Métodos de esterilización y desinfección.
Medios de cultivo.
Curso: Diagnóstico de enfermedades vegetales
27 de mayo de 2011
Ing. Agr. MSc. Vivienne Gepp
Objetivo
• Que el estudiante se familiarice con los procesos de desinfección y esterilización comúnmente utilizados en un Laboratorio de Fitopatología.
• Conocer los medios de cultivo más usados.
DefinicionesEsterilización = proceso mediante el cual se
matan o eliminan todas las formas de vida microbiana.
estéril o no estéril.
Desinfección = eliminar microorganismos patógenos total o parcialmente
niveles de desinfección.
Asepsia = exclusión continuada de microorganismos contaminantes.
Métodos de esterilización
• FISICOS:– Calor
• seco (llama, horno)
• húmedo (autoclave)
– Radiaciones
• MECÁNICOS– Filtración
• QUIMICOS– Gaseosos
– No gaseosos
Calor seco
• Esterilización directa en la llama
Calor seco
alcohol 96% + mechero
Calor seco
alcohol 96% + mechero
Calor seco
Horno
Calor seco - Horno
• Se utiliza para: vidrio seco instrumentos quirúrgicos objetos metálicos aceites, vaselinas y polvos
• Temperaturas:180 ºC ---------- 30 - 60 min.170 ºC ---------- 60 - 120 min
T ºC
horas
Calor seco
• Recipientes de metal o envolver en papel (usar temp. menor en este caso)
• Dejar que vuelva a temp. ambiente antes de abrir
Calor húmedo
• Con presión: autoclave, olla presión
• Para sustancias estables al calor – ¿combinaciones reactivos a temp altas?
• Temperatura – presión – tiempo
Temp. 100 110 115 121 125 130
Tiempo 20 h 2,5 h 51 min. 15 min. 6,4 min. 2,4 min.
Autoclave
Autoclave
Presión
(lb/in.)
Temperatura interna (ºC) según % aire eliminado
100% 66% 50% 33% 0%
5 109 100 94 90 72
10 115 109 105 100 100
15 121 115 112 109 100
25 130 126 124 121 115
30 135 130 128 126 121
Calor húmedo - Autoclave
• ¿cómo optimizar eficacia? – eliminar aire,– contenidos similares, – no apretados, dejar espacios verticales,
• Precauciones: – tapas sueltas, – recipientes con hasta 1/3 de volumen, – vuelta a presión normal lenta.
Controles de esterilización
a. Físicos
b. Químicosc. Biológicos
Controles de esterilización
a. Físicos
b. Químicos
c. Biológicos
Esterilización química
• Ventajas: no requiere altas temperaturas ni aparatos costosos
• Desventajas: mayor tiempo, sustancias inflamables y muy tóxicos y alto costo
• Ejemplos: óxido de etileno, formaldehído
Esterilización por filtrado
• Elimina microorganismos >virus• Ventaja: no modifica composición• Para: cantidades pequeñas• Para: vitaminas, hormonas, antibióticos, etc.• Requiere bomba de vacío• Ejemplo membranas de ésteres de celulosa: 1 uso,
“poros” de 0,22 µm
CAMPANAS DE FLUJO LAMINAR
Radiaciones UV
Desinfección superficial
Desinfección superficial
Técnicas comunes en Fitopatología:
• Lavado previo en agua corriente – detergente? cepillo?
• Agua corriente 2 o más horas
• Alcohol 70%
• Hipoclorito de sodio: – 1% Cloro activo, 2 %, 0,35% etc.– minutos– enjuague posterior
Desinfección superficial
Selección de técnica(s) según:
• tejido: grosor, consistencia
• hongo a aislar: ej. Oomycetes,
Rhizoctonia
• dónde pensamos que está el patógeno
Medios de cultivo
• Componentes básicos
• ¿Sólido o líquido?
• Ajuste de pH
• Inhibidores de “contaminantes”:– bacterias – hongos no deseados
Clasificación de medios de cultivo
• Sintéticos – más complicados para elaborar, muchos componentes
• Naturales – raíces y frutos aportan lo necesario para hongos, ¿bacterias necesitan más?
• Semi-sintéticos
¿Qué aportan los medios?
• Soporte - Agentes solidificantes:– gelatina: fusión a 37ºC, solidifica 25-30ºC, se
descompone a 121ºC– agar: fusión a 80-100ºC, solidifica a 35-50ºC
• Carbono orgánico– Azúcares inducen crecimiento micelio, pueden inhibir
esporulación temporal- o permanentemente.
• Vitaminas y otros factores de crecimiento• Inhibidores• Sustancias que permiten diferenciar spp. o biotipos• Indicadores
Medios comunes:
• Agar papa dextrosa
• Agar agua
• Agar malta
• Agar harina de maíz
• Agar V8
• Nutriente agar dextrosa
• Extracto de levadura dextrosa con carbonato de calcio (Yeast Dextrose CaC03)
• B de King
Dispensado de medios
• Temperatura: 45-50ºC– mayor: condensa H2O– menor: solidificación prematura
• Placas de Petri: aprox. 20 ml c/u
• Tubos de ensayo: vertical o pico de flauta