Los marcadores moleculares como
herramienta multifuncional en la
conservación de recursos fitogenéticos de
origen silvestre
Departamento de Biología Vegetal. Universidad Politécnica de Madrid. Avda. de la Complutense, s/n. 28040 Madrid, España.
Trabajo financiado por el proyecto “Desarrollo y evaluación de estrategias de conservación de diversidad genética en bancos de germoplasma” Ref: 099/RN08/02.1 del MARM y la red REMEDINAL-2 (S2009/AMB-1783), de la Comunidad de Madrid.
M.L. Rubio Teso, C. Martín Fernández, J.B. Martínez Laborde, D. Draper Munt, M. E. González Benito & M. de la Cruz Rot.
V Congreso Biología de la Conservación de Plantas. 28 de Septiembre – 1 de Octubre de 2011.
Es Mercadal (Menorca)
Los marcadores moleculares como herramienta multifuncional en la conservación de recursos fitogenéticos de origen silvestre
Ø Introducción
Ø Resultados
ØMaterial y métodos
Ø Conclusiones
Índice
Fotografía: Julia Chacón Labella
Los marcadores moleculares como herramienta multifuncional en la conservación de recursos fitogenéticos de origen silvestre
Introducción
Planes de conservación in situ y ex situ
Biología de la reproducción
Estructura genética de las poblaciones
Garantizar representatividad de la diversidad total en los planes de conservación
Selección de poblaciones para la conservación in situ
Estrategias de recolección de germoplasma de origen silvestre
Los marcadores moleculares como herramienta multifuncional en la conservación de recursos fitogenéticos de origen silvestre
Introducción
Contrastar la validez de la metodología de recolección usualmente empleada en Bancos de Germoplasma para:
- Garantizar la representatividad de las muestras que se conservan
- Poder diseñar un modelo de muestreo que garantice una alta representatividad de la diversidad genética del material conservado
Objetivos:Objetivos:
Los marcadores moleculares como herramienta multifuncional en la conservación de recursos fitogenéticos de origen silvestre
Material y métodos
Tres especies silvestres del género Brassica
- B. barrelieri (L.) Janka
- B. oxyrrhina Coss.
- B. tournefortii Gouan.
• Alógama
•Autoincompatible
•2n =20
• Probablemente autógama
• Completamente autocompatible
• 2n = 18
•Probablemente autogama
• Completamente autocompatible
•2n = 20
Fotografía: Julia Chacón Labella
Fotografía: Mª Luisa Rubio Teso
Los marcadores moleculares como herramienta multifuncional en la conservación de recursos fitogenéticos de origen silvestre
Material y métodos
Toma de muestras
- B. barrelieri (L.) Janka
- B. oxyrrhina Coss.
- B. tournefortii Gouan.
• 11 poblaciones
• 20 individuos
• 10 poblaciones
• 20 individuos
• 9 poblaciones
• 20 individuos
600 individuos estudiados
Fotografía: Mª Luisa Rubio Teso
Los marcadores moleculares como herramienta multifuncional en la conservación de recursos fitogenéticos de origen silvestre
Material y métodos
- B. oxyrrhina Coss. - B. tournefortii Gouan.- B. barrelieri (L.) Janka
EspecieName population Locality
B. barrelieri BA1 Navalagamella (M)
B. barrelieri BA2 San Lorenzo de El Escorial (M)
B. barrelieri BA4 Colmenarejo (M)
B. barrelieri BA16 San Felices de los Gallegos (Sa)
B. barrelieri BA21 Santa Amalia (Ba)
B. barrelieri BA23 Campanario (Ba)
B. barrelieri BA26 Velada (To)
B. barrelieri BA27 Don Gil (Cc)
B. barrelieri BA29 Palacio de Doñana (Hu)
B. barrelieri BA33 Valdemorillo (M)
EspecieName population Locality
B. oxyrrhina OX1 Toril (Cc)
B. oxyrrhina OX3 La Mazagosa (Cc)
B. oxyrrhina OX5 Velada (To)
B. oxyrrhina OX6 Velada (To)
B. oxyrrhina OX7 Palacio del Acebrón (Hu)
B. oxyrrhina OX10 Simancas (Va)
B. oxyrrhina OX11 Madina del Campo (Va)
B. oxyrrhina OX12 Villanueva del Duero (Va)
B. oxyrrhina OX13 Toro (Za)
B. oxyrrhina OX14 Toro (Za)
Especie Name population Locality
B. tournefortii TF2 Playa de los genoveses. Cabo de gata. (Al)
B. tournefortii TF3 Parque Natural Punta Sabinar (Al)
B. tournefortii TF4 Carretera de Sorbas a Tabernas. Cruce Venta de los Yesos (Al)
B. tournefortii TF5 Cartagena. Salinas del Rassall. Parque Natural de Calblanque. (Mu)
B. tournefortii TF6San Pedro del Pinatar. Parque Natural Salinas de San Pedro del Pinatar (Mu)
B. tournefortii TF7 Laguna de la Mata. Torrevieja (A)
B. tournefortii TF8 La Marina. Santa Pola (A)
B. tournefortii TF9 Matalascañas. Parque Dunar (Hu)
B. tournefortii TF13 Parque Natural de El Saler (V)
Los marcadores moleculares como herramienta multifuncional en la conservación de recursos fitogenéticos de origen silvestre
Material y métodos
Procesado muestras
- Desecación en gel de sílice
- 20 mg tejido de hoja peso seco
-Conservación – 80 º C
Los marcadores moleculares como herramienta multifuncional en la conservación de recursos fitogenéticos de origen silvestre
Material y métodos
Caracterización Molecular
- Extracción ADN
- Preparación soluciones de trabajo
- Técnicas basadas en PCR (Polymerase Chain Reaction)
- Electroforesis en gel de agarosa
- Tinción bromuro de etidio y visualización UV
Los marcadores moleculares como herramienta multifuncional en la conservación de recursos fitogenéticos de origen silvestre
Material y métodos
Caracterización molecular:
- RAPDs (Random Amplified Polymorphic DNA)
- 11 cebadores
OPA-11 CAATCGCCGT
OPB-07 GGTGACGCAG
OPB-15 GGAGGGTGTT
OPD-11 AGCGCCATTG
OPF-01 ACGGATCCTG
OPF-03 CCTGATCACC
OPF-04 GGTGATCAGG
OPF-10 GGAAGCTTGG
OPO-05 CCCAGTCACT
OPO-07 CAGCACTGAC
OPO-20 ACACACGCTG
Los marcadores moleculares como herramienta multifuncional en la conservación de recursos fitogenéticos de origen silvestre
Análisis de datos
MATRIZ AUSENCIA/PRESENCIA à para cada especie
Material y métodos
Los marcadores moleculares como herramienta multifuncional en la conservación de recursos fitogenéticos de origen silvestre
Análisis de datos
• Matriz de similitud à Índice de DICE
Ø Agrupamiento UPGMA
• ESTIMACIÓN DE LA DIVERSIDAD
ØÍndice de Shannon
à Diversidad media INTRA poblacional
à Diversidad total
R (version 2.13.1)
Material y métodos
Los marcadores moleculares como herramienta multifuncional en la conservación de recursos fitogenéticos de origen silvestre
Resultados y discusión
Análisis de datos
B. barrelieri: 50 marcadores:
4 monomórficos (8%)
46 polimórficos (92%)
B. oxyrrhina: 37 marcadores:
17 monomórficos (46%)
20 polimórficos (54%)
B. tournefortii: 44 marcadores:
17 monomórficos (39%)
27 polimórficos (61%)
ba29
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16ba
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16ba
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16ba
27
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0.4
0.6
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t
Los marcadores moleculares como herramienta multifuncional en la conservación de recursos fitogenéticos de origen silvestre
Resultados y discusión
Análisis de datos
ANÁLISIS DE AGRUPAMIENTO: UPGMA B. barrelieri
BA1
BA2
BA4
BA8
BA16
BA21
BA23
BA26
BA27
BA29
BA33
Los marcadores moleculares como herramienta multifuncional en la conservación de recursos fitogenéticos de origen silvestre
Resultados y discusión
Análisis de datos
ANÁLISIS DE AGRUPAMIENTO: UPGMA B. oxyrrhinaO
X1
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X1
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7O
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3O
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12
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3O
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4O
X1
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X3
OX
3O
X3
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3O
X1
2O
X3
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12
OX
12
OX
12
OX
12
OX
12
OX
12
OX
14
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X1
4O
X1
4O
X6
OX
6O
X1
3O
X1
3O
X3
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X5
OX
5O
X5
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6O
X6
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6O
X6
OX
6O
X5
OX
5O
X3
OX
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X5
OX
6O
X6
OX
5O
X5
OX
5O
X5
OX
5O
X5
OX
5O
X5
OX
5O
X5
OX
3O
X3
OX
3O
X3
OX
6O
X5
OX
5O
X1
OX
1O
X1
OX
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X1
OX
1O
X1
OX
1O
X1
OX
1O
X1
OX
1O
X1
OX
1O
X1
OX
1O
X1
OX
1O
X1
OX
1O
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X1
1O
X1
1O
X1
1O
X1
1O
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X1
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X1
1O
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OX
11
OX
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X1
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OX
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13
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10
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10
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10
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10
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14
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0.2
0.3
0.4
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OX6
OX7
OX10
OX11
OX12
OX13
OX14
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TF
8T
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TF
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TF
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80.0
0.1
0.2
0.3
0.4
He
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t
Los marcadores moleculares como herramienta multifuncional en la conservación de recursos fitogenéticos de origen silvestre
Resultados y discusión
Análisis de datos
ANÁLISIS DE AGRUPAMIENTO: UPGMA B. tournefortii
TF2
TF3
TF4
TF5
TF6
TF7
TF8
TF9
OX13
Los marcadores moleculares como herramienta multifuncional en la conservación de recursos fitogenéticos de origen silvestre
Resultados y discusión
Dive
rsid
ad e
stim
ada:
B. b
arre
lieri
Índice de Shannon para cada especie: (Ho= -∑pilog2pi)
BA1 11.934818
BA2 9.142491
BA4 11.537017
BA8 7.987262
BA16 10.070703
BA21 10.747052
BA23 9.178620
BA26 10.935556
BA27 13.199072
BA29 5.984194
BA33 10.673030
OX1 1.951313
OX3 2.866568
OX5 1.005127
OX6 2.693872
OX7 1.238758
OX10 1.658081
OX11 3.958894
OX12 3.042601
OX13 3.541621
OX14 3.295887
TF2 2.1107755
TF3 3.5278684
TF4 5.5214580
TF5 1.3708709
TF6 1.3336613
TF7 0.9636811
TF8 4.0731343
TF9 2.4312890
TF13 1.4709515
Dive
rsid
ad e
stim
ada:
B. o
xyrr
hina
Dive
rsid
ad e
stim
ada:
B. to
urne
fort
ii
Análisis de datos
Los marcadores moleculares como herramienta multifuncional en la conservación de recursos fitogenéticos de origen silvestre
Resultados y discusión
Análisis de datos
B. barrelieri B. oxyrrhina B. tournefortii
Diversidad media INTRAPOBLACIONAL de las poblaciones (Hpop)
10.1263469 2.3639742 2.3643702
Proporcion de la diversidad INTRA poblacional (Hpop/Hsp)
0.6071024 0.4243881 0.2846649
Proporcion de la diversidad INTER poblacional(Hsp-Hpop)/Hsp
0.3928976 0.5756119 0.7153351
Diversidad total (Hsp)
16.6798018 5.5703115 8.3058015
Los marcadores moleculares como herramienta multifuncional en la conservación de recursos fitogenéticos de origen silvestre
Conclusiones
1. Los marcadores moleculares de tipo RAPD son adecuados para estudios de estimación de diversidad genética
2. La altísima diversidad hallada en el caso de B. barrelieri difícil su análisis y por ello se sugiere el uso de otro tipo de marcadores más específicos para completar y ampliar los resultados obtenidos
3. Los índices de diversidad hallados para cada especie son elevados, lo cual confirma la utilidad de los marcadores moleculares para el diseño de los planes de conservación, ya sean ex situ o in situ.
4. Los patrones de bandas obtenidos están condicionados por el tipo de reproducción de la especie (alogamia/autogamia), lo cual pone de manifiesto la capacidad de los marcadores moleculares de tipo RAPD para estudiar las estrategias reproductivas de las especies.
GRACIAS POR SU ATENCIÓN
Foto
graf
ía: J
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Los marcadores moleculares como herramienta multifuncional en la conservación de recursos fitogenéticos de origen silvestre
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