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Instituto Politécnico Nacional-CBG
‘ESTUDIO DE LA DIVERSIDAD GENÉTICA Y
ANÁLISIS MOLECULAR DEL LOCUS b DE
Ustilago maydis’
TESIS QUE PARA OBTENER EL GRADO DE
MAESTRO EN CIENCIAS EN BIOTECNOLOGÍA
GENÓMICA
PRESENTA
MARÍA FERNANDA JIMÉNEZ BECERRIL
DIRECTORES DE TESIS
M.C. SANJUANA HERNÁNDEZ DELGADO
DR. JUAN MANUEL GONZÁLEZ PRIETO
Reynosa, Tamaulipas febrero, 2010
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ÍNDICE
ÍNDICE DE CUADROS ..................................................................................................................... 6
ÍNDICE DE FIGURAS ....................................................................................................................... 7
ABREVIATURAS ............................................................................... ¡Error! Marcador no definido.
I. INTRODUCCIÓN ......................................................................................................................... 14
II. ANTECEDENTES ....................................................................................................................... 16
2.1 Generalidades de Ustilago maydis. ......................................................................................... 16
2.1.1 Ciclo de vida ........................................................................................................................... 16
2.1.2 Control de apareamiento y patogénesis .................................................................................... 17
2.1.3 Organización y estructura del locus a y b ................................................................................ 20
2.1.4 Análisis sexual del apareamiento in vitro ............................................................................... 22
2.1.5 Variabilidad genética ............................................................................................................... 23
2.1.6 Uso de marcadores moleculares para estudiar variabilidad genética ...................................... 24
2.1.7 Marcadores moleculares AFLP ............................................................................................... 25
2.1.8 Análisis de variabilidad genética en U. maydis ....................................................................... 26
2.1.9 Análisis moleculares realizados en el locus b en U. maydis .................................................... 27
III. JUSTIFICACIÓN ..................................................................................................................... 29
IV. OBJETIVOS ............................................................................................................................... 30
4.1 Objetivo general .......................................................................................................................... 30
4.2 Objetivos específicos .................................................................................................................. 30
V. HIPÓTESIS .................................................................................................................................. 31
VI. MATERIALES Y MÉTODOS ................................................................................................... 32
6.1 Obtención de tumores de U. maydis en diferentes Regiones y localidades de la República
Mexicana ........................................................................................................................................... 32
6.2 Obtención y purificación de teliosporas a partir de tumores. ...................................................... 33
6.3 Germinación de teliosporas a partir de tumores. ......................................................................... 34
6.4 Determinación del tipo sexual de U. maydis in vitro .................................................................. 34
6.5 Diseño de oligonucleótidos ..................................................................................................... 35
6.5.1 Obtención de DNA genómico de U. maydis ........................................................................... 36
6.5.2 Amplificación del locus b de U. maydis ............................................................................... 37
6.5.3 Purificación del DNA ............................................................................................................... 38
6.5.4 Preparación de muestras para la determinación de la secuencia nucleotídica.......................... 39
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6.5.5 Purificación de Reacción de Secuenciación ............................................................................. 40
6.5.6 Análisis Bioinformático de las secuencias del locus b de U. maydis ....................................... 40
6.6 Técnica AFLP ............................................................................................................................. 41
6.6.1 Análisis de Datos AFLP ........................................................................................................... 42
VII. RESULTADOS ......................................................................................................................... 43
7.1 Muestreo y colección de aislados para la detección de variantes alélicas de U. maydis ............. 43
7.2 Determinación del tipo sexual de U. maydis mediante Reacción Fuzz. ...................................... 46
7.3. Amplificación del locus b por Reacción en cadena de la polimerasa (PCR). .......................... 47
7.4 Análisis Bioinformático de las secuencias del locus b de U. maydis de la República Mexicana.
........................................................................................................................................................... 48
7.5 Análisis AFLP ............................................................................................................................. 62
VIII. DISCUSIÓN ............................................................................................................................ 70
IX. CONCLUSIONES ...................................................................................................................... 75
X. RECOMENDACIONES .............................................................................................................. 77
XI. BIBLIOGRAFÍA ........................................................................................................................ 78
XII. GLOSARIO ............................................................................................................................... 81
XIII. ANEXOS .................................................................................................................................. 82
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ÍNDICE DE CUADROS
Cuadro 1. Oligonucleótidos diseñados empleados en los ensayos de amplificación del locus b de U.
maydis por PCR. .......................................................................................................................................... 35
Cuadro 2. Condiciones de reacción de la amplificación del locus b de U. maydis ..................................... 37
Cuadro 3. Componentes y cantidades empleadas en la reacción de la amplificación del locus b de
U. maydis ..................................................................................................................................................... 38
Cuadro 4. Condiciones de reacción de la amplificación del locus b de U. maydis para la
determinación de la secuencia nucleotídica. ................................................................................................ 39
Cuadro 5. Estados de las diferentes regiones de la República Mexicana muestreados para la
detección de variantes alélicas de U. maydis. .............................................................................................. 44
Cuadro 6. Variantes alelicas encontradas en los diferentes estados y localidades de la Republica
Mexicana ......................................................................................................... ¡Error! Marcador no definido.
Cuadro 7. Aislamientos de U. maydis sometidos al analisis AFLP. ............................................................ 50
Cuadro 8. Productos AFLP amplificados por combinación en especímenes de U. maydis........................ 67
Cuadro 9. Análisis de varianza Molecular de diferentes individuos de U. maydis colectados de
diferentes localidades y estados de la República Mexicana ......................................................................... 68
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ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1. Enfermedad del huitlacoche en el maiz ............................. ¡Error! Marcador no definido.
Figura 2. Etapas del Ciclo biologico de U. maydis, (1) inicia cuando dos celulas sexualmente
compatibles se aparean, (2) formacion de los tubos de conjugacion, (3) conjugacion de esporidias,
(4) formacion del dicarion que penetra e invade la planta(5) formación de teliosporas, (6)
cariogamia, (7) germinación de teliospora y formación de promicelio, (8) promicelio constituido por
cuatro basidioesporas. Tomado de (Ruiz y Martinez,
1998)……………………………………….¡Error! Marcador no definido.
Figura 3. Interacciones entre dos loci de apareamiento durante el desarrollo de U. maydis. El locus a
bialelico codifica para una feromona y un receptor y el reconocimiento de estos desencadena la
fusion celular. Despues de la fusion, alelos diferentes del locus b inducen el desarrollo micelial y
patogénico. Tomado de (Bolker, 2001)……………………………………………………………
¡Error! Marcador no definido.
Figura 4. Organizacion y estructura de los alelos a1 y a2 del locus a de U. maydis. ................ ¡Error!
Marcador no definido.
Figura 5. Organizacion y estructura del locus b multialelico de U. maydis. ..... ¡Error! Marcador no
definido.
Figura 6. Reaccion Fuzz .................................................................... ¡Error! Marcador no definido.
Figura 7. Regiones donde existen diferentes razas del maiz ............. ¡Error! Marcador no definido.
Figura 8. Localidades de la Republica Mexicana donde se colectaron tumores de U. maydis . ¡Error!
Marcador no definido.
Figura 9. Prueba de la reaccion Fuzz en placa. Las cepas que mostraron reaccion positiva se
observan macroscopicamente como una colonia micelial. ............................................................... 46
Figura 10. Morfologia colonial de una reaccion Fuzz positiva de cepas de U. maydis ............ ¡Error!
Marcador no definido.
Figura 11. Gel de agarosa al 0.8% mostrando productos de PCR correspondientes al gen bE de U.
maydis, tamaño de fragmento esperado señalado con flecha. ........... ¡Error! Marcador no definido.
Figura 12. Grafica que muestra la frecuencia de variantes alelicas distribuidas en la Republica
Mexicana. .......................................................................................... ¡Error! Marcador no definido.
Figura 13. Dendrograma de las variantes alelicas presentes en Aguascalientes con base en la
secuencia nucleotidica del locus b de U. maydis .............................................................................. 54
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Figura 14. Dendrograma de las variantes alelicas presentes en Chiapas con base en la secuencia
nucleotidica del locus b de U. maydis. .............................................................................................. 54
Figura 15. Dendrograma de las variantes alelicas presentes en Guanajuato con base en la secuencia
nucleotidica del locus b de U. maydis ............................................... ¡Error! Marcador no definido.
Figura 16. Dendrograma de las variantes alelicas presentes en Jalisco con base en la secuencia
nucleotidica del locus b de U. maydis ............................................................................................... 56
Figura 17. Dendrograma de las variantes alelicas presentes en Nuevo Leon con base en la secuencia
nucleotidica del locus b de U. maydis. .............................................................................................. 57
Figura 18. Dendrograma de las variantes alelicas presentes en Michoacan con base en la secuencia
nucleotidica del locus b de U. maydis. .............................................................................................. 57
Figura 19. Dendrograma de las variantes alelicas presentes en Oaxaca con base en la secuencia
nucleotidica del locus b de U. maydis. .............................................................................................. 58
Figura 20. Dendrograma de las variantes alelicas presentes en Nayarit con base en la secuencia
nucleotidica del locus b de U. maydis. .............................................................................................. 58
Figura 21. Dendrograma de las variantes alelicas presentes en Puebla con base en la secuencia
nucleotidica del locus b de U. maydis ............................................................................................... 59
Figura 22. Dendrograma de las variantes alelicas presentes en Queretaro con base en la secuencia
nucleotidica del locus b de U. maydis. .............................................................................................. 60
Figura 23. Dendrograma de las variantes alelicas presentes San Luis de Potosi con base en la
secuencia nucleotidica del locus b de U. maydis. ............................................................................. 60
Figura 24. Dendrograma de las variantes alelicas presentes en Tamaulipas con base en la secuencia
nucleotidica del locus b de U. maydis. .............................................................................................. 61
Figura 25. Dendrograma de las variantes alelicas presentes en Veracruz con base en la secuencia
nucleotidica del locus b de U. maydis. .............................................................................................. 61
Figura 26. Dendrograma de las variantes alelicas presentes en Zacatecas con base en la secuencia
nucleotidica del locus b de U. maydis. .............................................................................................. 62
Figura 27. Dendrograma de las relaciones geneticas de U. maydis con base en el metodo UPGMA
entre estados de la Republica Mexicana ........................................................................................... 69
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ABREVIATURAS
a1 = locus a1.
a2 = locus a2
a.a = Aminoácidos.
AFLP = Siglas en inglés Polimorfismos en la Longitud de Fragmentos Amplificados.
AMOVA = Siglas en ingles Análisis de Varianza Molecular.
bE = gen bE.
bW = gen bE.
°C = Grado centígrado.
DNA = Acido desoxirribonucleico.
DNAc = Acido desoxirribonucleico complementario.
DNAg = Acido desoxirribonucleico genómico.
EAFs = Siglas en inglés Fragmentos de restricción asociados a extremos.
EDTA = Etilen Diamino Tetra acético.
EFs = Siglas en inglés Fragmentos de restricción en el extremo.
g = Gramos.
h = Hora.
HCL = Acido Clorhídrico.
HD = Homeodominio.
ID = Índice de Diversidad.
kb = Kilobases.
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L = Litros.
mg = Miligramo.
min = minuto.
ml = Mililitros.
mM = Milimolar.
NaCl = Cloruro de Sodio.
NCBI = Centro Nacional de Información sobre Biotecnología.
pb = Pares de bases.
PCR = Siglas en inglés de la Reacción en Cadena de la Polimerasa.
PCR-RFLP = Siglas en inglés Reacción en Cadena de la Polimerasa- Polimorfismos en
la Longitud de Fragmentos de Restricción.
PDA = Agar Papa Dextrosa.
pH = Potencial Hidrogeno.
PK = Proteinasa K.
RAPDs = Siglas en inglés ADN Polimórfico Amplificado al Azar.
rpm = Revoluciones por minuto.
SDS = Dodecilsúlfato Sódico.
TBE = Tris Borato EDTA.
TE = Tris EDTA.
µL= Microlitro.
UPGMA = Agrupamiento de Muestras no Ponderadas con Medias Aritméticas.
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RESUMEN
Ustilago maydis (DC) De Candole es un hongo, basidiomiceto, dimórfico,
patógeno, específico del maíz, y el teozintle, agente causal del "huitlacoche" o carbón
común, cuyas características principales son el desarrollo de tumores en las partes aéreas de
la planta. El hongo necesita de la planta para completar su ciclo de vida. El apareamiento y
patogénesis de U. maydis está controlado por dos locus (a y b), el locus a encargado del
apareamiento y consta de dos alelos, (a1 y a2), el locus b controla la patogénesis y posee
25 alelos a la fecha conocidos. México es el lugar de origen, domesticación, y diversidad
genética del maíz y por la estrecha coevolución que existe con el hongo en el presente
trabajo nos dimos a la tarea de estudiar molecularmente el patógeno proveniente de
diferentes localidades y estados de la República Mexicana. El análisis del locus b
multialélico, mediante secuenciación automática por electroforesis capilar identificó en
total 11 variantes alélicas (b1, b3, b7, b9, b13, b14, b15 b17, b18, b18a y b19), distribuidas
en todas las Regiones (Occidente, Altiplano Central, Centro, Maya, Oaxaca y Noreste)
siendo el alelo b7 el más frecuente e identificado en todas las regiones mencionadas ; el
alelo b1 y b3 menos frecuentes, el primero identificado únicamente en el estado de hidalgo
perteneciente a la Región del altiplano Central y el segundo identificado únicamente en
Nayarit perteneciente a la Región Occidente. Con la técnica AFLP, se evaluó la diversidad
genética de dicho hongo, el análisis mostro un polimorfismo del 98% y el AMOVA indico
moderada diferenciación genética entre U.maydis. El análisis de conglomerados con base
en datos AFLP indico que U. maydis es ampliamente diverso ya que no se observaron
agrupamientos bien definidos con base en las regiones mencionadas anteriormente. Los
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especímenes de U. maydis de Michoacán pertenecientes a la Región Occidente fueron
genéticamente distintos de la Región Altiplano Central, Centro, Noreste y Maya.
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SUMMARY
Ustilago maydis (DC) De Candole is a mushroom, basidiomycete, dimorphic
pathogen-specific maize and teozintle, causal agent of "huitlacoche" or common coal,
whose main features are the development of tumors on aerial parts of the plant . The fungus
needs the plant to complete its life cycle. The mating and pathogenesis of U. maydis is
controlled by two loci (b) to charge the mating locus and has two alleles (a1 and a2), the
locus b controls the pathogenesis and has 25 alleles known to date. Mexico is the place of
origin, domestication and genetic diversity of maize and the close coevolution with fungus
that exists in the present work we took on the task of studying the molecular pathogen from
different localities and states of Mexico. The analysis of the multiallelic b locus by
automated sequencing by capillary electrophoresis identified a total of 11 allelic variants
(b1, b3, b7, b9, b13, b14, b15 b17, b18, b19 and B18A), distributed in all regions (West,
Central Highlands, Central, Maya, Oaxaca, and Northeast) being the most frequent allele b7
and identified in all the regions mentioned, the b1 and b3 allele less frequent, the first found
only in the state of gentleman belonging to the Central Highlands region and the latter
found only in Nayarit belonging to the Western Region. With the AFLP technique, we
assessed the genetic diversity of the fungus, the analysis showed a 98% polymorphism and
AMOVA indicated moderate genetic differentiation between U.maydis. Cluster analysis
based on AFLP data indicated that U. maydis is widely diverse and that there were no well-
defined groupings based on the above regions. Specimens of U. maydis Michoacán
belonging to the Western Region were genetically different from the Central Plateau
Region, Central, Northeast and Maya.
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I. INTRODUCCIÓN
El huitlacoche (carbón común) es una enfermedad específica del maíz (Zea mays) y
de su antecesor, el teozintle (Zea mays ssp parviglumis) (Ruíz, 2008), caracterizada por la
formación de tumores en los tejidos aéreos de la planta hospedera, causada por el hongo
Ustilago maydis. U. maydis es un patógeno, basidiomiceto y dimórfico, que durante su
ciclo de vida presenta dos formas; a) una forma unicelular (esporidia), la cual es haploide
uninucleada y presenta crecimiento saprofítico; b) una forma filamentosa dicariótica, la
cuál es parasítica y patógenica (Banuett, 1995). El ciclo de vida de U. maydis está regulado
por el sistema de reconocimiento tetrapolar el cual consiste del loci de reconocimiento tipo
a y b. El locus bialélico a codifica para un sistema feromona/receptor requerido para la
fusión de las esporidias. El locus multialélico b codifica para proteínas con homeodominios
bE/bW, las cuales en combinaciones no alélicas se dimerizan para formar un factor de
transcripción activo crucial para el desarrollo patogénico (Banuett, 1995).
Para determinar el tipo sexual del hongo se hace un análisis in vitro conocido como
reacción ‘Fuzz’. Es importante mencionar que mientras más variantes alélicas existan en el
locus b de U. maydis, aumentará el número de apareamientos, recombinación y variabilidad
genética, por lo tanto también aumentará la probabilidad de patogénesis del hongo en la
planta. México es el lugar de origen, domesticación, mayor distribución y diversidad
genética del maíz y por la estrecha coevolución entre el hongo y la planta, se puede suponer
que en la República Mexicana también existe la mayor variabilidad genética de dicho
hongo, sin embargo; a la fecha existen muy pocos análisis de variabilidad genética por
ejemplo. (Valverde y col.,2000) mediante análisis RFLP analizaron la diversidad genética
de 32 especímenes de U. maydis pertenecientes a cinco estados diferentes de la República
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Mexicana, trabajo en el cual reportan un alto grado de polimorfismo y una amplia
diversidad genética de dicha especie, distribuida en todos los sitios analizados, también
(Saleh y col., 2006) realizaron análisis de diversidad genética de U. maydis en siete
diferentes localidades de Egipto y la diversidad genética encontrada entre poblaciones fue
del (85.86%), y a la fecha no existe ningún análisis del locus b. Es necesario tener un
conocimiento más amplio para entender el apareamiento y patogénesis en U. maydis. En
dicho hongo se han realizado pocos análisis de variabilidad genética entre los que se
incluyen técnicas que utilizan enzimas de restricción y marcadores moleculares de ADN
como son: Fragmentos de restricción en el extremo (EFs), Fragmentos de restricción
asociados a extremos (EAFs) (Sánchez y col, 1996), y ADN polimórfico amplificado al
Azar (RAPDs). En cuanto a estudios del locus b solamente se han realizado análisis del
tipo de polimorfismo en la longitud de fragmentos de restricción por medio de reacción en
cadena de la polimerasa (PCR-RFLP) . Por lo anterior es necesario tener conocimiento más
amplio para entender el apareamiento y patogénesis en U. maydis, además de estudiar la
variabilidad genética y molecular del locus b del hongo, en aislados colectados de
diferentes zonas rurales de la República Mexicana. En el presente trabajo se analizó la
diversidad genética mediante Polimorfismos en la longitud de los fragmentos de
amplificación (AFLP), y el locus b de U. maydis se analizó mediante la secuenciación de
sus bases nucleotídicas.
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II. ANTECEDENTES
2.1 Generalidades de Ustilago maydis.
Ustilago maydis (DC) De Candole es un hongo, patógeno, basidiomiceto,
dimórfico, que causa enfermedad en el cultivo de maíz comúnmente conocida como
‘huitlacoche’ ó ‘carbón común’, que se caracteriza por inducir clorosis, necrosis,
hiperplasia e hipertrofia, causando el desarrollo de tumores en tallo, hojas, espigas y en los
granos de elote (Figura 1), (Agrios, 1998). En cuanto a su taxonomía U. maydis pertenece
al Reino: Fungi, Subreino: Eumycota, Phylum: Basidiomycota Clase: Basidiomicetes,
Subclase: Heterobasidiomycetydae, Orden: Ustilaginales, Familia: Ustilaginaceae,
Género: Ustilago, Especie: maydis, (Holliday, 1974). Ustilago maydis presenta dos formas
de crecimiento, fuera de la planta es levaduriforme, saprófita, haploide no patogénica, y
dentro de la planta es micelial, parasítica, diploide y patogénica, (Holliday, 1974). U.
maydis tiene dos tipos sexuales: el a y el b, determinados por las regiones que controlan el
apareamiento y la patogénesis denominadas locus a y locus b.
2.1.1 Ciclo de vida
Cuando dos células sexualmente compatibles se encuentran cerca, se atraen
mediante feromonas y emiten tubos de conjugación que se dirigen hacia la célula opuesta
en un ángulo que va de 30º- 45º, (Snetselaar y col, 1996), las células se fusionan y forman
un micelio dicariótico siendo éste la forma parasítica del hongo. El micelio penetra a la
planta a través de los estomas (Banuett y Herskowitz, 1996) por las partes aéreas de la
planta. Posteriormente invade los tejidos y estimula a las células de la planta para que se
dividan incontrolablemente, formando tumores que van desde 1cm hasta 30 cm de diámetro
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(Villanueva, 2007) reemplazando a los granos del maíz. El tumor es una masa negruzca
cubierta por una membrana llamada peridio (Villanueva, 2007) y dentro de éste, se
encuentran millones de teliosporas que son liberadas al suelo o dispersadas por el viento a
grandes distancias cuando se rompe el tumor. Si las condiciones son favorables, la
teliospora germina y forma el promicelio o basidio, que produce basidiosporas de diferente
tipo de compatibilidad sexual y nuevamente comienza el ciclo de vida de U. maydis (Figura
2) (Banuett, 1992; Ruiz y Martínez 1998).
2.1.2 Control de apareamiento y patogénesis
El apareamiento de U. maydis está controlado por el locus a bialélico (a1 y a2) cada
alelo contiene los genes mfa y pra que codifican para una feromona y un receptor
respectivamente (Figura 3) (Banuett, 1995). Cuando se une la feromona con el receptor
opuesto de la célula opuesta desencadenan una señal que activa un factor de transcripción,
y éste a su vez se une en la zona intergénica del locus b, que contienen los genes bW y bE,
los cuales codifican para proteínas regulatorias que forman un heterodímero activo bE-bW,
y éste desencadena el crecimiento micelial, activando también diversos genes involucrados
en la patogénesis, (Basse y Steinberg, 2004; Bolker, 2001; Romeis y Col., 1997).
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Figura 1. Enfermedad del huitlacoche en el maiz.
.
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Figura 2. Etapas del Ciclo biólogico de U. maydis, (1)inicia cuando dos células sexualmente compatibles
se aparean, (2)formación de los tubos de conjugación, (3) conjugación de esporidias, (4)formación del
dicarión que penetra e invade la planta, (5) formación de teliosporas, (6) cariogamia, (7) germinación
de teliospora y formación de promicelio, (8) promicelio constituido por cuatro basidioesporas. Tomado
de (Ruiz y Martinez, 1998).
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Figura 3. Interacciones entre dos loci de apareamiento durante el desarrollo de U. maydis. El locus a
bialelico codifica para una feromona y un receptor y el reconocimiento de estos desencadena la fusión
celular. Despues de la fusión, alelos diferentes del locus b inducen el desarrollo micelial y patogénico.
Tomado de (Bolker, 2001).
2.1.3 Organización y estructura del locus a y b
Los alelos a1 y a2 son disimilares, uno de 4.0 kb y el otro de 8.5 kb
respectivamente, cada alelo tiene el gen (mfa) que codifica para una feromona y el gen
(pra) que codifica para un receptor, el alelo a1 tiene los genes pra1 y mfa1, mientras que el
alelo a2 tiene los genes pra2 y mfa2 (Figura 4). El locus b consiste de 25 alelos múltiples
que controla el crecimiento filamentoso y la patogenicidad, (Banuett,1995). De acuerdo a
su estructura molecular, la organización del locus b, consta de dos genes divergentes, bE y
bW, ambos codifican para los polipéptidos bE de 410 a.a y bW de 626 a.a, conteniendo un
motivo homeodominio (HD) (Figura 5). Los genes bE y bW no muestran una secuencia
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similar pero su organización es parecida, poseen una región variable de 120 a.a en el
extremo amino terminal para el polipéptido bE y una región conservada en el extremo
carboxilo terminal, de igual manera el polipéptido bW tiene una región variable de 130 a.a
en el extremo amino terminal y una región conservada en el extremo carboxilo terminal.
Entre ellos existe una región intergénica aprox. De 260 pb (Banuett, 1992, Banuett, 1995).
Figura 4. Organización y estructura de los alelos a1 y a2 del locus a de U. maydis.
Figura 5. Organización y estructura del locus b multialélico de U. maydis.
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2.1.4 Análisis sexual del apareamiento in vitro
Para determinar el tipo sexual del hongo se recurre a la reacción Fuzz descrita por
(Banuett, 1995), consiste en colocar una gota de la suspensión celular (a1b1) de U. maydis
sobre una caja petri que contenga PDA con carbón activado al 1% esto con la finalidad de
dar contraste a las colonias crecidas, cuando se observa que la gota esta seca sobre esta
misma se coloca otra gota con la suspensión celular (a2b2), lo anterior se realiza con la
finalidad de aparear dichas células (Figura 6). La reacción fuzz es positiva cuando
fenotípicamente se observa una colonia blanca con apariencia algodonosa, indicando que
las células confrontadas presentan alelos a y b diferentes. Por el contrario la reacción Fuzz
es negativa cuando fenotípicamente se observa una colonia cremosa y brillante que nos
indica que las células confrontadas presentan los dos alelos idénticos.
Figura 6. Reacción Fuzz.
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2.1.5 Variabilidad genética
La variabilidad genética se refiere a la variación en el material genético dentro y
entre poblaciones de organismos. La variación surge por recombinación y mutación del
material hereditario, es un requisito necesario para que la especie evolucione y se adapte a
nuevas condiciones (Jiménez y Collada 2000). A partir de los años sesenta las técnicas
desarrolladas para estudiar la variación a nivel molecular abrieron la posibilidad de estudiar
caracteres con un control genético sencillo, como las diferencias de movilidad en proteínas;
con el paso del tiempo ha sido posible estudiar la variación en el ADN. Al estudiar la
variabilidad fenotípica se desconocía la variación subyacente en el genoma, al cuantificar la
variación molecular, ignoramos el efecto que tiene sobre el fenotipo, o por el contrario
puede ser nulo, pues a veces se estudian fragmentos de ADN que no codifican para ningún
carácter. Por lo tanto, existen dos tipos de variación genética: la primera es una diversidad
neutral, la cual no se ve afectada por la selección natural, y la segunda diversidad
corresponde a los caracteres con valor adaptativo. Para determinar la cantidad y
distribución de la diversidad genética en una especie se requiere el análisis de ambos tipos
de variación, pues la acción de distintos procesos evolutivos sobre cada tipo de caracteres
hace que los patrones de variación no se correspondan entre sí. La selección no actúa de
igual modo en todas las partes del genoma, mientras que las tasas de migración son iguales
para todos los genes, por lo que los marcadores neutrales no predicen necesariamente los
patrones de variación de los rasgos sujetos a selección diferencial (Jiménez y Collada
2000).
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2.1.6 Uso de marcadores moleculares para estudiar variabilidad genética
Los marcadores moleculares son biomoléculas que se pueden relacionar con un
rasgo genético. Las biomoléculas que pueden ser marcadores moleculares son las proteínas
(antígenos e isoenzimas) y el DNA (genes conocidos o fragmentos de secuencia y función
desconocida) (Claros ,2008). Un marcador molecular monomórfico es invariable en todos
los organismos estudiados, pero cuando presenta diferencias en el peso molecular, actividad
enzimática, estructura, o sitios de restricción, se dice que es polimórfico. Los marcadores
moleculares nos dan una estimación de la diversidad genética neutral. Existen diversos
tipos de técnicas, que brindan distinto tipo de información dependiendo de las
características de la molécula o fragmento de la molécula analizado. Lo más común es la
detección de diferencias de tamaño; a partir de las frecuencias con que aparecen cada una
de las distintas variantes (alelos) se calculan diversos parámetros que dan la medida de la
diversidad neutral y además permiten comparar entre especies y/o estudios, (Jiménez y
Collada 2000). Los estudios con marcadores son relativamente baratos y ofrecen
rápidamente resultados, los grupos de marcadores se dividen en dos tipos: los que se basan
en el análisis de proteínas (análisis isoenzimático, polimorfismo posicional de péptidos), y
los que se basan en el análisis del ADN. Las características de los marcadores moleculares,
frente a los proteicos: no se ven afectados por variaciones ambientales ni de desarrollo.
Permiten seleccionar regiones concretas dentro de la molécula de ADN para estudios
determinados, el número de polimorfismos detectables es teóricamente ilimitado, permiten
analizar tanto la información que se expresa como la que no y en la actualidad se han
desarrollado un gran número de técnicas adecuadas a diferentes situaciones.
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2.1.7 Marcadores moleculares AFLP
La técnica polimorfismos en la longitud de fragmentos amplificados (AFLP), por
sus siglas en inglés, es una técnica molecular descrita por (Vos y col. 1995), que consiste en
una combinación de las tecnologías de RFLP y PCR, basada en la amplificación selectiva
mediante PCR, de fragmentos de restricción obtenidos de DNA genómico total y DNAc
digerido con 2 enzimas. Es un método altamente sensible para caracterizar el ADN sin
importar su origen ni complejidad, (Blears y col. 1998). La técnica comprende tres etapas,
en la primera etapa se digiere el ADN con enzimas de restricción diferentes, una de corte
frecuente (MseI) y una de corte poco frecuente (EcoRI). Después, se ligan adaptadores
oligonucleótidos que son específicos a los extremos de los fragmentos de ADN digeridos,
con el objetivo de ser la base para la amplificación selectiva. Posteriormente, se amplifican
subconjuntos específicos de los productos de digestión, utilizando combinaciones de
oligonucleótidos selectivos, y por último el polimorfismo se detecta empleando
radioisótopos, tinción de plata, colorantes fluorescentes y fluoróforos. En cuanto a las
reacciones de PCR, se realiza una primera PCR preselectiva, utilizando oligonucleótidos
que son complementarios al adaptador y a los sitios de restricción. Luego se añade un
nucleótido para seleccionar un subconjunto de fragmentos. Los productos de la
amplificación preselectiva son sometidos a otra PCR con la finalidad de seleccionar un
subconjunto de fragmentos, cabe mencionar que en la segunda amplificación selectiva se
añaden otros dos nucleótidos y finalmente los productos amplificados son separados por
medio de electroforesis en geles de poliacrilamida. Las ventajas que ofrecen los AFLP
comparado con otras técnicas es que permiten explorar rápidamente los polimorfismos del
genoma entero, como generan un gran número de bandas, cada marcador da una huella
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identificadora de ADN que es sumamente informativa, (Blears y col. 1998., Bensch y
Akesson 2005). Además son altamente reproducibles y no es necesaria la información
previa de las secuencias ni hay que generar sondas de hibridación. Los AFLP se pueden
aplicar para evaluar la diversidad genética, construcción de mapas genéticos, clonación
posicional de genes (Bensch y Akesson 2005), identificación y caracterización de hongos y
bacterias, (Blears y col. 1998), es muy útil en análisis de paternidad y estudios de flujo
genético, análisis de filogenia, y en análisis de distancia genética. (Jiménez y Collada
2000).
2.1.8 Análisis de variabilidad genética en U. maydis
A la fecha se han realizado pocos análisis de variabilidad genética en U. maydis, por
ejemplo en siete localidades de Egipto se obtuvieron ocho diferentes tipos de locus b, con
aproximadamente frecuencias iguales, siendo los alelos b1, b3 y b8 los más frecuentes. La
diversidad total calculada de todas las poblaciones fue de un 85.86% y el promedio dentro
de las poblaciones fue de un 82.79 % y la diversidad de genes entre poblaciones fue de 3.07
indicando que la mayoría de la diversidad génica ocurrió en una escala espacial pequeña.
(Saleh y col. 2006). En 10 muestras de U. maydis, de cuatro regiones geográficas de Egipto
con diferentes tipos de apareamiento por medio de RAPD se generaron 40 bandas de ADN
en un rango de 150-2500 pb de las cuales 27 fueron polimórficas (67.50%) con un
promedio de 8 bandas por iniciador. Por lo tanto estos resultados indicaron que no hay
relación entre los RAPD y los sitios geográficos de donde se colectaron las muestras (Saleh
y col. 2006). Otro de los análisis de variabilidad genética en U. maydis, usando sondas
derivadas de secuencias teloméricas, se realizaron en cuatro grupos de diferentes áreas
geográficas de México, para identificar patrones de huella genética discriminativos,
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mediante análisis de fragmentos de restricción en el extremo (EFs) y fragmentos de
restricción asociados a extremos (EAFs) de los cromosomas. La mayoría de los EFs en dos
grupos de cepas mostró una longitud similar y los otros dos grupos se distribuyeron en
longitudes de diferentes clases, y en el caso de los EAFs, permitieron predecir patrones de
huella genética para cada grupo de cepas, basados en la ocurrencia de bandas amplificadas.
(Sánchez y col, 1996). Por otro lado (Valverde y col.,2000) mediante análisis RFLP
analizaron la diversidad genética de 32 especímenes de U. maydis pertenecientes a cinco
estados diferentes de la República Mexicana trabajo en el cual reportan un alto grado de
polimorfismo y una amplia diversidad genética de dicha especie, distribuida en todos los
sitios analizados.
2.1.9 Análisis moleculares realizados en el locus b en U. maydis
También a la fecha existen muy pocos análisis moleculares en el locus b de U.
maydis, por ejemplo, en cuatro localidades de Minnesota se realizaron análisis de los
niveles de diversidad poblacional en U. maydis del locus b de apareamiento, combinando
análisis de apareamiento en placa y polimorfismo en la longitud de fragmentos de
restricción (RFLP) y por PCR se demostraron altos niveles de diversidad del locus b dentro
de poblaciones, con un rendimiento poblacional de 17, de un total de 18 tipos b; los valores
Pairwise Gst fueron de 0.02 a 0.05, encontrándose los tipos de apareamiento común en
distancias geográficas amplias. Estos resultados demostraron que hay muy bajos niveles de
diferenciación entre poblaciones de U. maydis con respecto a la variación del locus b
(Zambino y col.1997). Los tipos b de apareamiento fueron representados en
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aproximadamente frecuencias iguales dentro de todas las poblaciones de Minnesota
(Zambino y col.1997).
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III. JUSTIFICACIÓN
México es el lugar de origen y domesticación del maíz (Zea mays), en el que existe
la mayor diversidad genética de esta planta, además es importante mencionar que el maíz se
cultiva en casi toda la República Mexicana. U. maydis es el hongo que produce la
enfermedad del ‘huitlacoche’ únicamente en el maíz y teocintle para poder concluir su ciclo
de vida. Por lo tanto entre huésped-hospedero existe una estrecha coevolución. Con
respecto a lo anterior, es de esperarse que también en U. maydis exista una amplia
diversidad genética. Se sabe que el locus b del hongo presenta a la fecha 25 variantes
alélicas, además es el encargado de controlar la patogénesis y desencadenar la enfermedad
en la planta del maíz; por lo anterior es posible que existan mas variantes alélicas y como
consecuencia de esto aumenta la recombinación sexual y genética, aumentando la
probabilidad de que el hongo cause la enfermedad en el maíz. A la fecha, en México no hay
suficientes reportes de estudios de diversidad genética y tampoco en el locus b de
apareamiento de U. maydis. realizar estudios en el locus b de U. maydis permitirá conocer
la distribución de la variantes alélicas en la República Mexicana, los estudios anteriores
permitirán complementar el conocimiento sobre los mecanismos de apareamiento y
patogénesis del hongo, para que en un futuro puedan servir de base y buscar mejores
alternativas para disminuir la probabilidad de patogénesis en el cultivo del maíz o por el
contrario aumentar la patogénesis, ya que el huitlacoche constituye una ganancia para el
agricultor, ya que para muchos agricultores una mazorca infectada tiene un valor de
mercado varias veces mas alto que el de una sana. Cabe destacar que Instituciones
Mexicanas han puesto un interés especial por la biodiversidad de especies mexicanas, y U.
maydis es una especie de la que casi no se conoce nada.
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IV. OBJETIVOS
4.1 Objetivo general
Determinar la diversidad genética de U. maydis e identificar sus variantes alélicas
en el locus b de aislamientos de la República Mexicana.
4.2 Objetivos específicos
Identificar las variantes alélicas del locus b de U. maydis presentes en aislamientos
de República Mexicana
Analizar genéticamente aislamientos de U. maydis de la República Mexicana.
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V. HIPÓTESIS
Existe diferenciación genética significativa entre aislamientos de U. maydis de la
República Mexicana.
Existen variantes alélicas en el locus b de aislamientos de U.maydis de la República
Mexicana.
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VI. MATERIALES Y MÉTODOS
6.1 Obtención de tumores de U. maydis en diferentes Regiones y localidades de la
República Mexicana
Se realizaron colectas de tumores a pie de carretera, presentes en cultivos de maíz
de zonas rurales de la República Mexicana, con base en las regiones donde existen
diferentes razas de maíz, dichas regiones son: Occidente, Altiplano central, Centro, Maya y
Oaxaca (Muñoz, 2005); otra región que se incluyó en el presente trabajo fue el noreste
(Figura 7 y 8). Los tumores se cortaron cuidadosamente con la mano y se guardaron en
bolsas de papel destrasa (previamente rotuladas) con el objetivo de mantenerlos secos y
fueron trasladados al laboratorio, donde se almacenaron a -70 ˚C hasta su procesamiento.
Figura 7. Regiones donde existen diferentes razas del maíz.
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L
Figura 8. Localidades de la República Mexicana donde se colectaron tumores de U. maydis.
6.2 Obtención y purificación de teliosporas a partir de tumores.
Los tumores colectados, fueron macerados en un mortero con agua destilada estéril
para liberar las teliosporas, se filtraron y colectaron en tubos Falcon de 50 ml,
posteriormente se trataron con una solución de sulfato de cobre al 0.5% durante una hora en
agitación constante, para eliminar células vegetales y contaminantes (Holliday, 1974) se
eliminó la solución de sulfato de cobre por centrifugación durante 5 min a 3500 rpm,
después se les añadió 2.5 mL de una solución de antibióticos (0.5g/L de ampicilina, 0.5g/L
kanamicina, 0.5g/L estreptomicina y 0.4g/L gentamicina), finalmente las teliosporas se
almacenaron a 4 ˚C.
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6.3 Germinación de teliosporas a partir de tumores.
Se tomó una alícuota de la solución de teliosporas y se colocó en un portaobjetos
para observar al microscopio que dichas esporas estuvieran libres de bacterias y
contaminantes vegetales, después de la solución de teliosporas se tomaron 25 µl de la
dilución 10-1
para ponerlas a germinar en Agar Papa Dextrosa y finalmente se incubaron a
30˚C durante 24 h.
6.4 Determinación del tipo sexual de U. maydis in vitro
De cada tumor se germinaron y aislaron tres colonias, a las que llamamos A, B y C
y en una caja Petri con medio compuesto de 4% de dextrosa, 4% peptona, 2% de extracto
de levadura, 1% de carbón activado, 2.7% de agar y 100 mL de agua destilada (Holliday
y 1974); se cofrontaron entre sí, la presencia de una colonia blanca con aspecto algodonoso
indicó crecimiento micelial del hongo y por lo tanto la Reación Fuzz se consideró positiva
esto indicó que esa colonia presentaba alelos a y b diferentes, la cepa FB2 se usó como
control negativo.(Banuett, 1995).
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6.5 Diseño de oligonucleótidos
Con base en el alineamiento de las secuencias parciales de los alelos b disponibles
en la base de datos del Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI)
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/), realizado con el Software Seqman del paquete (DNAstar
versión 6), se diseñarón oligonucleótidos (Cuadro 1) de zonas cien por ciento idénticas de
los genes bE y bW del locus b de U. maydis.
Cuadro 1. Oligonucleótidos diseñados en zonas invariables del locus b de U. maydis.
Nombre Secuencia de 5´ a 3´ Tm (˚C)
bE1484S CATAGCGTGAGCTGATGAAC 60.4
bE1946S CTCGTTGAGGCACTCCAAG 62.32
bE1965R CTTGGAGTGCCTCAACGAG 62.32
bW3480R CCGCTCGACTCTGACGAC 64.46
bW3174R CTTCTTCCCTTTCCGGTTAC 60.4
bW2719R GTGTCCACGACCAGTCTTG 62.32
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6.5.1 Obtención de DNA genómico de U. maydis
Se usó el método modificado de Hoffman y Wriston (1987). Se inoculó una asada
de una colonia fresca del hongo en 10 mL de medio rico, y se incubó durante 16-18 h en
agitación constante y con buena aeración. Luego el cultivo se centrifugó para obtener una
masa celular, la cual se lavó con 0.5 mL de agua estéril, posteriormente se transfirió a un
tubo eppendorf, luego se centrifugó por 30 s y se descartó el sobrenadante. Las células se
resuspendieron en 0.2 mL de solución de lisis (tritón X-100, 2%; SDS, 1%; NaCl, 0.1M;
Tris-HCL pH8, 10mM y EDTA, 1mM, después se añadió 0.2 mL de fenol-cloroformo (1:1)
y 0.3 g de perlas de vidrio de 0.45 mm de diámetro. El tubo se agitó en un agitador tipo
‘vortex’ por 1 min., y se dejó reposar en hielo durante 1 min (este paso se repitió 3 veces),
después se añadieron 0.2 mL de TE 10:1 (Tris 10 mM y EDTA 1mM) y se centrifugó
durante 10 min a 12000 rpm. Posteriormente la fase acuosa se transfirió a un tubo nuevo y
se añadieron 30 µg de RNAsa de 10 mg mL-1
Luego de una incubación de 5 min a 37 ºC, se
agregaron 10 µL de acetato de amonio 4M y 1 mL de etanol al 100%. El tubo se mezcló
por inversión y se dejó reposar 15 min. a -20 ºC. Se centrifugó por 5 min a 12000 rpm y se
lavó el precipitado con 100 µL de etanol al 70%. Después el sobrenadante se eliminó y el
precipitado se secó durante 1-2 min a una temperatura de 55 ºC. Finalmente el DNA
obtenido se resuspendió en 50 µl de TE 10:1 y se guardó a -20 ºC hasta su uso.(Figura 12).
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6.5.2 Amplificación del locus b de U. maydis
El locus b fue amplificado en un termociclador Applied Biosystems modelo 9800
Fast, y se usaron aproximadamente 100 ng de DNA genómico con los oligonucleótidos 5'
1484CATAGCGTGAGCTGATGAAC 3' (sentido) para el gen bE y 3' 3480
CCGCTCGACTCTGACGAC 5' (antisentido) para el gen bW a una concentración de 1.5
µg µL-1
. Los deoxinucleótidos (dNTP´s) se usaron a una concentración de 10 mM, 1.5 µL
de Cloruro de Magnesio a 50 mM, 5 µL de buffer 10X y 0.5 U de enzima Taq DNA
polimerasa (Invitrogen®) en un volumen final de 50 µL. Las condiciones, componentes y
cantidades empleadas para la amplificación del locus b se describen en el (Cuadro 2 y 3 ).
Cuadro 2. Condiciones de reacción de la amplificación del locus b de U. maydis
Condiciones Tiempo T(°C) Ciclos
T°C
desnaturalización
T°C alineamiento
T°C extensión
T°C mantenimiento
3 min
1 min
1 min
2 min
∞
94
94
56
72
4
1
30
∞
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Cuadro 3. Componentes y cantidades empleadas en la reacción de la amplificación del locus b de U.
maydis.
Componente Volumen Concentración
DNAg
Oligo bE1484S
bW2719R
MgCL
Buffer
dNTP's
Agua MQ
Enzima Taq
1µL
1µL
1µL
1.5µL
5 µL
1µL
39 µL
0.5 µL
100ng
500 ng/µL
500 ng/µL
50mM
10X
10 mM
5U/µL
6.5.3 Purificación del DNA
La purificación de los productos amplificados por PCR del locus b de U. maydis se
llevó a cabo con el estuche comecial Wizard® SV and PCR Clean-up System de la marca
Promega, y consistió en que una vez obtenidas las bandas de DNA en el gel de agarosa por
electroforesis, fueron cortadas cada una cuidadosamente con un bisturí, y después se
colocaron en un tubo eppendorff de 1.5 mL. posteriormente se añadieron 250 µL de la
solución de unión a la membrana, se dió un vortex por 5 seg y después se incubaron en el
termomixer a 65˚C hasta observar que la agarosa se disolvió completamente, después esta
disolución fue añadida cuidadosamente sobre la minicolumna y luego se centrifugó a
13,000 rpm durante 1min, posteriormente se desechó el filtrado y se añadieron 700 µL de la
solución de lavado de la membrana, nuevamente se centrifugó a 16,000 rpm durante 1 min
y el filtrado se desechó, enseguida se añadieron 500 µL de la solución de lavado de la
Página 39
membrana y se volvió a centrifugar a 16,000 rpm durante 1 min, luego cuidadosamente la
minicolumna se transfirió a un tubo eppendorf nuevo y finalmente el ADN obtenido se
resuspendió en 40 µl de TE 10:1y se guardó a -20 ºC hasta su uso. (Figura 13).
6.5.4 Preparación de muestras para la determinación de la secuencia nucleotídica
Para determinar la secuencia nucleotídica del locus b de U. maydis, se llevó a cabo
una amplificación por PCR en un termociclador BIORAD® modelo i־ cycler, usando 5 µL
de ADN como templado a una concentración de 50 ng, oligonucleótidos a una
concentración de 5 µM, 4µL de buffer Big Dye v3.1, 5X, 6 µL de agua milli ־Q estéril, 4µL
de buffer Big Dye v3.1 Ready mix, en un volumen final de 20 µL. Las condiciones en que
se llevaron a cabo las amplificaciones se muestran en el (Cuadro 4).
Cuadro 4. Condiciones de reacción de la amplificación del locus b de U. maydis para la determinación de
la secuencia nucleotídica.
.
Condiciones Tiempo T(ºC) Ciclos
Desnaturalización 1 min 96
Desnaturalización 10 seg 96 25
Alineamiento 5 seg 50
Alineamiento
T ºC mantenimiento (tiempo
indefinido)
4 min
-
60
4
25
-
Página 40
6.5.5 Purificación de Reacción de Secuenciación
Para la purificación de la reacción de secuenciación se utilizó el kit Bigdye
Xterminator® Purification, de la reacción de secuenciación se tomaron 10 µL y se
depositaron en un tubo junto con 45 µL de solución SAM, después se agitó vigorosamente
hasta observar una mezcla homogénea, luego al mismo tubo se le añadieron 10 µL de
solución Xterminador, posteriormente el tubo se agitó fuertemente a una temperatura de 25
ºC a 1400 rpm por 30 min y después de una centrifugación de 2 min a 12000 rpm, el
sobrenadante fue separado, y de éste se colocaron 10 µL en la placa del secuenciador
automático ABI 3130, mediante electroforesis capilar.
6.5.6 Análisis Bioinformático de las secuencias del locus b de U. maydis
Para el análisis de las secuencias nucleotídicas del locus b de U. maydis se utilizó el
programa computacional Chromas Lite. En internet se utilizaron las herramientas de la base
de datos del Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI)
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). La región analizada comprende parte del gen bW y del gen
bE (Anexo), ambos genes incluyeron la región variable y el homeodominio, así como la
región intergénica, el tamaño de las secuencias analizadas fue de 600 pb, y finalmente las
secuencias fueron comparadas con la base de datos blast en el NCBI.
Página 41
6.6 Técnica AFLP
El ADNg total se digirió con dos enzimas de restricción (MseI y PstI) que se ligaron
a los adaptadores. Posteriormente, se realizaron dos amplificaciones selectivas mediante
PCR utilizando oligonucleótidos que contienen secuencias comunes a los adaptadores y de
uno a dos nucleótidos arbitrarios serán secuencias selectivas. El total de bandas
polimórficas obtenidas de la reacción se determinó por la especificidad con los iniciadores
de las endonucleasas de restricción usadas para digerir el DNA genómico, el número y la
opción para la elección de iniciadores selectivos en el extremo 3' de los iniciadores de las
enzimas de restricción así como el tamaño y complejidad del ADN. El ADNg del hongo fue
digerido con las enzimas Mse I y Pst I a 37ºC por 2 h, después se calentó 70 ºC durante 15
min con la finalidad de inactivar las enzimas. Posteriormente los fragmentos se ligaron a
los adaptadores Mse I y Pst I durante 2h a 20 ºC. Una vez concluida la reacción, la muestra
de ligación fue diluida con agua estéril y se llevó a cabo la pre-amplificación por 20 ciclos
en la PCR. La amplificación preselectiva y selectiva se llevó a cabo como lo describen
Vos y col. (1995). Los fragmentos amplificados fueron separados mediante electroforesis
en gel de poliacrilamida al 6.5 % con un precorrimiento en un sistema de secuenciación
semiautomática IRD (modelo 4200-029; Li-cor ®; Lincoln, NE, EUA) con amortiguador
TBE 1X por 30 min a 2000 V y la separación de los fragmentos fue por 3 h al mismo
voltaje.Los datos AFLP de las muestras marcadas con el fluoróforo IRDye™ 800 se
obtuvieron del equipo en tiempo real.
Página 42
6.6.1 Análisis de Datos AFLP
Los cuatro geles se analizaron y las bandas polimórficas y monomórficas se
registraron. Se asumió que las bandas de un mismo peso molecular en diferentes individuos
son idénticas. La presencia de una banda fue indicada por un uno (1) y la ausencia como
cero (0); una vez obtenida la matriz binaria se construyó una matriz de distancias genéticas
empleadas para construir un dendrograma con el algoritmo UPGMA (Método de
Agrupamiento de pares no Ponderados con Medias Aritméticas; Avise, 1994); dicho
análisis se llevo a cabo con el software Statistica versión 7 ( StatSoft™, 2004); Luego se
realizó un análisis de varianza molecular (AMOVA) con el paquete estadístico Info-gen/P
(Balzarini y Di Rienzo., 2004) para determinar si hay diferencias estadísticas entre y dentro
de las cepas de U. maydis de los diferentes aislados de la República. El índice de diversidad
genética fué calculado como ID = 1 – pi2, donde pi es la frecuencia del alelo i
n; en este
caso cada alelo individual se considera locus único y a su vez un fragmento de
amplificación (Powell y col.1996).
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VII. RESULTADOS
7.1 Muestreo y colección de aislados para la detección de variantes alélicas de U.
maydis
Los estados de la República Mexicana muestreados para identificar las variantes
alélicas fueron 16 (Tamaulipas, Nuevo león, Hidalgo, Chiapas, Veracruz, Puebla,
Guanajuato, Oaxaca, Tlaxcala, Zacatecas, Nayarit, Jalisco, San Luis Potosí, Michoacán,
Querétaro y Aguascalientes) dicho muestreo se realizó con base en las zonas de mayor
producción y diversidad de las razas del maíz, que se dividen en cuatro (Occidente,
Vertiente del golfo, Altiplano central y Oaxaca); incluyendo también dos estados del norte
de la República Mexicana (Tamaulipas y Nuevo León). Es importante resaltar que en los
estados de Jalisco, Guanajuato, Hidalgo, Zacatecas y Puebla se analizaron un mayor
número de muestras, debido a que el centro de la República Mexicana es el origen, mayor
domesticación, diversidad, y recombinación del maíz y por la estrecha coevolución que
tiene con U. maydis, asumimos que también encontraríamos la mayor diversidad de
variantes alélicas. (Cuadro 5).
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Cuadro 5. Estados de las diferentes regiones de la República Mexicana muestreados para la detección
de variantes alélicas de U. maydis.
Regiones Estados Localidad
es
Localidades Variantes alélicas
Occidente
Nayarit 2 Los balastros
Jala
b3, b18
Ixtlán del Rio
b13, b13, b7
Jalisco 13 Autlán de
Jalisco juárez
b19, b19, b15
El grullo b18
Unión de
tula
b15
San Agustín b7
El banco b14, b15
La paz
Cihuatlán
b9
Cocula b9
El saucillo b15, b13
Palo chino b15,18a, b7
Magdalena b15
Los cuartos b17, b9
Tequila b7
Villa
Hidalgo
b7, b19
Michoacán 4 Queréndaro b7, b9, b15
Charo b18
Jesús María b7
Morelia b7
Altiplano Central
Hidalgo 3 Progreso Mixquihuala
b19,b19,b7,b7,b7,b7,b7,b7,b1,b15,b18,b18,b18,
Teocalco 14, 14, 14, 7,7, 7, 7,7, 13, 13, 13, 17, 17, 18, 18
Cruz Azul b7, b17
Zacatecas 6 Juchipila b7, b18a, b18
Felipe
Angeles
b7, b14
San Luis de Costique
b14
Villanueva b15, b19, b19
Jalpa b9, b7, b18, b17, b19
Moyahua b17, b17, b7
Puebla 5 Quetzalapa b13, b15
Sebastian
Zinacatepec
b15, b15, b15, b15, b15, b17, b18
Cuesta
Blanca
b19, b15
Esperanza b13, b7
Ciudad Serdán
b18, b17, b17, b17, b7
Tlaxcala 1 Huamantla b15, b15, b7, b7, b7, b7, b7, b14, b14, b14, b14,
b18, b17, b17
Región
Centro
Querétaro 2 Cadereyta b7, b14
Camarco b19, b18
Guanajuato 9 San Luis de
la Paz
b14, b9, b13, b14, b14, b7
Página 45
Irapuato b18, b18, b7
Tomelópez b14, b18
Temporales
Victoria
b17, b15, b15, b18, b18, b18a
Hacienda de
Higueras
Victoria
b18, b18
Milpillas b9
Dolores
Hidalgo
b7
La cuevita b7, b17, b7
Victoria carretera
Juventino
Rosas
b14
Aguascalie
ntes
1 Apozotlán b17, b17
Región Maya Chiapas 3 Chichilca municipio de
Comitan
b17, b17, b7, b7, b7, b7, b7, b7, b7, b7, b13, b13, b13, b13, b13, b13, b19, b19,
Riviera de la Victoria
b7
Rincón
Chamula
b13, b17, b17, b18, b14
Noreste Nuevo
León
1 San cayetno
de vacas
b7, b17
Tamaulipas 3 San Lorencito
7
Rancho
Nuevo
b14, b7, b7
Reynosa b15, 1b9
San Luis
Potosí
1 Entronque
Real de
catorce
b18
Oaxaca Oaxaca 2 Unión
Zapata
b17, b7
Santiago
Tilantongo
b7
Página 46
7.2 Determinación del tipo sexual de U. maydis mediante Reacción Fuzz.
La técnica in vitro para detectar el tipo sexual del hongo consistió en la observación
y comparación macroscópica y microscópica de las cepas de U. maydis cultivadas que
fueron confrontadas en medio completo con carbón activado, el crecimiento de una colonia
blanca con aspecto algodonoso (Figura 9) nos indicó que las cepas confrontadas se
aparearon y por lo tanto presentaron alelos a y b diferentes y se considera una Reacción
Fuzz positiva (Cuadro 6), el crecimiento de una colonia blanca brillante con aspecto
cremoso se consideró una Reacción Fuzz negativa. La confirmación de una Reacción Fuzz
positiva consistió en la observación del crecimiento micelial en microscopio (Figura 10); la
cepa FB2 se utilizó como control negativo.
.
Figura 9. Prueba de la reacción Fuzz en placa. Las cepas que mostraron reacción positiva se observan
macroscópicamente como una colonia micelial.
.
Página 47
Figura 10. Morfologia colonial de una reacción Fuzz positiva de cepas de U. maydis.
7.3. Amplificación del locus b por Reacción en cadena de la polimerasa (PCR).
Figura 11. Gel de agarosa al 0.8% mostrando productos de PCR correspondiente al gen bE de U.
maydis, tamaño de fragmento esperado señalado con flecha.
Página 48
7.4 Análisis Bioinformático de las secuencias del locus b de U. maydis de la República
Mexicana.
Los criterios considerados para analizar las secuencias nucleotídicas del locus b de
U. maydis fueron que presentaran un alto porcentaje de cobertura e identidad que varió del
90 al 100% y posteriormente fueron comparadas con la base de datos del NCBI. Es
importante mencionar que a la fecha existen 25 variantes alélicas reportadas (b1, b2, b3, b4,
b5, b6, b7, b19, b14, b12, b18, b18a, b9, b15, b10a, b16, b11, b10, b8, b4a, b4b, b13, b6a,
b6b, b6c), y en nuestro trabajo de las 25 variantes alélicas reportadas encontramos 11
(b7,b14, b15, b19, b18, b1, b17, b13, b9, b18a, y b3), distribuidas en diferentes localidades
y estados de la República mexicana, véase (cuadro) En total se encontraron 52 alelos b7,
este fue el más frecuente y corresponde al 30.4%, el segundo alelo con mayor frecuencia
fue el b18 y corresponde al 14%, el tercer alelo con mayor frecuencia fue el b15 y
corresponde al 12.2%; el alelo b17 corresponde al 10.5%; el alelo b13 corresponde al 9.9%;
el alelo b14 corresponde al 9.3%; el alelo b19 corresponde al 7.6%; el alelo b9 corresponde
al 4%; y los alelos con menor frecuencia fueron el b18a, b3y b1, cada uno corresponde al
0.5% del total de las secuencias analizadas, véase (figura 12). Ver (Figura 13, 14, 15,16,17,
18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 y 26).
Página 49
Figura 12. Gráfica que muestra la frecuencia de variantes alélicas distribuidas en la República
Mexicana.
Página 50
Cuadro 6. Variantes alelicas encontradas en los diferentes estados y localidades de la República
Mexicana.
Estado Localidad Muestra
(nomenclatura)
Variante
alelica
Cobertura Identidad
(%)
Coordenadas
Hidalgo
Chiapas
Progreso Mixquihuala
Teocalco
Cruz Azul
Chichilca
Tumor3/cepa13
Tumor7/cepa4
Tumor6/cepa1
Tumor11/cepa1
Tumor11/cepa1
Tumor9/cepa16
Tumor2/cepa3
Tumor8/cepa14
Tumor1/cepa3
Tumor12/cepa2
Tumor1/cepa2
Tumor4/cepa2
Tumor1/cepa4
Tumor 12/cepa2
Tumor 2/cepa2
Tumor 4/cepa 3
Tumor 5/cepa 16
Tumor16/cepa3
Tumor18/cepa3
Tumor17/cepa3
Tumor6/cepa12
Tumor15/cepa2
tumor4/cepa3
Tumor 5/cepa 16
Tumor16/cepa3
Tumor18/cepa3
Tumor17/cepa3
Tumor6/cepa12
Tumor15/cepa2
Tumor4/cepa3
Tumor 13/cepa1
Tumor 3/cepa12
Tumor 4 /cepa5
Tumor14/cepa11
Tumor3/cepa13
Tumor6/cepa12
Tumor1/cepa3
Tumor1/cepa1
Tumor21/cepa1
Tumor23/cepa3
Tumor9/cepa13
Tumor7/cepa7
Tumor22/cepa13
Tumor11/cepa14
Tumor20/cepa3
Tumor18/cepa10
Tumor1/cepa3
Tumor14/cepa3
b19
b7
b1
b15
b7
b18
b7
b18
b7
b18
b7
b19
b7
b14
b13
b7
b13
b13
b14
b13
b17
b18
b7
b13
b13
b14
b13
b17
b18
b7
b7
b14
b17
b7
b7
b18
b7
b17
b7
b17
b7
b7
b7
b7
b13
b19
b13
b7
99
100
85
95
98
100
99
100
98
100
99
99
94
99
99
99
100
100
90
98
99
100
89
100
100
90
98
99
100
89
99
90
99
99
99
99
90
99
87
80
96
100
100
99
100
100
97
100
98
98
97
96
98
99
94
94
99
99
98
97
97
97
97
98
91
94
93
97
89
98
98
91
94
93
97
89
98
98
86
99
89
98
97
99
98
97
86
93
97
99
98
98
100
98
91
99
Lat 20 1331 N Lon 99 10 42 W
Lat 20 5 38 N Lon 99 17 27 W
Lat 19 59 26 N
Lon 99 20 44 W
Lat 16 14 49 N
Lon 92 5 46 W
Página 51
Guanajuato
Rivera de la Victoria
Rincon Chamula
Sebastian
Cuesta blanca
Esperanza
Ciudad Serdán
San Luis de la Paz
Irapuato
Tomelópez
Temporales Victoria
Hacienda de Higueras
Dolores Hidalgo
La cuevita
Victoria
Tumor23/cepa15
Tumor5/cepa9
Tumor8/cepa5
Tumor17/cepa7
Tumor2/cepa2
Tumor23/cepa2
Tumor9/cepa2
Tumor1/cepa9
Tumor1cepa1
Tumor1cepa1
Tumor3/cepa9
Tumor4/cepa10
Tumor1/cepa11
Tumor1/cepa2
Tumor3/cepa7
Tumor 1/cepa2
Tumor1/cepa3
Tumor1/cepa2
Tumor1/cepa1
Tumor8/cepa1
Tumor5/cepa2
Tumor3/cepa2
Tumor1/cepa1
Tumor6/cepa3
Tumor 4/cepa3
Tumor 2/cepa3
Tumor2/cepa2
Tumor2/cepa2
Tumor1/ cepa1
Tumor1/ cepa1
Tumor1/ cepa 2
Tumor1/cepa1
Tumor3/cepa1
Tumor1/cepa3
Tumor 4/cepa1
Tumor4/cepa2
Tumor2/cepa10
Tumor5/cepa7
Tumor1/cepa13
Tumor4/cepa6
Tumor3/cepa9
Tumor5/cepa14
Tumor2/cepa2
Tumor3/cepa1
Tumor3/cepa3
Tumor2/cepa1
Tumor1/cepa3
Tumor7/cepa2
Tumor2/cepa1
Tumor6/cepa3
Tumor4/cepa2
Tumor8/cepa1
b13
b19
b13
b7
b13
b17
b13
b7
b7
b7
b13
b17
b18
b14
b17
b7
b13
b15
b15
b15
b15
b15
b17
b15
b18
b15
b19
b19
b15
b13
b7
b18
b17
b17
b7
b17
b14
b9
b13
b14
b14
b7
b18
b18
b7
b14
b18
b17
b18
b15
b15
b18
100
98
100
97
100
100
92
99
100
100
100
99
100
99
100
94
90
99
100
97
100
99
100
98
98
99
100
100
96
100
98
96
99
99
100
99
100
92
100
100
93
94
100
99
100
91
99
99
100
100
100
100
97
98
98
97
98
98
98
99
96
96
98
88
97
90
88
97
97
100
99
85
99
99
99
98
91
99
99
99
96
99
97
93
91
93
95
99
98
89
99
99
96
97
99
99
94
90
92
98
100
96
95
99
Lat 16 54 14 N
Lon 93 26 46 W
Lat 18 19 52 N
Lon 97 15 11 W
Lat 18 49 22 N
Lon 97 29 27 W
Lat 18 51 55 N
Lon 97 23 21 W
Lat 19 0 56 N
Lon 97 27 39 W
Lat 20 39 7 N Lon 101 21 28 W
Página 52
Oaxaca
Tlaxcala
Tamaulipas
Unión Zapata
Santiago Tilantongo
Huamantla
San Lorencito
Rancho Nuevo
Reynosa
Reynosa CBG
Juchipila
Felipe Angeles
San luis de Costique
Villanueva
Jalpa
Moyahua
Los balastros
Ixtlán del río
Autlán
El grullo
Unión de Tula
San Agustin
El banco
La Paz Cihuatlán
Cocula
El saucillo
Tumor1/cepa3
Tumor2/cepa2
Tumor3/cepa2
Tumor1/cepa1
Tumor1/cepa2
Tumor5/cepa1
Tumor3/cepa1
Tumor4/cepa2
Tumor1/cepa2
Tumor1/cepa2
Tumor1/cepa 1
Tumor 1/cepa 2
Tumor 1/cepa 3
Tumor 5/cepa 2
Tumor 6/cepa 3
Tumor 1/cepa 3
Tumor 4/cepa 1
Tumor 7/cepa1
Tumor7/cepa 2
Tumor 4/cepa 6
Tumor2/cepa 2
Tumor 1/cepa 1
Tumor 3/cepa 1
Tumor 5/cepa 1
Tumor 3/cepa 3
Tumor 6/cepa1
Tumor4/cepa2
Tumor 1/cepa 1
Tumor 3/cepa 3
Tumor 2/cepa 1
Tumor 1/cepa 2
Tumor 1/ cepa1
Tumor 1 / cepa1
Tumor 3/cepa 1
Tumor 1/cepa 3
Tumor 2/cepa 3
Tumor 2/cepa 1
Tumor 1/cepa 3
Tumor 1/cepa 1
Tumor 3/cepa 1
Tumor 1/cepa 2
Tumor 5/cepa 2
Tumor 5/cepa 1
Tumor 2/cepa 2
Tumor 3/cepa 3
Tumor 4/cepa 2
Tumor 1/cepa 2
Tumor 3/cepa 3
Tumor 1/cepa 2
Tumor 2/cepa 3
Tumor 2/cepa 2
Tumor 1/cepa 3
Tumor 2/cepa 3
Tumor 4/cepa 3
b18a
b18
b18
b9
b7
b7
b17
b17
b14
b17
b7
b7
b7
b15
b7
b7
b14
b18
b15
b17
b7
b14
b14
b7
b7
b14
b17
b7
b14
b7
b7
b15
b19
b18a
b7
b18
b7
b14
b14
b15
b19
b19
b9
b7
b18
b17
b19
b17
b17
b7
b3
b18
b13
b7
96
99
99
84
99
99
90
90
100
91
99
99
98
100
93
96
100
86
98
98
98
41
100
92
96
100
99
88
97
96
100
97
98
60
75
100
99
96
95
100
100
98
100
100
100
100
99
100
98
100
99
99
99
96
97
99
100
88
94
98
90
91
99
90
99
93
99
99
96
98
95
91
86
96
80
80
98
98
98
98
99
98
97
95
96
88
98
96
95
97
95
97
98
98
97
93
92
100
98
84
97
100
96
100
96
99
92
98
Lat 16 55 25 N
Lon 96 24 45 W
Lat 17 27 33 N
Lon 97 13 28 W
Lat 23 23 54 N Lon 99 24 23 W
Lat 21 25 56 N Lon 6 9 00 W
Lat 22 33 3 N Lon 102 47 32 W
Lat 21 58 30 N Lon 102 52 52 W
Lat 21 4 14 N Lon 104 26 40 W
Lat 21 15 45 N
Lon 103 09 35 W
Lat 21 4 9 N
Lon 104 26 53 W
Lat 21 2 11 N
Lon 104 23 39 W
Lat 20 25 9 N
Lon 103 37 8 W
Página 53
Palo chino
Magdalena
Los cuartos
Tequila
Villa Hidalgo
Entronque Real de catorce
Queréndaro
Charo
Jesús María
Morelia
Cadereyta
Camarco
San cayetano de vacas
Apozotlán
Tumor 1/cepa 1
Tumor 2/cepa 2
Tumor 2/cepa 1
Tumor 3/cepa 2
Tumor 1/cepa 3
Tumor 1/cepa 2
Tumor 1/cepa 3
Tumor 1/cepa 2
Tumor 2 /cepa2
Tumor 1/cepa 2
Tumor 1/cepa 3
Tumor 1/cepa 1
Tumor 2/cepa 2
Tumor 2/cepa 2
Tumor 2/cepa 3
Tumor 1/cepa 3
Tumor 1/cepa 2
Tumor 1/cepa 2
Tumor 2/ cepa 3
Tumor 1 /cepa 1
Tumor 1/cepa 1
Tumor 1/ cepa 3
Tumor 2/cepa 2
Tumor 3/cepa 2
Tumor 5/cepa 2
Tumor 7/cepa 2
Tumor 1 /cepa 3
Tumor 1/cepa 1
Tumor 1/ cepa 3
Tumor 1/cepa 1
Tumor 2/cepa 2
Tumor 1/cepa 3
Tumor 2/cepa 3
Tumor 1/cepa 1
Tumor 1/cepa 3
Tumor 1/cepa 2
b13
b19
b19
b15
b18
b15
b7
b14
b15
b9
b9
b15
b13
b15
b18a
b7
b15
b17
b9
b7
b7
b19
b18
b7
b9
b15
b18
b7
b7
b7
b14
b19
b18
b7
b17
b17
100
100
99
99
99
99
99
99
80
99
100
100
99
100
36
97
94
100
100
98
97
99
100
87
99
99
100
100
89
100
99
94
99
100
100
98
90
98
88
95
98
97
97
83
95
90
92
96
90
95
94
97
95
91
91
96
98
99
99
94
93
98
100
100
98
99
87
97
99
100
97
90
Lat 19 49 9 N
Lon 104 14 1 W
Lat 19 59 48 N
Lon 104 11 16 W
Lat 20 5 8 N
Lon 104 12 10 W
Lat 19 46 56 N
Lon 104 14 14 W
Lat 20 21 38 N
Lon 103 53 11 W
Lat 21 1 40 N
Lon 104 10 8 W
Lat 19 29 45 N
Lon 104 34 56 W
Lat 20 16 0 N Lon 103 56 2 W
Lat 20 52 38 N Lon 103 48 58 W
Lat 23 50 36 N
Lon 100 48 58 W
Lat 19 48 25 N Lon 100 52 33 W
Lat 19 45 9 N
Lon 101 2 46 W
Lat 20 00 22 N
Lon 102 57 32 W
Lat 20 41 47 N
Lon 99 43 54 W
Lat 21 6 30 N Lon 19 43 14 W
Lat 23 59 01 N
Lon 100 25 27 W
Página 54
Figura 14. Dendrograma de las variantes alélicas presentes en Aguascalientes con base en la secuencia
nucleotídica del locus b de U. maydis
Figura 14. Dendrograma de las variantes alélicas presentes en Chiapas con base en la secuencia
nucleotidica del locus b de U. maydis.
Figura 13. Dendrograma de las variantes alélicas presentes en Aguascalientes con base en la secuencia
nucleotidica del locus b de U. maydis.
Página 55
Figura 15. Dendrograma de las variantes alélicas presentes en Guanajuato con base en la secuencia
nucleotídica del locus b de U. maydis
Página 56
Figura 16. Dendrograma de las variantes alélicas presentes en Jalisco con base en la secuencia
nucleotidica del locus b de U. maydis.
Página 57
Figura 17. Dendrograma de las variantes alélicas presentes en Nuevo León con base en la secuencia
nucleotídica del locus b de U. maydis.
Figura 18. Dendrograma de las variantes alélicas presentes en Michoacán con base en la secuencia
nucleotídica del locus b de U. maydis.
Página 58
Figura 19. Dendrograma de las variantes alélicas presentes en Oaxaca con base en la secuencia
nucleotídica del locus b de U. maydis.
Figura 20. Dendrograma de las variantes alélicas presentes en Nayarit con base en la secuencia
nucleotidica del locus b de U. maydis.
Página 59
Figura 21. Dendrograma de las variantes alélicas presentes en Puebla con base en la secuencia
nucleotidica del locus b de U. maydis
Página 60
Figura 22. Dendrograma de las variantes alélicas presentes en Querétaro con base en la secuencia
nucleotidica del locus b de U. maydis.
Figura 23. Dendrograma de las variantes alélicas presentes San Luis de Potosí con base en la secuencia
nucleotídica del locus b de U. maydis.
Página 61
Figura 24. Dendrograma de las variantes alélicas presentes en Tamaulipas con base en la secuencia
nucleotídica del locus b de U. maydis.
Figura 25. Dendrograma de las variantes alélicas presentes en Veracruz con base en la secuencia
nucleotídica del locus b de U. maydis.
Página 62
Figura 26. Dendrograma de las variantes alélicas presentes en Zacatecas con base en la secuencia
nucleotidica del locus b de U. maydis.
Página 63
7.5 Análisis AFLP
Se probaron seis combinaciones de oligonucleótidos AFLP, pero cuatro fueron las
mas polimórficas y generaron informacion en los 60 individuos de U. maydis (Cuadro),
colectados en distintas regiones geográficas y localidades de la República Mexicana. Las
cuatro combinaciones de oligonucleótidos selectivos amplificaron un total de 273 productos
de los cuales 267 (98 %) fueron polimórficos y 6 monomórficos (2%) ( Figura 21). El
análisis de varianza molecular (AMOVA) indicó la existencia de diferencias significativas
(p<0.0001) entre estados en U. maydis. Asimismo, se observó que el factor estado explicó
la mayor parte de la varianza detectada en el AMOVA (92 %) (Cuadro 8), en cambio el
factor de variación dentro de poblaciones solo explicó el (8%) de la varianza; el valor Fst
obtenido fue de 0.07 el cual explica que existe una diferenciación genética moderada. El
análisis de conglomerados con base en datos AFLP (Figura 22) mostró la formación de dos
grupos principales de individuos de U. maydis, donde las distancias genéticas variaron de
2.3 a 6.2 %. En primer lugar se agrupan los especímenes de U. maydis colectados de
Hidalgo, Guanajuato, Zacatecas y Jalisco con distancias genéticas que varían de 2.8-3.5 %.
En el segundo grupo están incluidos los especímenes de U. maydis colectados en los
estados de Tamaulipas, San Luis Potosí, Querétaro, Nayarit, Tlaxcala, Chiapas, Puebla, y
Michoacán con distancias genéticas que varían de 2.3- 6.3. Sin embargo los especímenes de
U. maydis no se agruparon con base en las regiones de mayor diversidad de las razas de
maíz, aunque los especímenes de U. maydis colectados de la región noreste son los únicos
incluidos dentro de un mismo grupo. Con los especímenes de U. maydis empleados para los
AFLP, se realizó un dendrograma con base en las secuencias nucleotídicas, en el cual se
formaron claramente 6 grupos de conglomerados, se observó que se agruparon en base al
Página 64
tipo de variante alélica, el alelo b18 formó el mayor grupo, el alelo b7 formo dos grupos, el
alelo b14, b15 y b19, están agrupados claramente; el alelo b18 fue el más frecuente y el
alelo b3 es el menos frecuente, según el dendrograma el alelo b7 esta mas estrechamente
relacionado con el alelo b19 y b13, los alelos b3 y b9 también están estrechamente
relacionados, el alelo b17 tiene una relación menor con respecto al b7, b19, b13, b14, b18,
b15,b3, b9.
Cuadro 7. Aislamientos de U. maydis sometidos al análisis AFLP
Estado Localidad No. De Muestras
Hidalgo Teocalco 15/2 6
Teocalco 7/1
Teocalco 12/2
Progreso 9/16
Progreso 3/13
Progreso 7/4
Oaxaca Santiago Tilantongo 1/2 1
Tlaxcala Huamantla 4/1 3
Huamantla 5/2
Huamantla 7/1
Chiapas Rincón Chamula 1/11 7
Rincón Chamula 3/15
Chichilca Comitan 7/7
Chichilca Comitan 3/8
Página 65
Chichilca Comitan 8/5
Chichilca Comitan 21/1
Rivera de Victoria 21/1
Guanajuato SLPZ 21/1 8
SLPZ 2/10
SLPZ 3/9
Temporales 7/2
Hacienda de Higueras 2/2
Milpillas 1/1
Dolores Hidalgo 1/1
Irapuato 2/2
Puebla Esperanza 1/1 3
Sebastian 5/2
Quetzalapa 3/2
Tamaulipas Rancho Nuevo 2/1 3
Rancho Nuevo 3/3
San Lorenzo 1/1
Jalisco El grullo 1/3 8
Autlan 1/2
Autlan 2/2
Palo chino 1/3
Los cuartos 1/2
Magdalena 1/2
Página 66
Hastotipaquillo 1/1
Autlan 1/3
Nayarit Los balastros 2/2 3
Ixtlan del rio 4/3
Ixtlan del rio 2/3
Michoacan Querendaro 7/2 3
Queredaro 9/2
Querendaro 5/2
Queretaro Cadereyta 1/1 2
Camarco 1/3
Zacatecas Villa Nueva 2/3 8
Villa Nueva 5/2
Apozotlan 3/3
Villa Nueva 3/1
Juchipila 3/1
Jalpa 4/2
Jalpa 3/3
Juchipila 2/3
SLP Real de Catorce 1/2 2
Real de Catorce 2/2
Nuevo León San Diego de Vacas 1/1 1
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Figura 21. Productos AFLP de individuos de U. maydis colectados de diferentes localidades y estados de
la República Mexicana. M pb = Marcador de pares de bases; * Numero de accesión.
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Cuadro 8. Productos AFLP amplificados por combinación en especímenes de U. maydis
Combinación AFLP Productos amplificados
Monomórficos Polimórficos Total
Polimorfismo (%)
AG/AC 1 45 46 97.8
AG/AT 1 64 65 98.4
AG/AG 2 102 104 98.0
AC/ AC 1 57 58 98.2
Total/Media 1 67 273 98.1
Cuadro 9. Análisis de Varianza Molecular de diferentes individuos de U. maydis colectados de
diferentes localidades y estados de la República Mexicana.
Fuente de
Variación Suma de
Cuadrados
Grados
de
libertad
Cuadrados
Medios
p-valor Iter. # varianza
explicada
(%)
Entre
estados
15433.18 11.00 1403.02 < 0.0001 750 92
Dentro de
poblaciones
1343.98 36.00 37.09 < 0.0001 750 8
Total 16777.16 54 310.69 100
Página 69
27. Dendrograma de las relaciones geneticas de U. maydis con base en el metodo UPGMA entre estados
de la Republica Mexicana.
.
.
Página 70
VIII. DISCUSIÓN
A la fecha se han reportado 25 variantes alélicas en el locus b de U. maydis, en el
presente trabajo fueron analizadas 173 secuencias nucleotídicas de dicho locus, para
conocer la diversidad de variantes alélicas presentes en diferentes localidades, estados y
regiones de la República mexicana, en nuestro trabajo solo se encontraron 11 variantes
alélicas (b7, b14, b15, b19, b18, b1, b17, b13, b9, b18a, y b3) de un total de 26, y los que
no encontramos fueron (b2, b4, b5, b6,b12,b10, b10a, b11, b16, 4a, 4b, 6a, 6b, 6c,); era de
esperarse que como México es el centro de origen del maíz domesticacin, y mayor
diversidad, por la estrecha coevolución que tiene con U. maydis también estarían presentes
la mayoría de las variantes alélicas y sin embargo no fue así, probablemente se debe a que
los que no encontramos no son tan frecuentes, o valdría la pena analizar un mayor número
de muestras es posible que en los estados y localidades no muestreados estén presentes. En
total de las secuencias analizadas el alelo b7 fue el más frecuente y el menos frecuente fue
el b1 ya que solo se encontró en la localidad de Progreso Mixquihuala, (Saleh y col., 2006)
reportan haber identificado 8 variantes alélicas (b1, b2, b3, b4, b5, b6, b7 y b8) en 7
localidades de Egipto, a diferencia de nosotros ellos identifacarón con frecuencias iguales
los alelos b1, b3 y b8, siendo los alelos b4 y b6 los menos frecuentes, los alelos
identificados que tenemos en común con (Saleh y col., 2006) son el b1, b3 y b7. Jalisco fue
el estado donde se encontró una mayor diversidad de variantes alélicas en dicho estado
están presentes 10 alelos b de un total de 11, en Jalisco el alelo b15 fue el mas frecuente y
esta disperso en 5 localidades diferentes, en este estado no se observo que existirá relación
geográfica con algún tipo de variante alelica; en el estado de Gto.se muestrearon 6
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localidades y también se encontraron 6 alelos b diferentes, se observó que existe una
relación geográfica entre las localidades del Norte de Guanajuato (San Luis de la Paz y
Victoria) con el alelo b14, esto se debe posiblemente a que dichas localidades son cercanas;
es importante mencionar que el alelo b14 también fue el más frecuente en Guanajuato; por
otro lado también se observo que existe una relación geográfica entre las localidades del
centro de Gto.( Irapuato y Tomelópez) con el alelo b18, ya que este tipo de alelo no se
encontró en ninguna otra localidad de Gto. Hidalgo es el segundo estado con mayor
diversidad de variantes alélicas ya que se identificaron 8 de un total de 11, siendo el alelo
b7 el mas frecuente, cabe mencionar que de todos los estados analizados la variante alélica
b7 se identificó con mayor frecuencia en dicho estado; en el estado de Puebla se
identificaron 5 variantes alélicas diferentes, siendo el b15 el más frecuente y se observo que
existe una relación geográfica y el tipo de variante alelica en la localidad de Sebastian con
el alelo b15; en el estado de Zacatecas se identificaron 7 variantes alélicas diferentes y 2
están en frecuencias iguales (b19 y b17), en esta caso no observó que alguna variante
alélica tuviera afinidad con alguna localidad o bien con el mismo estado como en los casos
anteriormente mencionados. En el estado de Oaxaca a pesar de que solo se analizaron dos
localidades diferentes observamos que en la localidad de Santiago tilantongo únicamente
está presente el alelo b7, en Tlaxcala a pesar de que solo se analizó un localidad están
presentes 5 tipos de alelos diferentes, siendo el mas frecuente el b7. En el estado de San
Luis Potosí solo se analizó una localidad encontrándose únicamente el alelo b18; y en
Nuevo león se analizaron 2 localidades y en una identificamos el alelo b7 y en la otra el
b17, en el caso del estado de Nayarit se analizaron 2 localidades diferentes encontrándose 4
alelos diferentes (b13, b7, b18, y b3), en la localidad de Ixtlán del Rio el alelo b13 es el mas
frecuente, En Michoacán encontramos 5 variantes alélicas diferentes y en la localidad de
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Queréndaro están presentes (b7, b9, y b15); en Querétaro fueron analizadas 2 localidades
diferentes en la primera se encuentran (b19, y b18), en la segunda estan presentes el alelo
(b14 y b7), Finalmente en nuestro trabajo se incluyó el estado de Tamaulipas porque
observamos que existen varios ejidos en los que se siembra maíz y nos pareció interesante
conocer que variantes alélicas del locus b de U. maydis están presentes, los alelos b
identificados fueron (b19, b15,b14 y b7), siendo el b7 el más frecuente. Finalmente
podemos decir que solo en algunos casos mencionados líneas atrás, si existe relación
geográfica con el tipo de variante alelica.
Por otro lado en la región occidente se encuentran la mayoría de los alelos b
encontrados a excepción de los alelos b1 y b18a esto concuerda que en dicha región
también se siembran varios tipos de maíz según (Muñoz, 2005) que son aproximadamente
10 razas (Chapalote, Reventador, Tablilla de ocho, Tabloncillo, Harinoso de ocho, Maíz
dulce, Maíz conejo, Cónico Norteño, Celaya, y Jala) ; La Región del Altiplano Central es la
segunda región donde existen varias razas de maíz y también en nuestro trabajo la segunda
con mayor diversidad de variantes alélicas ( b1, b7, b13, b14, b15, b17, b18 y b19) en dicha
región según (Muñoz, 2005) están presentes 8 razas diferentes de maíz ( Palomero,
Toluqueño, Cónico, Cacahuacintle, Elotes cónicos, Pepitilla, Ancho, y Chalqueño ; en la
Región Centro también se encontraron 8 variantes alélicas diferentes, finalmente según
(Muñoz, 2005) en la Región Maya existen 7 razas de maíz diferentes (Nal- tel Olotillo,
Olotón, Tehua, Tepecintle, Vandeño y Comiteco) y en el presente trabajo en dicha región
también existe el menor número de variantes alélicas (b7, b13, b14, b17, b18 y b19), con
base en lo anterior se puede sugerir que existe una relación proporcional entre la diversidad
de variantes alélicas con las regiones donde se siembran varias razas de maíz, es decir a
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mayor número de razas de maíz mayor numero de variantes alélicas. Con base en los
resultados obtenidos en la presente investigación se sugiere que 10 de las variantes alélicas
encontradas ninguna está relacionada con una raza de maíz, ya que por ejemplo el alelo b7
esta distribuido en todas las regiones analizadas y entre ellas no existen razas de maíz en
común, sin embargo el alelo b1 únicamente se encontró en la región Altiplano Central.
El análisis AFLP detectó alto nivel de polimorfismo (98%) en las poblaciones de U.
maydis analizadas y discriminó entre individuos de uno y otro estado, el análisis de
conglomerados mostró la formación de dos grupos de especímenes de U. maydis de
acuerdo a su origen, los especímenes de estados más cercanos (Guanajuato, Jalisco,
Hidalgo y Zacatecas) formaron un grupo, y los especímenes oriundos de estados más
lejanos ( Nayarit, Chiapas, Tamaulipas y San Luis Potosí, Tlaxcala, Puebla y Michoacán)
están incluidos en otro grupo. Genéticamente los especímenes del estado de Michoacán son
los más diferentes en comparación con el resto de los estados, y los especímenes de U.
maydis de los estados de Guanajuato y Zacatecas fueron genéticamente los más parecidos;
pero en el trabajo de (Valverde y Col., 2000) con base en algoritmo UPGMA observaron
que entre los estados de Oaxaca y Pachuca existe la mayor identidad poblacional. La
diversidad genética de U. maydis entre estados fue alta (92%); (Saleh y col., 2006)
realizaron análisis de diversidad genética de U. maydis en siete diferentes localidades de
Egipto y la diversidad genética encontrada entre poblaciones fue del (85.86%). En sus
trabajos (Valverde y Col., 2000) y (Zambino y Col., 1997) mencionan haber encontrado
mayor diversidad genética en escalas espaciales pequeñas que en escalas macro
geográficas. En el presente trabajo se analizaron especímenes de U. maydis de 39
localidades diferentes de la República mexicana y a pesar de que (Saleh y col., 2006) solo
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analizaron 7 localidades, también obtuvieron un alto porcentaje de diversidad genética; es
importante mencionar que mediante análisis RAPD (Saleh y col., 2006) analizaron solo
diez muestras de U. maydis pertenecientes a cuatro localidades diferentes de Egipto y
reportan un polimorfismo del 67.50%. Los resultados obtenidos en el presente trabajo en
cuanto a diversidad genética y polimorfismo son más altos, debido a que se analizaron un
mayor número de especímenes y de localidades comparado con el trabajo de (Saleh y col.,
2006). Los especímenes de U. maydis no se agruparon con base a la región de origen, ya
que en el primer grupo de conglomerados están incluidas cuatro regiones diferentes de las
seis que se analizaron, y en el segundo grupo tampoco se observó agrupamiento de las
regiones pero en este caso están incluidas todas las regiones de mayor diversidad de las
razas de maíz; las muestras de U. maydis colectadas en la región noreste están incluidas en
el segundo grupo, lo anterior demuestra la amplia diversidad genética de dicha especie y
por lo tanto es de suponer que a mayor diversidad genética mayor recombinación genética
y también mayor número de variantes alélicas en el locus b de U. maydis.(Valverde y
col.,2000) mediante análisis RFLP analizaron la diversidad genética de 32 especímenes de
U. maydis pertenecientes a cinco estados diferentes de la República Mexicana distribuidos
en el norte, centro y sur del país, trabajo en el cual reportan un alto grado de polimorfismo
y una amplia diversidad genética de dicha especie, distribuida en todos los sitios analizados
( Irapuato, Oaxaca, Pachuca, Toluca y Culiacán) lo cual coincide con el presente trabajo;
cabe mencionar que (Valverde y col.,2000) concluyen en su trabajo que no existe una
correlación entre distancias genéticas con distancias geográficas, altitud, o precipitación
anual en poblaciones de U. maydis; en el presente trabajo también se observó que no existe
una correlación entre distancias genéticas con distancias geográficas por región ni por
estados de los especímenes de U. maydis analizados. Por ejemplo a pesar de que el estado
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de Michoacán se encuentra geográficamente más cerca de Gto., Hidalgo, Zacatecas y
Jalisco, presenta la mayor distancia genética. Nuestros resultados demostraron que la
técnica AFLP es una herramienta capaz de detectar la variación genética en poblaciones de
U. maydis, además de discriminar las poblaciones entre estados.
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IX. CONCLUSIONES
La variabilidad genética de U. maydis en la República Mexicana es significativa y
los aislamientos pueden diferenciarse con base en su origen geográfico.
Existen 11 variantes alélicas (b7, b14, b15, b19, b18, b1, b17, b13, b9, b18a, y b3),
distribuidas en la República Mexicana.
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X. RECOMENDACIONES
Resultaría interesante el estudio y evaluación de un mayor número de muestras de
U. maydis de las regiones del Norte y Sur de México, con la finalidad de obtener un
panorama más amplio de la distribución de las variantes alelicas.
También resultaría interesante evaluar un mayor número de aislamientos para tener
conocimiento de las localidades y estados que presentan mayores niveles de diversidad
genética, ya que en el presente trabajo únicamente sesenta aislamientos fueron sometidos al
análisis.
Existen escasos trabajos como el que aquí se describe, se sugiere que se continúe
desarrollando investigaciones sobre U. maydis ya que sus características biológicas,
bioquímicas, genéticas, moleculares, patogénesis y gastronómicas, lo han hecho atractivo
para la ciencia.
Página 78
XI. BIBLIOGRAFÍA
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Página 81
XII. GLOSARIO
Basidiomiceto = basidios. Son hongos con micelio tabicado que producen esporas en
estructuras especializadas llamadas
Buffer = Solución amortiguadora.
Dendrograma = Representación grafica de datos en forma de árbol que organiza los datos
en subcategorias que se van dividiendo en otros hasta llegar al nivel de detalle deseado.
Diversidad = Diferencia entre las características de un conjunto o entre los de una misma
clase.
Iniciador = Secuencia sintética de oligonucleótidos que se utiliza para reconocer por
apareamiento complementario secuencias blanco en ADN molde, que consiste
generalmente en ADN genómico.
MseI = Enzima de restricción derivada de Micrococcus species que corta el ADN dentro de
cada una de las cadenas de forma palíndrome (5'…T▼TAA…3').
PstI = Enzima de restricción producida por el microorganismo Providencia stuartii que
posee una diana de restricción en el ADN de cadena doble dependiente de una secuencia no
metilada, palindrómica y asimétrica, sobre la cual su actividad catalítica hidrolasa genera
extremos cohesivos.
Radioisótopos = a aquel isótopo que es radiactivo e indica que todos los tipos de átomos de
un mismo elemento se encuentran en el mismo sitio de la tabla periódica.
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XIII. ANEXOS
Figura 9. Representación esquemática de las secuencias parciales alineadas de los 25 alelos b de U. maydis, a apartir de las zonas en verde
(Homeodominio), punteada (Región intergénica y café (Región variable), se realizó el análisis de las secuencias. Las líneas en azul y rojo
delimitando la zona de estudio.
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