RESUMEN
Los Extractos Dializables de Leucocitos (DLEs) son pequeñas moléculas mensajeras
inmunológicas de aproximadamente 5 KDa., hidrofílicas y altamente polares, producidas
en pequeñas cantidades por células linfoides de los organismos de nivel más alto.
Presentan un gran efecto terapéutico, sin producir efectos adversos, son libres de
gérmenes, y fueron descubiertos por Sherwood Lawrence en 1954.
En este estudio se busca conocer un poco más acerca de su mecanismo de acción,
al parecer interactúan directamente con algunas células y promueven la producción de
citocinas que actúan de forma directa sobre células fagocíticas para que éstas sean
capaces de controlar la replicación intracelular bacterias.
Como primer paso células de bazo estimuladas con DLE a diferentes tiempos
fueron recolectadas para buscar por RT-PCR la presencia de los mRNA para dos citocinas
importantes como son TNFα e IFNγ y los sobrenadantes de éstos cultivos fueron utilizados
para buscar ambas citocinas por el método de ELISA. Los resultados mostraron solo la
presencia de IFNγ a las 24h de incubación.
Estos mismos sobrenadantes fueron adicionados a cultivos de macrófagos
infectados con Listeria monocytogenes y se observa que hubo una reducción en el número
de bacterias intracelulares por lo que se concluye que el sobrenadante de las células de
bazo estimuladas con DLEs en donde hay presencia de IFNγ puede ayudar, a los
macrófagos infectados a controlar la infección por inducir sus mecanismos microbicidas.
1. INTRODUCCIÓN En 1942 Landstainer y Chase realizaron por primera vez la transferencia de
hipersensiblidad retardada (inmunidad celular) de un animal inmune a otro no
inmune, empleando para ello cobayos sensibilizados con el Bacilo de Calmette y
Guerin (BCG) y Dinitrobenceno (DNCB), los leucocitos obtenidos de estos
animales fueron inoculados en otro animal no inmune, transfiriendo en éste último
la inmunidad celular o hipersensibilidad tardía (DTH) que presentaban los
animales originales (Petersen et al 1979).
Posteriormente Lawrence demostró que si estos leucocitos eran lisados, el lisado
mantenía la capacidad de transferir DTH, cabe mencionar que en aquellos tiempos
se creía que solo una molécula era la responsable de este fenómeno y se le
bautizó con el nombre de “Factor de Transferencia” (FT) (Lawrence et al 1955)
actualmente se le llama apropiadamente extracto dializable de leucocitos (DLE).
En 1963 Lawrence y col. demostraron que el DLE era capaz de pasar por una
membrana con un corte molecular de 10 KDa, sin perder su actividad (Lawrence et
al 1963) y en un principio se pensó que este producto contenían solo una especie
molecular, sin embargo, al analizar con mayor detalle estos extractos, se encontró
que estaban compuestos por mas de 200 especies moleculares entre ellas la
timosina, prostaglandinas, hipoxantina, nicotinamida, quimioatrayentes para
monocitos, y un factor para la inhibición de migración de neutrófilos por mencionar
algunas por mencionar algunas (Fudenberg et al 1993).
En los primeros experimentos de Landstainer y de Lawrence, se observaba una
relación entre la respuesta al antígeno por parte del donador, y la transferencia de
la respuesta al mismo antígeno en el receptor; esto hizo suponer que la
transferencia llevada a cabo por el “Factor de Transferencia” (FT) era antígeno
espécifica.
En los experimentos de Rapaport y Lawrence se obtuvo DLE de un grupo de
donadores positivos a coccidioidina, procedentes de California donde el antígeno
es endémico; y se aplicó a un grupo de Neoyorquinos con respuestas de DTH
negativas a la coccidioidina; observándose que los Neoyorkinos dieron una DTH
positiva hacia la coccidiodina de manera similar al donador. (Rapaport et al 1959)
Años más tarde Borkowsky demuestra que los Factores de Transferencia
contenidos dentro de los extractos eran capaces de unirse específicamente al
antígeno que les daba origen, pero no así a los anticuerpos contra el mismo
antígeno (Borkowsky et al 1981).
Petersen y col. desarrollaron un modelo murino, en el cual estudiaron la respuesta
celular antígeno especifica a través de la determinación de la transferencia de
hipersensibilidad cutánea tardía (DTH), empleando DLE obtenido de esplenocitos
de ratones sensibilizados con PPD, ferritina, peroxidasa de rábano, entre otros,
aplicándolo posteriormente a animales no sensibilizados; 24 horas después los
animales presentaron DTH positiva sólo contra los antígenos con los cuales había
sido inmunizado el donador; además emplearon como control negativo DLE
obtenido de ratones no inmunizados, y al aplicar este último a ratones no
inmunizados estos no presentaron DTH contra ninguno de los antígenos
estudiados (Petersen et al 1979).
Más tarde Kirkpatrick confirmó los trabajos de Borkowsky donde se demostraba
que moléculas dentro del DLE eran capaces de unirse al mismo antígeno
empleado para inmunizar a los animales de donde se obtuvo el DLE, es decir las
moléculas de FT eran antígeno específicas. Kirkpatrick empleó DLE de ratones
sensibilizados con ferritina, los cuales incubó sobre superficies cubiertas con
ferritina, al recuperar el DLE éste perdía su capacidad de transferir la DTH contra
el antígeno; esta actividad podía recuperarse si se eluían de la superficie las
moléculas de FT empleando urea 8M o acetonitrilo (Kirkpatrick et al 1985;
Kirkpatrick et al 1992).
Los DLEs están compuestos por diversas moléculas, muchas de ellas con
actividad biológica, de manera general podemos dividir a los componentes de los
DLEs en moléculas antígeno independientes y antígeno dependientes (Wilson et
al 1979; Fudenberg et al 1993).
Entre los componentes antígeno independientes se encuentran moléculas que
tienen un efecto no específico sobre la inmunidad celular y participan activamente
en el fenómeno inflamatorio como son: prostaglandinas, nicotinamida, ácido
ascórbico, histamina, serotonina, timosina, quimioatrayentes para monocitos entre
otros (Fudenberg et al 1993; Burger et al 1976).
Dentro de los componentes antígenos dependientes se encuentran los
denominados Factores de Transferencia (FT), moléculas de naturaleza peptídica
con un peso molecular comprendido de 3.5 a 5 KDa, y que son capaces de
transferir la respuesta inmune celular de manera antígeno específica, contra los
antígenos hacia los cuales responde el donador de leucocitos de donde se ha
obtenido el extracto.
Con respecto a la estructura del Factor de Transferencia hasta el día de hoy no se
conoce totalmente, sin embargo, diversos grupos de investigación han tratado de
caracterizarlos por ejemplo:
Baram y Mosko fraccionaron el DLE específico para tuberculosis, en columnas de
celulosa, a partir del cual obtuvieron fracciones capaces de transferir sensibilidad a
PPD en individuos no sensibilizados previamente. Empleando filtración en gel
obtuvieron 2 fracciones capaces de transferir sensibilidad a PPD, una de éstas no
era dializable y eluía en la fracción de las gamma globulinas; mientras que la otra
estaba compuesta por un polinucleótido, en el cual se encontraban presentes
adenina, guanina y citosina (Baram et al 1965)
En 1967 Árala, Chávez y Heremans empleando una combinación de filtración en
gel y electroforesis de alto voltaje, describieron proteínas dentro de las fracciones
activas del extracto (Arala-Chavez et al 1967); en 1973 Neidhart y col separaron
así 6 fracciones de DLE específico para tuberculosis de 5 donadores diferentes;
encontrando que la fracción 4 era la que tenía mayor actividad (Neidhart et al
1973). Kronh desarrolló estudios similares de cromatografía; pero el encontró 7
fracciones de las cuales 3 mostraban actividad biológica (Krohn et al 1976) y en
1977 Wilson, Welch y Fundeberg publicaron un análisis en el cual identificaron una
fracción activa de “factor de transferencia dializable humano” lo que hoy
entendemos por DLE, de esta fracción separaron dos subfracciones de las cuales
solo una transfería DTH en cobayos (Wilson et al 1977).
Borvak y Mayer realizan un fraccionamiento bioespecífico en el cual el DLE se
hace pasar por una columna de afinidad con m-aminofenil y ácido borónico, y
posteriormente se mide la absorbancia en luz ultravioleta; con éste
fraccionamiento se concentró material proteíco y además contenía purinas y
pirimidinas, por lo tanto los FT podían ser polipéptidos unidos a fracciones de RNA
21 . Este mismo grupo de trabajo realizó una purificación parcial de dos fracciones
principales por cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) demostrando la
presencia de lisina, glicina, serina y ácido glutámico (Borvak et al 1990).
A partir de 1992, Kirkpatrick y col. purificaron factor de transferencia específico
(FTs), a partir de DLE obtenidos de ratones inmunizados con albúmina de huevo y
ferritina de caballo, por diferentes métodos como: afinidad al antígeno,
cromatografía de fase reversa y HPLC; analizando posteriormente por
electroforesis en geles de poliacrilamida con dodecil sulfato de sodio (SDS-PAGE)
y ensayos in vivo para medir su actividad. Tras estos trabajos la conclusión
principal fué que los FT antígeno especifico eran moléculas de bajo peso
molecular de aproximadamente 5000 Da y que son hidrofílicas y altamente
polares (Kirkpatrick et al 1992). Además Kirkpatrick, logro aislar y secuenciar dos
péptidos diferentes de manera consistente en DLE murino y bovino. La secuencia
que encontraron fue: MxLLYAQDLEDN y MxLLYAQDVEDN, ésta secuencia se
encontraba presente en todos los DLE analizados. Dichos péptidos no eran
capaces de transferir DTH, pero si de inhibirla si se administraban con el FT; lo
anterior hace suponer que dichos péptidos podrían estar compitiendo con el sitio
receptor de los FT en la célula blanco, y probablemente corresponden a una parte
del FT que se une a la célula de manera especifica independientemente del
antígeno (Kirkpatrick et al 2000).
Se han desarrollado diversas hipótesis acerca del mecanismo de acción del DLE,
de acuerdo con los trabajos realizados, tanto “in vitro”, “ex vivo” e “in vivo” desde
su descubrimiento. Pero dentro de las actividades inmunológicas del DLE que se
han demostrado previamente tenemos:
• Proliferación de linfocitos específicos para tuberculina empleando DLE;
realizado “in vitro” en células humanas (Levin et al 1973).
• Aumento de la capacidad de respuesta de linfocitos a mitógenos, realizado
“in vitro” en células humanas (Petersen et al 1979; Burger et al 1976).
• Producción de IFNγ, in vivo ratones sensibilizados con DLEs específicos
(Kirkpatrick et al 1995).
• Producción de células T citotóxicas especificas para células de sarcoma
osteogénico, utilizando DLE obtenido de convivientes (Gottlieb et al 1995).
• Secreción de IFNγ y de IL-12, específicas de antígeno, “in vitro” células de
bazo de ratón (Alvarez et al 1996).
• Incremento en la producción de interefron gamma en pacientes con herpes
zoster tratados con Fcator de transferencia (Estrada Parra S. et al 1998).
• Incremento en el receptor para IL-2 (CD25) en células CD4+, empleando
para la obtención del DLE una membrana de diálisis de 3500Da; realizado
in vitro en células mononucleares periféricas humanas (Pérez-Tapia 1999).
• Modulan la expresión de osteopontina en células mononucleares humanas
(in vitro) (Pérez-Tapia et al 2001).
• Inducción de la expresión de IFN γ en células mononucleares humanas (in
vitro) y en un modelo murino de infección con tuberculosis (in vivo) (Fabre et
al 2004).
• Incremento de células NKT y CD4 + CD25 +, en un ensayo ex vivo a las
24h de haber aplicado el DLE en personas sanas (Rodríguez Flores et al
2004).
• Incremento en la expresión de Beta-defensinas en células de sangre
periférica (Rivera Ordaz A 2005).
• Presencia de ligandos para TLR-2 en los DLEs (Robledo F, 2006).
• Activación y proliferación de linfocitos T CD4+ (De la Fuente M. 2006).
• Incremento de linfocitos T CD4+ y en la expresión de HLA-DR en
monocitos de pacientes con sepsis y tratados con DLE (Pérez-Tapia 2007).
Desde el descubrimiento de los DLE se han utilizado para el tratamiento de
muchas enfermedades que afectan al hombre. En la tabla I se describen los
padecimientos en los cuales los DLE han sido utilizados, los resultados que se han
obtenido son heterogéneos ya que el éxito de su uso depende del padecimiento y
por supuesto del estado clínico del paciente.
Tabla I. Enfermedades en las que se ha dado tratamiento con DLE
I. Defectos de amplio espectro en inmunidad mediada por células (Inmunodeficiencias severas)
II. Cáncer (principalmente cuando tiene etiología viral) o para evitar metástasis específicas.
A. Defectos congénitos
Síndrome de Wiskott-Aldrich
Ataxia telagiectasia
Síndrome de inmunodeficiencia severa combinada
Síndrome parcial de Di George
Disgamaglobulinemia con defectos en inmunidad
celular
B. Defectos de origen desconocido
Sarcoidosis
Enfermedad de Hodking
Osteosarcoma
Cáncer de seno
Hipernefroma
Carcinoma nasofaríngeo
III.- Enfermedades Infecciosas producidas por IV.- Enfermedades autoinmunes
A.- Hongos
Histoplasmosis diseminada
Coccidioidomicosis diseminada
B.- Virus
Citomegalovirus
Herpes zoster
Sarampión
Otros (especialmente aquellos comunes en
inmunodeficiencias)
C. Infecciones provocadas por micobacterias
Tuberculosis
Lepra
3. Mycobacterium fortuitum
D. Infecciones provocadas por protozoarios
Leishmaniasis cutánea
A.- Enfermedades autoinmunes no órgano específico
Lupus eritematoso crónico discoide
Síndrome de Behcet
Tabla tomada de Wilson y Fudenberg (1983).
De los DLEs se ha observado su actividad no es solo como estimulante del
sistema inmune, sino también como supresor de la respuesta, es por esto que se
considera un inmunomodulador. Como sabemos, los inmunomoduladores son
sustancias con la capacidad de mediar los efectos inmunológicos, ya sea
inhibiendo los mecanismos supresores que disminuyen la capacidad de defensa
del huésped o incrementando la capacidad de respuesta del mismo, además los
DLE se han empleado solos o con otros agentes quimioterapeúticos; el número
de dosis empleadas y la frecuencia de estas dependen del padecimiento en
cuestión y no se han encontrado efectos secundarios. (Estrada Parra S. et al
1999)
El efecto del DLE se evalúa en base a la evolución clínica del padecimiento
utilizando pruebas de laboratorio encaminadas a analizar diferentes componentes
del sistema inmune.
El DLE es preparado a partir de donadores de sangre sanos que son sometidos a
pruebas para evitar la transmisión de infecciones por el VIH, la Hepatitis B,
hepatitis C, Brucelosis, VDRL etc, se escogen los donadores que llenen los
requisitos para una donación de una unidad de sangre, es decir que no tengan
antecedentes de hepatitis y que hayan resultado negativos en las pruebas
anteriores. El DLE también se obtienen de tejidos linfoides de donadores sanos.
Los leucocitos se lisan por choque térmico, y posteriormente se dializa, con una
membrana de diálisis de corte molecular de 10 000 Da; todas las moléculas
obtenidas menores a este peso molecular son las que componen el DLE; a los
extractos así obtenidos se les denomina polivalentes, ya que son capaces de
transferir todas las respuestas celulares positivas del donador del cual se
obtuvieron los leucocitos.
Además se pueden preparar DLE antígeno especifico, para esto, se obtiene
sangre periférica del donador reactivo al antígeno; se purifican los leucocitos;
posteriormente se colocan en placas de cultivo en contacto con el antígeno, el FT
especifico para dicho antígeno es liberado al medio; al recuperar el sobrenadante
este mantiene la actividad de transferir la respuesta celular. (Lawrence HS &
Ascher MS 1974).
2. ANTECEDENTES En 1983 Estrada-Parra y cols. demostraron que pacientes con tuberculosis
pulmonar avanzada resistentes al tratamiento antifímico, al ser tratados con factor
de transferencia (1U cada semana por vía oral durante un mes y 1U cada quince
días por vía subcutánea durante un mes), obtenido de donadores sanos PPD
positivos, tuvieron franca mejoría tanto inmunológica como clínica, además de que
estos pacientes se volvieron negativos a la baciloscopía después del tratamiento
con factor de transferencia específico (Estrada-Parra et al, 1983).
En un modelo experimental murino de tuberculosis, Fabre y cols probaron la
eficacia de los DLE al medir la sobrevida de los animales infectados y tratados
con DLE y antifímicos; los resultados demostraron que estos ratones mejoraron
notablemente al utilizar la dosis de 0.1 U, con esta dosis el porcentaje de
sobrevida fue de un 100% siendo todos estos valores estadísticamente
significativos con respecto a los grupos controles (Fabre et al 2004).
Este modelo experimental resulto excelente, pero se tenía la desventaja de ser
extremadamente caro, tanto por el número de ratones que se emplean como por
el tiempo que dura el experimento. Por esta razón se necesitaba desarrollar un
modelo in vitro que nos permitiera evaluar el efecto de estos extractos
directamente sobre la infección del macrófago con M. tuberculosis. Las hipótesis
que se tenían acerca del efecto del factor eran dos:
La primera consistía en proponer que los DLEm específicos de tuberculosis
(DLEmTB) actúan directamente sobre los macrófagos estimulándolos a producir los
mecanismos microbicidas que les permitan controlar la infección con
M. tuberculosis H37Rv. La segunda hipótesis era proponer que los DLEmTB actúan
sobre células del bazo (Macrófagos, células dendríticas, linfocitos T, linfocitos B)
provocando que éstas produzcan citocinas que estimulen a los macrófagos para
activar sus mecanismos microbicidas y de esta manera controlar la infección con
M. tuberculosis H37Rv. En el 2005 Valderrabano Ortiz utilizando este modelo in
vitro concluye que el sobrenadante de cultivos de células de bazo que contiene
DLEmTB tiene un efecto biológico estadísticamente significativo sobre el control de
la infección con M. tuberculosis H37Rv en los macrófagos de la línea celular
J774A.1 y que no hay algún efecto biológico cuando el DLEmTB se agrego
directamente sobre los macrófagos de la linea J774A.1 infectados con M.
tuberculosis H37Rv (Valderrabano Ortiz ; 2004)
Hasta la fecha no se ha estudiado los componentes presentes en los
sobrenadantes de células de bazo estimuladas con DLEm que les permite a los
macrófagos controlar la infección, por lo que en este trabajo se estudiaron los
sobrenadantes de células de bazo estimulados con DLE específico para Listeria
monocytogenes (DLELm). Listeria al igual que M. tuberculosis es una bacteria
intracelular, pero con la gran ventaja de que su crecimiento es muy rápido lo que
nos permitirá en menos tiempo observar los efectos provocados por los DLEs.
3. OBJETIVO Analizar los mecanismos de activación celular involucrados cuando células de
bazo son estimuladas con los EDL
3.1. OBJETIVOS PARTICULARES
Estandarizar la técnica de RT-PCR para las citocinas a determinar.
Analizar la expresión de mRNA para IFNγ, TNFα por RT-PCR en células de
bazo estimuladas con DEL.
Analizar la presencia de IFNγ, TNFα por el método de ELISA en los
sobrenadantes de células de bazo estimuladas con DLE a diferentes
tiempos de incubación.
4. JUSTIFICACIÓN Actualmente se conoce una gran cantidad de beneficios obtenidos al emplear los
DLEs como terapia, sin embargo hasta el momento no se conoce con claridad el
mecanismo de acción de estos extractos por lo que en este trabajo intentaremos
conocer que citocinas se producen en cultivos de células de bazo estimuladas con
DLEs y si estas son suficientes para que macrófagos infectados con
L. monocytogenes puedan controlar la infección.
5. HIPÓTESIS El DLE actúa sobre células del bazo (Macrófagos, células dendríticas, linfocitos T,
linfocitos B) induciéndolos a que se produzcan citocinas como TNFα o IFNγ que
estimulen a los macrófagos para activar sus mecanismos microbicidas que ayuden
a eliminar al microorganismo intracelular.
6. MATERIALES Y METODOS 6.1. Obtención de células de bazo
Los ratones BALB/c sanos se sacrificaron y se les extrajo el bazo, los órganos se
colocaron en la superficie de una tela de organza que cubrió la boca de un frasco
estéril para posteriormente macerarlos usando solución de Hanks.
La suspensión libre de grumos se lavó dos veces con solución de Hanks a
1500rpm durante 5 minutos, y después se resuspendió en 5ml de medio DMEM
con 10% de suero fetal bovino (SFB), así mismo se determinó la viabilidad con
solución de azul de tripano. La suspensión celular se ajustó a 1X106 células
viables/ml.
6.2. Activación celular En una botella de cultivo se colocaron 5 X106 células de bazo viables por pozo y
las células fueron estimuladas con: 2 µg/ml de DLE Lm, o con 0, 40, 80 y
200µg/ml de PMA (phorbol, myristate, ascorbic) como control positivo (de las
citocinas a determinar).
Los cultivos se incubaron a 37°C en atmósfera húmeda de CO2 48h los que
contenían PMA y durante cinco días. Terminado el tiempo de incubación los
cultivos fueron centrifugados a 1500rpm y el sobrenadante fue guardado en
alícuotas de 1ml para la determinación de citocinas mientras que las células
fueron lisadas en Trizol para la extracción de RNA y determinación de citocinas
por RT-PCR.
6.3. Aislamiento de RNA utilizando Trizol (Invitrogen Life technologies)
Se realizó la extracción de RNA total a partir de los cultivos arriba mencionados, a
las células lisadas en 1ml de Trizol se les adicionaron 200 µl de cloroformo, se
mezcló en vortex vigorosamente por 30 segundos obteniéndose así una
suspensión de color rosa lechoso, se incubó a 4ºC por 5 minutos y se centrífugo a
10, 000rpm por 15 minutos. Posteriormente se trasfirió la fase acuosa a un tubo
Eppendorf nuevo y se adicionaron 500µL de isopropanol, se incubaron por 15
minutos a 4ºC y se centrifugó a 10, 000 rpm durante 15 minutos a 4ºC el
precipitado obtenido se lavó con 500 µL de etanol al 80% en agua DEPC y se
centrífugo a 7500 rpm a 4°C por 5 minutos, se removió el sobrenadante y se
elimino el exceso de etanol con ayuda de una micropipeta, el precipitado (RNA
total)se dejo secar durante 5 a 10 minutos en la campana de flujo laminar, y
posteriormente se disolvió el RNA en 13 µL de agua DEPC y se procedió a
cuantificar cada muestra.
6.4. Cuantificación del RNA Para la determinación de las citocinas de interés es importante tener la misma
cantidad de muestra con la que se trabajará, por ello, después de la extracción se
toman 2µl del RNA y se diluyen en 98 µl de agua, es decir se hace una dilución
1:50 y cada una de estas diluciones se colocaron en una celda de cuarzo, para
leerla en un espectrofotómetro, a 260 nm de Luz UV, Todas las muestras se
ajustaron a una concentración de 3µg de RNA total para realizar la transcripción
inversa.
6.5 Trascripción Inversa 3µg de RNA se resuspendierón en 13 µL de agua DEPC se le adicionó 1ug de
Oligo dT y se incubó a 65ºC por 10 minutos en un termociclador, pasado el
tiempo se añadió 15 µL de la mezcla de reacción para cDNA (teniendo un volumen
de reacción final de 30 µL) la cual contiene los siguientes reactivos: 3.8 µL de
agua-DEPC, 6.0 µL de regulador 5X, 1.2 µL de DNTP`S 10mM, 3.0 µL de DTT
100 mM y 1.0 µL de la enzima MMLV.RT 200 U/ µL. La reacción se continuó en el
termociclador con el siguiente programa: 37ºC por 60 minutos, 95ºC por 5 minutos
y finalmente 4ºC. Terminada la reacción se adicionaron 70 µL de agua DEPC para
tener un volumen final de 100 µL
6.6 Determinación de citocinas por el método de RT- PCR (G3DPH, IFN-γ y
TNF-α) A partir 5µL del cDNA de cada muestra y colocados en un tubo Eppendorff se
añadieron 45µL de la mezcla de reacción, la cual contenía 35.3µL agua-DEPC,
5.0µL de regulador 10X, 2.5µL de MgCl2 (50mM), 1.0 µL de DNTP`S 10 mM,
0.5µL de del iniciador 5’ (20 µM), 0.5µL del iniciador 3’ (20 µM) y 0.2 µL de la
enzima Taq polimerasa. La reacción se llevó a cabo en un termociclador con el
siguiente programa: 30 ciclos de 94ºC/45 segundos, 60ºC/45 segundos, 72ºC/90
segundos y un ciclo de 72ºC/7 minutos. La secuencia de los iniciadores se
muestra en la Tabla II
Tabla II. Secuencia de los iniciadores utilizados para la determinación de citocinas por la técnica de PCR.
SECUENCIA DE LOS INICIADORES
Gen Secuencia Producto especifico
TNF α 5`GAGCCCCCAGTCTGTGTCCTTCTA3`
3`CCCCGGCCTTCCAAATCCCTACAT5`
420 pb
IFN γ 5`GAAAGCCTAGAAAGTCTGAATAACT
3`ATCAGCAGCGACTCCTTTTCCGCTT
387 pb
GG33PPDDHH 5`TGCCATCAACGACCCCTTCATT3`
3`ATATACTGTAATAGACATAAACCT5´
235 pb.
6.7 Corrimiento de los productos de PCR (Sambrook y Russell, 2001) en gel de agarosa al 2% Se preparó agarosa al 2% en TBE 1X, posteriormente esta agarosa fue fundida y
colocada en la cámara de electroforesis donde se dejó polimerizar por 30 minutos,
después de esto se llenó la cámara con regulador TBE 1X hasta cubrir la agarosa,
8µL de muestra fueron mezcladas con 2 µL de regulador de corrimiento y los 10µL
totales se colocaron en los pozos del gel de agarosa Las muestras fueron corridas
a 95 voltios durante 40 minutos. Terminado el corrimiento se colocó el gel en una
solución de TBE 1X con bromuro de etidio durante 15 minutos y se enjuagó al
chorro de agua, para finalmente observar el gel en un transluminador de luz
ultravioleta.
6.8 Determinación de citocinas por RT-PCR método semicuantitativo. Para cuantificar los cambios en la expresión de citocinas, a cada una de las
bandas visualizadas en los geles de agarosa se les determinó el valor de
densidad óptica, con ayuda del fotodocumentador.
La semicuantificación se llevó de acuerdo a la relación: D.O. del gen de
interés/D.O. del G3DPH.
6.9 Determinación de IFNγ y TNFα por ELISA.
Los sobrenadantes de células estimuladas con DLEs fueron colectados, y
almacenados a –70°C hasta su uso, posteriormente niveles de IFNγ y TNFα
fueron medidos por ELISA usando un estuche comercial y siguiendo las
instrucciones del fabricante (Amersham, Buckinghamshire, UK). Dos experimentos
independientes fueron realizados.
6.10 Cultivo de células J774. A1 La línea celular J774.A1 son macrófagos de ratón BALB/c provenientes de un
sarcoma, estas células se mantuvieron en cultivo en medio DMEM (Gibco, Grand
Island NY USA) suplementado con 10% de suero fetal bovino (SFB)(Hyclone,
Road Logan Utah USA) inactivado con 100U/ml de penicilina y 0.1ng/ml de
estreptomicina (Gibco) a 37°C y 5% de C02)
6.11 Efecto de los sobrenadantes de células de bazo estimuladas con Extractos Dializables de Leucocitos específico (DLE) sobre la infección de macrofagos J774A.1 Se sembraron macrófagos de la línea celular J774A.1 en placas de 24 pozos, las
monocapas confluentes (1 x 106 células/pozo) se lavaron tres veces con solución
de Hanks 1X (Gibco Grand Island NY USA), una vez hecho esto, se adicionó a
cada monocapa 1 ml de medio DMEM (Gibco, Grand Island NY USA) y se infectó
con Listeria monocytogenes a un índice de infección de 20:1 , las placas se
incubaron a 37°C en una atmósfera al 5% de CO2 durante dos horas, transcurrido
el tiempo se lavaron las placas tres veces con Hanks 1X (Gibco Grand Island NY
USA), para eliminar todas las bacterias que hubieran quedado extracelulares.
Posteriormente se adicionó a las células DLE a diferentes diluciones 1:10, 1:5 y
1:2.5 o medio DMEM (Gibco, Grand Island NY USA) y se incubaron durante 24
horas para posteriormente determinar las UFC/ml.
6.12 Cuenta viable. A los tiempos de 2 y 24h se realizó la determinación del crecimiento bacteriano, en
cada tiempo las células infectadas fueron lisadas con 300 µL de agua y se
realizaron diluciones con un factor de 10, 20 µl de cada dilución fueron sembrados
en medio BHI (Becton Dickinson CO., Sparks USA) y se incubaron a 37°C por 24h
para determinar el número de UFC/1 x 106 células.
7. RESULTADOS
7.1. ESTANDARIZACIÓN DE LA RT-PCR Para realizar la determinación de citocinas por RT-PCR el primer paso es la
estandarización de la técnica para conocer que se cuenta con las condiciones y
concentraciones óptimas de todos los reactivos a utilizar. Para la estandarización
de esta técnica primero se hicieron cultivos de células de bazo y fueron
estimuladas con diferentes concentraciones de PMA el cual es un activador
policlonal que induce la expresión y síntesis de citocinas de manera inespecífica.
7.2. Determinación de la expresión de los RNAm para TNFα e IFNγ en las
células de bazo estimuladas con los DLEs a diferentes tiempos
En la figura 1 se muestran los resultados obtenidos en la determinación de TNFα
e IFNγ en las células de bazo estimuladas con los DLEs a diferentes tiempos,
como se observa hay presencia de los mensajeros tanto para ambas citocinas
aún en células sin estimular por lo que fue necesario cuantificar la expresión de los
mensajeros determinando la densidad óptica de cada muestra.
A
Figura 1 Expresión de mRNA de G3DPH, TNFα e IFN γ en células de bazo estimuladas con DLEs y recolectadas a diferentes tiempos. El RNA total de estas células fue extraído y 3µg fueron convertidos a cDNA y este fue amplificado por PCR utilizando los iniciadores respectivos para cada molécula. Figura A y B corresponden al primer y segundo experimento respectivamente. Donde carril 1 corresponde a marcador de peso molecular, carril 2, 3,4 y 5 corresponde a células sin estimular recolectadas a las 24, 48, 72 y 96 horas de incubación respectivamente, carril 6,7,8 y 9 corresponde a células estimuladas con DLE a las 24, 48, 72 y 96 horas de incubación respectivamente, carril 10 corresponde al control negativo de la reacción de PCR.
7.3. Relación de la expresión de TNFα e IFNγ en las células de bazo
estimuladas con los DLEs
Los resultados semicuantitativos de la expresión de los RNAm para TNFα e IFNγ
en las células de bazo estimuladas con los DLEs a diferentes tiempos de
incubación determinando su densidad óptica y se observa que la máxima
expresión de los mensajeros para IFNγ fue a las 24 y 72h de la misma forma se
observa para el TNFα (datos no mostrados).
B
7.4. Determinación de TNFα e IFNγ en las células de bazo estimuladas con
los DLEs por el método de ELISA
Para conocer si teníamos la presencia de las citocinas de estudio en los
sobrenadantes de las células estimuladas con DLEs se procedió a realizar la
búsqueda de estas por ELISA, los resultados mostraron que no hubo presencia
de TNFα en ninguno de los sobrenadantes mientras que para IFNγ se encontró la
proteína solo en los sobrenadantes de las células estimuladas durante 24h de
incubación (figura 2).
Figura 2 Producción de IFNγ en cultivos de células de bazo estimuladas con DLE a diferentes tiempos, terminados los
tiempos de incubación los sobrenadantes de estos cultivos fueron alicuoteados y congelados hasta su uso. La producción
de TNFα fue determinada por el método de ELISA. Los valores son dados como la media ± desviación estándar de
triplicados de un experimento representativo de dos.
Confirmado la producción de una de las citocinas en estudio IFNγ, se procedió a
realizar la infección de macrófagos con L. monocytogenes para conocer si estos
sobrenadantes con la presencia de IFNγ eran capaces de activar a los
macrófagos y que estos fueran capaces de controlar la infección. En la figura 3 se
muestran los resultados en los que se observa que en presencia de los
sobrenadantes de las células estimuladas con DLE los macrófagos si eran
capaces de controlar la infección.
Figura 3. Efecto de los sobrenadantes de células de bazo estimuladas con DLE provenientes de ratones sanos y
adicionados (a diferentes diluciones) posteriormente a cultivos de macrófagos infectados con Listeria monocytogenes. En
los experimentos se utilizó como testigo macrófagos solo con medio DMEM. Los datos que se muestran son el valor
promedio ± desviación estandar de un experimento realizado por triplicado y es representativo de dos experimentos.
0
50000
100000
150000
200000
250000
300000
UFC
/1x1
06 cél
ulas
2h24h
0 1:10 1:5 1:2.5 dilución
8. DISCUSIÓN
Los factores de transferencia son moléculas que inducen a los organismos que las
reciben (receptores no inmunes) a que expresen una respuesta inmune celular
específica frente a un antígeno contra el cual el donador ya montó una RIC
previamente (Kirkpatrick et al, 1988).
Los extractos leucocitarios dializables (DLE) que contienen a los factores de
transferencia, han sido utilizados con éxito en innumerables enfermedades
causadas por bacterias, virus y hongos, ya que se ha demostrado que éstos
transfieren la respuesta de linfocitos T, de una manera antígeno específica de un
individuo inmune a otro no inmune (Fudenberg y Pizza, 1993).
Debido a los problemas que se tenían al evaluar el efecto de los extractos
dializables de células de bazo utilizando el modelo murino tanto in vivo como “in-
vitro” en la infección con M. tuberculosis debido a que los experimentos son
costosos y el tiempo de crecimiento de la bacteria que es muy lento, en este
trabajo se realizó la estimulación de células de bazo con DLE a diferentes tiempos
y los sobrenadantes de estos cultivos fueron adicionados a macrófagos infectados
con L. monocytogenes (una bacteria intracelular de rápido crecimiento) con el fin
de que nos pudiera orientar un poco más sobre el mecanismo de acción de estos
extractos dializables, y como actuaban sobre el macrófago para que este sea
capaz de controlar la replicación intracelular de la bacteria.
Los principales mecanismos por los cuales se pudiera activar los macrófagos son:
• Que las células de bazo en presencia de los DLE estimulen la producción
de IFNγ el cual es sintetizado por Lc T, activa a los macrófagos para
convertirlo en una potente célula efectora antimicrobiana, los macrófagos
activados fusionan sus lisosomas mas eficientemente a los fagosomas
exponiendo a los microorganismos ingeridos a una gran variedad de
enzimas lisosomales microbicidas.
• Que las células estimuladas con los DLE sean capaces de producir TNFα
que es una citocina que estimula la producción de óxido nítrico en el
macrófago el cual es tóxico para la bacteria.
De acuerdo a los resultados obtenidos los DLE que se utilizaron en los
experimentos aquí realizados, se encontró que no hubo presencia de la citocina
TNFα en ninguno de los tiempos de incubación aunque si se encontró el
mensajero. Esto pudiera deberse a que hay una modificación postranscripcional
del mRNA para esta citocina que impide la expresión de la proteína. Sin embargo
si encontramos la presencia de IFNγ al tiempo de 24hr posteriores a su
incubación.
Estos resultados nos sugieren que el DLE estimula la producción de IFNγ en las
células de bazo, y al poner estos sobrenadantes, en el cual va dicha citocina en
contacto con los macrófagos infectados los activa, y de esta manera son capaces
de controlar la infección.
El hecho de solo observar IFNγ a las 24hr podría hablarnos que la estimulación
con los DLE es muy rápida lo cual podría explicar el efecto benefico de estos
extractos en un tiempo corto.
Dwyer menciona que las moléculas que componen al factor de transferencia (que
se encuentran dentro de los DLEs) al parecer interactúan con las regiones
variables de las cadenas alfa o beta del receptor de los linfocitos T, para de esta
manera cambiar su avidez y afinidad por el antígeno. (Dwyer et al, 1996).
Nuestros resultados concuerdan con lo encontrado por Alvarez-Thull y Kirkpatrick
en 1996 donde ellos proponen que los linfocitos Th pueden ser los que están
involucrados en la respuesta inmunológica producida por el FT, ya que el perfil de
citocinas que encontraron en los receptores del FT fue la producción de IFNγ y
disminución de IL-4 e IL10 ; por lo que junto con ellos concluimos que uno de los
papeles en la respuesta inmune de los DLE es la activación de linfocitos Th 1
(Alvarez y Kirkpatrick 1996).
9. CONCLUSIONES
• Se estandarizó la técnica de RT-PCR
• La expresión de los mRNA para TNFα e IFNγ en las células de bazo
estimuladas con DLEs fue máxima a las 24 y 72 horas de incubación
• A nivel de proteínas solo se encontró la presencia de IFNγ en los
sobrenadantes de células de bazo estimuladas con los DLEs
• Estos sobrenadantes al ser adicionados a macrófagos infectados con
L. monocytogenes al parecer activaron a los macrófagos a controlar la
infección probablemente por la presencia de IFNγ la cual es una citocina
que activa los mecanismos bactericidas del macrófago.
10. IMPACTO
El trabajo ayuda a comprender como los DLEs modulan la respuesta inmune a
través de la producción de IFN por parte de las células estimuladas con el
DLEs.
Por otra parte los alumnos participantes fueron capacitados en el uso de
diversas técnicas y en el análisis y escritura de sus resultados.
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