Alberto Varela San Pedro
Carmen Torres Manrique
Facultad de Ciencias, Estudios Agroalimentarios e Informática
Grado en Química
2014-2015
Título
Director/es
Facultad
Titulación
Departamento
TRABAJO FIN DE GRADO
Curso Académico
Identificación y caracterización del fenotipo y genotipode resistencia a antibióticos en aislados de
Enterococcus de la microbióta intestinal del ganado vacuno
Autor/es
© El autor© Universidad de La Rioja, Servicio de Publicaciones, 2015
publicaciones.unirioja.esE-mail: [email protected]
Identificación y caracterización del fenotipo y genotipo de resistencia aantibióticos en aislados de Enterococcus de la microbióta intestinal del ganado
vacuno, trabajo fin de gradode Alberto Varela San Pedro, dirigido por Carmen Torres Manrique (publicado por la
Universidad de La Rioja), se difunde bajo una LicenciaCreative Commons Reconocimiento-NoComercial-SinObraDerivada 3.0 Unported.
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UNIVERSIDAD DE LA RIOJA FACULTAD DE CIENCIAS, ESTUDIOS AGROALIMENTARIOS E INFORMÁTICA GRADO EN QUÍMICA
Identificación y caracterización del fenotipo
y genotipo de resistencia a antibióticos en
aislados de Enterococcus de la microbiota
intestinal de ganado vacuno
Tutora: Carmen Torres Manrique
ALBERTO VARELA SAN PEDRO
TRABAJO FIN DE GRADO
Curso académico 2014/ 2015
RESUMEN
La resistencia bacteriana a los antibióticos y su diseminación es un problema en salud pública,
presente no sólo en el ámbito clínico sino también en el veterinario o el agroalimentario, entre
otros. En este trabajo se ha llevado a cabo la caracterización de 36 cepas de Enterococcus
aisladas previamente de la microbiota intestinal de 33 vacas de una granja en explotación
extensiva de la Rioja. Dichas cepas han sido identificadas en este trabajo a nivel de especie
mediante técnicas microbiológicas, bioquímicas y de la Biología Molecular (reacción en cadena
de la polimerasa o PCR, especie-específicas) con los siguientes resultados: Enterococcus hirae
(18 cepas), Enterococcus casseliflavus (6 cepas), Enterococcus faecium (5 cepas) y
Enterococcus spp (7 cepas). Asimismo se llevó a cabo el estudio fenotípico y genotípico de la
resistencia a antibióticos en dicha colección bacteriana.
Diez de las 36 cepas (27,8%) presentaron resistencia frente al menos a un antibiótico de los 12
testados. Se demostraron resistencias frente a los antibióticos: trimetoprim-sulfametoxazol
(SXT, 8 cepas, 22,2%), kanamicina (3 cepas, 8,3%) y linezolid (1 cepa, 2,8%). Dos de las cepas
de la especie E. hirae presentaron resistencia a SXT y kanamicina conjuntamente. Por otro lado,
se llevó a cabo el estudio de los genes responsables de los principales mecanismos de resistencia
mediante la técnica de PCR y secuenciación posterior de los amplicones obtenidos. Se detectó el
gen de resistencia dfrK y asimismo mutaciones en el gen codificante de RNA ribosómico
(rRNA) 23S, responsables de la resistencia a trimetoprim y linezolid, respectivamente. Siete
cepas mostraron sensibilidad disminuida a vancomicina (categoría intermedia), siendo seis de
ellas E. casseliflavus (con el gen vanC2) y una E.hirae.
Conclusión. Se detecta E. hirae como especie de enterococo predominante en la microbiota
intestinal de ganado vacuno. En general se detectan bajos niveles de resistencia para la mayor
parte de los antibióticos testados, aunque destaca la identificación de un aislado E. hirae con
resistencia a linezolid, cuyo mecanismos de resistencia podría estar relacionado con mutaciones
en el gen codificante del rRNA 23S.
ABSTRACT
Bacterial resistance to antibiotics and its dissemination is an issue of great importance in public
health, present not only in the clinical field but also in the veterinary or agroalimentary, among
others. In this work, characterization of 36 strains of Enterococcus previously isolated from the
intestinal microbiota of 33 cows from a farm in extensive exploitation in La Rioja was carried
out. These strains have been identified to species level by microbiological, biochemical and
molecular biology techniques (polymerase chain reaction or PCR, species-specific) with the
following results: Enterococcus hirae (18 strains), Enterococcus casseliflavus (6 strains),
Enterococcus faecium (5 strains) and Enterococcus spp (7 strains). Also, a genotypic and
phenotypic study of antibiotic resistance of our bacterian collection were carried out.
Ten of the 36 strains (27.8%) showed resistance to at least one antibiotic of the 12 tested. It was
demonstrated resistance to the following antibiotics: trimethoprim-sulfamethoxazole (SXT, 8
strains, 22.2%), kanamycin (3 strains, 8,3%) and linezolid (1 strain, 2.7%). Two strains (E.
hirae) presented a SXT and kanamycin resistant phenotype simultaneously. On the other hand,
study of resistant mechanisms by PCR technique and sequencing of amplicons obtained was
carried out. It were detected the dfrK resistance gene and likewise mutations in the gene
encoding the ribosimal RNA (rRNA) 23S, responsible for resistance to trimethoprim and
linezolid, respectively, in E. hirae strains. Seven strains showed diminished susceptibility for
vancomicin, being six of them E. casseliflavus with (vanC2gene) and one E. hirae.
Conclusions: E. hirae is detected as the predominant specie of Enterococcus in the intestinal
microbiota of cattle. In general, low resistance levels are detected for most of the antibiotics
tested, but an E. hirae´s strain stands out for his linezolid resistance, whose resistance
mechanism could be associated to mutations in the enconding gene rRNA 23S.
ÍNDICE
Lista de tablas ............................................................................................................................. 1
Lista de figuras ............................................................................................................................ 2
Abreviaturas ................................................................................................................................ 3
1. INTRODUCCIÓN ......................................................................................................... 5
1.1 DESCUBRIMIENTO DE LOS ANTIBIÓTICOS Y
PROBLEMÁTICA DE LA RESISTENCIA A LOS MISMOS ................................... 5
1.2 EL GÉNERO Enterococcus ........................................................................................... 6
1.2.1 Características generales, filogenia y taxonomía. .................................................. 6
1.2.2 Hábitat .................................................................................................................. 7
1.3 ELEMENTOS GENÉTICOS DE ADQUISICIÓN Y DISEMINACIÓN
DE GENES DE RESISTENCIA A ANTIBIÓTICOS .................................................. 7
1.4 MECANISMOS GENERALES DE RESISTENCIA A LOS
ANTIBIÓTICOS ............................................................................................................ 9
1.4.1 Resistencia a Glucopéptidos .................................................................................. 9
1.4.2 Resistencia a β-lactámicos .................................................................................. 14
1.4.3 Resistencia a Aminoglucósidos ........................................................................... 14
1.4.4 Resistencia a Macrólidos, Lincosamidas y Estreptograminas (MLS) ................... 16
1.4.5 Resistencia a Quinilonas ..................................................................................... 17
1.4.6 Resistencia a Oxazolidinonas .............................................................................. 18
1.4.7 Resistencia a Cloranfenicol y Tetraciclinas ....................................................... 19
1.4.8 Resistencia a Trimetoprim................................................................................... 19
2. OBJETIVOS................................................................................................................... 21
3. MATERIAL Y MÉTODOS ...................................................................................... 22
3.1 CEPAS INCLUÍDAS EN EL ESTUDIO .................................................................... 22
3.2 MEDIOS Y CONDICIONES DE CULTIVO ............................................................. 22
3.2.1 Medios de cultivo .......................................................................................... 22
3.2.2 Condiciones de cultivo ................................................................................. 23
3.2.3 Conservación de las cepas ........................................................................... 23
3.3 TINCIÓN DE GRAM .................................................................................................. 23
3.4 TEST CATALASA ...................................................................................................... 26
3.5 BILIS ESCULINA ....................................................................................................... 27
3.6 ESTUDIO DE LA SENSIBILIDAD A ANTIBIÓTICOS POR EL
MÉTODO DEL ANTIBIOGRAMA ........................................................................... 27
3.7 EXTRACCIÓN DE DNA: Protocolo InstaGeneTM Purification
Matrix ......................................................................................................................... 29
3.8 REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR) ..................................... 29
3.9 ELECTROFORÉSIS EN GEL DE AGAROSA ......................................................... 34
3.10 SECUENCIACIÓN ..................................................................................................... 35
4. RESULTADOS .............................................................................................................. 37
5. DISCUSIÓN ................................................................................................................... 43
CONCLUSIONES ............................................................................................................... 46
BIBLIOGRAFÍA ................................................................................................................. 47
1
LISTA DE TABLAS.
Tabla 1. Función y proteína codificada por cada uno de los genes del operón vanA.
Tabla 2. Estructura química de los antibióticos glucopeptídicos.
Tabla 3. Características de los diferentes genotipos de resistencia a vancomicina (López, M., Tesis 2011)
Tabla 4. Estructura química de los antibióticos β-lactámicos.
Tabla 5. Estructura química de los antibióticos aminoglucosídicos.
Tabla 6. Estructura química de los antibióticos macrolidos, lincosaminas y estreptograminas.
Tabla 7. Estructura química de los antibióticos del grupo de las quinolonas.
Tabla 8. Estructura química de los antibióticos oxazolidinónicos.
Tabla 9. Estructura química de cloranfenicol y tetraciclina.
Tabla 10. Estructura química de trimetoprim y sulfametoxazol.
Tabla 11. Estructura química del peptidoglicano, del colorante cristal violeta y del colorante safranina.
Tabla 12. Carga de los discos de antibiótico empleados en antibiogramas y puntos de corte de los halos de
inhibición según el CLSI (2015).
Tabla 13. Componentes de los reactivos utilizados en la técnica de PCR.
Tabla 14. Secuencia nucleotídica de cebadores empleados para la identificación de especies de Enterococcus y
condiciones de amplificación.
Tabla 15. Secuencia nucleotídica de cebadores y condiciones de amplificación empleados para la detección de
genes relacionados con la resistencia a antibióticos.
Tabla 16. Secuencia nucleotídica de cebadores y condiciones de amplificación empleados para la
caracterización de la resistencia a trimetoprim y el entorno del gen dfrK.
Tabla 17. Secuencia nucleotídica de cebadores y condiciones de amplificación empleados para la detección de
genes asociados a la producción de bacteriocinas.
Tabla 18. Secuencia nucleotídica de cebadores y condiciones de amplificación empleados para amplificación
del rRNA 23S.
Tabla 19. Resumen del estudio Gram, test catalasa, gen especie-específico e identificación de las cepas de
Enterococcus.
Tabla 20. Halos de inhibición (expresados en mm) producidos por los distintos antibióticos testados en las
cepas de Enterococcus y estudio de su resistencia según los puntos de corte asignados por el CLSI
(2015).
Tabla 21. Resumen del estudio fenotípico y genotípico de las cepas de Enterococcus estudiadas.
2
LISTA DE FIGURAS
Fig. 1. Evolución de la resistencia antibiótica a través de la selección natural (modificada de:
University of California Museum of Paleontology's - Understanding Evolution
http://evolution.berkeley.edu).
Fig. 2. Relación filogenética de las distintas especies de Enterococcus (López, M., Tesis 2011).
Fig. 3. Mecanismos de transferencia genética horizontal (Essential Biochemistry, Chapter 20;
http://www.wiley.com).
Fig. 4. Mecanismos de acción y de resistencia a los antibióticos (Mulvey, M.R., 2009).
Fig. 5. Esquema de los distintos operones van (López M., Tesis 2011).
Fig. 6. Rutas enzimáticas de desactivación de un antibiótico aminoglucósido, acetilación por acetil-
CoA, fosforilación mediada por ATP y adenilación mediada por ATP (Walsh, 2003).
Fig. 7. Cultivo en estrías de una cepa de Enterococcus y obtención de colonias aisladas.
Fig. 8. Procedimiento de la tinción Gram
(https://compendiomicrobiologia.wordpress.com/tag/endocarditis).
Fig. 9. Diferencias estructurales de la pared bacteriana entre bacterias Gram positivas (izq) y Gram
negativas (dcha) (modificación de: http://www.generasibiologi.com/2012/09/dinding-sel-
bakteri.html).
Fig. 10. Observación microscópica de las tinciones de bacterias Gram positivas y negativas
(https://www.studyblue.com/notes/note/n/staining-/deck/14490231).
Fig. 11. Representación de la estructura cuaternaria de la catalasa
(http://maestradelia.files.wordpress.com/2012/10/474px-catalase_structure-by-vossman.png).
Fig. 12. Reacción catalítica de la catalasa (Modificada de: McFaddin, J.F., 2003)
Fig. 13. Reacción negativa (A) y positiva (B) de la catalasa
(http://aprendeenlinea.udea.edu.co/lms/moodle/file.php/743/Bacteriologia/Pruebas_de_labora
torio/Prueba_de_catalasa.html)
Fig. 14. Reacción de hidrolisis de la esculina (McFaddin, J.F., 2003)
Fig. 15. Reacción y formación del complejo esculetina-Fe3+ en placa (Modificada de: McFaddin, J.F.,
2003 ; https://commons.wikimedia.org/wiki/File:Bile_esculin_agar.jpg)
Fig. 16. Antibiograma de una cepa de Enterococcus.
Fig. 17. Fases de la amplificación por PCR (Andy Vierstraete, 1999).
Fig. 18. Termociclador T3 Biometra.
Fig. 19. Resultados para la PCR de identificación para Enterococcus casseliflavus.
Fig. 20. Resultados para la PCR del gen dfrK.
Fig. 21. Distribución de especies en la colección de Enterococcus estudiada.
Fig. 22. Comparación de las cepas según el antibiótico al que muestran resistencia.
Fig. 23. Potenciales vías de propagación de bacterias resistentes a antibióticos de animales a humanos
(http://www.gao.gov).
3
ABREVIATURAS
AAC Acetiltransferasa
Ala Alanina
AMP Ampicilina
ANT Nucleotidiltransferasa
APH Fosfotransferasa
ATP Adenosín trifosfato
BEA Bilis Esculina Agar
BHI Brain Heart Infusion
ºC Grado centígrado
CHL Cloranfenicol
CIP Ciprofloxacina
CLSI Clinical and Laboratory Standars Institute
dATP Desoxiadenosina trifosfato
dCTP Desoxicitidina trifosfato
dGTP Desoxiguanosina trifosfato
DNA Ácido desoxirribonucleico
dNTPs Desoxinucleotidos trifosfato
dTTP Desoxitimidina trifosfato
DHFR Dihidrofolato reductasa
EGM Elementos Genéticos Móviles
ERV Enterococos resistentes a vancomicina
ERY Eritromicina
g Gramo
GEH Gentamicina (alta carga)
KAH Kanamicina (alta carga)
l Litro
Lac Lactato
LZD Linezolid
M Molar (mol/l)
MHA Müeller-Hinton Agar
min Minuto
ml Mililitro
4
mm Milímetro
MLSb Macrólidos-lincosamidas-estreptograminas B
mM Milimolar
p/V Relación peso/volumen
pb Pares de bases
PBPs Penicillin binding protein (proteínas de unión a penicilina)
PCR Polymerase chain reaction (reacción en cadena de la polimerasa)
pH Potencial de hidrógeno
R Resistente
RAN Resistencia de alto nivel
r.p.m. Revoluciones por minuto
rRNA Ácido ribonucleico ribosómico
S Susceptible
seg Segundos
Ser Serina
SI Secuencia de Inserción
STH Estreptomicina (alta carga)
SXT Trimetoprim-sulfametoxazol
TBE Tris/Ácido Bórico/EDTA
TE Tris/EDTA
TEI Teicoplanina
TET Tetraciclina
Tn Transposón
UFC Unidades Formadoras de Colonias
μg Microgramo
μl Microlitro
μM Micromolar
V Voltios
VAN Vancomicina
INTRODUCCIÓN
5
1. INTRODUCCIÓN
1.1 DESCUBRIMIENTO DE LOS ANTIBIÓTICOS Y PROBLEMÁTICA
DE LA RESISTENCIA A LOS MISMOS.
Alexander Fleming (1881-1955) en el año 1928 descubrió de manera fortuita la penicilina,
producida por el hongo Penicillium notatum, el cual contaminó unas placas en las que estaba
cultivando la bacteria Staphylococcus aureus, inhibiendo su crecimiento. Dicha sustancia fue el
primer compuesto natural descubierto con actividad antibacteriana. En 1939, tras este
descubrimiento, la penicilina comenzó a producirse a nivel industrial y a utilizarse a nivel
clínico lo cual supuso el impulso en busca de nuevos fármacos con actividad antibiótica.
Dicho uso a nivel clínico, supuso un importante descenso de la mortalidad a nivel mundial. Sin
embargo, transcurrido poco tiempo, las bacterias comenzaron a adquirir y diseminar diferentes
mecanismos de resistencia a los antibióticos.
Esta diseminación de mecanismos de resistencia no es única del ámbito hospitalario, ya que el
uso y abuso de antibióticos en animales (muy especialmente en animales de consumo) ha
supuesto en los últimos años un incremento del número de bacterias resistentes en dichos
animales, en los alimentos y en su entorno. Estas bacterias resistentes pueden diseminarse en el
ambiente a través del aire, del agua, hasta llegar a cultivos cercanos a los animales y de esta
manera puedan incorporarse en la cadena alimentaria, hasta llegar al ser humano dificultando el
tratamiento de las infecciones en las que se ven implicadas (Torres et al., 2006; Torres et al.,
2010; López et al., 2010).
El alarmante incremento de la resistencia bacteriana a los antibióticos es, sin duda, uno de los
grandes problemas actuales de salud pública ya que estos compuestos constituyen una de las
principales herramientas para controlar y tratar las infecciones bacterianas, tanto en medicina
humana como en veterinaria.
Figura 1. Evolución de la resistencia antibiótica a través de la selección natural (modificada de: University of
California Museum of Paleontology's - Understanding Evolution http://evolution.berkeley.edu).
Bacteria normal
Bacteria resistente
Bacteria muerta
Un grupo de bacterias que incluye una variedad resistente…
….son expuestas a un antibiótico. La mayoría de las bacterias normales mueren.
La bacteria resistente se multiplica y se vuelve más común.
Finalmente, toda la infección se convierte en una cepa resistente.
INTRODUCCIÓN
6
1.2 EL GÉNERO Enterococcus.
1.2.1 Características generales, filogenia y taxonomía
Los enterococos son cocos Gram positivos, que se pueden encontrar aislados, formando parejas
o cadenas cortas. Son anaerobios facultativos y crecen a una temperatura óptima de 35ºC,
aunque la mayoría son capaces de crecer en un rango de temperatura de 10 a 45ºC. Pueden
crecer a pH 9,6 y en presencia de concentraciones de hasta 6,5% de cloruro sódico. Son
quimiorganotrofos, y presentan un metabolismo fermentativo, siendo el ácido láctico el
producto final mayoritario de la fermentación de la glucosa. Como características bioquímicas
utilizadas para su identificación destaca que hidrolizan la esculina y son catalasa negativos.
El término enterococo fue utilizado por Thiercelin en 1899 para describir unas bacterias con
forma de cocos, Gram-positivas, aisladas del intestino humano. Posteriormente se renombraron,
debido a su hábitat en intestino, como Streptococcus faecalis por Andrewer y Hoder en 1906.
Sherman en 1937 clasificó el género Streptococcus en 4 grupos: pyogenes, viridans, lactis y
enterococos. En 1984, se produjo la separación del género bacteriano Enterococcus del género
Streptococcus, cuando Schleifer y Klipper-Bälz propusieron la inclusión de las especies S.
faecium y S. faecalis en un nuevo grupo al que se transfirieron más tarde las especies E. avium,
E. casseliflavus, E. durans, E. gallinarum y E. malodoratus, así como otras especies descritas
posteriormente: E. hirae, E. mundtii, E. pseudoavium, E. raffinosus y E. solitarius (Collin et al.,
1984).
Figura 2. Relación filogenética de las distintas especies de Enterococcus (López, Tesis 2011).
INTRODUCCIÓN
7
1.2.2 Hábitat
Los enterococos están ampliamente distribuidos en la naturaleza. Colonizan el tracto intestinal
del hombre y de otros mamíferos, pero también se encuentran frecuentemente en alimentos,
vegetales, agua, suelo, insectos, etc. (Deibel & Siliker, 1963).Los enterococos forman parte de
la microbiota gastrointestinal aunque también pueden colonizar la cavidad bucal o el tracto
genital. A partir de estas localizaciones puede colonizar otros tejidos donde actúa como
patógeno oportunista como es el caso de tejidos blandos, cavidad peritoneal, sistema nervioso
central, flujo sanguíneo o tejido cardíaco, entre otros.
La presencia de enterococos en alimentos es común. La colonización del tracto gastrointestinal
de animales puede llevar a la contaminación de la carne, a través de la contaminación de las
plantas de elaboración y procesos de contaminación cruzada. Los enterococos son también
aislados en aguas y suelos, posiblemente como resultado de la diseminación proveniente de
fuentes fecales, y su capacidad para sobrevivir en diferentes nichos ecológicos (Robredo et al.,
2000).
1.3 ELEMENTOS GENÉTICOS DE ADQUISICIÓN Y DISEMINACIÓN
DE GENES DE RESISTENCIA A ANTIBIÓTICOS.
Existen dos tipos de resistencia a los antibióticos (Mulvey, 2009):
Intrínseca: Este tipo de resistencia la poseen de forma innata todos los microorganismos
de un determinado grupo, género o especie bacteriana, y casi siempre son de
localización cromosómica.
Adquirida: La resistencia antibiótica surge a causa de una mutación en sus propios
genes o gracias a la adquisición de nuevos genes que otorgan una resistencia no poseída
previamente.
Existen diferentes elementos genéticos móviles (EGM) que permiten la adquisición y
diseminación de genes de resistencia a los antibióticos, entre los que cabe destacar los
siguientes:
Plásmidos
Son moléculas de DNA de doble cadena y cíclicas, capaces de replicarse de forma autónoma,
que generalmente no poseen genes esenciales para la bacteria sino genes que aportan ventajas
adaptativas como pueden ser genes de resistencia a ciertos antibióticos.
Transposones y Secuencias de inserción
Son secuencias de DNA, generalmente más pequeñas que un plásmido, que poseen la
capacidad de moverse dentro de la misma molécula de DNA o de incorporarse a otra molécula
de DNA diferente. Esta movilización puede ocurrir entre dos plásmidos o entre un plásmido y el
cromosoma.
INTRODUCCIÓN
8
Integrones
Los integrones son unidades o fragmentos genéticos que se caracterizan por su capacidad de
captación de genes denominados genes cassette, los cuales contienen un gen y un lugar de
recombinación genética.
Cabe resaltar la transferencia genética horizontal como el mecanismo mayoritario para adquirir
nuevos genes de resistencia. Ésta se produce entre bacterias de un mismo entorno, bien sean del
mismo género como entre bacterias muy diferentes (no siendo una descendiente de la otra). Los
posibles mecanismos se explican a continuación (Tenover, 2006):
Conjugación: Consiste en la transmisión de plásmidos y transposones entre dos
bacterias (dadora-receptora) a través de los pili sexuales. Se puede producir entre
bacterias presentes en ecosistemas complejos como el intestinal.
Transformación: Consiste en la introducción, absorción y expresión del material
genético (DNA o RNA) del entorno, que puede quedar libre como consecuencia de lisis
bacteriana.
Transducción: Consiste en la transferencia de DNA exógeno a una bacteria receptora
mediante un bacteriófago (virus bacteriano).
Figura 3. Mecanismos de transferencia genética horizontal
(Essential Biochemistry, Chapter 20; http://www.wiley.com).
INTRODUCCIÓN
9
1.4 RESISTENCIA A ANTIBIÓTICOS EN Enterococcus.
Figura 4. Mecanismos de acción y de resistencia a los antibióticos (Mulvey, 2009).
1.4.1 Resistencia a Glucopéptidos.
Los glucopéptidos inhiben la síntesis de la pared celular al unirse a los precursores
pentapeptídicos del peptidoglicano, de forma que la pared bacteriana pierde su integridad
estructural y se produce la muerte bacteriana.
El mecanismo bioquímico de resistencia a los glucopéptidos en enterococos se basa en la
modificación de la diana: el pentapéptido de la pared celular terminado en D-Ala-D-Ala. El
pentapéptido modificado puede contener D-Ala-D-lactato (D-Lac) o bien D-Ala-D-serina (D-
Ser), poseyendo una afinidad 1.000 veces menor o 7 veces menor por la vancomicina,
respectivamente.
Se han descrito 8 operones distintos que intervienen en la resistencia adquirida a glucopéptidos
en enterococo denominados vanA, vanB, vanD, vanE, vanG, vanL, vanM y vanN, y uno que
interviene en la resistencia intrínseca, denominado vanC, con las variantes vanC-1, vanC-2 y
vanC-3, que es una característica intrínseca de algunas especies de enterococos (Enterococcus
gallinarum, Enterococcus casseliflavus y Enterococcus flavescens, respectivamente) (Torres &
Cercenado, 2010; Lozano et al., 2015a).
INTRODUCCIÓN
10
Figura 5. Esquema de los distintos operones van (López, Tesis 2011)
En los tipos VanA, VanB, VanD y VanM, el precursor alternativo es D-Ala-D-Lac, mientras
que en los tipos VanC, VanE, VanG, VanL y VanN, el precursor alternativo es D-Ala-D-Ser.
De los mecanismos de resistencia a vancomicina adquiridos, los que más relevancia y más
frecuentemente se encuentran a nivel clínico son los codificados por los genes vanA y vanB.
(López et al., 2012a; López et al., 2012b).
Operón vanA
El operón vanA codifica resistencia inducible de alto nivel a vancomicina y a teicoplanina y se
adquiere generalmente a través del transposón Tn1546. Este operón contiene 7 genes: tres
(vanH, vanA, vanX) responsables de la resistencia, dos (vanR y vanS) son los responsables de la
regulación de la resistencia, y uno (vanY) es el responsable de eliminar los precursores normales
de la pared celular. Se desconoce la función de un séptimo gen (vanZ) (tabla 1) (Murray, 1997).
INTRODUCCIÓN
11
Tabla 1. Función y proteína codificada por cada uno de los genes del operón vanA.
Gen Proteína Función
vanH Deshidrogenasa Convierte piruvato a lactato.
vanA Ligasa Liga alanina a lactato formando el D-Ala-D-Lac
vanX Dipeptidasa Rompe el D-Ala-D-Ala que pudiera formarse
vanR Regulador de respuesta Activa la vía de la transcripción de la resistencia
vanS Proteinquinasa Sensor de presencia de glucopéptido que fosforila a vanR
vanY Carboxipeptidasa Hidroliza el dipéptido D-Ala-D-Ala de cualquier pentapéptido
precursor
vanZ Desconocida Desconocida. ¿¿Resistencia a teicoplanina??
Se han hallado estructuras de Tn1546 idénticas en cepas de origen animal y humano (Jensen et
al., 1998; Woodford et al., 1998; López et al., 2010).
Operón van B
El operón vanB produce resistencia inducible de bajo o alto nivel a la vancomicina, pero no a
teicoplanina. Tanto el mecanismo de resistencia como la estructuración del operón, es similar a
la del vanA. En base a las diferencias en la secuencia del gen que codifica la ligasa, el clúster
génico vanB puede corresponder a tres subtipos: vanB1, vanB2 y vanB3 (Cetinkaya et al.,
2000).
Este operón suele estar presente en el cromosoma, aunque también se puede diseminar por
plásmidos (Zheng et al., 2009) o transposones conjugativos (Dahl et al., 2003). La diseminación
de esta resistencia se produce por la transferencia de elementos genéticos grandes que contienen
el transposón Tn1547. La transmisión de la resistencia de tipo vanB junto con la resistencia a
ampicilina se ha encontrado en el transposón Tn5382.
Se está observando en los últimos años un incremento en la detección de enterococos vanB2 a
nivel hospitalario (López et al., 2012) y asimismo se está evidenciando también su presencia en
el ámbito animal (Torres et al., 2003; López et al., 2009; Lozano et al., 2015a).
Operón vanC
El operón vanC es una propiedad intrínseca de determinadas especies de enterococos produce
bajo nivel de resistencia a la vancomicina y sensibilidad a teicoplanina. Como se indicó
anteriormente, los genes que codifican el fenotipo de resistencia VanC son endógenos en E.
gallinarum (vanC-1), E. casseliflavus (vanC-2) y E. flavescens (vanC-3).
INTRODUCCIÓN
12
La disposición de estos genes es similar en las 3 especies, pero cada gen es específico de
especie. El tipo de resistencia VanC es de codificación cromosómica y se expresa
constitutivamente. Se diferencia de los vanA y vanB en la situación de los genes reguladores en
el operón (Courvalin et al., 2006; Lozano et al., 2015a; Lozano et al., 2015b).
Tabla 2. Estructura química de los antibióticos glucopeptídicos.
Glucopéptidos Estructura
Vancomicina
Teicoplanina
Las características de los distintos fenotipos de resistencia a glucopéptidos de los enterococos se
muestran en la tabla 3.
INTRODUCCIÓN
13
Tabla 3. Características de los diferentes genotipos de resistencia a vancomicina.
Fenotipo Especies Sensibilidada Genes ligasa (producto)
Tipo de resistencia
Expresión de la resistencia
Resistencia transferible (Elemento asociado)
Localización
Van Tei
Van A E. faecium, E. faecalis, E. avium, E. durans, E. gallinarum, E. casseliflavus, E. mundtii, E. hirae, E. raffinosus
R R Van A (D-Lac)
Adquirida Inducible (Van, Tei)
SI (Tn1546) Plásmido (cromosoma)
Van B E. faecium, E. faecalis r-R S Van A (D-Lac)
Adquirida Inducible (Van)
SI (Tn1547-Tn5382) Plásmido (cromosoma)
Van C E. gallinarum (Van C-1), E. casseliflavus (Van C-2/3),
R S Van C-1 (D-Ser)
Van C-2/3 (D-Ser)
Intrínseca Inducible o constitutiva
NO Cromosoma
Van D E. faecium, E. faecalis R S Van D (D-Lac)
Adquirida Constitutiva NO Plásmido (cromosoma)
Van E E. faecalis R S Van E (D-Ser)
Adquirida Inducible (Van)
NO Cromosoma
Van G E. faecalis R S Van G (D-Ser)
Adquirida Inducible Cromosoma-cromosoma ¿?
Van L E. faecalis R S Van L (D-Ser)
Adquirida Inducible NO Cromosoma
Van N E. faecium R S Van N (D-Ser)
Adquirida Constitutiva SI Plásmido (cromosoma)
Van M E. faecium R R Van M (D-Lac)
Adquirida ¿? SI
a: Resistencia a glicopéptidos ; R: alto nivel; r: bajo nivel; S: susceptible
INTRODUCCIÓN
14
1.4.2 Resistencia a β-lactámicos
Los enterococos poseen cierta resistencia natural intrínseca a los β-lactámicos, debido a la baja
afinidad de sus proteínas de unión a penicilinas (PBPs o penicillin-binding proteins).
Dentro de estos β-lactámicos, las penicilinas tienen mayor actividad frente a los enterococos y,
en menor medida, las cefalosporinas, puesto que, para éstas, poseen un nivel intrínseco de
resistencia tan elevado que no son aptas para el uso en pacientes con infecciones por
enterococos. (Torres & Cercenado, 2010; Zhou et al., 2008)
La resistencia de alto nivel (RAN) a penicilinas es debida mayoritariamente a la
hiperproducción de la PBP5, que posee una baja afinidad natural por las penicilinas y la
capacidad para sustituir las funciones de las PBP sensibles a β-lactámicos, pero también es
debida a mutaciones en el gen pbp5, por lo que las cepas no presentan sustituciones de
aminoácidos cerca del sitio activo de las PBP que implican una todavía menor afinidad por las
penicilinas y por tanto son las responsables del aumento de la resistencia. (Klibi et al., 2008;
Fontana et al., 1984)
La síntesis de β-lactamasas como mecanismo de resistencia frente a penicilinas y
cefalosporinas, producen la inhibición de dichos antibióticos por pérdida de su estructura activa.
Tabla 4. Estructura química de los antibióticos β-lactámicos.
1.4.3 Resistencia a Aminoglucósidos.
Los enterococos poseen intrínsecamente una resistencia de bajo nivel a los aminoglucósidos que
es debida a un deficiente transporte del antibiótico aminoglucosídico al interior de la bacteria.
Sin embargo, con la asociación de un antibiótico que actúe en la pared celular, se produce un
β-lactámicos Estructura
Penicilinas
Ampicilina
Cefalosporinas
Cefalexina
INTRODUCCIÓN
15
efecto sinérgico que aumenta la captación del aminoglucósido (Murray, 1990; Torres &
Cercenado, 2010).
Esta sinergia bactericida es capaz de ser evitada mediante la adquisición de genes que codifican
la producción de enzimas que inhiben la actividad aminoglucosídica llegando a producirse una
RAN. Estas enzimas son fosfotransferasas (APH), acetiltransferasas (AAC) o
nucleotidiltransferasas (ANT) (Gavaldá et al., 1999; del Campo et al., 2005).
Figura 6. Rutas enzimáticas de inactivación de un antibiótico aminoglucósido, acetilación por
acetil-CoA, fosforilación mediada por ATP y adenilación mediada por ATP (Walsh, 2003).
Las APH inactivan los aminoglucósidos, de forma que se transfiere el γ-fosfato del ATP a un
grupo hidroxilo en el aminoglucósido, las AAC utilizan la acetil-coenzima A como dador y
acetilan un grupo amino, y las ANT utilizan el ATP como dador y adenilan un grupo hidroxilo
en el aminoglucósido.
La resistencia a estreptomicina en los enterococos se produce por modificaciones en la
subunidad ribosómica 30S que conlleva una disminución de la unión de la estreptomicina. No se
ha documentado resistencia a aminoglucósidos en enterococos asociada con cambios
ribosómicos, excepto para la estreptomicina. La RAN a estreptomicina implica resistencia
solamente a ésta, mientras que la RAN a gentamicina conlleva RAN al resto de los
aminoglucósidos a excepción de la estreptomicina.
INTRODUCCIÓN
16
Tabla 5. Estructura química de los antibióticos aminoglucosídicos.
1.4.4 Resistencia a Macrolidos, lincosaminas y estreptograminas (MLS)
Puesto que los enterococos son intrínsecamente resistentes a las lincosamidas (como la
clindamicina) y frecuentemente a los macrólidos, no se utilizan para el tratamiento de las
infecciones enterocócicas.
Uno de los mecanismos de resistencia más frecuentes frente a macrólidos (eritromicina,
azitromicina y claritromicina), que también está presente frente a lincosamidas y
estreptograminas B, es la metilación, por medio de una enzima, de un residuo de adenina en la
subunidad 23S del RNA ribosómico, reduciendo su unión al ribosoma. Este mecanismo es
producido por la presencia del gen erm(B) y por el gen erm(A) en menor medida (Portillo et al.,
2000). Este fenotipo se denomina MLSb (macrólidos-lincosamidas-estreptograminas B) y
produce RAN a todos los macrólidos.
Aminoglucósidos Estructura
Estreptomicina
Gentamicina
Kanamicina
INTRODUCCIÓN
17
Tabla 6. Estructura química de los antibióticos Macrolidos, lincosaminas y estreptograminas.
1.4.5 Resistencia a Quinolonas.
La actividad antimicrobiana de las quinolonas se basa en la inhibición de la topoisomerasa IV y
de la DNA girasa, codificadas por los genes parC y gyrA respectivamente, esenciales para la
replicación del DNA.
Los mecanismos de resistencias frente a estas quinolonas (mayoritariamente fluoroquinolonas)
se basan en la modificación de sus dianas y en la disminución de permeabilidad de la membrana
por pérdida de porinas (Chow & Kak, 2002; López et al., 2011).
MLS Estructura
Macrólidos
Eritromicina
Lincosaminas
Clindamicina
Estreptograminas
Quinupristina
INTRODUCCIÓN
18
Tabla 7. Estructura química de los antibióticos del grupo de las quinolonas.
1.4.6 Resistencia a Oxazolidinonas.
Esta resistencia, debida la mutación G2576T en la subunidad 23S del rRNA, es poco frecuente y
ha sido descrita en E. faecium y E. faecalis.
En la mayoría de los casos descritos era procedente de pacientes que recibieron linezolid
durante largos periodos de tiempo y fueron seleccionados en presencia del antibiótico, aunque
también se ha descrito la diseminación clonal.
También existen cepas de enterococo que poseen un mecanismo de resistencia transferible a
linezolid, que es expresado por el gen cfr, el cual codifica una metilasa ribosómica (Meka &
Gold, 2004; Cercenado et al, 2010).
Tabla 8. Estructura química de los antibióticos oxazolidinónicos.
Oxazolidinonas Estructura
Linezolid
Torezolid
Quinolonas Estructura
Ciprofloxacina
Ácido Nalidíxico
INTRODUCCIÓN
19
1.4.7 Resistencia a Cloranfenicol y Tetraciclinas.
El cloranfenicol inhibe la síntesis de proteínas a nivel de la subunidad ribosómica 50S. El
mecanismo de resistencia a cloranfenicol se basa en la producción de acetiltransferasas
codificadas por genes cat.
Respecto a tetraciclinas, su mecanismo de resistencia se basa en modificaciones en la diana
codificadas por los genes tet, siendo tet(M) y tet (L) los más frecuentes. (Bentorcha et al., 1991;
Klare et al., 2003).
Tabla 9. Estructura química de Cloranfenicol y Tetraciclina.
Cloranfenicol
Tetraciclina
1.4.8 Resistencia a trimetoprim
El trimetoprim es un compuesto bacteriostático (que provoca la inhibición del crecimiento
microbiano, pero no su muerte) que inhibe la actividad de la enzima dihidrofolato reductasa
(DHFR), quedando la bacteria deficiente en ácido di- y tetrahidrofólico, cofactor esencial en la
biosíntesis de purinas, y por tanto de DNA (Wisell et al., 2008). Habitualmente, se combina con
sulfamidas (sulfametoxazol) ya que presenta una actividad sinérgica
Su eficacia frente a enterococos es controvertida, ya que poseen la capacidad de incorporar
folatos del exterior (di- y tetrahidrofolato) (Frosolono et al., 1991; Wisell et al., 2008). El
mecanismo de resistencia más frecuente frente a este antibiótico son las mutaciones en los genes
dfr, los cuales codifican las DHFR, produciéndose enzimas DHFR resistentes al trimetoprim
(Huovinen, 2001; López et al., 2012c).
Los genes dfr descritos en bacterias gram positivas son dfrA (Rouch et al., 1989), dfrD
(Charpentier & Courvalin, 1997) (Dale et al., 1995), dfrG, dfrF (Cattoir et al., 2009) y dfrK
(Kadlec & Schwarz, 2009 ; Kadlec & Schwarz, 2010; López et al., 2012c).
INTRODUCCIÓN
20
Tabla 10. Estructura química de trimetoprim y sulfametoxazol.
Bacteriostáticos Estructura
Trimetoprim
Sulfametoxazol
OBJETIVOS
21
2. OBJETIVOS
Objetivo general
Utilizar y aplicar diferentes técnicas microbiológicas, bioquímicas y de la biología molecular para el
estudio de la resistencia a los antibióticos en una colección de cepas de Enterococcus de origen
animal.
Objetivos específicos
1) Identificar por diferentes técnicas una colección de cepas de Enterococcus previamente
aisladas de muestras fecales de ganado vacuno.
2) Estudiar en dicha colección el fenotipo de resistencia a diferentes clases de antibióticos.
3) Determinar los mecanismos de resistencia a antibióticos en aquellas cepas que mostraron un
fenotipo resistente.
.
MATERIAL Y MÉTODO
22
3. MATERIAL Y MÉTODO
3.1 CEPAS INCLUÍDAS EN EL ESTUDIO
Se partió de una colección de 36 aislados bacterianos, previamente obtenidos por el grupo de
investigación donde se ha desarrollado este trabajo, y que fueron obtenidos de la microbiota intestinal
de vacas de una granja en explotación extensiva en La Rioja. Dichos aislados bacterianos presentaban
la morfología compatible con ser enterococo, aunque no habían sido identificados previamente y se
mantenían conservados en congelación (-80ºC). En este trabajo de fin de grado, se ha partido de esta
colección bacteriana para llevar a cabo su identificación por técnicas microbiológicas, bioquímicas y
de la biología molecular y caracterización en cuanto a la resistencia a los antibióticos. Para ello, en
primer lugar se realizó un cultivo y reaislamiento en estria de los cultivos bacterianos conservados en
congelación para verificar que se encontraban en cultivo puro y de esta manera obtener a través de
varios pases consecutivos, colonias aisladas a partir de las cuales poder realizar las distintas pruebas de
caracterización.
Figura 7. Cultivo en estrías de una cepa de Enterococcus y obtención de colonias aisladas.
3.2 MEDIOS Y CONDICIONES DE CULTIVO
3.2.1 Medios de cultivo
Infusión de cerebro y corazón Agar (BHI) (Conda): utilizado para el crecimiento de
enterococos. Composición (g/l):
Cerebro de ternera 7,5
Corazón de vaca 10,0
Bacto proteasa peptona 10,0
Bacto dextrosa 2,0
Cloruro sódico 5,0
Fosfato disódico 2,5
Agar 15,0
MATERIAL Y MÉTODO
23
Muller-Hinton Agar (MHA) (Difco): utilizado para los estudios de sensibilidad a antibióticos.
Composición (g/l):
Infusión de ternera 2,0
Bacto casaminoácidos 17,5
Almidón 1,5
Agar 15,0
Bilis Esculina Agar (BEA) (Difco): utilizado para el aislamiento y presunta identificación de
enterococos. Composición (g/l):
Bilis 40,0
Extracto de carne 3,0
Peptona de caseína 5,0
Esculina 1,0
Citrato Férrico 0,5
Agar 15,0
Leche deshidratada (Difco): utilizada para congelar cepas para su conservación. 100% leche
descremada.
3.2.2 Condiciones de cultivo
Todos los medios se prepararon siguiendo las recomendaciones del fabricante. La esterilización se
llevó a cabo en autoclave. Los cultivos se realizaron, en general, a 37ºC durante 24 horas.
3.2.3 Conservación de las cepas
Todas las cepas se conservaron en leche descremada estéril al 10% (Difco) y congeladas a -80ºC.
3.3 TINCIÓN GRAM
La tinción de Gram es un tipo de tinción diferencial empleada en microbiología para la visualización y
diferenciación de bacterias. Debe su nombre al bacteriólogo danés Christian Gram, que desarrolló la
técnica en 1884. Se utiliza tanto para poder referirse a la morfología celular bacteriana como para
poder realizar una primera aproximación a la diferenciación bacteriana, considerándose bacteria Gram
positiva a las bacterias que se visualizan de color violeta y bacteria Gram negativa a las que se
visualizan de color rosa.
MATERIAL Y MÉTODO
24
Para su realización partimos del frotis del microorganismo preparado y fijado y seguimos los
siguientes pasos:
1. Cubrir con cristal violeta y mantener durante 1 minuto.
2. Lavar con agua del grifo.
3. Cubrir con lugol y mantener 30 segundos.
4. Lavar con agua.
5. Decolorar con etanol-acetona.
6. Lavar con agua.
7. Cubrir con safranina y mantener 1 minuto.
8. Lavar con agua, secar al aire y observar al microscopio con aceite de inmersión y el objetivo de 100X.
Figura 8. Procedimiento de la tinción Gram
(https://compendiomicrobiologia.wordpress.com/tag/endocarditis).
Los fundamentos de esta técnica se basan en las diferencias entre las paredes celulares de las bacterias.
La pared celular de las bacterias Gram positivas posee una gruesa capa de peptidoglicano, además de
dos clases de ácidos teicoicos: el ácido lipoteicoico y el ácido teicoico (Bartholomew, 1952).
Por el contrario, la capa de peptidoglicano de las Gram negativas es delgada, y se encuentra unida, por
medio de lipoproteínas, a una segunda membrana plasmática exterior (de composición distinta a la
interna). La membrana exterior está hecha de proteínas, fosfolípidos y lipopolisacáridos.
Por lo tanto, ambos tipos de bacterias se tiñen diferencialmente debido a estas diferencias constitutivas
de su pared. La clave es el peptidoglicano, ya que es el material que confiere su rigidez a la pared
celular bacteriana, y las Gram positivas lo poseen en mucha mayor proporción que las Gram negativas.
MATERIAL Y MÉTODO
25
Figura 9. Diferencias estructurales de la pared bacteriana entre bacterias Gram positivas (izq) y Gram negativas
(dcha) (modificación de: http://www.generasibiologi.com/2012/09/dinding-sel-bakteri.html)
La diferencia que se observa en la resistencia a la decoloración, se debe a que la membrana externa de
las Gram negativas es soluble en solventes orgánicos. La capa de peptidoglicano que posee es
demasiado delgada como para poder retener el complejo de cristal violeta/yodo que se forma
previamente, y por lo tanto este complejo se escapa, perdiéndose la coloración azul-violácea.
Por el contrario, las Gram positivas, al poseer una pared celular más resistente y con mayor
proporción de peptidoglicanos, no son susceptibles a la acción del solvente orgánico, por lo que éste
actúa deshidratando los poros cerrándolos, lo que impide que pueda escaparse el complejo cristal
violeta/yodo, y manteniendo la coloración azul-violácea.
Figura 10. Observación microscópica de las tinciones de bacterias Gram positivas y negativas.
(https://www.studyblue.com/notes/note/n/staining-/deck/14490231)
Tabla 11. Estructura química del peptidoglicano, del colorante cristal violeta y del colorante safranina.
Estructura del peptidoglicano Estructura del cristal violeta Estructura de la safranina
MATERIAL Y MÉTODO
26
3.4 TEST CATALASA
La catalasa es una enzima que cataliza la descomposición del peróxido de hidrógeno (H202) en
oxígeno y agua.
2 H2O2 (l) 2 H2O (l) + O2(g)
Esta enzima es similar a la estructura de la hemoglobina. El género Enterococcus, al contrario que la
mayoría de las bacterias aerobias y anaerobias facultativas, no posee la enzima.
Figura 11 . Representación de la estructura cuaternaria de la catalasa
(http://maestradelia.files.wordpress.com/2012/10/474px-catalase_structure-by-vossman.png).
La reacción química se produce en dos etapas:
Figura 12. Reacción catalítica de la catalasa (Modificada de: McFaddin, J.F., 2003).
La base de esta prueba es demostrar la presencia de la enzima catalasa, colocando 2 o 3 gotas al cultivo, resultando positivo si en la colonia hay efervescencia debida a la liberación de O2(g).
Figura 13. Reacción negativa (A) y positiva (B) de la catalasa
(http://aprendeenlinea.udea.edu.co/lms/moodle/file.php/743/Bacteriologia/Pruebas_de_laboratorio/Prueba_de_catalasa.html).
MATERIAL Y MÉTODO
27
3.5 BILIS ESCULINA
Esta prueba se realiza para diferenciar entre Enterococcus y Streptococcus mediante su cultivo en
BEA, ya que las bacterias del género Enterococcus son capaces de crecer en presencia de un 4% de
bilis y, como ya se ha mencionado anteriormente en la introducción, son capaces de hidrolizar la
esculina para formar glucosa y esculetina.
Figura 14. Reacción de hidrolisis de la esculina (McFaddin, J.F., 2003).
La esculina generada se combina con iones de hierro formando un complejo de color negro
Figura 15. Reacción y formación del complejo esculetina-Fe3+ en placa (Modificada de: McFaddin, J.F., 2003 ; https://commons.wikimedia.org/wiki/File:Bile_esculin_agar.jpg).
3.6 ESTUDIO DE SENSIBILIDAD A ANTIBIÓTICOS POR EL MÉTODO DEL
ANTIBIOGRAMAS
Se recogieron una o dos colonias de un cultivo puro de 24 horas en BHI agar (Conda), y se realizó una
suspensión en 3ml de solución salina estéril (0,9% NaCl) hasta obtener una turbidez equivalente a 0,5
McFarland (que supone una concentración de bacterias de aproximadamente 1,5·108 UFC/ml).
Posteriormente, se llevó a cabo la inoculación en placa. Se introdujo un hisopo estéril de algodón en la
suspensión bacteriana, y se extendió, sobre la superficie de una placa de MH agar homogéneamente,
MATERIAL Y MÉTODO
28
colocándose seguidamente los discos de antibiótico, con una separación suficiente que permita
distinguir los halos posteriormente.
Figura 16. Antibiograma de una cepa de Enterococcus.
Las placas se incubaron a 37ºC durante 24 horas. En el caso del estudio de las resistencias de alto nivel
a kanamicina, los discos de antibiótico fueron preparados añadiendo a discos estériles (Difco) las
cantidades necesarias de antibióticos (120 μg/disco). Tras las 24 horas de incubación se midió el
diámetro del halo de inhibición producido y se interpretó el resultado de acuerdo con los criterios del
CLSI (2015).
Tabla 12. Carga de los discos de antibiótico empleados en antibiogramas y puntos de corte de los halos de inhibición según el CLSI (2015).
Antibiótico Carga por disco (μg)
Punto de corte del halo de inhibición (mm)
R I S
Vancomicina (VAN) 30 ≤14 15-16 ≥17
Teicoplanina (TEI) 30 ≤10 11-13 ≥14
Ampicilina (AMP) 10 ≤16 - ≥17
Eritromicina (ERY) 15 ≤13 14-22 ≥23
Tetraciclina (TET) 30 ≤14 15-18 ≥19
Ciprofloxacina (CIP) 5 ≤15 16-20 ≥21
Cloranfenicol (CHL) 30 ≤12 13-17 ≥18
Trimetoprim-sulfametoxazol (SXT)a 1,25 + 23,75 ≤21 22-49 ≥50
Gentamicina alta carga (GEH)a 120 6 7-9 ≥10
Estreptomicina alta carga (STH)a 300 6 7-9 ≥10
Kanamicina alta carga (KAH)a 120 6 7-9 ≥10
Linezolid 120 ≤20 21-22 ≥23 a Puntos de corte no definidos.
MATERIAL Y MÉTODO
29
3.7 EXTRACCIÓN DE DNA: Protocolo InstaGeneTM Purification Matrix.
Para la extracción del DNA en Enterococcus se utilizó el sistema InstaGene Matrix (BioRad), una
matriz que absorbe los productos de la lisis celular, que interfieren en la reacción de PCR, facilitando
la preparación de DNA válido para amplificación por PCR y permitiendo además eliminar los pasos
correspondientes a la extracción con fenol/cloroformo. El protocolo seguido fue el siguiente:
Se tomó una colonia de la bacteria crecida durante las 24 horas en medio sólido BHI (Difco), y se
inoculó en 1 ml de agua miliQ estéril. Se centrifugó 1 minuto a 12.000 r.p.m. y se eliminó el
sobrenadante. Se resuspendió el precipitado con 200 μl de InstaGene Matrix y se incubó durante 20
min. a 56ºC. Tras este periodo se vorteó y se introdujo en un baño a 100ºC durante 8 min. Se vorteó de
nuevo y se centrifugó a 12.000 r.p.m. durante 3 min. El sobrenadante se recogió en tubos limpios,
pudiendo ser utilizado para técnicas de PCR.
3.8 REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR).
La reacción en cadena de la polimerasa se define como una técnica que amplifica in vitro un
fragmento de DNA que suele corresponder a la expresión de un gen específico. (Mullis & Faloona.
1987)
Para ello, se deben seleccionar los cebadores (o también denominados primers) específicos que
delimitarán la región a amplificar y, con los cuales, la DNA polimerasa comenzará la réplica del DNA
mediante ciclos repetitivos. Del mismo modo, se precisa de la presencia de 4 desoxynucleótidos
(dNTPs): dATP, dGTP, dTTP y dCTP; y de unas condiciones buffer para que se lleve a cabo.
La ADN polimerasa utilizada es la llamada Taq-Polimerasa, la cual es aislada de la bacteria thermus
aquaticus, puesto que debe ser capaz de soportar elevadas temperaturas (Kaledin A.S. et al, 1980).
Los ciclos repetitivos constan de 3 etapas diferenciadas:
Desnaturalización.
Hibridación.
Enlongación.
Desnaturalización:
La mezcla de reacción se calienta aproximadamente a 95ºC, produciéndose que las hebras
complementarias se separen en un proceso de desnaturalización.
Las hebras obtenidas tras cada uno de los ciclos sirven de molde para las siguientes. El resultado final
de cada ciclo consiste en un fragmento de DNA de doble hebra determinado por la secuencia de los
oligonucleótidos cebadores y la distancia entre éstos.
MATERIAL Y MÉTODO
30
Hibridación:
Se reduce la temperatura a 55ºC produciéndose la unión de los cebadores (primers) al DNA en un
proceso denominado hibridación. Los enlaces resultantes son estables sólo si la cadena del cebador y
del segmento de DNA es complementaria.
Elongación:
Se aumenta la temperatura hasta 72ºC. Se alcanza la temperatura óptima de trabajo de la taq-
polimerasa y se favorece produce la unión de los dNTPs con la ayuda de los iones Mg2+, formando
complejos solubles con éstos.
Figura 17. Fases de la amplificación por PCR (Andy Vierstraete, 1999).
La técnica de PCR se utilizó para llevar a cabo la amplificación de genes de Enterococcus para su
identificación, y estudio de genes de resistencias o del gen codificante del rRNA. De manera general,
la mezcla de reacción de PCR se preparó en un volumen final de 25μl, utilizando los componentes
indicados en la Tabla 14.
MATERIAL Y MÉTODO
31
Tabla 13. Componentes de los reactivos utilizados en la técnica de PCR.
Componentes Concentración del
stock
Volumen por
tubo
Concentración final de
reacción
*Cebador forward 25μM 0.5μl 0,5μM
*Cebador reverse 25μM 0.5μl 0,5μM
Tampón de reacción NH4 (Bioline) 10X 2.5μl 1X
MgCl2 (Bioline) 50mM 0.75μl 1,5mM
dNTPs (Sigma-Aldrich) 2,5mM 0.5μl 0,5mM
BioTaq DNA polimerasa (Bioline) 5U/μl 0.15μl 1,5U
DNA --- 5μl ---
Agua miliQ estéril --- Hasta 25 μl ---
* Los cebadores fueron sintetizados por Sigma-Aldrich. A partir de un stock de 100μM, preparamos nuestro
stock de trabajo de 25μM.
En todos los casos se incluyó una muestra control positivo y una muestra control negativo. Las
reacciones de PCR se realizaron en los termocicladores siguientes: Perkin Elmer (GeneAmp PCR
System 2400, Applied Biosystems) y T3 y T3000 Thermocycler (Biometra). Las secuencias de los
cebadores, las condiciones de amplificación y los tamaños de los fragmentos de DNA amplificados en
cada caso se describen en las tablas 15-19.
Figura 18. Termociclador T3 Biometra.
MATERIAL Y MÉTODO
32
Tabla 14. Secuencia nucleotídica de cebadores empleados para la identificación de especies de Enterococcus y
condiciones de amplificación.
Primers (secuencia 5´→3´) Condiciones Referencia
(tamaño del amplicón)
ddlE. faecalis
F: ATCAAGTACAGTTAGTCT
R: ACGATTCAAAGCTAACTG
94ºC 2 min 1 ciclo
94ºC 1 min
54ºC 1 min 30 ciclos
72ºC 1 min
72ºC 10 min 1 ciclo
Dutka – Malen et al., 1995
(941 pb)
aac(6´)-Ii E. faecium
F: GCGGTAGCAGCGGTAGACCAAG
R: GCATTTGGTAAGACACCTACG
94ºC 2 min 1 ciclo
94ºC 1 min
55ºC 2 min 35 ciclos
72ºC 3 min
72ºC 7 min 1 ciclo
Costa et al., 1993
(323 pb)
VanC1 (E. gallinarum)
F: GCTGAAATATGAAGTAATGACC
R: CGGCATGGTGTTGATTTCGTT
94ºC 3 min 1 ciclo
94ºC 30 seg
58ºC 2 min 40 ciclos
72ºC 2 min
72ºC 6 min 1 ciclo
Miele et al., 1995
(811 pb)
vanC2/C3 (E. casseliflavus)
F: CTCCTACGATTCTCTTG
R: CGAGCAAGACCTTTAAG
94ºC 3 min 1 ciclo
94ºC 1 min
58ºC 1 min 30 ciclos
72ºC 1 min
72ºC 10 min 1 ciclo
Dutka – Malen et al., 1995
(439 pb)
mur-2ed (E. durans)
F: AACAGCTTACTTGACTGGACGC
R: GTATTGGCGCTACTACCCGTATC
94ºC 2 min 1 ciclo
94ºC 1 min
60ºC 15 seg 30 ciclos
72ºC 1min 30seg
72ºC 7 min 1 ciclo
Robredo et al., 1999
(176 pb)
mur-2 (E. hirae)
F: CGTCAGTACCCTTCTTTTGCAGAGTC
R: GCATTATTACCAGTGTTAGTGGTTG
94ºC 2 min 1 ciclo
94ºC 1 min
61ºC 15 seg 30 ciclos
72ºC 1min 30seg
72ºC 7 min 1 ciclo
Arias et al., 1992
(521 pb)
MATERIAL Y MÉTODO
33
Tabla 15. Secuencia nucleotídica de cebadores y condiciones de amplificación empleados para la detección de
genes relacionados con la resistencia a antibióticos.
Primers (secuencia 5´→3´) Condiciones Referencia
(tamaño del amplicón)
vanA
F: ATGGCAAGTCAGGTGAAGATGG
R: TCCACCTCGCCAACAACTAACG
96ºC 2 min 1 ciclo
94ºC 30 seg
50ºC 30 seg 35 ciclos
72ºC 1 min
72ºC 10 min 1 ciclo
Woodford et al 1993
(399pb)
vanB
F: CAAAGCTCCGCAGCTTGCATG
R: TGCATCCAAGCACCCGATATAC
94ºC 3 min 1 ciclo
94ºC 30 seg
58ºC 2 min 40 ciclos
72ºC 2 min
72ºC 6 min 1 ciclo
Dahl et al., 1999
(484 pb)
aph(3’)-IIIa
F: GCCGATGTGGATTGCGAAAA
R: GCTTGATCCCCAGTAAGTCA
94ºC 5 min 1 ciclo
94ºC 30 seg
60ºC 2 min 30 ciclos
72ºC 2 min
72ºC 7 min 1 ciclo
Van de Klundert and Vliegenthart, 1993
(292 pb)
Tabla 16. Secuencia nucleotídica de cebadores y condiciones de amplificación empleados para la
caracterización de la resistencia a trimetoprim y el entorno del gen dfrK.
Primers (secuencia 5´→3´) Condiciones Referencia
(tamaño del amplicón)
dfrK
F: GAGAATCCCAGAGGATTGGG
R: CAAGAAGCTTTTCGCTCATAAA
94ºC 5 min 1 ciclo
94ºC 1 min
58ºC 2 min 40 ciclos
72ºC 3min
72ºC 7 min 1 ciclo
Kadlec and Schwarz 2009
(422 pb)
MATERIAL Y MÉTODO
34
Tabla 17. Secuencia nucleotídica de cebadores y condiciones de amplificación empleados para la detección de
genes asociados a la producción de bacteriocinas.
Primers (secuencia 5´→3´) Condiciones Referencia
(tamaño del amplicón)
cfr (Ent1071A/B)
F: ATAATTAGGGGGAACGATAA
R: ATACATTCTTCCACTTATTTTT
97ºC 2 min 1 ciclo
94ºC 45 seg
51ºC 30 seg 35 ciclos
72ºC 20 seg
72ºC 7 min 1 ciclo
Franz et al., 2002
(403pb)
Tabla 18. Secuencia nucleotídica de cebadores y condiciones de amplificación empleados para amplificación del
rRNA 23S.
Primers (secuencia 5´→3´) Condiciones Referencia
(tamaño del amplicón)
rRNA 23S
F: GCGGTCGCCTCCTAAAAG
R: ATCCCGGTCCTCTCGTACT
97ºC 5 min 1 ciclo
94ºC 1 min
54ºC 1 min 30ciclos
72ºC 1 min
72ºC 7 min 1 ciclo
Dibo et al., 2004
(420pb)
3.9 ELECTROFORESIS EN GEL DE AGAROSA.
Para la visualización del DNA de los fragmentos amplificados por PCR, se utilizó la técnica de
electroforesis en gel de agarosa. Para la preparación del gel se debe previamente preparar TBE 5X (54
g/l Tris-base; 27,5 g/l Ácido bórico; 20 ml EDTA 0,5M pH=8). A continuación se mezcla 1 g de
agarosa con 20 ml de TBE 5X y 80 ml de agua destilada. Tras calentar la mezcla hasta ebullición
durante 2 minutos, se adiciona 6 µl de Midori Green (agente intercalante del DNA que emite
fluorescencia con luz UV) y se vierte sobre una cubeta de electroforesis, la cual se debe sellar
previamente con cinta de carrocero para evitar fugas, provista con unos peines que formarán los
pocillos (tras solidificar el gel) donde se cargaran los productos de PCR.
Una vez se ha solidificado el gel, se retiran los peines y se cargan los pocillos con 10μl de producto de
PCR mezclado con tampón de carga (10% sacarosa (p/v), 0,0025% azul de bromofenol en TE [10mM
Tris(hidroximetil) aminometano, 1mM EDTA pH8]).
MATERIAL Y MÉTODO
35
Una vez se termine de cargar todos los productos de PCR, se retira la cinta de carrocero y el gel se
sumerge totalmente en una cámara de electroforesis con TBE 1X, en la que se somete a un campo
eléctrico de 75-100V durante 45 min para que los fragmentos amplificados se separen según su peso
molecular. Posteriormente, se visualizan las bandas obtenidas con luz ultravioleta en un
transiluminador, y se fotografian utilizando el captador de imágenes (Image Store 5000, UPV).
Figura 19. Resultados para la PCR de identificación para Enterococcus casseliflavus.
Figura 20. Resultados para la PCR del gen drfK.
3.10 SECUENCIACIÓN
Se llevó a cabo la secuenciación del gen codificante del rRNA 23S obtenido a través de la técnica de
PCR en la cepa resistente a linezolid.
Reacción de secuenciación
Los amplicones obtenidos en la reacción de PCR fueron purificados y posteriormente secuenciados
utilizando el mismo cebador forward que se empleó en la PCR. Dicha secuenciación se llevó a cabo en
una empresa externa (Beckman Coulter Genomics, Reino Unido). Una vez recibidos en el laboratorio
los cromatogramas y las secuencias de nucleótidos resultantes, estos fueron analizados y verificados.
.Análisis de las secuencias
Para el análisis de las secuencias se emplearon diversas herramientas bioinformáticas a través de
diferentes páginas web:
NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)
Attotron Biosensor Corporation: (http://www.attotron.com/cybertory/analysis.htm)
C+ 422pb Cepas positivas
C- C+ 439 pb
Cepas positivas
Cepas
negativa
s
MATERIAL Y MÉTODO
36
EMBL-EBI (European Bioinformatics Institute):
(http://www.ebi.ac.uk/Information/tools_sitemap.html).
ExPASy Proteomics Server:
(http://expasy.org/tools/dna.html).
Las secuencias obtenidas se compararon con las incluidas en la base de datos del GenBank
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) utilizando para ello el programa BLAST Basic Local Aligneame
desarrollado por el NCBI que muestra los alineamientos entre la secuencia problema y las incluidas en
la base de datos.
RESULTADOS
37
4. RESULTADOS Se estudiaron 36 aislados morfológicamente compatibles con el género Enterococcus, que
habían sido previamente aislados de 33 vacas de una granja de ganadería extensiva de La
Rioja. En primer lugar se llevó a cabo la identificación de estas cepas por técnicas
microbiológicas/bioquímicas (tinción de Gram, test catalasa y reacción de bilis esculina) y
también por técnicas moleculares (PCR especie-específicas). Asimismo se determinó los
fenotipos y genotipos de resistencia a antibióticos. Todas las cepas presentaron las siguientes
características: tinción Gram positivo, actividad catalasa negativa y reacción bilis esculina
positiva.
La identificación de las 36 cepas mediante la técnica de PCR se realizó mediante la
detección de genes especie-específicos lo cual permitió la adscripción final de la especie
bacteriana (ver tabla 20). En este sentido, 18 cepas fueron identificadas como E. hirae (50%)
al poseer el gen mur-2, 6 cepas como E. casseliflavus (16,7%) al poseer el gen vanC2, 5
cepas como E. faecium (13,9%) al poseer el gen aac(6´)-Ii, y 7 cepas como Enterococcus
spp (19,4%). En las 7 cepas Enterococcus spp no se pudo llegar a nivel de especie y solo
fueron identificadas a nivel de género.
Tabla 19. Estudio del Gram, test catalasa, gen especie-específico e identificación de las cepas de Enterococcus.
Cepa Gram Catalasa Gen especie-específico por PCR Identificación por PCR G3-A Positivo Negativo mur-2 E. hirae G5-A Positivo Negativo Enterococcus spp G9-A Positivo Negativo mur-2 E. hirae
G10-A-1 Positivo Negativo mur-2 E. hirae G11 Positivo Negativo mur-2 E. hirae
G12-A Positivo Negativo mur-2 E. hirae G13-A Positivo Negativo mur-2 E. hirae G15-A Positivo Negativo mur-2 E. hirae G16-A Positivo Negativo mur-2 E. hirae
G17-A-1 Positivo Negativo mur-2 E. hirae G18-A Positivo Negativo mur-2 E. hirae
G19-A-1 Positivo Negativo mur-2 E. hirae G20-A Positivo Negativo mur-2 E. hirae G21-A Positivo Negativo mur-2 E. hirae G23-B Positivo Negativo Enterococcus spp G24-A Positivo Negativo vanC2 E. casseliflavus
G24-A* Positivo Negativo aac(6´)-Ii E. faecium G25-A Positivo Negativo vanC2 E. casseliflavus G26-A Positivo Negativo mur-2 E. hirae G27-A Positivo Negativo vanC2 E. casseliflavus G28-A Positivo Negativo Enterococcus spp G29-B Positivo Negativo Enterococcus spp G30-A Positivo Negativo aac(6´)-Ii E. faecium
G31-A*2 Positivo Negativo Enterococcus spp G32-A-1 Positivo Negativo aac(6´)-Ii E. faecium
G32-VAN Positivo Negativo aac(6´)-Ii E. faecium G33-A Positivo Negativo aac(6´)-Ii E. faecium G34-A Positivo Negativo Enterococcus spp G35-A Positivo Negativo vanC2 E. casseliflavus G36-A Positivo Negativo vanC2 E. casseliflavus
G36-VAN Positivo Negativo vanC2 E. casseliflavus G37-A Positivo Negativo mur-2 E. hirae G38-A Positivo Negativo mur-2 E. hirae
G39-A-1 Positivo Negativo mur-2 E. hirae G40 Positivo Negativo Enterococcus spp
G41-A Positivo Negativo mur-2 E. hirae
RESULTADOS
38
Figura 21. Distribución de especies en la colección de Enterococcus estudiada.
A continuación se realizó el estudio fenotípico de resistencia mediante la realización del
antibiograma con 12 antibióticos diferentes correspondientes a diferentes familias
(glucopéptidos, beta-lactámicos, aminoglucósidos, macrólidos, fluoroquinolonas,
oxazolidinonas, cloranfenicol, tetraciclina, y SXT). Diez de las 36 cepas (27,8%)
presentaron resistencia a al menos uno de los antibióticos testados. De éstas, 8 cepas
presentaban resistencia a trimetoprim-sulfametoxazol (SXT, 22,2%), 3 cepas resistencia a
kanamicina de alta carga (KAH, 8,33% ) y 1 cepa resistencia a linezolid (LZD, 2,77%). Dos
de las cepas de la especie E. hirae presentaron resistencia a SXT y KAH, conjuntamente.
Los datos correspondientes a los halos de inhibición producidos por los antibióticos en
contacto con las diferentes bacterias se pueden ver en la tabla 21.
Se realizó el estudio genotípico de las cepas que presentaron alguna resistencia mediante
PCR y posterior electroforesis en gel de agarosa. En las cepas que presentaron resistencia a
SXT se estudió la presencia de los genes drfF, dfrG y dfrK (codificante de DHFR); en las
que presentaron resistencia a KAH se estudió la presencia del gen aph(3´)-IIIa (codificante
de la fosfotransferasa APH(3´)-III); y en la cepa que presentó resistencia a LZD se estudió la
presencia del gen cfr (codificante de una metilasa ribosómica) .
En 2 de las cepas resistentes a SXT se constató la presencia del gen dfrK (cepas: E. hirae
G17A1 y G19A1). En el resto de cepas estudiadas, no se obtuvo ningún resultado positivo
frente a los genes estudiados. También se observó una resistencia intermedia a VAN en todas
las especies E. casseliflavus y en la cepa G-21A (resistente a LZD) (E.hirae) (tabla 22). Las
cepas de E. casseliflavus con resistencia intermedia a vancomicina portaban el gen vanC2,
especifico de esta especie bacteriana, y que sirve asimismo para su identificación molecular
al ser un mecanismo intrínseco de esta especie. En la cepa E. hirae G-21a con resistencia
intermedia a vancomicina no se detectó ninguno de los genes van estudiados.
En la tabla 21 se pude observar que otras cepas presentaron sensibilidad disminuida
(resistencia intermedia) frente a otros antibióticos (eritromicina, SXT, tetraciclina,
cloranfenicol, kanamicina, ciprofloxacina).
18
5
6
7
Identificación de las Cepas
E. hirae
E. faecium
E. casseliflavus
Enterococcus spp
RESULTADOS
39
Tabla 20. Halos de inhibición (expresado en mm) producidos por los distintos antibióticos testados en las cepas de Enterococcus y estudio de su resistencia según los puntos
de corte asignados por el CLSI (2015)*.
*No sombreado: categoría sensible; sombreado en naranja: categoría intermedia; sombreado en verde: categoría resistente. En la parte superior de las columnas se indican los
puntos de corte de resistencia y de sensibilidad para cada antibiótico, de acuerdo con el CLSI 2015
≤14 ≥17 ≤10 ≥14 ≤16 ≥17 ≤13 ≥23 ≤14 ≥19 ≤15 ≥21 ≤12 ≥18 ≤21 ≥50 <6 ≥10 <6 ≥10 <6 ≥10 ≤20 ≥23
Cepas \ Antibióticos VAN TEI AMP ERY TET CIP CHL SXT GEH STH KAH LZD E. hirae G3-A 20 20 30 25 30 24 20 26 22 22 18 28
Enteroccus spp G5-A 22 22 34 16 30 28 26 16 26 24 20 30 E. hirae G9-A 24 20 28 26 30 24 26 32 26 26 20 28
E. hirae G10-A-1 26 26 36 32 30 19 30 0 26 20 0 34 E. hirae G11 24 26 38 30 30 22 30 0 20 20 0 32
E. hirae G12-A 20 20 24 20 30 24 28 34 24 22 18 32 E. hirae G13-A 24 22 28 26 30 24 24 32 26 24 16 29 E. hirae G15-A 22 22 26 23 34 22 24 32 18 22 20 30 E. hirae G16-A 24 22 34 32 32 28 24 34 26 24 22 28
E. hirae G17-A-1 26 26 38 24 34 22 28 0 26 24 10 30 E. hirae G18-A 24 20 26 26 28 26 22 32 20 18 14 26
E. hirae G19-A-1 23 21 23 28 26 25 24 0 20 21 17 29 E. hirae G20-A 24 24 32 26 26 18 20 30 24 16 18 26 E. hirae G21-A 16 22 38 24 18 20 18 30 20 16 14 14
Enteroccus spp G23-B 22 22 31 32 34 16 32 24 22 18 12 26 E. faecium G24-A 16 21 24 18 30 21 24 34 26 27 22 28
E. casseliflavus G24-A* 20 20 28 20 26 19 24 28 27 16 18 28 E. casseliflavus G25-A 15 20 30 26 28 16 24 20 16 22 18 24
E. hirae G26-A 23 16 30 26 24 20 22 26 18 18 17 26 E. casseliflavus G27-A 16 19 27 19 28 19 28 24 25 24 18 30 Enteroccus spp G28-A 26 24 40 24 30 22 32 0 22 22 14 32 Enteroccus spp G29-B 26 22 36 22 34 28 34 0 20 25 20 34
E. faecium G30-A 30 24 40 28 34 24 18 20 24 26 10 34 Enteroccus spp G31-A*2 24 21 28 21 33 22 26 28 25 23 20 30
E. faecium G32-A-1 26 22 38 30 24 20 30 26 18 17 10 22 E. faecium G32-VAN 24 22 35 28 30 24 30 20 22 24 0 26
E. faecium G33-A 24 24 31 22 32 19 34 24 24 24 18 32 Enteroccus spp G34-A 30 22 32 23 20 20 22 22 18 18 12 32 E. casseliflavus G35-A 16 40 31 20 29 22 31 38 25 21 15 34 E. casseliflavus G36-A 15 25 36 22 38 32 30 36 32 30 20 36
E. casseliflavus G36-VAN 16 16 30 18 24 18 20 28 26 26 18 28 E. hirae G37-A 22 22 34 30 28 28 24 34 23 24 18 30 E. hirae G38-A 24 20 24 22 26 21 24 32 25 24 20 26
E. hirae G39-A-1 24 20 26 22 28 22 25 32 22 24 20 30 Enteroccus spp G40 26 21 34 34 28 24 28 20 22 20 14 34
E. hirae G41-A 26 22 30 24 30 22 23 34 24 26 24 26
DISCUSIÓN
40
Tabla 21. Resumen del estudio fenotípico y genotípico de las cepas de Enterococcus.
Cepa Especie Fenotipo de resistencia* Genotipo de resistencia
G3-A E. hirae Sensible a Todo
G5-A Enterococcus spp Sensible a Todo
G9-A E. hirae Sensible a Todo
G10-A-1 E. hirae SXT y KAH
G11 E. hirae SXT y KAH
G12-A E. hirae Sensible a Todo
G13-A E. hirae Sensible a Todo
G15-A E. hirae Sensible a Todo
G16-A E. hirae Sensible a Todo
G17-A-1 E. hirae SXT dfrK
G18-A E. hirae Sensible a Todo
G19-A-1 E. hirae SXT dfrK
G20-A E. hirae Sensible a Todo
G21-A E. hirae LZD** / VAN
G23-B Enterococcus spp Sensible a Todo
G24-A E. casseliflavus VAN vanC2
G24-A* E. faecium Sensible a Todo
G25-A E. casseliflavus SXT / VAN vanC2
G26-A E. hirae Sensible a Todo
G27-A E. casseliflavus VAN vanC2
G28-A Enterococcus spp SXT
G29-B Enterococcus spp SXT
G30-A E. faecium Sensible a Todo
G31-A*2 Enterococcus spp Sensible a Todo
G32-A-1 E. faecium Sensible a Todo
G32-VAN E. faecium KAH
G33-A E. faecium Sensible a Todo
G34-A Enterococcus spp Sensible a Todo
G35-A E. casseliflavus VAN vanC2
G36-A E. casseliflavus VAN vanC2
G36-VAN E. casseliflavus VAN vanC2
G37-A E. hirae Sensible a Todo
G38-A E. hirae Sensible a Todo
G39-A-1 E. hirae Sensible a Todo
G40 Enterococcus spp SXT
G41-A E. hirae Sensible a Todo
* Naranja: Fenotipo con resistencia intermedia; Verde: fenotípo resistente **En esta cepa se detectaron mutaciones en el gen codificante del rRNA 23S.
DISCUSIÓN
41
Figura 22. Comparación de las cepas de Enterococcus que mostraron resistencia a antibióticos.
También se decidió realizar en la cepa resistente a LZD (G21A; E. hirae), a la vista de que
no se constató la presencia del gen cfr, una amplificación del RNA ribosómico (rRNA) 23S
para su posterior secuenciación en busca de mutaciones que explicaran dicha resistencia.
La secuencia obtenida se comparó con la secuencia base en busca de mutaciones:
S.base CGGTCGCCTCCTAAAAGGTAACGGAGGCGCTCAAAGGTTCCCTCAGAATGGTTGGAAATC
S.G21 ------------------------------------------------ATGGTTGGAATC
* * * ****
S. base ATTCATAGAGTGTAAAGGCATAAGGGAGCTTGACTGCGAGACCTACAAGTCGAGCAGGGT
S. G21 ATTCGAAGAGTGTAAAGGCAGAAGGGAGCTTGACTGCGAGACCAACAAGTCGAGCAGGGA
**** ************** ********************** ***************
S. base CGAAAGACGGACTTAGTGATCCGGTGGTTCCGCATGGAAGGGCCATCGCTCAACGGATAA
S. G21 CGAAAGTCGGGCTTAGTGATCCGGTGGTTCCGCATGGAAGGGCCATCGCTCAACGGATAA
****** *** *************************************************
S. base AAGCTACCCCGGGGATAACAGGCTTATCTCCCCCAAGAGTTCACATCGACGGGGAGGTTT
S. G21 AAGCTACCCTGGGGATAACAGGCTTATCTCCCCCAAGAGTCCACATCGACGGGGAGGTTT
********* ****************************** *******************
S. base GGCACCTCGATGTCGGCTCATCGCATCCTGGGGCTGTAGTCGGTCCCAAGGGTTGGGCTG
S. G21 GGCACCTCGATGTCGGCTCGTCGCATCCTGGGGCTGTAGTCGGTCCCAAGGGTTGGGCTG
******************* ****************************************
8
3
1
2
0
7
0
10
SXT KAH LZD SXT + KAH VAN
36 cepas aisladas
KAH
VAN
Fenotipo resistente
Fenotipo de resistencia intermedia
DISCUSIÓN
42
S. base TTCGCCCATTAAAGCGGTACGCGAGCTGGGTTCAGAACGTCGTGAGACAGTTCGGTCCCT
S. G21 TTCGCCCATTAAAGCGGCACGCGAGCTGGGTTCAGAACGTCGTGAGACAGTTCGGTCCCT
***************** ******************************************
S. base ATCCGTCGTGGGCGTAGGAAATTTGAGAGGAGCTGTCCTTAGTACGAGAGGACCGGGATG
S. G21 ATCCGTCGCGGGCGTTGGAAATTTGAGAGGAGCTGTCCTTAGTACGAG------------
******** ****** ********************************
Se encontraron 18 mutaciones, las cuales se detallan a continuación:
1. Mutación T2323A (T2296A según la numeración de Escherichia coli).
2. Mutación G2324T (G2297T según la numeración de Escherichia coli).
3. Mutación T2326G (G2299T según la numeración de Escherichia coli).
4. Mutación G2328T (G2301T según la numeración de Escherichia coli).
5. Mutación A2330G (A2303G según la numeración de Escherichia coli).
6. Mutación A2339G (A2312G según la numeración de Escherichia coli).
7. Mutación T2340A (T2313A según la numeración de Escherichia coli).
8. Mutación T2355G (T2328G según la numeración de Escherichia coli).
9. Mutación T2378A (T2351A según la numeración de Escherichia coli).
10. Mutación T2394A (T2367A según la numeración de Escherichia coli).
11. Mutación A2401T (A2374T según la numeración de Escherichia coli).
12. Mutación A2405G (A2388G según la numeración de Escherichia coli).
13. Mutación C2464T (C2447T según la numeración de Escherichia coli).
14. Mutación T2495C (T2478C según la numeración de Escherichia coli).
15. Mutación A2534G (A2517G según la numeración de Escherichia coli).
16. Mutación T2598C (T2571C según la numeración de Escherichia coli).
17. Mutación T2649C (T2622C según la numeración de Escherichia coli).
18. Mutación A2656T (A2629T según la numeración de Escherichia coli).
DISCUSIÓN
43
5. DISCUSIÓN
En las últimas décadas ha existido una gran preocupación por la transferencia de bacterias resistentes a
antibióticos del animal al hombre.
Los animales de granja han sido considerados en algunos casos como reservorios de ciertos genes de
resistencia. Las bacterias intestinales pueden diseminarse a través de las heces en diferentes ambientes
como es el caso de las aguas residuales, la tierra, el abono orgánico, etc (Radhouiani et al., 2014)
Además, algunos mecanismos de resistencia altamente preocupantes podrían haber surgido en
ecosistemas naturales y, posteriormente, podrían haber pasado al ambiente hospitalario (Martínez,
2009) puesto que existe una continua diseminación e intercambio de bacterias resistentes y de genes de
resistencia entre los diferentes ecosistemas (humano, animal, acuático, terrestre, etc) favorecida por la
globalización.
Figura 23. Potenciales vías de propagación de bacterias resistentes a antibióticos de animales a humanos (Antibiotic Resistance: Agencies Have Made Limited Progress Addressing Antibiotic Use in Animals -
http://www.gao.gov)
Un ejemplo de dicha transferencia animal-hombre de bacterias resistentes a antibióticos, fue la
detección de Enterococcus resistentes a vancomicina (ERV) (genotipo vanA) fuera del ámbito
hospitalario (Robredo et al., 2000; Radhouiani, 2010; Lozano et al., 2015b). Este hecho se relacionó
con el uso de avoparcina (antibiótico muy similar a la vancomicina) como promotor del crecimiento en
animales de abasto (Robredo, 1999). La avoparcina fue el primer antibiótico que se prohibió como
promotor del crecimiento en animales y posteriormente, en 2006, se produjo la prohibición total de
todos ellos. A partir de esta prohibición se puso de manifiesto una disminución en la frecuencia de
DISCUSIÓN
44
detección de cepas ERV (Hammerum et al., 2010) aunque estas cepas aún prevalecen, detectándose en
animales de abasto y salvajes.
Hoy en día se considera a la transferencia de bacterias multirresistentes del animal al hombre, a través
de la cadena alimentaria, un problema de seguridad alimentaria. Por ello, el problema global de la
resistencia de bacterias a antibióticos no se refiere sólo en el ámbito clínico, sino que toma fuerza en
los ámbitos veterinario y alimentario.
En este trabajo se realizó la identificación de 36 cepas de enterococos aisladas previamente de
muestras fecales de una granja de vacuno de ganadería extensiva de La Rioja. Un total de 18 cepas
fueron identificadas como E. hirae, 6 cepas como E. casseliflavus, 5 cepas como E. faecium y 7 cepas
como Enterococcus spp. Estudios previos llevados a cabo en aislados de enterococcos fecales de vaca
detectan las especies E. faecalis, E. hirae, E. casseliflavus y E. faecium (Devriese, 1987; Devriese,
1992), identificando la especie E. faecium como la más prevalente, lo cual difiere de nuestro estudio
donde E. hirae es la más prevalente aunque la especie E. faecium es también detectada. Estas
diferencias pueden ser reflejo de diferencias en la microbiota intestinal de ganado vacuno de diferentes
razas (como las analizadas en los diferentes estudios), aunque se requieren estudios con un mayor
número de cepas y de animales testados para poder llegar a conclusiones claras al respecto.
Además se detectaron 6 cepas de E. casseliflavus con resistencia intermedia a la vancomicina y una
cepa de E. hirae con resistencia intermedia a este antibiótico. La resistencia intermedia a vancomicina
en E. casseliflavus es intrínseca de especie y se debe a la presencia a nivel cromosómico del gen
vanC2 en los aislados de esta especie (Lozano et al., 2015b). En el caso de la cepa de E. hirae no se
detectó ningún gen van que pudiese justificar el fenotipo intermedio. En un futuro se estudiará en
profundidad esta cepa por si pudiese presentar un mecanismo nuevo de resistencia. Conviene destacar
que esta cepa presentó asimismo resistencia al linezolid.
El porcentaje total de bacterias resistentes ha sido moderado, pero es importante destacar que las cepas
fueron aisladas de una granja de vacas en explotación extensiva, y estos animales en general presentan
un porcentaje de bacterias resistentes a antibióticos menor que otros animales de granja como pueden
ser los pollos o los cerdos en explotaciones intensivas (Chantziaras et al., 2014), y puede ser un reflejo
del diferente uso relativo de antibióticos en los diferentes sectores de la producción animal.
En cuanto al estudio genotípico de las cepas, en 2 de las cepas resistentes a SXT se constató la
presencia del gen dfrK, el cual codifica la producción de enzimas DHFR que confieren resistencia al
SXT. Este gen se describió por primera vez en el género Staphylococcus (Kadlec & Schwarz, 2010) y
se relacionó con cepas de origen porcino. En un estudio de 2012 se describió por primera vez en el
género Enterococcus (López et al., 2012c) lo que sugirió un intercambio de este gen de resistencia
entre ambos géneros bacterianos. Hay que destacar que los géneros Enterococcus y Staphylococcus
son Gram positivos y comparten otros muchos genes de resistencia a antibióticos, como los
relacionados con la eritromicina, aminoglucosidos etc., cuya transferencia probablemente se ha
producido a través de plásmidos o transposones conjugativos (Torres& Cercenado, 2010).
DISCUSIÓN
45
Por otro lado, respecto a la cepa resistente a LZD, ésta no poseia el gen cfr, por lo que se amplificó el
gen codificante del rRNA 23S y se secuenció en busca de posibles mutaciones que explicaran dicha
resistencia.
Al no encontrarse la mutación inusual G2603T (G2576T según la numeración de E. coli) que se suele
asociar con la resistencia a LZD, se estudiaron las 18 mutaciones encontradas en nuestra cepa en
dicho gen, a través de un análisis exhaustivo de la bibliografia y de la base de genes, resultando
únicamente una de ellas, ligada a la resistencia a LDZ:
Mutación T2598C
(T2571C según la numeración de Escherichia coli)
Dicha mutación se ha encontrado en S. aureus, aunque siempre acompañada por la mutación G2576T
(según E. coli) (Locke et al., 2010). En enterococos, solo hay constancia de cepas de E. faecalis y E.
faecium que presenten la mutación G2576T proporcionando su resistencia LZD (Ntokou et al., 2012)
y, no hay casos publicados en los que se haya dado una resistencia a LZD sin formar pareja con la
mutación G2576T, ni en los que se haya dado en la especie E. hirae. En un futuro se deberían llevar a
cabo estudios de mutagénesis dirigida para determinar en cepas de E. hirae isogéncias que presenten
solo esta mutación de diferencia para determinar si esta única mutación es capaz de provocar la
resistencia al linezolid y explicar por tanto de manera irrefutable el fenotipo de resistencia detectado
en nuestra cepa. El aislamiento de esta cepa resistente es de gran relevancia ya que el linezolid es un
antibiótico que se utiliza para el tratamiento de infecciones graves por Enterococcus o Staphylococcus,
cuando las cepas presentan resistencia a otros antibióticos que puedan ser de primera elección. La
emergencia de estas cepas resistentes en ámbitos extrahospitalarios debe ser monitorizada y evaluada
para determinar los puntos críticos y factores de selección y las medidas de control.
CONCLUSIONES
46
6. CONCLUSIONES
1.- La especie E. hirae es la más abundante en la colección de enterococos fecales aislados de vacas de
explotación extensiva, seguido de las especies E. casselifavus y E. faecium.
2.- Se detectan moderados niveles de resistencia a antibióticos en la colección de enterococos, que
afectan al linezolid (1 cepa), kanamicina (3 cepas), y trimetoprim-sulfametoxazol (8 cepas).
3.- Siete cepas presentan sensibilidad disminuida a la vancomicina (categoría intermedia), siendo 6 de
ellas E. casseliflavus (portadores del gen especie-específico vanC2) y una E. hirae
4.- La cepa de E. hirae con sensibilidad disminuida a vancomicina podría presentar un nuevo
mecanismo adquirido de resistencia a vancomicina.
5.- Se detecta el gen dfrK en dos cepas de E. hirae resistentes a trimetoprim-sulfametoxazol, siendo
este gen inusual en esta especie bacteriana.
6.- La cepa de E. hirae resistente a linezolid, que carece del gen cfr, presenta 18 mutaciones en el gen
codificante del rRNA 23S, pudiendo estar una de ellas relacionada con la resistencia a este antibiótico
(T2598C); dicha mutación no ha sido detectada previamente en enterococos.
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