La Investigación al servicio de la Salud
Margarita SalasC t d Bi l í M l l S O hCentro de Biología Molecular Severo Ochoa
(CSIC–UAM)
La Propiedad Industrial en la Sociedad:Salud, Deportes y Medioambiente
UIMP, Santander, 13 de Julio de 2010
1944 - Avery, McLeod y McCarthy demostraron que el DNA es el “principio transformante” en pne mocco (el material genético)“principio transformante” en pneumocco (el material genético)
El DNA es una doble hEl DNA es una doble héélicelice
Propuesto porPropuesto por James WatsonJames Watson yyPropuesto por Propuesto por James WatsonJames Watson yyFrancis CrickFrancis Crick en 1953en 1953Basado en datos de difracciBasado en datos de difraccióón de rayos X n de rayos X y estudios de la composiciy estudios de la composicióón qun quíímica del mica del y py p qqDNADNA
Rosalind Elsie Franklin
• Londres,1920-1957
Una fotografía importanteg p
• Cristalograíia de rayos X del DNA B obtenida por Rosalind FranklinRosalind Franklin
• De esta foto se obtuvieron datos cruciales para datos c uc a es pa a proponer la estructura en doble hélice del DNA
Reglas de ChargafReglas de ChargafReglas de ChargafReglas de Chargaf
[A] = [T] y [C] = [G][A] = [T] y [C] = [G]
Apareamiento de bases complementariasApareamiento de bases complementarias
Estructura del DNAEstructura del DNA
•• Vuelta completa de hVuelta completa de héélicelice(360(360°°) es) es 3 4 nm3 4 nm(360(360 ) es ) es 3.4 nm3.4 nm
•• bases espaciadas bases espaciadas .34nm.34nmpp•• 10 bases/vuelta10 bases/vuelta
Modelo de WatsonModelo de Watson--Crick de replicación Crick de replicación
1955: Arthur Kornberg
Descubrió la primera DNA polimerasa en Escherichia colicon la que sintetizó por primera vez ácido desoxiribonu-cleico en el tubo de ensayo
1959: Arthur Kornberg (Stanford University) & Severo Ochoa (NYU)
Central Dogma of BiologyCentral Dogma of Biology
SEVERO OCHOA (1905-1993)
Premio Nobel 1959 N 959
Descubrió la Polinucleótido Polinucleótido fosforilasa: sintetizópor primera vez ácido ribonucleico en el tubo de ensayo
Código genéticoCódigo genético
Algunas contribuciones de la Biotecnología
– Sector farmacéutico: Insulina, hormona de crecimiento,interferones, vacunas, etc
S di bi l B i difi d – Sector medioambiental: Bacterias modificadas parabiodegradar compuestos tóxicos
– Sector agrícola: Plantas transgénicas resistentesa insectos, virus, suelos salinos, etc.
ALGUNOS GENOMAS SECUENCIADOS
Eucariotas Procariotas
Saccharomyces cerevisiaeArabidopsis thalianaO
Escherichia coliBacillus subtilis
Oryza sativaPlasmodium falciparumAnopheles gambiaeT b i
Bacillus anthracisBorrelia burgdorferiChlamydia trachomatisCl t idi f iTrypanosoma brucei
Trypanosoma cruziLeishmania majorDrosophila melanogaster
Clostridium perfringensHaemophilus influenzaeHelicobacter pyloriMycobacterium lepraeDrosophila melanogaster
Caenorhabditis elegansFugu rubripesGallus gallus
Mycobacterium lepraeMycobacterium tuberculosisNeisseria meningitidisSalmonella entericaGallus gallus
Mus musculusRattus norvegicusPan troglodytes
Salmonella entericaSalmonella typhiStaphylococcus aureusStreptpcoccus pneumoniaePan troglodytes
Homo sapiensStreptpcoccus pneumoniaeVibrio choleraeYersinia pestis
30-4000026000
19000
26000Genes
14000
60004000
Genome 4 6 12 1 125 97 180 3200Genome(Mb)
4,6 12,1 125 97 180 3200
E t t tá d dEstructura estándar de un gen
Procesamiento del mRNA
A. RNA editing
B. Alternative splicingp g
• Are we ‘just’ E. coli, except more so?
"Tout ce qui est qvrai pour le C lib ill t Colibacille est vrai pour l'éléphant" vrai pour l éléphant
Jacque Monod (1972) (1972) 1965 Nobel laureate
Humanos y ChimpancésHumanos y Chimpancés
Homo sapiens 99.9% idénticosomo sapiens 99.9% dé cosHomo sapiens y Pan troglodytes 99.0% idénticos
Q é di l ?Qué nos dice el genoma?
Todavía no mucho…
• el mismo tamaño (3 200 millones de nucleotidos)• ~ el mismo tamaño (3.200 millones de nucleotidos)
• ~el mismo número de genes (~25.000)
• los mismos genes• ~los mismos genes
Expresión de genes
Hipótesis: No son las diferencias estructurales de las proteinas, sino las diferencias en su expresión entre los phumanos y los chimpancés lo que da cuenta de nuestra “humanidad ”cuenta de nuestra humanidad.
Telómeros y Telomerasa
1 Los extremos de los cromosomas eucarióticos tienen miles de 1. Los extremos de los cromosomas eucarióticos tienen miles de copias de una secuencia de DNA de 6 nucleótidos (telómeros).
2. Telomerasa, enzima que cataliza la adición de nuevas secuencias repetidas.
3. La ausencia o la mutación de la telomerasa produce acortamiento del cromosoma y división celular limitadaacortamiento del cromosoma y división celular limitada.
SNPs
• Los polimorfismos de un solo nucleótido (SNPs) representan el tipo de variación más frecuente en el DNA de los humanos.
• Ocurren con una frecuencia de 1 por cada 1000 nucleótidos
y tienen una gran importancia en el fenotipo.
Cambio sinónimo: TTA (Leu) a TTG (Leu)Cambio no sinónimo: TTA (Leu) a TTT (Phe)Cambio no sinónimo: TTA (Leu) a TTT (Phe)
AsthmaAutoimmune polyglandular syndrome
Breast and ovarian cancer
Crohn's diseaseDiGeorge syndromeFamilial Mediterranean feverI d fi i ith H I MBurkitt lymphoma
Chronic myeloid leukemiaColon cancer
Immunodeficiency with Hyper-IgMSevere combined immunodeficiency
Alzheimer diseaseLung cancerMalignant melanomaMultiple endocrine neoplasiaN fib t i
Alzheimer diseaseAmyotrophic lateral sclerosisAngelman syndromeCharcot-Marie-Tooth diseaseNeurofibromatosis
p53 tumor suppressorPancreatic cancerProstate cancer
Charcot Marie Tooth diseaseEpilepsyEssential tremorFragile X syndromeProstate cancer
Ras oncogeneRB: retinoblastomavon Hippel-Lindau syndrome
g yFriedreich's ataxiaHuntington diseaseNiemann-Pick diseasevon Hippel-Lindau syndromeParkinson diseasePrader-Willi syndromeRett syndromeSpinocerebellar atrophyWilliams syndrome
BIOMEDICINA
- La mayoría de enfermedades tienen alguna base genética
- Algunas son monogénicas: unas 1500 asociadas a genes de secuencia conocida
- Otras, las más comunes (cáncer, obesidad, cardiopatías)dependen de más de un gen y el medio ambiente desempeña un importante papel
- Hasta ahora se han caracterizado unos 3 millones de SNPs distribuidos a lol d t d l hlargo de todo el genoma humano
El conocimiento de los genes implicados en la enfermedad, de sus mecanismosde control y del efecto de los SNPs y mutaciones permitirá:
1. DIAGNOSTICO: tests genéticos para detectar predisposición a enfermedades
2 PREVENCION: Evitar la exposición a factores ambientales que favorezcan2. PREVENCION: Evitar la exposición a factores ambientales que favorezcanla aparición de enfermedades. Evaluación de riesgos por exposición a contaminantes, agentes químicos o radiaciones.
3. TERAPEUTICA:
- Terapia génicae ap a gé ca- Farmacogenómica: drogas personalizadas. Diseño de medicamentosespecíficos para un patrón genético determinado. Reducción de losefectos secundarios al conocer la capacidad genética del pacientep g ppara asimilarlos.
Genómica ComparadaH R dHumanos vs. Roedores
La mutación c-kit de humanos y ratones tiene fenotipos similaresLa mutación c-kit de humanos y ratones tiene fenotipos similares Puede observarse el mismo tipo de hipopigmentación en ambos organismos
Por tanto los ratones son buenos modelos para estudiarPor tanto los ratones son buenos modelos para estudiarenfermedades humanas
Phage ø29 and Biotechnology
BACTERIOPHAGE φ29 DNA
Enzymatic activities of bacteriophage φ29 DNA polymerasey p g φ p y
M13 DNA REPLICATION BY THE φ29 DNA POLYMERASE
Exonucleasedomain
TPR2
Thumb
Fingers
Palm
TPR1
Exonucleasedomain
TPR2
Thumb
Fingers
Palm
TPR1
BA
.. FRYYD-LRNATAITTFGQMAL...NV---------------------.QINRKLLINSLYGALG
CRB69 /558/
. G EEETKDPVYTPMGVFITAWARYTT..... DVTGKVPYLKEN ALGFRLGSNPKQLAKLMLNSLYGKFACRFFD-PRLASSITMRGHQIM..... T---------------------T.Q-ALKIIMNAFYGVLG
..
..RWYC-KECAESVTAWGRQYI...AYA---------------------RWYC-KECAESVTAWGRHYI..AYAK--------------------
.QRAIKILANSFYGYYG
.QRAIKILANSFYGYYGRWYC-LECAESVTAWGREYI..A... YA--------------------- .QRAIKILANSYYGYYGRWYC ..A... AR-------------------- .-KECAESVTAWGREYIQRAIKILANSYYGYYGY
420398ø29 /379/
.T. gorgonarius /481/Thermococcus sp.9ºN-7P. kodakaraensis
/483//483/
E. coli Pol IITOK DNA pol
/490//483/
Region TPR-2 confers processivity to ø29 DNA polymerase15 33
240 72 15 3.7 1 0.2 0.05
Wild-type ∆TPR2
[DNA pol], nM240 72 15 3.7 1 0.2 0.05
15 33*
33 mer
15 mer
Region TPR-2 is required for strand-displacement activityof ø29 DNA polymerase
15 20 33*
Wild-type1 10 50∆TPR2c
1 10
33 mer
20 mer
15 mer
TP-primed & strand-displacement DNA amplification(Isothermal PCR)(Isothermal PCR)
IN VITRO AMPLIFICATION OF φ29 DNA (19285 bp)
Infectivity of the in vitro-amplified φ29 DNA
D l I ti ió Bá i A li iDe la Investigación Básica a sus Aplicaciones
1989. Patente DNA polimerasa de ø29(Inventores: Luis Blanco, Antonio Bernad, Jose M. Lázaro, Margarita Salas)
2001 Comercialización de la DNA polimerasa de ø292001. Comercialización de la DNA polimerasa de ø29Amersham Biosciences ––> GE Healthcare
Kit Templiphi: amplificación DNA circular
2003 Kit G i hi lifi ió DNA ó i li l2003. Kit Genomiphi: amplificación DNA genómico lineal
A B
C
DD
control pUC18(ng)
pUC18(pg of DNA
added to reaction)
pUC18/DH5α(amount of colonyadded to reaction)
A B DC
Patki, AAmersham Biosciences
Li, W. et alAmersham Biosciences
Li, W. et alAmersham Biosciences
GenomiPhi
-Amplificación de DNA genómico linealp g
- Estudios de genotipadoC ió d - Construcción de genotecas
- Archivos de DNA- Medicina forenseMedicina forense
Improvement of φ29 DNA polymerase amplification performance by fusion ofamplification performance by fusion of DNA binding motifs
Chimera:Chimera:
1. Greek Mythology: a fire-breathing monster with the head of a lion, body of a goat and tail of a snake.
2. Biology: A substance, such as an antibody created from the proteins or genes of two different species.
3. Psicology: A fanciful mental illusion or fabrication.
Collins English Dictionary
φ29 DNA polymerase (HhH)
Modelling of the chimerical DNA polymerase
φ29 DNA polymerase (HhH)2
N terminus
downstream 5´
N‐terminus
TPR2
template tunnel
primerstrand
thumb3´
5´
3´
5
dsDNAmelting
displacedstrand
templatestrand5´
C‐terminus
linkermelting
product double-stranded
tunnel
strand
GTGSGA Stop codon
Scheme of the construction of chimerical DNA polymerases
Stop codon
pJLw2
HindIII29 DNA pol
H I695-751 696-802
BamHI
p
pJLw2derivative
pUC57-(HhH)2
PCR of 29 DNA polymerase gene with primer 3containing the HindIII site, and primer 4 thatadds the sequence coding for the linkerGTGSGA, removes the stop codon and containsa KasI site
PCR of the HhH domains H and I of TopoV withprimer 1 that adds the sequence coding forGTGSGA, and primer 2 which adds the stopcodon and a BamHI site
Primer 4
KasI
29 DNA polymerase
HindIII
GTGSGA
Primer 3
Fragment II
GTGSGA
KasI
Primer 2
BamHI
TopoV-(HhH)2 domains H-I
Primer 1
Fragment I
Digestion with KasI y further ligation with T4 DNA ligase
BamHI
Primer 4Fragment II Primer 2Fragment I
HindIIIPrimer 3
Cloning into the pJLw2 derivative (HindIII-BamHI)chimera 29-HI
29 DNA polymerase GTGSGA
Primer 2
TopoV-(HhH)2 domains H-I
Site-directed mutagenesis to insert a stop codon at the end of (HhH)2 domain H to obtain chimera 29-H
g p ( )
Chimerical DNA polymerases have an improved DNA binding
φ29 DNAP φ29-H φ29-HI
stable DNA pol/DNA complexes
- 1 1 2 2 4 5 9 1 1 2 2 4 5 9 1 1 2 2 4 5 9 [DNA pol] nM
free DNA
1.1 2.2 4.5 9 1.1 2.2 4.5 9 1.1 2.2 4.5 9 [DNA pol], nM
φ29 DNAP φ29 H φ29 HI
Chimerical DNA polymerases show an enhanced Rolling Circle Replication efficiency
A φ29 DNAP φ29-H φ29-HI B
φ29-H
A (n
g)
ssDNA M13unit-length φ29-HI
ynth
esiz
ed D
NA
5 10 5 10 5 10 time min
φ29DNAPSy
C φ29 DNAP φ29-H φ29-HI
5 10 5 10 5 10 time, min time (min)
ssDNA M13ssDNA M13unit-length
60 30 15 7.5 60 30 15 7.5 60 30 15 7.5 [DNA pol], nM
Multiply-primed Rolling Circle Amplification of plasmidic DNA by ø29 DNA polymerase and chimerical DNA polymerases
φ29 DNAP φ29-H φ29-HIDNA polymeraseA
4370-2899-
1933-
1331-
759-
Reaction time, h. 1 2 4 6 1 2 4 6 1 2 4 6
DNA polymeraseB
φ29 DNAP φ29-H φ29-HI
4370-2899-
DNA polymerase φ29 DNAP φ29 H φ29 HI
1933-
1331-
Reaction time, h. 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4
759-
Multiply-primed Whole Genome Amplification of genomic DNA with φ29 DNA polymerase and chimerical DNA polymerases
φ29 DNAP φ29-H φ29-HI
6x105
4370-2899 ca
tion
fold 5x105
4x105
3x1052899-1933-1331-
759
Am
plifi
3x10
2x105
1x105
time, h. 2 4 8 16 2 4 8 16 2 4 8 16
759-
Reaction time, h.
CENTRO DE BIOLOGźA MOLECULAR ŅSEVERO OCHOAÓC S I C ŠU A MC.S.I.C.ŠU.A.M.
Grupo ø29 2006–2009
Protein p56 inhibits B. subtilis UDG activity
0 0
UDG 15 nMT G A T G C G C U G T A C C G A T C C C5´*p56 (nM)
S
30 90 270
810
T G A T G C G C ___ G T A C C G A T C C C5´*
+ UDG
5
+ NaOH, Heat
AP site
PT G A T G C G C G T A C C G A T C C C5´*
Therapeutic potential of protein p56
As antiviral agent against herpesvirus, poxvirus and HIV
In Chemotherapy (combined with anti-tumor agents)
“protein p56 inhibits DNA-binding ability of uracil-DNA glycosylase”of uracil DNA glycosylase
Role of p56 as antiviral agent
Herpesvirus(HSV 1 VZV CMV )
Poxvirus(Vaccinia smallpox ) (HSV-1; VZV; CMV…) (Vaccinia, smallpox…)
Viral uracil-DNA glycosylase
“ Important role for replication and infection cycle in non-dividing cells”
Role of p56 as antiviral agent
HIV cellular UDG is incorporated into particles
“Essential for viral life cycle” y
Particleassembly
Release virus core
Vpr-UDGcomplex
Polyprotein withVpr-UDG complex
Reverse transcriptionin presence of Vpr-UDG
nucleus nucleus
complex
provirusprovirus
Role of p56 in chemotherapyRole of p56 in chemotherapy
dUMP dTMPThymidylate
Fluoropyrimidines “Thymineless death”
- depletion of dTTP pool
Methylene tetrahydrofolate
synthase
- Misincorporation of uracil into DNA
DihydrofolateMethylene tetrahydrofolate
DNA synthesis arrests and DNA degradation(block in S-phase)
Tetrahydrofolate
Dihydrofolatereductase
NADP+ NADPH + H+
Antifolates
Role of p56 in chemotherapyRole of p56 in chemotherapy
“Thymineless death”
- depletion of dTTP pool
Antitumor agents treatment in UDG mutants
- depletion of dTTP pool
- Misincorporation of uracil into DNA - Misincorporation of uracil into DNA
DNA synthesis arrest and DNA degradation(block in S-phase)
Dramatic effect (Lethality)
-Arrest in G2-M boundary
-Toxicicity and cell death
Tinkelenberg et al. (2002)
Modelling processivity and strand-displacement in ø29 DNA polymerase
VIRUS DE INTERES SANITARIO QUE INICIAN LA REPLICACION CON PROTEINA TERMINAL
VIRUS DNA ADENOVIRUSVIRUS DNA ADENOVIRUS
VIRUS RNA POLIOVIRUSRINOVIRUSENCEFALOMIOCARDITISHEPATITIS C HEPATITIS C
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