Metodologías para implementar EstándaresMetodologías para implementar Estándares Internacionales de pureza del Azafrán
Análisis MicrobiológicosAnálisis Microbiológicos
Dª Olga Acevedo Regalado
Dr. Rafael Rotger
Dr. José Luis Novella
Dra. Leonor Nozal
Normativa microbiológica sobre especiessobre especies
• Normativa española (R.D. 2242/1984, de 26-IX):• Ausencia de microorganismos patógenos y sus toxinasAusencia de microorganismos patógenos y sus toxinas• Ausencia de Salmonella en 25 g• Escherichia coli: ≤10 UFC/g
3• Esporulados anaerobios sulfito-reductores: ≤103 UFC/g• Recomendaciones ICMSF (1974, 2005):
• Aerobios mesófilos totales: ≤106 UFC/gAerobios mesófilos totales: 10 UFC/g• Hongos y Coliformes: ≤104 UFC/g• E. coli y Clostridium perfringens: ≤103 UFC/g
R d i d l U ió E (2004/24/CE)• Recomendaciones de la Unión Europea (2004/24/CE):• Ausencia de Salmonella en 25 g• Bacillus cereus: satisfactorio ≤102 UFC/g; aceptable ≤103 UFC/gg; p g• Clostridium perfringens: satisfactorio ≤103 UFC/g; aceptable ≤104 UFC/g• Enterobacteriaceae: para discriminar especies irradiadas• Aflatoxinas: niveles permitidos por la normativa UE• Aflatoxinas: niveles permitidos por la normativa UE
Análisis de la calidad microbiológica de 80 muestrasmicrobiológica de 80 muestras
de azafrán • Origen:– Irán: 33Detección de Salmonella – Irán: 33– Italia: 15– Grecia: 15Detección de Enriquecimiento
Detección de Salmonella
– España: 14– Marruecos: 2
I di 1
25 g azafrán + 225 ml Agua Peptona + 0.1% Tween80 Pre-enriquecimiento (16 h 37 ºC)
Staphylococcusselectivo
– India: 1Pre enriquecimiento (16 h, 37 C)Homogeneizado
Stomacher
Recuentos de
Dil i d i l
Recuentos de bacterias y hongos
Diluciones decimales
Recuento de bacterias y hongos
Anaerobios sulfito-reductores
Filtración para recuento de mohos
5 min a 80 ºC para recuento de reductores,
Clostridium perfringens y Bacillus cereus
recuento de mohos y levaduras
recuento de esporulados
Bacillus cereus.
Dil i 10 1 10 4Sabouraud
Diluciones 10-1 a 10-4(2-4 días at 24 ºC)
Recuento de aerobios totales, lif E t b t i E licoliformes, Enterobacterias y E. coli.
Resultados del análisis microbiológico de 80 muestrasmicrobiológico de 80 muestras
de azafrán
• Ausencia de Salmonella en 25 g en todas las muestras, confirmada por PCR.P i d E li 5 t (6 25%)• Presencia de E. coli en 5 muestras (6.25%), confirmada por PCR.
• Presencia de Staphylococcus aureus en 3• Presencia de Staphylococcus aureus en 3 muestras (3.75%), confirmada por PCR.
• Ausencia de Aspergillus spp• Ausencia de Aspergillus spp.• 76 muestras (95%) cumplieron la normativa
española.española.
Niveles de microorganismos en azafrán
70Aerobios totales
50
60
Aerobios esporuladosEnterobacteriasColiformes totales
40
50
mue
stra
s Clostridios Sulfito-red.Clostridium perfringensLevaduras
20
30
% d
e m Levaduras
Mohos
0
10
< 10
10E1-1
0E210
E2-10E3
10E3-1
0E410
E4-10E5
10E5-1
0E610
E6-10E7
1 1 1 1 1 1
Porcentaje de muestras i l á l dcon niveles más elevados
70 Irán*Incumplen normativa española
50
60
ada
país Grecia
It li
**Sobrepasan recomendaciones ICMSF
30
40
tras
de
ca Italia
España
10
20
30
de m
uest
0
10
6 ** 0E4 4 ** E1 * 0E2
0E2 E4**%
erob Total
> 10E6
terobact
erias >1
0E4Colifo
rmes >10E
4
E. coli >
10E1
B. cereu
s >10E
perfringens >
10E2
Levaduras >
10E4
Aero
Enter Co
C. p L
Supervivencia de S l ll f áSalmonella en azafrán
1,E+07
1,E+05
1,E+06
1,E+04
g U
FC
1,E+02
1,E+03Log
Enteritidis
Enteritidis FT1
1,E+01
,Typhimurium DT104
Typhimurium DT104BControl*
Tiempo de reducción decimal (D): 2 días
1,E+000 4 7
Días
Control
Días
*Promedio de las 4 cepas en ausencia de azafrán
Propuesta de método microbiológicomicrobiológico
Triturar 25 g azafrán en molino de bolas para análisis químico y y
microbiológico
Pesar ∼5 g (±0 1) y resuspender en 45Detección de
Salmonella
PCR
Pesar ∼5 g (±0.1) y resuspender en 45 ml de agua de peptona tamponada
(ISO 6579) (±0,1% Tween80) CULTIVO(ISO 6579)
Salmonella
O
0,5 mlReposar 10 min Tª
amb.
( )
MezclarE. coli
Recuentos:Dos alícuotas 1 ml
Pre-enriquecimiento 16±1 h, 37 ºCAnaerobios
esporulados sulfito-reductoressulfito reductores
PCR Reacción en Cadena de la PolimerasaReacción en Cadena de la Polimerasa
Cebadores para el gen invA de Salmonella5’-CGGTGGTTTTAAGCGTACTCTT-3’
0,5 ml pre-enriquecimiento Nº de
ciclos: Minutos: Tª (ºC)
5 CGG GG GCG C C 35’-CGAATATGCTCCACAAGGTTA-3’
Electroforesis en
Filtración
ciclos:
1 5 94
1 94
agarosa
D t ió 30 1
1
55,6
72
1 3 72
Detección
1 3 72DNA +
cebadores + Taq-polimerasa
TOTAL: 4-6 HORAS
Lisis purificación DNA
Taq polimerasa
DNA
Detección de Salmonellapor cultivo (ISO 6579)por cultivo (ISO 6579)
• Caldo Rappaport-Vassiliadis• Caldo Muller-Kauffman
Dos alícuotas de 1 ml del pre-enriquecimiento
24 h
XLD
q
24 h
Otro agar selectivo
para
XLD Agar
24 hpara Salmonella
24-48 hIdentificación bioquímica y serológica
Resultados de la validación interlaboratorios
Método: PCR Cultivo (ISO 6579) E ifi id d 100 0 % 100 0 %Especificidad 100.0 % 100.0 %Sensibilidad
Concentración de Salmonella
Alta: [5×106] 77.8 % 100.0 % Media: [5×103] 66.7 % 83.4 % Baja: [5×102] 18.8 % 16.7 %
Exactitud 66.2 % 75.0 %
Media de dos réplicas analizadas por 9 laboratoriosMedia de dos réplicas, analizadas por 9 laboratorios.
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