Las pautas para calcular y reportar el conteo de placas se han cambiado para
ajustarse a los cambios previstos en la 16ª edición de los Métodos estándar para
el examen de los productos lácteos (2) y los procedimientos de la Federación de
Lácteos Internacional (IDF) (6).
Método Convencional de Recuento en Placa
A. Equipos y materiales
1. Área de trabajo, una mesa nivelada con una amplia superficie en una
habitación que esté limpia, bien iluminada y bien ventilada, razonablemente
libre de polvo y de corrientes de aire. La densidad microbiana del aire del
área de trabajo, medida en precipitados vertidos en placas tomada durante
el plaqueo, no deberá exceder de 15 colonias / placa durante 15 minutos de
exposición.
2. El área de almacenamiento, libre de polvo e insectos y adecuada para la
protección de equipos y suministros
3. Placas Petri, de vidrio o plástico (al menos 15x90mm)
4. Pipetas con bombilla (no pipetear con la boca) o pipeteadores de 1,5, y 10
ml graduado en 0.1 ml
5. Botellas de dilución, de 160 ml, vidrio de borosilicato resistente, con
tapones de goma o tapas rosca de plástico.
6. Contenedores para pipetas y placas Petri, adecuadas para la protección.
7. Baño de agua circulante, para el temperado del agar, controlada
termostáticamente a 45°C + 1°C.
8. Incubadora, 35 + 1°C; leche, 32 ± 1°C
9. Contador de colonias de campo oscuro, Quebec, o equivalente, con fuente
de luz adecuada y placa de rejilla.
10.Registro del recuento
11.Blanco de dilución, 90 ± 1 ml de agua de dilución de fosfato tamponado
Butterfield (R11); leche, 99 ± 2 ml
12.Agar para recuento en placa (métodos estándar) (M124)
13.Frigorífico, para enfriar y mantener las muestras a 0-5 ° C; leche, 0-4,4 ° C
14.Congelador, para mantener las muestras congeladas -15 a -20 ° C
15.Termómetros (de mercurio) de rango adecuado; la exactitud comprobada
con un termómetro certificado por el Instituto Nacional de Estándares y
Tecnología (NIST)
B. Procedimiento para el análisis de alimentos refrigerados,
congelados, precocinados elaborados
Utilizar pipetas estériles separadas, preparar diluciones decimales de 10-2, 10-3,
10-4, y otras si es necesario, del homogeneizado del alimento (véase el
Capítulo 1 para la preparación de muestras) mediante la transferencia de 10 ml
de la dilución anterior a 90 ml de diluyente. Evitar la espuma de muestreo.
Agitar todas las diluciones 25 veces en un arco de 30 cm (1 pie) por 7 s.
Pipetear 1 ml de cada dilución en las placas Petri separadas y por duplicado,
apropiadamente marcadas. Volver a agitar la botella de dilución 25 veces en un
arco de 30 cm durante 7 segundos si esta estuvo en reposo por más de 3
minutos antes de que esta sea pipeteada en la placa de Petri. Añadir 12-15 ml
de Agar de Recuento en Placa (enfriado a 45 ± 1 ° C) a cada placa dentro de
15 min de la dilución inicial. Para las muestras de leche, verter un control de
agar, verter un control de agua de dilución y pipetear el agua para un control de
pipeta. Añadir agar para las últimas dos series de muestras. Añadir agar
inmediatamente a las placas Petri cuando el diluyente de la muestra contenga
materias higroscópicas, p.e., harina y almidón. Verter al azar el agua de
dilución de las placas control para cada una de las series de las muestras.
Inmediatamente mezcle las diluciones de la muestra y el medio de agar por
completo y uniformemente por rotación alternada y movimiento de atrás y hacia
delante de las placas sobre una superficie en plano horizontal. Deje que el agar
solidifique. Invierta las placas de Petri solidificadas, e incube inmediatamente
por 48 ± 2 h a 35°C. No apilar las placas cuando vierta el agar o cuando el agar
esté solidificando.
C. Pautas para calcular y reportar APCs de casos no comunes
Los Métodos Oficiales de Análisis (3) no provee pautas para el conteo y
reporte de los recuentos en placa, mientras que los Métodos Estándar para la
Examinación de Productos Lácteos, 16va ed. (2) presenta indicaciones
detalladas, por uniformidad, por lo tanto, utilizar la guía del APHA como se
modificó (6,8). Reportar todos los recuentos aeróbicos en placa (2) calculados
de placas por duplicado. Para muestras de leche, reporte todos recuentos
aeróbicos en placa (2) calculados de placas por duplicado que contienen
menos de 25 colonias como un recuento estimado de menos de 25. Reportar
todos los recuentos aeróbicos en placa (2) calculados de placas por duplicado
que contienen más de 250 colonias como recuentos estimados. Los recuentos
fuera del rango normal de 25-250 pueden dar indicaciones erróneas de la
actual composición bacteriana de la muestra. Los factores de dilución pueden
exagerar recuentos bajos (menos de 25), y las placas llenas (mayores de 250)
pueden dificultar el recuento o inhibir el crecimiento de alguna bacteria,
resultando en un recuento bajo. Reportar los recuentos menores de 25 o de
más de 250 colonias como recuentos aeróbicos estimados en placa (EAPC).
Utilizar la siguiente guía:
Placas normales (25-250):
Seleccione placa(s) libre de esparcimiento. Cuente todas las unidades
formadoras de colonia (UFC), incluyendo aquellas del tamaño de la
punta de un alfiler, sobre las placa(s) seleccionada(s). Registre la
dilución(s) utilizada y la cantidad total de colonias contadas.
Placas con más de 250 colonias:
Cuando la cantidad de UFC por placa excede a 250, para todas las
diluciones, registre los recuentos como demasiado numeroso para el
conteo (TNTC) para todas pero para la placa más cercana a 250, y el
recuento de UFC en estas porciones de las placa que son
representativas de la distribución de la colonia. Vea la ref. 2 para
indicaciones detalladas. Señalar el calculó de APC como EAPC para
denotar que fue estimado los recuentos fuera del rango de 25-250 por
placa (vea 4-3).
Esparcimientos (Crecimiento difusivo en superficie):
Las colonias que se esparcen usualmente son de 3 tipos distintos: 1)
una cadena de colonias, no lo suficientemente distanciadas para
diferenciarlas, que parecen ser causadas por la desintegración de un
grupo bacteriano; 2) una que se desarrolla en una película de agua
entre el agar y el fondo de la placa; y 3) una que se forma en una
película de agua en el borde o en la superficie del agar.
Si las placas preparadas de la muestra tienen un excesivo crecimiento
esparcido tanto que (a) un área es cubierta por los esparcimientos,
incluyendo el área total del crecimiento reprimido, que excede el 50%
del área de la placa, o (b) el área del crecimiento reprimido excede el
25% del área de la placa, reportar las placas como esparcidas. Cuando
sea necesario el recuento de las placas que contengan propagaciones
no eliminadas por (a) o por (b) mencionado, cuente cada uno de los 3
tipos distintos de esparcimiento como una fuente. Para el primer tipo, si
solo existe una cadena, contarlo como una colonia simple. Si aparecen
una o más cadenas que se originan de fuentes separadas, contar cada
fuente como una colonia separada. Los tipos 2 y 3 usualmente resultan
en colonias distintas y son contadas como tales. Combine el recuento
de propagación y el recuento de la colonia para calcular el APC.
Placas sin UFC:
Cuando las placas de todas las diluciones no tienen colonias, reportar
el APC como menos de 1 vez la correspondiente dilución más baja
utilizada. Marcar el cálculo del APC con asterisco para denotar que fue
estimado de los recuentos fuera del rango de 25-250 por placa. Cuando
se sabe que la placa(s) de una muestra está contaminadas o presenta
otra irregularidad, registrar el resultado(s) como accidente de
laboratorio (AL).
D. Cálculo y registro de los recuentos (vea refs. 6, 8)
Para evitar crear una impresión ficticia de la precisión y exactitud cuándo se
calcula el APC, reportar solo los dos primeros dígitos significantes.
Redondear a dos cifras significativas únicamente en el momento de la
conversión a SPC. Para muestras de leche, cuando las placas para todas las
diluciones no tienen colonias, reportar el APC como un recuento estimado con
menos de 25 colonias. Redondear subiendo el segundo dígito hasta el
siguiente número más alto cuando el tercer dígito sea 6, 7, 8, 9 y use ceros
para cada dígito sucesivo hacia la derecha del segundo dígito. Redondee
hacia abajo cuando el tercer dígito sea 1, 2, 3, ó 4. Cuando el tercer dígito sea
5, redondee hacia arriba cuando el segundo dígito sea impar y redondee hacia
abajo si fuera par.
Ejemplos:
Calculo del Recuento
APC
12,700 13,00012,400 12,00015,500 16,00014,500 14,000
1. Placas con 25-250 UFC
a) Calcular el APC como sigue:
(31+31 ) colonias0.0015ml
=4.1 x104
Donde:N= Número de colonias por ml o g de producto∑C= Sumatoria de todas las colonias en todas las placas contadasn1=Número de placas en la primera dilución contadan2= Número de placas en la segunda dilución contadad= Dilución de la cual los primeros conteos fueron obtenidos
Ejemplo
1:100 1:1000
232, 244 33, 28
N=¿¿
=537÷0.022
=24,409
≈24,000
b) Cuando el conteo de las placas duplicadas caen dentro y fuera del
rango de 25-250 colonias, utilizar sólo aquellos recuentos que caen
dentro de este rango.
2. Todas las placas con menos de 25 UFC. Cuando las placas de ambas diluciones produzcan menos de 25 UFC cada una, registrar el recuento actual de la placa pero registre el conteo como menos de 25 x 1/d cuando d sea el factor de dilución para la dilución de la cual los primeros recuentos fueron obtenidos.
Ejemplo
Colonias1:100 1:1000 EAPC/ml (g)
18 2 <2,5000 0 <2,500
3. Todas las placas con más de 250 UFC. Cuando las placas de las 2 diluciones producen más de 250 UFC cada una (pero menos de 100/cm2), estimar los recuentos aerobios de las placas (EAPC) más cercanas a 250 y multiplíquela por la dilución.
Ejemplo
Colonias1:100 1:1000 EAPC/ml (g)
TNTC 640 640,000
TNTC (DNPC): demasiadas numerosas para contarEAPC (RAPE): Recuento aerobio de placas estimado
4. Todas las placas con esparcimientos y/o accidente de laboratorio. Reportar respectivamente como Esparcidas (SPR), o Accidente de Laboratorio (AL).
5. Todas las placas con más de un promedio de 100 UFC por cm2. Estimar el APC como mayor de 100 veces la dilución plaqueada más alta, veces del área de la placa. Los ejemplos de abajo tienen un promedio de recuento de 110 por cm2.
Colonias/Dilución
1:100 1:1000 EAPC/ml (g)
TNTC 7,150(a) >6,500,000 EAPC(b)
TNTC 6,490 >5,900,000 EAPC
(a) Basado en un área de placa de 65 cm2
(b) EAPC, APC estimado(c) Basado en un área de placa de 59 cm2
Método de la Placa en Espiral
El método de recuento en placa en espiral (SPLC) para los microorganismos en la
leche, alimentos y cosméticos es un método oficial de la APHA (2) y la AOAC (3).
En este método, un Plaqueador mecánico inocula en una placa de agar que rota
con muestra líquida. El volumen de la muestra dispensada disminuye como los de
la aguja de dispensación se mueve desde el centro hasta el borde de la placa
giratoria. La concentración microbiana se determina contando las colonias en una
parte de la placa de Petri donde sea fácilmente contable y dividiendo este
recuento por el volumen apropiado. Una inoculación determina densidades
microbianas entre 500 y 500 000 microorganismos / ml. Diluciones adicionales
deben ser hechas para concentraciones microbianas altas sospechosas.
A. Equipos y materiales:
1. Plaqueador espiral (Spiral Sistemas Instruments, Inc., 7830 Old
Georgetown Road, Bethesda, MD 20814)
2. Contador de colonias Espiral (Spiral Systems) con rejilla especial para
relacionar volúmenes de muestras depositadas a partes específicas de
placas de Petri
3. Trampa de vacío para la eliminación de líquidos (botella de vacío de 2-4
litros para actuar como depósito de vacío y la fuente de vacío de 50 a 60 cm
de Hg)
4. Micro vasos de precipitado disponibles, 5 ml
5. Placas de Petri de plástico o de vidrio, 150 x 15 mm o 100 x 15 mm
6. Agar para recuento en placa (métodos estándar) (M124)
7. Calculadora (opcional), se recomienda una calculadora de mano electrónico
de bajo costo
8. Bolsas de polietileno para el almacenamiento de placas preparados
9. Solución de hipoclorito de sodio comercial, cerca del 5% NaOCl (lejía)
10.Agua de dilución estéril
11.Jeringa, con punta Luer para obstrucciones en aguja; capacidad no crítico
12.El área de trabajo, espacio de almacenamiento, nevera, termómetros,
contador, incubadora, como se describe para el método convencional de
recuento en placa, mencionada arriba.
13.Solución de hipoclorito de sodio (5,25%). Comercialmente disponible.
B. Preparación de las placas de agar.
Se recomienda dispensador automático con sistema de entrega estéril para
preparar placas de agar. Volumen dispensado de agar en placas es
reproducible y la tasa de contaminación es baja en comparación con el vertido
a mano de agar en laboratorio abierto. Cuando sea posible, utilice campana de
flujo laminar junto con dispensador automatizado. Vierta la misma cantidad de
agar en todas las placas de manera que la misma altura de agar se presentará
a la punta del Plaqueador espiral para mantener el ángulo de contacto. Las
placas de agar deben estar al mismo nivel durante el enfriamiento.
El siguiente método se sugiere para el pre-vertido de placas de agar: Usar el
dispensador automático o verter cantidad constante (alrededor de 15 ml / 100
mm placa; 50 ml / 150 mm plato) de agar estéril a 60-70 ° C en cada placa de
Petri. Deje solidificar el agar en una superficie plana con las placas vertidas en
pilas de no más de 10 placas. Coloque las placas de agar solidificado en
bolsas de polietileno, cierre con lazos o calor sellador y almacenar invertidas a
0-4.4 ° C. Llevar las placas previamente vertidas a temperatura ambiente
antes de la inoculación.
C. Preparación de las muestras.
Como se describe en el capítulo 1, seleccione esa parte de la muestra con
menor cantidad de tejido conectivo o glóbulos de grasa.
D. Descripción del Plaqueador en espiral.
El Plaquador en espiral inocula la superficie de agar preparada en placa para
permitir la enumeración de microorganismos en soluciones que contienen
entre 500 y 500 000 microorganismos por ml. Operador con formación mínima
puede inocular 50 placas por hora. Dentro del rango indicado, no se requieren
botellas de dilución o pipetas y otros equipos auxiliares. El espacio en
laboratorio requerido es mínimo, y el tiempo para comprobar la alineación del
instrumento es de menos de 2 min. El Plaqueador deposita una cantidad
decreciente de muestra en una espiral de Arquímedes en la superficie del agar
previamente vertido. Se conoce el volumen de la muestra en cualquier parte
de la placa. Después de la incubación, las colonias aparecen a lo largo de la
línea de la espiral. Si colonias en una porción de la placa están
suficientemente separadas entre sí, contarlos en la rejilla especial que asocia
un volumen calibrado con cada área. Estimar el número de microorganismos
en la muestra dividiendo el número de colonias en un área definida por el
volumen contenido en la misma área. Los estudios han demostrado que el
método es eficiente no sólo con leche (4), sino también con otros alimentos
(7,10).
E. Procedimiento de Plaqueado
Comprobar el ángulo de punta de la aguja diariamente y ajustar si es
necesario. (Use vacío para evitar que el cobertor del microscopio resbale en
contra de la cara de la punta de la aguja; si el cobertor de la vía de acceso
está en paralelo de alrededor de 1 mm de la superficie de la plataforma, la
punta es orientada apropiadamente). Los líquidos se mueven a través del
sistema de vacío. Limpiar la punta de la aguja enjuagando durante 1 s con una
solución de hipoclorito de sodio seguido de la dilución con agua estéril para 1
s antes de la introducción de la muestra. Este procedimiento de enjuague
entre el procesamiento de cada muestra minimiza la contaminación cruzada.
Después del enjuague, la muestra arrastrada en la punta del tubo de Teflón de
vacío aplicado a una válvula de 2 maneras. Cuando el tubo y la jeringa se
llenan de muestra, cierre la válvula unida a la jeringa. Coloque la placa de agar
en la plataforma, coloque la punta de la aguja sobre la superficie de agar, y
arrancar el motor. Durante la inoculación, etiquetar la tapa de la placa petri.
Después de que el agar ha sido inoculado, la punta se levanta de la superficie
de agar y dispensador en espiral se detiene automáticamente. Retire la placa
inoculada de plataforma y cubrirla. Mueva la aguja a la posición inicial.
Sistema de vacío-enjuague con hipoclorito y agua, y luego introducir nueva
muestra. Invertir las placas y con prontitud los colocar en la incubadora
durante 48 ± 3 horas a 35 ± 1 ° C.
F. Controles de esterilidad
Comprobar la esterilidad del plaqueador en espiral para cada serie de
muestras plaqueando una dilución estéril de agua.
PRECAUCIÓN: Placas pre-vertidas no deben estar contaminados en la
superficie por una colonia o estar por debajo de la temperatura ambiente
(agua puede liberarse a partir de agar). No deben estar excesivamente secas,
como se indica por las grandes arrugas o apariencia vidriada. No deben tener
gotas de agua sobre la superficie de agar o diferencias en la profundidad del
agar de más de 2 mm, y no deben ser almacenados a 0-4,4 ° C durante más
de 1 mes. El índice de flujo reducido a través del tubo indica obstrucciones o
material en el sistema. Para limpiar las obstrucciones, remover la válvula de la
jeringa, inserte la jeringa manualmente con el Luer restante que contiene
agua, y aplique presión. Usar enjuague de alcohol para remover el material
residual que se adhiere a las paredes del sistema. Disuelva el residuo
acumulado con ácido crómico. Enjuagar bien después de la limpieza.
G. Rejilla de recuento
1. Descripción. Utilizar la misma rejilla de recuento para ambos, placas de
petri de 100 y 150 mm. Una máscara se suministra para su uso con placas
de 100 mm. Rejilla de recuento se divide en 8 trozos iguales; cada cuña se
divide por 4 arcos etiquetados 1, 2, 3, y 4 del borde de la rejilla exterior. Se
añaden otras líneas dentro de estos arcos para facilitar el recuento. Un
segmento es el área entre 2 líneas de arco dentro de una cuña. Número de
áreas contados (por ejemplo, 3) significa el número de segmentos contados
dentro de una cuña. El plaqueador espiral deposita la muestra en la placa
de agar de la misma manera cada vez. La rejilla relaciona las colonias en la
placa espiral con el volumen en el que estaban contenidas. Cuando se
cuentan las colonias con rejilla, el volumen de la muestra es mayor a
medida conteo comienza en el borde exterior de la placa y procede hacia el
centro del esta.
2. Calibración. El volumen de la muestra representada por varias partes de la
rejilla de recuento se muestra en el manual del operador que acompaña al
plaqueador espiral. El área de la rejilla debe ser comprobado por el
fabricante y ser exactas. Para comprobar estos valores, preparar 11
concentraciones de bacterias en el rango de 106 a 103 células / ml haciendo
diluciones 1:1 de suspensión bacteriana (utilizar un esparcidor). Incubar
ambos sets de placas por 48 ± 3 h a 35 ± 1 ° C. Calcular las
concentraciones para cada dilución. Contar las placas en espiral sobre la
superficie de la rejilla, utilizando la regla de recuento de 20 (descrito en el
punto H, a continuación), y registrar el número de colonias contadas y área
de la rejilla sobre la que se contaron. Cada recuento de colonias en espiral
para cada área de la cuadrícula en particular, dividido por el recuento
aeróbico/ml para las correspondientes concentraciones bacterianas de
placa en espiral, indica que el volumen depositado en esa área de la
cuadrícula en particular. Usar la siguiente fórmula:
Volumen (ml ) parael area derejilla=Colonias enespiral contadas enel áreaConteo bacteriano /ml(APC )
Volumen (ml )=31+30colonias
4.1 x104 /ml=0.0015
Para comprobar volumen total dispensado por el plaqueador en espiral, pesar la cantidad dispensada desde la punta de la aguja. Recoger en 5 ml vaso de plástico de 5ml tarados y pesarlos en balanza de precisión (± 0,2 mg).
Figura 1. Placa de 10 cm, área (3b)
(30+31 ) colonias0.0015ml
=4.1x 104
H. El examen y la presentación de informes de los recuentos de placas en espiral.Recuento en regla de 20. Después de la incubación, ajuste el centro de la placa en espiral sobre la cuadricula logrando armar la vista. Elija cualquier cuña y comenzar a contar las colonias desde el borde exterior del primer segmento hacia el centro hasta que se hayan contado 20 colonias. Completar el conteo de las colonias restantes en el segmento donde se produce 20va colonia. En este procedimiento de conteo, los números como 3b, 4c (Fig. 1) se refieren a segmentos de área desde el borde exterior de la cuña hacia línea del arco designado. Cualquier irregularidad de recuento en la composición de la muestra se controla mediante el recuento de los mismos segmentos en la
cuña opuesta y registrando resultados. Ejemplo de placa inoculada en espiral (Fig. 1) demuestra el método para determinar el recuento microbiano. Dos segmentos de cada cuña se contaron en lados opuestos de la placa con 31 y 30 colonias, respectivamente. El volumen de la muestra contenida en los segmentos oscuros es 0,0015 ml. Para estimar el número de microorganismos, dividir el conteo de las colinas entre el volumen contenido en todos los segmentos contados. Ver ejemplo bajo la figura. 1. Si 20 UFC no están dentro de los 4 segmentos de la cuña, cuente UFC en la placa entera. Si el número de colonias supera 75 en el segundo, tercero, cuarto segmento, que también contiene el 20va colonia, el número estimado de microorganismos generalmente será bajo debido a la coincidencia de error relacionado con la aglomeración de las colonias. En este caso, contar cada segmento circunferencial adyacente en todas las 8 cuñas, contando al menos 50 colonias, por ejemplo, si los primeros 2 segmentos de una cuña contienen 19 colonias y el tercer segmento contiene el 20va y 76va (o más), contar las colonias en todos los segmentos, primero y segundo circunferencialmente adyacentes en todos los 8 cuñas. Calcular el volumen contenido en los segmentos contadas de cuñas y dividir entre el número de colonias.
Cuando menos de 20 colonias se cuentan en el total de la placa, reportar resultados como "menos de 500 SPLC por ml. estimado" Si el recuento de colonias es superior a 75 en el primer segmento de cuña, reportar resultados como "mayor que 500.000 SPLC por ml. estimado " No cuente placas espirales con distribución irregular de colonias causadas por errores en la dispensación. Informar los resultados de las placas como accidente de laboratorio (LA). Si la distribución esparcida cubre placa entera, deseche la placa. Si la mitad esta esparcida en el área de la placa, contar sólo aquellas colonias que están bien distribuidos y libre de esparcimiento.Calcule los SPLC a menos que se restrinja por detección de sustancias inhibitorias de sustancias en una muestra, el excesivo crecimiento esparcido o accidentes de Laboratorio. Presente los recuentos como se describe en 4. Reporte los recuento como SPLC o SPLC estimado por ml.Traducido de: FDA, 2001. Bacteriological Analytical Manual, Chapter 3 Aerobic Plate Count.
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