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INDICE
RESUMEN 3
SUMMARY 4
INTRODUCCIÓN 5
MATERIALES Y MÉTODOS 17
Escenarios de apareamiento y control de parentesco considerados 17
Características de los marcadores moleculares considerados 19
Asignación y simulación de paternidad 20
Análisis estadístico 21
RESULTADOS Y DISCUSIÓN 22
CONCLUSIONES 31
BIBLIOGRAFÍA 32
ANEJOS 35
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I. RESUMEN
La correcta asignación de las relaciones de parentesco de los animales es una parte
fundamental de cualquier programa de mejora genética ya que permite mejorar la precisión de
la evaluación genética y por tanto el progreso genético. En poblaciones donde predominan los
sistemas extensivos la identificación de parentesco vía control genealógico de los
apareamientos es difícil de implementar. Es el caso de las poblaciones de alpacas en sistemas
de crianza alto-andinos. En estos casos la utilización de marcadores moleculares de ADN para
la asignación de parentesco puede ser una útil herramienta. Los microsatélites han venido
siendo los marcadores habitualmente recomendados y utilizados hasta el momento, pero en la
actualidad se está valorando la posibilidad de utilizar polimorfismos de un único nucleótido
(SNP). Por ello el objetivo del presente trabajo fue analizar las ventajas e inconvenientes de
los marcadores SNP en la asignación de parentesco en poblaciones de alpacas. Para ello se
realizaron simulaciones informáticas que permitieron determinar el poder de asignación de
paternidad de los SNP (40, 60, 80 y 100) comparado con el de los microsatélites (10, 15, 20 y
25) en distintos escenarios, los cuales están basados en los sistemas de apareamiento
(controlado, alternado y múltiple) de las alpacas. Los resultados del presente estudio indican
que una asignación de paternidad casi perfecta se consigue utilizando paneles de 100 SNP y
25 microsatélites en los tres escenarios planteados. Por otro lado un panel de 40 SNP ha
demostrado ser una herramienta comparable a un panel de 10 microsatélites (bajo las
condiciones analizadas aproximadamente 3.9 SNP equivalieron a 1 microsatélite). De acuerdo
a los resultados se concluye que los marcadores SNP serían una herramienta utilizable para
paliar los problemas de asignación de parentesco que tienen los programas de mejora genética
de alpacas.
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SUMMARY
The correct assignment of kinship of animals is a fundamental part of any breeding
program because it improves the accuracy of genetic evaluation and hence genetic progress.
In populations where extensive systems are usual the parental identification by genealogical
control of mating is difficult to implement. This is the case of breeding systems of high-
Andean alpaca populations. In these situations the use of DNA molecular markers for
assigning parentage may be a useful tool. The microsatellites markers have been routinely
being recommended and used so far, but now the possibility of using single nucleotide
polymorphisms (SNPs) is being considered. Therefore the objective of this study was to
analyse the advantages and disadvantages of SNP markers in the assignment of kinship in
populations of alpacas. With this objective computer simulations were performed to estimate
the power of SNP (40, 60, 80 and 100) in parentage assignment compared with microsatellites
(10, 15, 20 and 25). Different scenarios were considered based on alpaca mating systems
(controlled, alternate and multiple). The results of this study indicate that a near-perfect
assignment of paternity is achieved using panels of 25 microsatellite and 100 SNP in the three
scenarios analysed. In addition, a panel of 40 SNP has proven to be a tool comparable to a
panel of 10 microsatellites (under the conditions analysed 3.9 SNP were approximately
equivalent to 1 microsatellite). According to the results it is concluded that SNP markers
would be a useful tool to reduce the problems of parental assignment in alpaca breeding
programs.
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II. INTRODUCCIÓN
2.1 Los camélidos sudamericanos
Los camélidos sudamericanos (CSA), constituyen un recurso de gran importancia
social, económica, cultural y científica para el Perú y algunos países de América del sur. Se
estima que existen más de 7.5 millones de CSA, los cuales son agrupados en cuatro especies,
de ellas dos son silvestres, la vicuña (Vicugna vicugna) y el guanaco (Lama guanicoe); y dos
son domésticas: la llama (Lama glama) y la alpaca (Vicugna pacos). Las especies domésticas,
proveen productos de alta calidad, como son la fibra y la carne y, a menudo, constituyen el
único medio de subsistencia de un vasto sector de la población alto andina. Las especies
silvestres, vicuña y guanaco, que se consideran antecesoras de las especies domésticas,
ofrecen igualmente un importante potencial de aprovechamiento sostenible (Sarno et al.,
1998).
En la actualidad, los CSA constituyen el único medio de utilización productiva de las
extensas áreas de pastos naturales de las zonas alto andinas, donde no es posible la agricultura
ni la crianza económica de otras especies de animales domésticos. Los CSA convierten, con
inusual eficiencia, los pastos pobres de estas alturas en productos de alta calidad como son la
fibra y la carne, además de los subproductos como las pieles y cueros que tienen múltiples
usos industriales y artesanales (Bustinza, 2001).
El Perú tiene el privilegio de ocupar el primer lugar en el mundo en la posesión de
alpacas y vicuñas y el segundo lugar en llamas. El aprovechamiento racional de esta ventaja
comparativa es el reto que el Perú encara como el medio más efectivo de lucha contra la
pobreza y la inseguridad alimentaria que afecta a las comunidades campesinas que viven de la
crianza de estas especies.
2.2 La alpaca
La alpaca es el más importante miembro de los camélidos sudamericanos en cuanto se
refiere a la producción de fibra (Wuliji et al., 2000; León-Velarde y Guerrero, 2001). En
función a ella habría sido domesticada hace más de 6000 años (Wheeler, 1995) y seleccionada
para producción de fibra desde hace más de 3000 años (McGregor, 2006). La industria textil
refiere a la fibra de alpaca como una fibra especial y las prendas que se confeccionan con
ellas, están clasificadas como artículos de lujo (McGregor, 2006). Su población mundial se
estima en unos 3.7 millones (FAO, 2005) y el 80% de ellas (aprox. 3 millones) se encuentran
en el Perú (CEPES, 2005).
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La crianza de alpacas se desarrolla en la región andina de la sierra del Perú,
particularmente sur y central, a altitudes que van de los 3 800 hasta más de 5 000 metros sobre
el nivel del mar. Alrededor del 90 % de las alpacas está en manos de pequeños productores
que paradójicamente constituyen uno de los segmentos menos favorecidos de la población
peruana, la misma que vive en estado de extrema pobreza (Montes et al., 2008). Pese a su
importancia socio-económica la crianza de alpacas no ha sido objeto de innovaciones
importantes que se traduzcan en una mayor producción y productividad, esto debido a lo poco
sofisticado de las tecnologías de crianza y manejo (FAO, 2005).
2.3 Mejoramiento genético
En Perú existen una serie de iniciativas de mejora genética en alpacas que abarcan
modestos planes a nivel predial hasta programas de gran escala a nivel nacional (Quispe et al.,
2008).
No obstante estos programas de mejora genética actualmente están teniendo pocos
avances y reducido progreso genético, debido a que en la mayoría de los sistemas de crianza
de alpacas priman los pequeños ganaderos, en los que se observan deficiencias en la
identificación de los animales, inadecuados registros de producción y genealogía, e
inadecuada (o inexistente) infraestructura. En este tipo de crianzas la identificación de
parentesco vía control genealógico de los apareamientos es difícil de implementar. En estos
casos la utilización de marcadores moleculares para la asignación de parentesco puede ser una
útil herramienta (Blancou, 2001; Cunningham y Meghen, 2001).
En la región de Huancavelica (Perú) la Universidad Nacional de Huancavelica hace 5
años viene ejecutando un plan de mejora genética en alpacas a través del Programa de Mejora
Genética de Camélidos Sudamericanos (PROCASUD) el cual tiene como objetivo mejorar la
producción de fibra de las alpacas tanto en cantidad (peso de vellón) como en calidad
(diámetro de fibra). El mencionado programa en la actualidad viene recogiendo gran cantidad
de información (genealógica y productiva) en las unidades productivas (UP) que tiene (25 UP
distribuidas en 7 comunidades), para su tratamiento estadístico con la finalidad de identificar
animales de alto valor genético. Paucar et al. (2009) diseñaron un programa informático
(Alpatec V. 01) para verificar la consistencia de dicha información, llegando a la conclusión
que existen deficiencias en la información de parentesco, lo cual atribuyen al sistema de
crianza extensivo que tienen los rebaños que integran el programa. En este tipo de crianza
predominan las practicas reproductivas inadecuadas que limitan a menudo el registro
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adecuado de parentesco lo cual repercute en la precisión de la estimación de los Valores de
Cría y por ende en el progreso genético.
2.4 Evaluación genética
La evaluación genética es un componente importante de los programas de mejora
genética y gran parte del éxito de un programa de mejora genética depende de este
componente.
Se entiende por evaluación genética al proceso que tiene como finalidad la obtención de
los valores de cría estimado (EVC) o predicción del valor genético aditivo de los animales de
una determinada población, lo cual se realiza aplicando las bases de la genética cuantitativa,
teniendo como insumos registros productivos y de genealogía (Bourdon y Bourbon, 1997).
En las últimas décadas, el uso de metodologías objetivas de estimación de valores de
cría basadas en las evaluaciones genéticas bajo la metodología Blup-modelo animal se han
vuelto populares; sin embargo, su empleo requiere la organización de bases de datos con una
estructura de información completa y confiable que incluya, tanto datos productivos como de
parentesco (Cardoso y Tempelman, 2004; Mrode y Thompson, 2005), asegurando la
predicción de valores genéticos precisos. Los errores en los registros de parentesco reducen la
precisión de las predicciones de los valores genéticos, y esto se da principalmente en los
sistemas de crianza extensivos (Tosh y Wilton, 1994; Sherman et al., 2004). Por lo cual es
necesario que los animales de este tipo de crianza, deban someterse a pruebas de verificación
de paternidad para obtener predicciones confiables de los valores genéticos (Tosh y Wilton,
1994).
El plan de mejoramiento genético de alpacas conducido por el PROCASUD, para el
control de parentesco utiliza un sistema de apareamiento denominado empadre controlado, el
cual consiste en emparejar una alpaca hembra con un macho en instalaciones adecuadas, en
promedio un macho puede aparear 20 hembras durante la campaña de apareamiento (enero a
marzo). El inconveniente de este sistema es que se consigue una baja natalidad (40%),
requiere infraestructura costosa, abundante mano de obra y genera una cantidad importante de
paternidades inciertas cuando no se ejecuta bien, lo cual es común debido a la falta de
instalaciones y mano de obra adecuada. Las paternidades inciertas hacen que disminuya la
cantidad de conexiones directas entre individuos y se incremente la varianza del error de
predicción reduciendo por lo tanto la precisión de los valores genéticos lo cual repercute en el
progreso genético.
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Por otro lado debido a lo costoso que es implementar el sistema de apareamiento
controlado muchos rebaños no integran los programas de mejoramiento genético, reduciendo
la variabilidad genética lo cual es importante para conseguir buenos progresos genéticos.
Muchos criadores se han retirado de los programas de mejora debido a la baja natalidad que
se consigue. Una herramienta reproductiva que ayuda solucionar los problemas mencionados
en otras especies domésticas es la inseminación artificial la cual no es fácilmente aplicable en
alpacas debido a sus características fisiológicas (la hembra tiene una ovulación inducida y el
tiempo de eyaculación de los machos es en promedio 30 minutos, lo que impide realizar una
colección de semen de calidad). Por ello los marcadores genéticos combinando con sistemas
de apareamiento serían una posible solución a este problema.
2.5 Marcadores moleculares
Un marcador molecular es un segmento de ADN, no necesariamente con función
conocida, con una ubicación física conocida en un cromosoma y cuya herencia se puede
seguir. Para que una porción de ADN pueda informar de la variabilidad existente entre
individuos debe mostrar una variación experimentalmente detectable entre ellos, y un modo
de herencia predecible. Esta variación puede ser considerada a diferentes niveles biológicos,
desde cambios fenotípicos heredables significativos, hasta la variación de un solo nucleótido
en la secuencia de ADN (Heyen et al., 1997; Ferreira y Grattapaglia, 1998; Pakstis et al.,
2007).
Los marcadores genéticos se están utilizando en diversos campos de la producción
animal. Entre ellos destacan: la identificación de parentesco, caracterización de la diversidad
genética, la identificación de genes responsables de caracteres de interés, el desarrollo de
nuevos tratamientos de enfermedades, etc, y de igual forma los marcadores moleculares
constituyen hoy una herramienta moderna y poderosa para el viejo arte de la selección
(Cornide et al., 2002; Heaton et al., 2002).
Un marcador molecular debe reunir una serie de características para maximizar su
utilidad y ser considerado como ideal (Ferreira y Grattapaglia, 1998).
Que sean muy polimórficos, es decir que presenten distintas formas genéticas
(alelos) en una población que nos permitan diferenciar los individuos.
Que estén distribuidos por todos los cromosomas de una especie para obtener
información representativa de la posible variación existente.
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Que tengan un bajo coste tanto en la obtención como en la aplicación para que no
se encarezca excesivamente su análisis. Su detección en numerosos individuos debe
ser fácil, rápida y barata.
Que sean públicos y no estén sometidos a ningún tipo de patente.
Que su interpretación sea sencilla y objetiva.
Que requieran poca cantidad y calidad de muestra de ADN.
Que sean reproducibles en cualquier experimento de laboratorio, es decir, utilizar
marcadores contrastados internacionalmente mediante el intercambio de
información de animales analizados en diferentes laboratorios.
Que sean automatizables para aumentar el rendimiento y abaratar los costes.
Que sean estables para que las mutaciones no puedan influir en los resultados.
Que tengan preferiblemente herencia codominante. Según el tipo de aplicación del
marcador, la tecnología elegida debe ser capaz de detectar las diferentes formas del
marcador, es decir, distinguir entre un homocigoto y un heterocigoto.
Que sean neutros. El alelo presente en el locus del marcador es independiente de la
presión de selección que se ejerce sobre el individuo y no tiene ningún efecto sobre
ella. Esta afirmación suele ser una suposición porque, generalmente, no hay datos
disponibles que confirmen o nieguen esta propiedad.
2.6 SNP
Concepto
Un polimorfismo de un solo nucleótido (SNP - Single Nucleotide Polymorphism) es una
variación en la secuencia de ADN que afecta a una sola base (adenina (A), timina (T), citosina
(C) o guanina (G)) de una secuencia del genoma (Brookes, 1999; Vignal et al., 2002). Se
encuentran distribuidos por todo el genoma y pueden localizarse tanto en regiones
codificantes como no codificantes (Sachidanandam et al., 2001).
En este tipo de polimorfismos puede estar presente cualquiera de los cuatro nucleótidos,
por lo tanto se debe suponer que cada SNP tendría cuatro alelos. Teóricamente esto es posible,
pero en la práctica la mayoría de los SNP tienen solamente dos variantes, la secuencia original
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y la versión mutada. Esto se debe a la vía en que estos aparecen y se distribuyen en una
población. Un SNP se origina cuando ocurre una mutación puntual en el genoma,
convirtiendo un nucleótido en otro. Si la mutación ocurre en los gametos de un individuo,
puede heredarse por uno o más descendientes y después de muchas generaciones, el SNP
puede establecerse en la población. Para que se produzca un tercer alelo, una nueva mutación
debe ocurrir en la misma posición en el genoma de otro individuo, y este individuo y su
descendencia deben reproducirse de forma tal que el nuevo alelo quede establecido. Esto no
es imposible, pero es poco probable, por lo tanto la mayoría de los SNP son bialelicos
(Brookes, 1999).
Características
Los SNP presentan múltiples características, entre las más importantes podemos citar:
a) Son muy abundantes en el genoma de los mamíferos y se calcula la existencia de un
SNP por cada 1000 pares de bases en humanos (Wang et al., 1998) o 1 por cada 500
pares de bases en ratón (Lindblad-Toh et al., 2000) y bovino (Heaton et al., 2001). Si
tenemos en cuenta que el tamaño promedio del genoma de los mamíferos es de 3.000
millones de pares de bases se puede prever que las secuencias de ADN de 2 individuos
pueden llegar a diferir en unos 3 millones de posiciones, lo que implica un gran
potencial para identificación de parentesco.
b) Los SNP son marcadores muy atractivos desde el punto de vista de su empleo en la
identificación de parentesco ya que son genéticamente estables en mamíferos
(Markovtsova et al., 2000; Nielsen, 2000; Thomson et al., 2000).
c) Poseen baja tasa de mutación del orden de 10-8
(Nachman y Crowell, 2000;
Kondrashov, 2003),
d) Tienen bajas tasas de error en el genotipado (Kennedy et al., 2003),
e) La interpretación de los resultados es menos compleja que el caso de otros marcadores
(Krawczak, 1999), permiten la representación de los genotipos mediante una “firma
digital de ADN” (Fries y Durstewitz, 2001)
f) El procesado de la muestra y el análisis de los datos es susceptible de una alta
automatización (Kruglyak, 1997; Wang et al., 1998; Lindblad-Toh et al., 2000).
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g) Los SNP son marcadores bialélicos, por tanto para conseguir un alto poder de
discriminación se requiere el análisis de un mayor número de marcadores.
Métodos de detección y análisis
El método más directo para detectarlos es la secuenciación de segmentos de ADN
previamente amplificados por PCR. Una vez localizado el SNP se pueden utilizar diversas
técnicas para su análisis, como son: extensión del primer (Pastinen et al., 1996),
pirosecuenciación (Ronaghi et al., 1998), espectrometría de masas MALDI-TOF (Matrix
Assisted Laser Desorption-Time of Flight) (Andersen y Mann, 2000), microarrays o
microchips de DNA (Schena et al., 1998) y discriminación alélica mediante PCR a tiempo
real usando sondas TaqMan (Livak et al., 1995) o utilizando cebadores modificados en 3’
(Liu et al., 1997) que también se puede realizar en PCR estándar.
Utilización
Debido a las ventajas que ofrecen los SNP y a la diversidad de métodos disponibles para
su estudio se están utilizando frecuentemente en diversas especies en estudios de
identificación y paternidad (Heaton et al., 2002; Li et al., 2006; Pakstis et al., 2007; Van
Eenennaam et al., 2007), caracterización de poblaciones (Inagaki et al., 2002), estudios de
biodiversidad (Ben-Ari et al., 2005; Twito et al., 2007), búsqueda de asociación con
caracteres cuantitativos (Page et al., 2002; Stone et al., 2005), estudios de trazabilidad (Sauer
et al., 2002; Capoferri et al., 2005; Goffaux et al., 2005) y elaboración de mapas de
ligamiento (Snelling et al., 2005), entre otros.
2.7 Microsatélites
Concepto
Los microsatélites, también llamados “Simples secuencias repetidas” (SSRs),
“Polimorfismos de longitud de simples secuencias (SSLPs), “Repeticiones cortas en serie”
(STRs), “Secuencias simples repetidas” (SSMs), “Secuencias blanco microsatélite” (STMs),
son segmentos cortos de ADN de 1 a 6 pares de bases (pb) los cuales se repiten en tándem y
de forma aleatoria en el genoma de los seres vivos (Aranguren-Méndez y Jordana, 2001).
Características
a) Son muy frecuentes y están repartidos en todo el genoma eucariota (Becerra, 2000;
Aranguren-Méndez y Jordana, 2001).
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b) Poseen una tasa de mutación que oscila entre 10-3
y 10-5
(Bowcock et al., 1994; Forbes
et al., 1995; Brinkmann et al., 1998).
c) Presentan herencia codominante y son fáciles de detectar metodológicamente (Sirchia
et al., 1996; Vega-Pla et al., 1998; Aranguren-Méndez y Jordana, 2001)
d) Constituyen la clase de marcadores moleculares más polimórficos que se conocen
(Ferreira y Grattapaglia, 1998; Cornide et al., 2002). Aportan un alto grado de
información debido al elevado número de alelos por locus que presentan (Baumung et
al., 2004). Por todo esto hasta el momento aparecen como la herramienta más
poderosa de discriminación genética entre animales (Blott et al., 1999).
e) Requieren de mínimas cantidades de material biológico para su análisis, permitiendo
incluso el análisis de muestras degradadas (Vega-Pla et al., 1998; Becerra, 2000).
Utilidad
Actualmente los microsatélites se utilizan en análisis forenses (Holt et al., 2000),
pruebas de paternidad (Lang et al., 1996; Mommens et al., 1998; Penedo et al., 1998;
Schnabel et al., 2000; Sanz et al., 2002; Rodríguez et al., 2004; Agapito et al., 2008; Spencer
et al., 2010), estudios de biodiversidad (Peelman et al., 1998; Martín-Burriel et al., 1999;
Martín-Burriel et al., 2007), análisis filogenéticos (Ritz y Glowatzki Mullis, 2000; Tapio et
al., 2006), construcción de mapas de ligamiento o como marcadores para la detección de
QTLs de importancia económica en producción animal (Arranz et al., 1998; Imai et al.,
2007). Por las ventajas que poseen estos marcadores, se ha trabajado ampliamente en la
búsqueda y empleo en diferentes especies animales, tales como ovino (Dietz et al., 1993;
Buchanan y Thue, 1998); caprino (Kemp et al., 1995), porcino (Moran, 1993) y bovino
(Giovambattista et al., 2000; Uffo, 2000; Lirón et al., 2006).
2.8 Determinación de parentesco a través de marcadores moleculares
La determinación de parentesco a través de marcadores moleculares se basa en la
exclusión genética (probabilidad de exclusión). El proceso de exclusión (basada en las leyes
de herencia mendeliana) usa incompatibilidades genéticas entre los supuestos padres y las
crías, para rechazar una particular hipótesis de asignación de paternidad (Jones y Ardren,
2003). Por ejemplo, en una prueba de paternidad, se tiene una madre y una cría que tienen un
genotipo diploide AA y AB respectivamente, para un simple locus, y dos machos uno con
genotipo AC y el otro con genotipo BC, el primer macho podrá ser excluido en cambio el
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segundo no. La probabilidad de exclusión se define como la habilidad de un marcador o de un
set de marcadores de excluir una relación de parentesco dada, y es determinada a partir de los
genotipos, las frecuencias alélicas en los diferentes loci y el número de loci independientes
testados (Jamieson, 1997).
La eficiencia de un sistema de marcadores genéticos para uso en pruebas de paternidad
es juzgado usualmente por la probabilidad de exclusión (Lee et al., 2000).
Habitualmente se ha venido trabajando con marcadores microsatélites para la
determinación de parentesco, también en alpacas, pero en los últimos años los marcadores
SNP se vienen utilizando para este fin de manera creciente.
2.9 Determinación de parentesco a través de marcadores moleculares en camélidos
Entre los estudios que han determinado parentesco a través de marcadores moleculares
(microsatélites) en camélidos, tenemos al realizado por Lang et al. (1996), en el cual
estudiaron a 20 llamas y 20 alpacas, obteniendo información para 15 loci. Estos mostraron
una probabilidad de exclusión de paternidad de 99.996 %. Los loci encontrados fueron los
siguientes:
Loci No de alelos PIC*
YWLL02 6 0.768
YWLL07 2 0.269
YWLL08 13 0.818
YWLL09 9 0.797
YWLL19 6 0.590
YWLL29 6 0.668
YWLL30 3 0.353
YWLL36 7 0.799
YWLL38 3 0.406
YWLL40 6 0.668
YWLL43 10 0.743
YWLL44 11 0.845
YWLL46 5 0.717
YWLL58 6 0.600
YWLL59 10 0.769
* PIC: Contenido de información del polimorfismo.
Así mismo Rodríguez et al. (2004) utilizando 10 marcadores reportados por Penedo et
al. (1998) y Lang et al. (1996) evaluaron el parentesco de 47 alpacas, los cuales mostraron
una probabilidad de exclusión de paternidad de 99.99 %. Los marcadores que utilizaron
fueron los siguientes:
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Loci No de alelos PIC*
LCA19 14 0.740
YWLL29 6 0.668
YWLL40 6 0.668
YWLL46 5 0.717
LCA23 11 0.800
LCA22 4 0.620
YWLL36 7 0.799
YWLL43 10 0.743
LCA5 11 0.750
YWLL08 13 0.818
* PIC: Contenido de información del polimorfismo.
De igual forma Agapito et al. (2008) evaluaron un sistema múltiple de microsatélites
para la determinación de parentesco en una población de 329 alpacas, encontrando una
probabilidad de exclusión total de 99.9456 %.
Loci No de alelos PIC*
LCA19 14 0.712
LCA37 18 0.853
YWLL40 6 0.636
YWLL29 8 0.681
YWLL36 17 0.872
LCA5 12 0.755
LCA66 16 0.842
YWLL08 28 0.929
LCA08 10 0.814
YWLL44 16 0.856
* PIC: Contenido de información del polimorfismo.
También Spencer et al. (2010) analizaron un sistema de pruebas de paternidad en
camellos. Utilizando 17 microsatélites encontrando una probabilidad de exclusión 99.999 %.
Por otro lado pruebas de paternidad utilizando marcadores SNP en camélidos no se han
reportado hasta el momento.
2.10 Objetivos
Objetivo general
Analizar las ventajas e inconvenientes de la utilización de los marcadores SNP para la
asignación de parentesco en poblaciones de alpacas.
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Objetivos específicos
Determinar el número de SNP necesarios para la correcta asignación de padres.
Investigar la utilidad de combinar los sistemas de apareamiento con los marcadores
moleculares para asignar paternidad.
Determinar el número de SNP que se requiere para dar el poder de exclusión
comparable a los microsatélites utilizados actualmente en alpacas.
Revisar las ventajas e inconvenientes de los marcadores SNP en cuanto a coste de
la aplicación de los marcadores SNP en la asignación de paternidad en poblaciones
de alpacas.
2.11 Justificación
La ejecución del presente trabajo es de importancia debido a que los resultados que se
logren contribuirán al conocimiento de las ventajas e inconvenientes de la utilización de los
marcadores SNP para la asignación de parentesco en poblaciones de alpacas. Esta
información constituirá un punto de partida para ver la aplicabilidad de los marcadores
moleculares SNP en la asignación de parentesco en poblaciones de alpacas.
Como ya se ha comentado, el control genealógico de los individuos es básico e incide
de distintas formas y a distintos niveles en las producciones animales, por tanto es necesario
disponer de alguna herramienta o sistema, fundamentada en la identificación de los
individuos, que nos permita determinar la paternidad a posteriori.
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III. MATERIALES Y MÉTODOS
El trabajo se desarrolló tomando en consideración los datos del Programa de Mejora
Genética de Camélidos Sudamericanos (PROCASUD) de la Universidad Nacional de
Huancavelica (Perú). Las unidades productivas del programa se encuentran en zonas cuyas
altitudes oscilan entre 4.000 y 4.800 metros sobre el nivel del mar, con temperaturas que
varían desde -5 °C a 0 °C por las noches y durante el día entre 14 a 18 °C; y con una
precipitación pluvial que alcanza los 750 mm/año.
3.1 Escenarios de apareamiento y control de parentesco considerados
Los escenarios (poblaciones de alpacas) considerados en el presente estudio para
realizar las simulaciones de asignación de paternidad con marcadores moleculares (SNP y
microsatélites), se determinaron teniendo como referencia los sistemas de apareamiento
utilizados en la crianza de alpacas (Tabla 1). A continuación se detalla cada uno de ellos.
Escenario 1
Para este escenario se consideró una estructura de rebaño de 100 crías, 100 madres y 5
posibles padres.
Este escenario está basado en el sistema de apareamiento controlado el cual consiste en
emparejar una alpaca hembra con un macho en instalaciones adecuadas. En promedio un
macho puede aparear 20 hembras durante la campaña de apareamiento (enero a marzo). Este
tipo de apareamiento es utilizado en los rebaños que integran los programas de mejora
genética ya que permite llevar el control de parentesco, el cual es importante en la predicción
de los valores genéticos. El inconveniente de este sistema es que se consigue una baja
natalidad (40%), requiere infraestructura costosa y abundante mano de obra. Por otro lado los
criadores para aumentar la natalidad recurren a prácticas no recomendadas como juntar las
alpacas machos y hembras al finalizar la campaña de apareamiento, lo cual genera una
cantidad importante de paternidades inciertas, estas acciones de los criadores no se puede
controlar debido a lo alejado que están las unidades productivas.
Escenario 2
En este escenario se consideró una estructura de rebaño de 100 crías, 100 madres y 10
posibles padres.
17
Este escenario se planteó teniendo como referencia el apareamiento alternado o rotativo;
consiste en usar un total de 10% de machos en relación al número de hembras en edad
reproductiva, el 50% de los cuales inicia el apareamiento por un lapso de 7 días; a su término,
son reemplazados por el 50% restante durante un lapso idéntico. Se continúa alternando a lo
largo de 8 semanas, hasta que termina el periodo de apareamiento. Este sistema de
apareamiento es moderadamente utilizado a pesar de que se obtiene una tasa de natalidad del
90 % (Novoa et al., 1970; Quispe, 1996) y su implementación no es muy costosa. Los
programas de mejoramiento genético no utilizan este tipo de empadre debido a que no permite
llevar el control de parentesco.
Escenario 3
Para este escenario se consideró una estructura de rebaño de 100 crías, 100 madres y 15
posibles padres.
Este escenario, ha sido planteado teniendo en cuenta las características del apareamiento
múltiple conocido también como empadre libre, que consiste en formar grupos de hembras
compuestas por 100, 200, 300 o máximo 500 animales, y luego aparearlas durante todo el
período de apareamiento que normalmente es entre enero a marzo. En ésta modalidad se
utiliza el 15 % de machos y no es posible identificar a los progenitores y sus crías, por lo cual
rebaños con este sistema de apareamiento no son considerados en los programas de mejora
genética. No obstante, es el más utilizado ya que no demanda personal, ni infraestructura y se
obtiene una natalidad del 80 % (Huanca, 1992; Quispe, 1996).
Tabla 1: Escenarios considerados en base al tipo de apareamiento.
Escenarios No de machos N
o de hembras
Escenario 1
Basado en el apareamiento
controlado.
5 100
Escenario 2
Basado en el apareamiento
alternado.
10 100
Escenario 3
Basado en el apareamiento múltiple.
15 100
18
3.2 Características de los marcadores moleculares considerados
SNP
Como no hay estudios previos referente a pruebas de paternidad utilizando marcadores
SNP en alpacas, para realizar las simulaciones se consideraron paneles de 40, 60, 80 y 100
SNP con MAF (menor frecuencia alélica) de 0.35 los cuales fueron utilizados y
recomendados en otras especies (Fisher et al., 2009; Duijvesteijn et al., 2010; Weller et al.,
2010). Las frecuencias de los SNP se simularon extrayendo valores de la distribución
uniforme rechazando aquellos de MAF<0.35 (se utilizó para ello la función ALEATORIO de
Excel; ver Anejos – Tabla 5).
Microsatélites
Para realizar la simulación de paternidad se utilizó un panel de 10 microsatélites
reportados por Lang et al. (1996) y Penedo et al. (1998) (ver Anejo – Tabla 6), con los cuales
Rodríguez et al. (2004) reportaron una probabilidad de exclusión de paternidad total de 99.99
%. De igual forma se utilizaron paneles de 15, 20 y 25 microsatélites, para los cuales se
duplicó al azar las frecuencias alélicas de los 10 microsatélites mencionados, en vista que no
está disponible esa información para un número tan grande de microsatélites. Cabe destacar,
que tampoco existe un panel estándar de microsatélites para determinar parentesco en alpacas,
establecidas por la Sociedad Internacional de Genética Animal (ISAG) como en otras especies
animales.
3.3 Asignación y simulación de paternidad
Las simulaciones de las poblaciones de alpacas y el poder de asignación de paternidad
de los marcadores moleculares (SNP y microsatélites) se realizaron mediante un programa
expresamente adaptado para este estudio, el cual fue desarrollado en colaboración con el Dr.
Leopoldo Alfonso del área de producción animal de la Universidad Pública de Navarra.
Este programa informático permite simular los genotipos de padres y madres. Luego
realiza los apareamientos, asignando un determinado número de hembras a cada macho,
generando una cría única para cada uno de ellos, utilizando las leyes de herencia mendeliana.
Posteriormente asigna los padres posibles de acuerdo a la información molecular y comprueba
si la asignación es correcta de acuerdo a la genealogía simulada. El proceso se repite un
determinado número de iteraciones y se calcula el porcentaje medio de hijos cuyo padre se
asigna incorrectamente.
19
Concretando un poco más el programa realiza los siguientes cálculos:
1. Simula una población base determinada por M machos, H hembras para un número X
de loci independientes cuyas características se le indican como entrada. Para cada
locus de los animales base asigna un alelo a cada uno de sus cromosomas a partir de
una distribución uniforme, el número de alelos y los valores de sus frecuencias.
2. Asume un determinado reparto de hembras por macho y aparea cada macho con el
número de hembras indicado, produciendo un único hijo por apareamiento. Escoge,
asumiendo igual probabilidad, uno de los alelos del padre y uno de los alelos de la
madre.
3. Calcula los errores de asignación de paternidad asumiendo que no se conoce el
genotipo de la madre. Para cada hijo comprueba si cada uno de los machos de la
población base puede ser o no el padre, mirando si algún alelo del hijo coincide con
alguno del padre. Si hay coincidencia compara el posible padre con el padre de verdad
y si no se trata del mismo, se contabiliza como asignación incorrecta.
4. El proceso se repite N iteraciones y se calculan los siguientes valores:
Heterocigosidad y PIC teóricos, para cada locus y para la media de todos los
loci.
Siendo pi y pj las frecuencias de los alelos i y j, respectivamente, y n el número
total de alelos (Arana et al., 2002).
Porcentaje de iteraciones en las que se produce alguna asignación de parentesco
incorrecta.
Porcentaje medio de hijos a los que no se les asigna correctamente el padre.
En el presente trabajo, cada escenario se simuló para los 40, 60, 80 y 100 SNP y los 10,
15, 20 y 25 microsatélites previamente indicados asumiendo 100 iteraciones. El número de
iteraciones se puede equiparar al número de poblaciones de alpacas que podrían entrar en un
20
sistema de asignación de parentesco por marcadores de ADN, resultando una población de
10.000 hembras y 500, 1000 y 1500 machos reproductores. El proceso se repitió 20 veces
para cada tipo y número de marcadores utilizados de igual forma para cada escenario, lo que
permitió calcular no solo el porcentaje medio de hijos a los que no se les asigna correctamente
el padre, sino también su variabilidad. Por otro lado en todos los escenarios se asumió que
todos los machos tenían la misma probabilidad de aparearse, es decir se asignó el mismo
número de hembras a cada macho.
3.4 Análisis estadístico
Para determinar el número de SNP que se requiere para dar el poder de exclusión
comparable a los microsatélites se realizó una regresión lineal simple. El análisis de datos se
realizó con ayuda del paquete estadístico R.
21
IV. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
En la Tabla 2 se observa el porcentaje de las iteraciones donde no se asigna
correctamente el padre a todos los hijos y de hijos sin padre discriminado atribuidos a los
paneles de SNP (100, 80, 60 y 40) y microsatélites (25, 20, 15 y 10) correspondientes al
Escenario 1. De igual forma podemos apreciar la Heterozigosidad (H) y Contenido de
Información Polimórfica (PIC) para cada uno de ellos. También se muestra la desviación
típica del porcentaje de iteraciones donde no se asigna correctamente el padre a todos los
hijos, y del porcentaje de hijos sin padre discriminado, valores que indican una baja
variabilidad entre repeticiones, permitiendo hacer comparaciones adecuadas entre distintas
situaciones con los valores medios obtenidos.
Los resultados obtenidos indican, como cabía esperar, que el porcentaje de iteraciones
donde no se asigna correctamente el padre a todos los hijos y el porcentaje de hijos sin padre
discriminado disminuye según se va incrementando la cantidad de SNP y microsatélites.
En el escenario 1 los paneles de 100 SNP y 25 microsatélites proporcionan porcentajes
bajos de iteraciones donde no se asigna correctamente el padre a todos los hijos (0.305% y
0.276% respectivamente) y de hijos sin padre discriminado (0.003% en ambos casos). De
igual forma los resultados encontrados con los paneles de 80 SNP y 20 microsatélites son
buenos ya que de las 100 iteraciones solo en 2 iteraciones aproximadamente no se asigna
correctamente el padre a todos los hijos y el porcentaje de hijos sin padre discriminado es de
0.019% y 0.017% respectivamente. Por otro lado los resultados encontrados con los paneles
de 60 y 40 SNP, y de igual forma los resultados de los paneles de 15 y 10 microsatélites,
indican que en algunas situaciones pueden ser suficientes para la asignación de paternidad.
Cuando se incrementa los valores del PIC y la H aumenta la precisión de la asignación
de paternidad (bajo % de iteraciones donde no se asigna correctamente el padre a todos los
hijos y de hijos sin padre discriminado) en los paneles de SNP y de microsatélites, como cabía
esperar de acuerdo a otros estudios de paternidad donde indican que la eficacia de la
asignación de paternidad, está influida por la H y el PIC (Valdés et al., 2006; Fisher et al.,
2009; Arellano-Vera et al., 2010) la cual a su vez está afectada por el número y frecuencia de
alelos. Esto indica que hay que tener en consideración estos datos al momento de seleccionar
los marcadores que se van utilizar. Por otro lado los valores encontrados de PIC (68.15) y H
(71.04) en el panel de 10 microsatélites son similares a los reportados en otros estudios
también utilizando 10 microsatélites (Rodríguez et al., 2004; Agapito et al., 2008). En general
nuestros resultados de H y PIC en los microsatélites son similares a las de otros estudios
22
desarrollados en otras especies, utilizando paneles recomendados por la ISAG (Aranguren-
Méndez y Jordana, 2001; Arana et al., 2002; Schopen et al., 2008).
También se puede observar que existen diferencias entre microsatélites y SNP respecto
a los valores de H y PIC, encontrándose valores más altos en los paneles de microsatélites, lo
que demuestra por qué se necesitan pocos microsatélites para una asignación correcta de
paternidad. Por otro lado los valores encontrados de H y PIC en los SNP son similares a los
reportados en otros trabajos (Schopen et al., 2008; Fisher et al., 2009).
Tabla 2. Asignación de paternidad utilizando SNP (100, 80, 60 y 40) y microsatélites (25,
20, 15 y 10) en el escenario 1 (5 machos y 100 hembras).
Marcadores
Iteraciones donde no
se asigna
correctamente el
padre a todos los
hijos (%)
Hijos sin padre
discriminado (%) H** PIC***
DS* DS*
100 SNP 0.305 0.130 0.003 0.001 48.40 36.68
80 SNP 1.847 0.528 0.019 0.005 48.34 36.65
60 SNP 17.219 1.258 0.206 0.017 48.23 36.59
40 SNP 83.943 1.374 2.502 0.082 48.00 36.47
25 Microsatélites 0.276 0.131 0.003 0.001 74.61 71.68
20 Microsatélites 1.571 0.679 0.017 0.007 73.20 70.08
15 Microsatélites 21.552 2.053 0.276 0.031 72.00 68.88
10 Microsatélites 77.638 1.790 2.307 0.101 71.04 68.15
* Desviación estándar.
** Heterocigosidad.
*** Contenido de información del polimorfismo.
En la Tabla 3 podemos apreciar el porcentaje de las iteraciones donde no se asigna
correctamente el padre a todos los hijos, y de hijos sin padre discriminado atribuidos a los
paneles de SNP (100, 80, 60 y 40) y microsatélites (25, 20, 15 y 10) correspondientes al
Escenario 2. De igual forma podemos apreciar la Heterozigosidad y Contenido de
Información Polimórfica para cada uno de ellos.
23
En el escenario 2 también se observa que disminuye el porcentaje de iteraciones donde
no se asigna correctamente al padre a todos los hijos y de hijos sin padre discriminado según
se incrementa la cantidad de SNP y microsatélites. De igual forma mayores valores de PIC y
H aparentemente están relacionados con una mayor eficacia en la asignación de paternidad.
Los paneles de 100 SNP y 25 microsatélites también ofrecen porcentajes bajos de
iteraciones donde no se asigna correctamente el padre a todos los hijos (0.409% y 0.764%
respectivamente) y de hijos sin padre discriminado (0.004% y 0.008% respectivamente). Por
otro lado los paneles de 40 SNP y 10 microsatélites dan valores altos de iteraciones donde no
se asigna correctamente el padre a todos los hijos (98.382% y 96.973% respectivamente) y de
hijos sin padre discriminado (5.462% y 5.047% respectivamente).
Tabla 3. Asignación de paternidad utilizando SNP (100, 80, 60 y 40) y microsatélites (25,
20, 15 y 10) en el escenario 2 (10 machos y 100 hembras).
Marcadores
Iteraciones donde no
se asigna
correctamente el
padre a todos los
hijos (%)
Hijos sin padre
discriminado (%) H** PIC***
DS* DS*
100 SNP 0.409 0.185 0.004 0.002 48.40 36.68
80 SNP 3.700 0.767 0.038 0.008 48.34 36.65
60 SNP 34.409 2.484 0.449 0.036 48.23 36.59
40 SNP 98.382 0.575 5.462 0.145 48.00 36.47
25 Microsatélites 0.764 0.347 0.008 0.003 74.61 71.68
20 Microsatélites 4.664 1.005 0.049 0.011 73.20 70.08
15 Microsatélites 42.045 3.156 0.618 0.047 72.00 68.88
10 Microsatélites 96.973 0.512 5.047 0.117 71.04 68.15
* Desviación estándar.
** Heterocigosidad.
*** Contenido de información del polimorfismo.
En la Tabla 4 se observa el porcentaje medio de las iteraciones donde no se asigna
correctamente el padre a todos los hijos y de hijos sin padre discriminado atribuidos a los
paneles de SNP (100, 80, 60 y 40) y microsatélites (25, 20, 15 y 10) correspondientes al
24
Escenario 3. De igual forma podemos apreciar la Heterozigosidad y Contenido de
Información Polimórfica para cada uno de ellos.
En el escenario 3 también se observa que disminuye el porcentaje de iteraciones donde
no se asigna correctamente al padre a todos los hijos y de hijos sin padre discriminado según
se incrementa la cantidad de SNP y microsatélites, al igual que en el escenario 1 y 2.
Por otro lado los paneles de 100 SNP y 25 microsatélites también proporcionan
porcentajes bajos de iteraciones donde no se asigna correctamente el padre a todos los hijos
(0.409% y 0.764% respectivamente) y de hijos sin padre discriminado (0.004% y 0.008%
respectivamente).
Tabla 4. Asignación de paternidad utilizando SNP (100, 80, 60 y 40) y microsatélites (25,
20, 15 y 10) en el escenario 3 (15 machos y 100 hembras).
Marcadores
Iteraciones donde no
se asigna
correctamente el
padre a todos los
hijos (%)
Hijos sin padre
discriminado (%) H** PIC***
DS* DS*
100 SNP 0.565 0.319 0.006 0.003 48.40 36.68
80 SNP 5.948 0.952 0.062 0.010 48.34 36.65
60 SNP 49.635 1.957 0.729 0.046 48.23 36.59
40 SNP 99.870 0.137 8.302 0.151 48.00 36.47
25 Microsatélites 1.209 0.460 0.012 0.005 74.61 71.68
20 Microsatélites 7.374 1.033 0.078 0.011 73.20 70.08
15 Microsatélites 56.757 1.842 0.930 0.035 72.00 68.88
10 Microsatélites 99.713 0.213 7.615 0.173 71.04 68.15
* Desviación estándar.
** Heterocigosidad.
*** Contenido de información del polimorfismo.
En los distintos escenarios (1, 2 y 3) podemos observar que el porcentaje de
asignaciones incorrectas de paternidad disminuye drásticamente con un asumible aumento de
25
marcadores (SNP y microsatélites), lo cual coincide con otros estudios (Anderson y Garza,
2006; Hill et al., 2008; Fisher et al., 2009; Duijvesteijn et al., 2010).
De acuerdo a los resultados una asignación casi perfecta se alcanza utilizando paneles
de 100 SNP en los tres escenarios, lo cual concuerda con los resultados encontrados en otros
estudios (Hill et al., 2008; Duijvesteijn et al., 2010). De igual forma utilizando paneles de 25
microsatélites se consigue una asignación casi perfecta en todos los escenarios.
Si comparamos los SNP con los microsatelites respecto a su eficacia en la asignacion de
paternidad en los tres escenarios, podemos observar que ambos marcadores ofrecen buenos
resultados.
Al analizar la combinación de los marcadores (SNP y microsatélites) con los sistemas
de apareamiento (Escenario 1, 2 y 3) se puede apreciar que en el escenario 1 se obtiene
mejores resultados seguido por el 2 y 3. Cabía esperar este resultado pues los sistemas de
apareamiento difieren solo en la cantidad de machos (posibles padres) y a menor número de
padres potenciales se consiguen mejores resultados.
De acuerdo a los resultados (Figuras 1,2 y 3) podemos observar que un panel de 40 SNP
(donde la frecuencia del alelo menor fue de 0.35) en los tres escenarios ha demostrado ser una
herramienta de diagnóstico de paternidad comparable con el panel de 10 microsatélites
reportados por Rodríguez et al. (2004). De acuerdo a los resultados de la regresión lineal
simple aproximadamente 3.9 SNP equivalen a 1 microsatélite. Similares resultados reportan
en otros estudios (Amorim y Pereira, 2005; Weller et al., 2006; Fisher et al., 2009; Tokarska
et al., 2009).
26
Figura 1. Comparación de los marcadores SNP y microsatélites respecto al porcentaje de
interacciones donde no se asigna correctamente el padre a todos los hijos en el escenario 1.
Figura 2. Comparación de los marcadores SNP y microsatélites respecto al porcentaje de
interacciones donde no se asigna correctamente el padre a todos los hijos en el escenario 2.
27
Figura 3. Comparación de los marcadores SNP y microsatélites respecto al porcentaje
de interacciones donde no se asigna correctamente el padre a todos los hijos en el escenario 3.
Los marcadores SNP serían una alternativa útil para solucionar la problemática del
control de parentesco que tienen los programas de mejora genética en alpacas. De acuerdo al
análisis de los resultados la combinación del apareamiento alternado (escenario 2) y el panel
de 100 SNP sería una buena alternativa, en vista que esta combinación proporciona 0.409%
de iteraciones donde no se asigna correctamente el padre a todos los hijos, claramente muy
superiores en cuanto a eficacia al panel de 10 microsatélites (96.973% de interacciones donde
no se asignan correctamente el padre a todos los hijos) recomendados en otros estudios
(Rodríguez et al., 2004; Agapito et al., 2008; Arellano-Vera et al., 2010). Por otro lado usar el
empadre alternado sumaría otras ventajas como una natalidad de 90% (Novoa et al., 1970;
Quispe, 1996) y reducción de costes en la actividad de apareamiento (mano de obra e
infraestructura), lo que se traduciría en la inclusión de más rebaños en los programas de
mejora genética, lo cual incrementaría la variabilidad genética y garantizaría la sostenibilidad
de estos programas. Por otro lado en los paneles de SNP se pueden incluir SNP de regiones
codificantes que sirvan simultáneamente para identificación genética y para establecer
posibles asociaciones con caracteres productivos (Sanz, 2010) lo cual haría que se optimicen
los recursos.
Las características anteriormente mencionadas de los SNP combinadas con el hecho de
que los SNP son genéticamente estables (Markovtsova et al., 2000; Nielsen, 2000; Thomson
28
et al., 2000), abundantes en el genoma de los mamíferos (Heaton et al., 2002), tienen baja tasa
de mutación (Nachman y Crowell, 2000; Kondrashov, 2003), bajas tasas de error en el
genotipado (Kennedy et al., 2003), fáciles de interpretar (Krawczak, 1999) y ofrecen un alto
potencial para la automatización (Kruglyak, 1997; Wang et al., 1998; Lindblad-Toh et al.,
2000) hacen que los SNP sean una alternativa prometedora para asignar paternidad en alpacas
y en otras especies.
Una desventaja de los SNP es que tienen un contenido informativo bajo, en
comparación con los microsatélites que son altamente polimórficos. Sin embargo, esta
desventaja puede ser compensada por un mayor número de SNP como se puede apreciar en
nuestros resultados. Esto concuerda con lo reportado en otros estudios (Vignal et al., 2002;
Werner et al., 2004; Weller et al., 2006; Wang y Santure, 2009; Weller et al., 2010).
Otro aspecto a tener en cuenta para determinar la aplicabilidad de los SNP en la
verificación de paternidad son los costes económicos que acarrean. Actualmente para el
genotipado de los SNP existe una gran diversidad de metodologías disponibles, y se estima
que la producción de un genotipo está en el orden de 0,01 $ (Heaton et al., 2005), sin embargo
dependiendo de la metodología utilizada para el genotipado los costes pueden variar. La
automatización en el genotipado de SNP, sugeriría un ahorro económico.
Desarrollar una metodología de genotipado con SNP a menor escala y frecuencia tiene
un coste elevado (equipos caros), por lo cual sería mejor realizar esta actividad mediante una
empresa que brinda estos servicios. Teniendo como referencia las tarifas de la empresa
CEGEN (http://www.cegen.org/primera.php?que=cost&lang=cast) genotipar el rebaño (500
crías y 50 machos) del Programa de Mejora Genética de Camélidos Sudamericanos
(PROCASUD) de la Universidad Nacional de Huancavelica (Perú) tendría un coste
aproximado de 6500 euros (utilizando 100 SNP). Cabe destacar que este coste hace referencia
después de haber puesto a punto la técnica.
29
V. CONCLUSIONES
De acuerdo a los resultados obtenidos las principales conclusiones del presente trabajo
son las siguientes:
Los marcadores SNP constituyen una herramienta utilizable para solucionar la
problemática del control de parentesco que tienen los programas de mejoramiento genético
en alpacas.
Un panel de 100 SNP con MAF de 0.35 proporciona una asignación de paternidad casi
perfecta en los sistemas de apareamiento habitualmente utilizados en alpacas
(apareamiento controlado, alternado y múltiple). De igual forma un panel de 25
microsatélites proporcionan una asignación de paternidad casi perfecta en los tres sistemas.
Se requieren 40 SNP aproximadamente para dar un poder de exclusión comparable a un
panel de 10 microsatélites (3.9 SNP equivalen aproximadamente a 1 microsatélite en las
situaciones analizadas).
Ambos tipos de marcadores son aplicables en la asignación de parentesco, la elección de
cualquiera de ellos dependerá del objetivo y situación de cada proyecto.
30
VI. BIBLIOGRAFÍA
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VII. ANEJOS
Tabla 5: Frecuencias de los SNP considerados para las simulaciones.
0.57 - 0.43 0.45 - 0.55 0.63 - 0.37 0.42 - 0.58
0.58 - 0.42 0.59 - 0.41 0.44 - 0.56 0.63 - 0.37
0.44 - 0.56 0.62 - 0.38 0.47 - 0.53 0.42 - 0.58
0.56 - 0.44 0.57 - 0.43 0.61 - 0.39 0.63 - 0.37
0.62 - 0.38 0.38 - 0.62 0.60 - 0.40 0.57 - 0.43
0.45 - 0.55 0.41 - 0.59 0.52 - 0.48 0.64 - 0.36
0.49 - 0.51 0.62 - 0.38 0.60 - 0.40 0.40 - 0.60
0.47 - 0.53 0.50 - 0.50 0.63 - 0.37 0.39 - 0.61
0.59 - 0.41 0.56 - 0.44 0.49 - 0.51 0.56 - 0.44
0.44 - 0.56 0.46 - 0.54 0.47 - 0.53 0.50 - 0.50
0.59 - 0.41 0.53 - 0.47 0.35 - 0.65 0.55 - 0.45
0.65 - 0.35 0.47 - 0.53 0.39 - 0.61 0.61 - 0.39
0.37 - 0.63 0.35 - 0.65 0.40 - 0.60 0.55 - 0.45
0.56 - 0.44 0.40 - 0.60 0.46 - 0.54 0.53 - 0.47
0.60 - 0.40 0.48 - 0.52 0.60 - 0.40 0.37 - 0.63
0.52 - 0.48 0.61 - 0.39 0.37 - 0.63 0.64 - 0.36
0.40 - 0.60 0.41 - 0.59 0.51 - 0.49 0.50 - 0.50
0.55 - 0.45 0.45 - 0.55 0.46 - 0.54 0.40 - 0.60
0.47 - 0.53 0.44 - 0.56 0.62 - 0.38 0.64 - 0.36
0.63 - 0.37 0.60 - 0.40 0.62 - 0.38 0.50 - 0.50
0.59 - 0.41 0.54 - 0.46 0.63 - 0.37 0.59 - 0.41
0.54 - 0.46 0.42 - 0.58 0.40 - 0.60 0.62 - 0.38
0.49 - 0.51 0.50 - 0.50 0.58 - 0.42 0.61 - 0.39
0.42 - 0.58 0.49 - 0.51 0.40 - 0.60 0.61 - 0.39
0.41 - 0.59 0.38 - 0.62 0.42 - 0.58 0.36 - 0.64
36
Tabla 6: Microsatélites considerados para las simulaciones.
Microsatélite
Número
de
Alelos
Tamaño de
los alelos
Alelos
Frecuencia
PE*
LCA 19* 12 85 – 117 85
89
91
93
95
99
101
103
105
107
111
117
0.1170
0.0213
0.0106
0.0319
0.0213
0.1277
0.4787
0.0638
0.0319
0.0213
0.0638
0.0106
0.548
YWLL 29** 9 214 – 234 214
216
218
220
222
224
226
228
234
0.0957
0.2128
0.0957
0.3191
0.0745
0.1277
0.0532
0.0106
0.0106
0.634
YWLL 40** 5 180 – 188 180
182
184
186
188
0.2340
0.0106
0.0957
0.1489
0.5106
0.408
YWLL 46** 4 97 – 109 97
103
105
109
0.8085
0.0106
0.0745
0.1064
0.174
YWLL 43** 8 128 – 156 128
138
142
144
146
148
150
156
0.0326
0.0109
0.2826
0.0761
0.4674
0.0217
0.0978
0.0109
0.452
LCA 5* 7 188 – 206 188
190
192
194
202
204
206
0.2021
0.0851
0.0957
0.0638
0.3617
0.1809
0.0106
0.575
YWLL 08** 20 134 – 186 134
138
140
0.1489
0.0106
0.0638
0.844
37
142
148
150
152
154
156
158
162
166
168
170
176
178
180
182
184
186
0.0532
0.0426
0.1170
0.0745
0.0319
0.0532
0.0319
0.0106
0.0745
0.0319
0.0426
0.0745
0.0851
0.0106
0.0213
0.0106
0.0106
LCA 23* 11 132 – 160 132
136
138
142
144
146
148
149
156
158
160
0.0106
0.0851
0.0532
0.2128
0.0106
0.2447
0.2660
0.0106
0.0106
0.0106
0.0851
0.621
LCA 22* 4 113 – 119 113
115
117
119
0.6383
0.2340
0.0532
0.0745
0.294
YWLL 36** 11 149 – 179
149
151
153
157
159
165
169
171
173
175
179
0.2340
0.1277
0.0638
0.1596
0.0745
0.0851
0.0532
0.0319
0.0213
0.1277
0.0213
0.733
* Penedo et al. (1998)
** Lang et al. (1996)
*** PE: probabilidad de exclusión
Tabla 7. Porcentajes de interacciones donde no se asigna correctamente el padre a todos los hijos (INCP) y de hijos sin padre discriminado (HSPD), utilizando
SNP (40, 60, 80 y 100) y microsatélites (10, 15, 20 y 25) en el escenario 1 (5 machos y 100 hembras).
Panel de 40 SNP Panel de 60 SNP Panel de 80
SNP
Panel de 100
SNP
Panel de 10
Microsatélites
Panel de 15
Microsatélites
Panel de 20
Microsatélites
Panel de 25
Microsatélites
INCP HSPD INCP HSPD INCP HSPD INCP HSPD INCP HSPD INCP HSPD INCP HSPD INCP HSPD
82.476 2.408 16.571 0.198 2.476 0.029 0.191 0.002 79.429 2.337 22.095 0.274 1.524 0.015 0.191 0.002
83.619 2.469 18.476 0.219 2.286 0.025 0.571 0.006 77.524 2.383 23.429 0.303 2.667 0.031 0.191 0.002
82.286 2.530 18.476 0.227 2.095 0.021 0.191 0.002 74.667 2.105 21.333 0.261 2.095 0.021 0.381 0.004
85.714 2.562 19.619 0.225 1.333 0.013 0.381 0.004 80.191 2.482 20.952 0.290 1.333 0.015 0.571 0.006
83.238 2.337 16.571 0.213 1.905 0.019 0.381 0.004 80.952 2.227 25.905 0.351 1.714 0.017 0.381 0.004
82.095 2.531 17.143 0.194 0.952 0.010 0.191 0.002 75.429 2.166 19.429 0.261 1.333 0.015 0.191 0.002
82.286 2.476 17.524 0.210 1.714 0.017 0.191 0.002 78.095 2.343 22.095 0.271 0.571 0.006 0.191 0.002
85.524 2.591 16.571 0.194 2.095 0.021 0.381 0.004 79.429 2.427 21.143 0.255 1.905 0.021 0.381 0.004
82.667 2.526 16.191 0.183 1.900 0.019 0.571 0.006 75.810 2.284 25.524 0.330 1.333 0.015 0.191 0.002
84.571 2.562 18.286 0.231 2.857 0.029 0.381 0.004 75.429 2.170 22.857 0.286 2.095 0.021 0.381 0.004
84.191 2.491 17.143 0.227 2.095 0.021 0.191 0.002 78.095 2.257 20.000 0.265 2.476 0.027 0.191 0.002
85.143 2.587 15.619 0.181 1.905 0.019 0.191 0.002 75.810 2.202 22.667 0.282 1.714 0.017 0.191 0.002
84.571 2.446 16.762 0.206 2.286 0.023 0.191 0.002 78.667 2.368 21.333 0.288 2.857 0.029 0.191 0.002
84.381 2.610 16.762 0.204 2.095 0.021 0.381 0.004 78.286 2.351 20.191 0.263 1.524 0.015 0.381 0.004
81.714 2.339 19.238 0.229 0.952 0.013 0.191 0.002 76.191 2.248 20.571 0.259 1.333 0.015 0.191 0.002
84.000 2.516 16.381 0.192 1.524 0.015 0.381 0.004 79.048 2.322 18.286 0.225 0.571 0.006 0.571 0.006
85.333 2.469 17.143 0.204 1.905 0.021 0.191 0.002 76.571 2.448 22.476 0.276 1.333 0.015 0.191 0.002
84.191 2.423 15.619 0.183 1.333 0.013 0.381 0.004 79.429 2.415 17.524 0.219 1.905 0.021 0.191 0.002
86.667 2.627 19.048 0.229 2.286 0.023 0.381 0.004 77.143 2.291 21.905 0.303 0.571 0.006 0.191 0.002
84.191 2.549 15.238 0.183 0.952 0.010 0.191 0.002 76.571 2.316 21.333 0.257 0.571 0.006 0.191 0.002
83.943* 2.502 17.219 0.206 1.847 0.019 0.305 0.003 77.638 2.307 21.552 0.276 1.571 0.017 0.276 0.003
1.374** 0.082 1.258 0.017 0.528 0.005 0.130 0.001 1.790 0.101 2.053 0.031 0.679 0.007 0.131 0.001
* Media
** Desviación estándar
39
Tabla 8. Porcentajes de interacciones donde no se asigna correctamente el padre a todos los hijos (INCP) y de hijos sin padre discriminado (HSPD), utilizando
SNP (40, 60, 80 y 100) y microsatélites (10, 15, 20 y 25) en el escenario 2 (10 machos y 100 hembras).
Panel de 40 SNP Panel de 60
SNP
Panel de 80
SNP
Panel de 100
SNP
Panel de 10
Microsatélites
Panel de 15
Microsatélites
Panel de 20
Microsatélites
Panel de 25
Microsatélites
INCP HSPD INCP HSPD INCP HSPD INCP HSPD INCP HSPD INCP HSPD INCP HSPD INCP HSPD
98.909 5.467 35.636 0.466 3.636 0.036 0.182 0.002 97.091 5.126 41.273 0.582 5.455 0.055 0.364 0.004
99.091 5.558 36.000 0.478 3.091 0.033 0.546 0.006 97.273 5.095 41.455 0.613 4.364 0.047 1.273 0.013
96.909 5.295 30.909 0.407 3.455 0.035 0.364 0.004 96.364 5.111 38.546 0.566 6.727 0.071 0.727 0.007
98.727 5.271 30.000 0.369 2.727 0.027 0.546 0.007 97.454 4.842 39.818 0.576 3.818 0.042 0.364 0.004
98.364 5.349 31.818 0.446 4.546 0.047 0.364 0.004 97.273 5.107 37.273 0.558 4.546 0.047 0.909 0.009
98.727 5.260 34.000 0.436 3.636 0.036 0.727 0.007 96.364 4.831 47.636 0.691 5.636 0.056 1.273 0.013
98.182 5.624 33.273 0.447 4.000 0.044 0.364 0.004 97.273 4.918 48.000 0.715 3.273 0.033 0.727 0.007
98.364 5.422 39.455 0.522 2.000 0.022 0.182 0.002 96.727 5.082 37.273 0.538 4.000 0.040 0.546 0.006
97.818 5.327 37.091 0.502 4.909 0.049 0.364 0.004 96.364 5.120 46.546 0.671 4.182 0.044 0.909 0.009
98.546 5.667 35.636 0.467 2.727 0.027 0.546 0.006 97.636 5.113 41.818 0.593 3.818 0.038 0.727 0.007
98.000 5.656 34.727 0.473 3.455 0.035 0.727 0.007 97.273 4.878 42.909 0.616 6.000 0.067 0.909 0.009
97.273 5.571 31.455 0.406 2.909 0.029 0.364 0.004 96.727 5.166 45.273 0.664 5.091 0.055 0.546 0.006
98.182 5.416 37.636 0.482 4.909 0.053 0.546 0.006 97.273 5.084 42.546 0.620 4.182 0.046 1.455 0.015
98.364 5.509 32.909 0.456 4.546 0.046 0.364 0.004 97.636 5.242 41.455 0.624 5.091 0.053 1.273 0.013
98.182 5.740 35.091 0.446 3.455 0.036 0.182 0.002 96.546 5.082 42.182 0.595 3.818 0.040 0.546 0.006
99.273 5.529 35.455 0.449 3.818 0.038 0.182 0.002 96.000 4.947 38.000 0.566 6.546 0.066 0.364 0.004
98.546 5.246 35.091 0.449 4.364 0.046 0.364 0.004 96.546 4.935 44.000 0.647 4.182 0.044 0.727 0.007
98.727 5.455 33.091 0.409 4.182 0.042 0.727 0.007 97.636 5.107 41.455 0.635 3.273 0.033 0.364 0.004
98.546 5.402 37.091 0.469 4.000 0.040 0.182 0.002 96.546 4.989 40.000 0.629 5.091 0.055 0.909 0.009
98.909 5.476 31.818 0.409 3.636 0.038 0.364 0.004 97.455 5.167 43.455 0.655 4.182 0.044 0.364 0.004
98.382* 5.462 34.409 0.449 3.700 0.038 0.409 0.004 96.973 5.047 42.045 0.618 4.664 0.049 0.764 0.008
0.575** 0.145 2.484 0.036 0.767 0.008 0.185 0.002 0.512 0.117 3.156 0.047 1.005 0.011 0.347 0.003
* Media
** Desviación estándar
40
Tabla 9. Porcentajes de interacciones donde no se asigna correctamente el padre a todos los hijos (INCP) y de hijos sin padre discriminado (HSPD), utilizando
SNP (40, 60, 80 y 100) y microsatélites (10, 15, 20 y 25) en el escenario 3 (15 machos y 100 hembras)
Panel de 40
SNP
Panel de 60
SNP
Panel de 80
SNP
Panel de 100
SNP
Panel de 10
Microsatélites
Panel de 15
Microsatélites
Panel de 20
Microsatélites
Panel de 25
Microsatélites
INCP HSPD INCP HSPD INCP HSPD INCP HSPD INCP HSPD INCP HSPD INCP HSPD INCP HSPD
99.652 8.397 49.391 0.685 7.304 0.073 0.174 0.002 99.478 7.600 53.739 0.911 8.000 0.089 1.391 0.014
100.000 8.454 50.609 0.717 5.913 0.063 0.348 0.004 100.000 7.591 58.609 0.990 8.348 0.087 1.217 0.012
99.826 8.268 50.957 0.743 6.609 0.068 0.870 0.009 99.826 7.513 55.130 0.890 6.261 0.070 1.391 0.014
100.000 8.137 45.739 0.654 5.739 0.061 0.522 0.005 99.826 7.543 56.348 0.908 8.348 0.087 1.391 0.014
99.652 8.031 49.044 0.746 6.261 0.068 1.044 0.010 99.826 7.722 56.522 0.925 6.957 0.073 0.696 0.007
99.826 8.059 51.304 0.777 4.174 0.047 0.348 0.004 99.826 7.343 53.739 0.894 6.435 0.068 0.870 0.009
99.826 8.360 46.957 0.675 6.435 0.066 0.870 0.009 99.652 7.950 58.957 0.932 8.870 0.094 1.217 0.012
100.000 8.160 51.304 0.753 5.913 0.061 0.522 0.005 99.478 7.640 57.565 0.913 6.957 0.071 1.391 0.014
99.826 8.162 48.870 0.757 6.087 0.068 0.696 0.007 99.652 7.558 59.652 0.964 8.522 0.087 0.870 0.009
100.000 8.397 49.739 0.730 6.435 0.068 0.348 0.004 99.478 7.685 56.870 0.955 6.609 0.071 0.522 0.005
100.000 8.257 48.174 0.717 6.783 0.071 0.522 0.005 100.000 7.551 56.348 0.897 7.130 0.080 1.391 0.014
99.826 8.235 48.000 0.675 5.217 0.052 0.870 0.009 99.652 7.473 60.522 0.986 7.304 0.078 2.087 0.023
99.826 8.320 48.348 0.692 5.044 0.050 0.348 0.004 100.000 7.673 57.044 1.007 8.870 0.094 1.391 0.014
100.000 8.374 52.348 0.817 6.435 0.066 1.217 0.012 99.826 7.543 56.696 0.880 6.087 0.063 0.348 0.004
100.000 8.567 47.478 0.663 6.261 0.063 0.522 0.005 100.000 7.379 57.391 0.943 8.522 0.090 1.913 0.019
99.826 8.577 50.957 0.798 3.478 0.035 0.174 0.002 99.478 7.515 57.565 0.920 6.957 0.071 1.391 0.014
100.000 8.296 47.652 0.701 5.739 0.057 0.348 0.004 99.652 8.070 57.391 0.943 5.044 0.054 1.044 0.010
99.652 8.461 51.130 0.748 5.217 0.054 0.174 0.002 99.478 7.708 54.435 0.915 7.130 0.075 1.913 0.019
100.000 8.230 52.522 0.777 7.130 0.073 0.348 0.004 99.826 7.757 55.826 0.929 7.130 0.082 1.044 0.010
99.652 8.290 52.174 0.764 6.783 0.073 1.044 0.010 99.304 7.492 54.783 0.903 8.000 0.084 0.696 0.007
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* Media
** Desviación estándar
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