Universitat Autònoma de Barcelona
Detección de Cloranfenicol en Leche Química BioAnalítica
Miguel Berenguel Alonso
2/21/2011
Detección de Cloranfenicol en Leche Química BioAnalítica
Miguel Berenguel Alonso
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DETECCIÓN DE CLORANFENICOL EN LECHE
CONTENIDOS
1. Introducción ...................................................................................................................... 3
2. Método estándar: HPLC – MS/MS ..................................................................................... 4
3. Método propuesto: biosensor SPR .................................................................................... 7
3.1. Elección del método de detección ............................................................................. 7
3.2. Elección del tipo de Inmunoensayo ............................................................................ 8
3.3. Producción de los bioreactivos .................................................................................. 9
3.4. Inmobilización ......................................................................................................... 11
3.5. Obtención de la señal analítica ................................................................................ 12
4. Referencias ..................................................................................................................... 15
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1. INTRODUCCIÓN
En las últimas dos décadas, se ha producido un gran progreso en cuanto al desarrollo de
biosensores de afinidad y sus aplicaciones en áreas como diagnóstico médico, control
medioambiental, biotecnología o seguridad alimentaria, entre otras.1 Los biosensores de
afinidad son dispositivos que usan anticuerpos, secuencias de ADN o proteínas receptoras
conectados a un transductor de señal para medir un evento de enlace.2
Las enfermedades y otros problemas de salud causados por residuos presentes en alimentos
son un serio problema, con graves connotaciones tanto en la salud pública como en su coste
económico. Éstas pueden ser provocadas por pesticidas, herbicidas, micotoxinas y antibióticos.
Por lo tanto, la detección de sustancias relacionadas con la seguridad alimentaria es de gran
importancia para todos los agentes implicados en la manipulación de alimentos, desde el
productor hasta el distribuidor comercial. A tal efecto, se han diseñado varios tipos de
biosensores de afinidad: electroquímicos, piezoeléctricos, de impedancia u ópticos.2
El cloranfenicol, o CAP, (ver Figura 1) es un antibiótico de amplio espectro considerablemente
usado desde los años cincuenta en países desarrollados, tanto en humanos como con fines
veterinarios. No obstante, debido a sus posibles efectos secundarios, tales como daños
irreparables en la médula ósea, leucemia o anemia aplásica, los cuales pueden conducir incluso
a la muerte, tanto Estados Unidos como la Unión Europea prohibieron su uso en 1994.3 En la
actualidad, su uso está autorizado en humanos tan sólo en casos concretos y mediante
aplicación tópica (tratamiento de conjuntivitis bacteriana).
Países menos desarrollados han seguido y siguen utilizando cloranfenicol debido a su bajo
coste y su facilidad de obtención, para combatir la fiebre tifoidea.4 Asimismo, el cloranfenicol
todavía sigue siendo utilizado ilegalmente por granjeros debido varios factores:5
- Actividad óptima a pH entre 7,4 y 8,0
- Elevado tiempo medio de vida en solución
- Bajo coste
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Figura 1 Representación de la molécula de cloranfenicol, a la izquierda en 3D, y a la derecha en 2D.
Debido a su peligrosidad para la salud pública, la legislación actual en los países occidentales
no permite el uso de cloranfenicol ni siquiera con finalidades veterinarias. En productos
alimentarios de origen animal no se especifica ni siquiera un límite máximo de residuo (MRL)
para cloranfenicol. No obstante, el límite mínimo de análisis requerido (MRPL) es de 0,3 µg/kg.6
Esto significa que el método analítico tiene que ser capaz de la detección de 0,3 ppb. Por
tanto, el diseño de biosensores de screening y de métodos de confirmación para cloranfenicol
deben fijar su objetivo en la especificidad y la disminución del límite de detección.
2. MÉTODO ESTÁNDAR: HPLC – MS/MS
El método estándar escogido es la cromatografía líquida de alta resolución con detección por
espectrometría de masas en tándem,7 debido a la alta sensibilidad y eficiente separación. El
procedimiento de análisis ha sido extraído de la compañía Thermo Scientific.
La preparación de la muestra es en este caso más simple que la descrita en otros
procedimientos, que incluyen extracción en fase sólida i/o extracciones líquido-líquido.
En primer lugar, se añade un patrón interno de cloranfenicol deuterado. Seguidamente, la
adición de acetonitrilo provoca la precipitación de las proteínas de la muestra (relación
acetonitrilo-agua 1,5 : 1). A continuación, la muestra es diluida con agua y refrigerada por un
cierto tiempo a 4 ºC. Se observa la precipitación de trazas de proteínas debido a que la el
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proceso con acetonitrilo no elimina la totalidad de éstas. Por tanto, se toma la parte superior
de la solución para la inyección en el cromatógrafo. La Figura 2 muestra esquemáticamente el
proceso de preparación de la muestra:
Figura 2 Esquema del proceso de tratamiento previo de la muestra de leche.
La cromatografía HPLC se realiza a temperatura ambiente con una fase móvil metanol – agua,
mientras que la detección se realiza mediante espectrometría de masas en tándem. El método
de ionización es el electrospray, y los valores de m/z para la cuantificación y confirmación del
cloranfenicol son los mostrados en la Figura 3.8 El patrón interno incorporado en el proceso de
preparación de la muestra se observa a m/z = 157. Este patrón interno es el d5 – CAP.
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Figura 3 Cloranfenicol y sus iones utilizados para su identificación i cuantificación mediante espectroscopía de masas, con sus
respectivas relaciones masa - carga.
Este método es relativamente simple y rápido en comparación con otros procedimientos de
análisis mediante HPLC encontrados en la literatura, debido en gran medida a la simplificación
del pre-tratamiento de la muestra. No obstante, requiere de instrumental de laboratorio muy
sofisticado y de personal de gran cualificación. El límite de detección (CCα) y límite de
cuantificación (CCβ) están por debajo del MRPL (0,3 µg/kg), y son los siguientes:
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3. MÉTODO PROPUESTO: BIOSENSOR SPR
3.1. ELECCIÓN DEL MÉTODO DE DETECCIÓN
El método elegido como cuantificación bioanalítica de CAP es el de detección mediante
Surface Plasmon Resonance (SPR). En un sistema formado por un metal (normalmente oro) y
un dieléctrico (muestra), los electrones superficiales del metal oscilan a una determinada
frecuencia. La excitación óptica para producir el plasmón superficial tan sólo tiene lugar bajo
condiciones de reflexión total atenuada (ATR) cuando la energía de los fotones es exactamente
igual al nivel de energía quántica de los plasmones.9 El plasmón superficial es una onda
electromagnética que se propaga a lo largo de la interfase (onda azul en la Figura 4) y decaen
con una onda evanescente perpendicular a la interfase. Debido a que la onda plasmónica se
encuentra en la frontera entre el metal y el medio externo, las oscilaciones del plasmón son
muy sensibles a cualquier cambio en la interfase, y por tanto, la resonancia de plasmón
superficial tiene aplicación en sensores.10
Figura 4 Resonancia de plasmón superficial (SPR) en reflexión total atenuada (ATR).
La inmovilización de un ligando en la superficie del metal, que interaccione con el analito,
propicia el cambio en el índice de refracción, y por tanto, permite la monitorización de
interacciones. Para monitorizar los cambios en el índice de refracción se pueden medir
distintos parámetros: variación angular, cambio de la longitud de onda, la intensidad, la
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modulación de fase y la modulación de la polarización. De todos éstos, los parámetros más
sencillos de monitorizar son la variación angular y el cambio de longitud de onda, los cuales
ofrecen alta resolución y no requieren instrumentación demasiado compleja.
3.2. ELECCIÓN DEL TIPO DE INMUNOENSAYO
Los biosensores pueden detectar el analito mediante diferentes formatos de ensayo. La
elección del formato de detección para una aplicación particular depende del tamaño del
analito en cuestión, el rango de concentraciones que se desea medir, etc. En el caso de la
detección por SPR, los formatos de detección más habituales son el directo, el tipo sándwich y
el ensayo indirecto.11 La Figura 5 muestra de manera esquemática el mecanismo de estos tres
tipos de inmunoensayo.
Figura 5 Representación esquemática de los formatos de inmunoensayo más habituales en SPR.
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La detección directa se prefiere normalmente cuando las concentraciones a determinar
producen señales elevadas. Los límites de detección son mejores en el caso del ensayo
sándwich. En el caso concreto de la detección de cloranfenicol mediante SPR, se decide utilizar
el inmunoensayo por inhibición competitiva, fundamentalmente porqué el analito es una
molécula pequeña. Debido a que el anticuerpo tiene una masa mucho mayor que la del
analito, proporcionará un mayor cambio en el índice de refracción al interaccionar con el CAP
inmovilizado en la superficie del biosensor, y por tanto aumentará la sensibilidad del método.
3.3. PRODUCCIÓN DE LOS BIOREACTIVOS
Para diseñar un biosensor SPR de cloranfenicol se requiere de un elemento de reconocimiento
específico, es decir, un anticuerpo. No obstante, el cloranfenicol es un hapteno, lo cual implica
que no genera respuesta inmune, debido a que es una molécula demasiado pequeña. Por
tanto, el cloranfenicol debe ser enlazado a una molécula portadora, produciendo de esta
manera un conjugado capaz de inducir respuesta inmune (ver Figura 6). Este inmunógeno será
inyectado en el animal, produciendo anticuerpos policlonales.
Figura 6 Representación esquemática de la obtención del conjugado CAP – KLH inmunógeno.
Las proteínas portadores más comunes son KLH (Keyhole Limpet Hemocyanin), OVA
(Ovoalbumin) y BSA (Bovine Serum Albumin). Se decide escoger la proteína portadora KLH
debido a su alto peso molecular y la abundancia de residuos disponibles de lisina, cuya cadena
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lateral contiene un grupo amino que permite una funcionalización sencilla. De entre las tres
proteínas portadoras mencionadas, KLH es la que propicia una mayor respuesta inmune.
Para la producción del inmunógeno se necesita la activación del cloranfenicol. A tal efecto, se
puede modificar el CAP con ácido succínico para obtener el correspondiente éster. Éste
reaccionará con el grupo amino del spacer para formar una amida, mediante la reacción con
DCC (N,N’-diciclohexilcarbodiimida) y NHS (N-hidroxisuccinimida). Este mismo tipo de reacción
se puede usar para unir el producto obtenido con la proteína KLH, mediante la formación de
otro enlace amida con los grupos amino de los residuos de lisina. La síntesis está representada
en la Figura 7.
Figura 7 Esquema de la síntesis del inmunógeno.
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El inmunógeno debe ser administrado al animal en dosis adecuadas al tamaño del mismo. Se
ha encontrado en la literatura anticuerpos producidos por distintos animales, como por
ejemplo, conejos y ovejas (anticuerpos comercializados por distintas empresas), así como
camellos, cabras o burros.12
Dos semanas después de la última inmunización, se procede a la extracción de sangre
mediante punción en la yugular. Esta sangre contiene los anticuerpos generados por el animal,
que deben ser aislados mediante técnicas de separación. Existen gran variedad de técnicas de
purificación de anticuerpos, como por ejemplo, diálisis, precipitación de proteínas, distintos
tipos de cromatografía (incluyendo la de afinidad con el antígeno o con Proteína A/G),
electroforesis, etc.
3.4. INMOBILIZACIÓN
Debido a que el tipo de inmunoensayo escogido es el de
inhibición indirecta, sobre la superficie de oro se debe
inmovilizar el propio cloranfenicol. Para tal efecto, se opta
por crear una monocapa autoensamblada mixta (mSAM)
con tioles funcionalizados,13 y posteriormente se modifica
con el inmunógeno, que contiene el cloranfenicol. Por
tanto, se trata de una inmovilización covalente e indirecta.
La mSAM está compuesta por una mezcla de 11-
mercaptoundecanol y ácido 16-mercaptohexadecanoico en
una relación 9:1 (ver Figura 8). El inmunógeno sintetizado
para la producción de anticuerpos (ver Figura 7) hace las
veces de antígeno inmovilizado, gracias a la reactividad de
la proteína KLH. Los residuos de la proteína que contienen
grupos amino pueden reaccionar con los grupos ácido
carboxílico de la monocapa, formando enlaces amida (igual
que en la síntesis del inmunógeno, con DCC/NHS). Figura 8 Representación gráfica de la inmovilización de CAP en la superficie de oro.
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Esta estrategia de inmovilización del cloranfenicol tiene varias ventajas. La monocapa mixta
permite que la inmovilización sea selectiva, y se dé tan sólo en los tioles funcionalizados con el
grupo ácido carboxílico. De esta forma, se evita la sobreacumulación del antígeno y se
favorece el entorno de enlace del mismo en la superficie. El spacer también mejora el entorno
de coordinación del cloranfenicol. Por otra parte, al no estar directamente unido a la
superficie, el cloranfenicol raramente pierde su funcionalidad debido el impedimento estérico
provocado por interacciones secundarias con otros elementos de la superficie. Otra gran
ventaja que proporciona este tipo de inmovilización covalente, es que después del ciclo de
análisis, la superficie puede ser regenerada fácilmente, y reusarse hasta 400 veces.13
3.5. OBTENCIÓN DE LA SEÑAL ANALÍTICA
El biosensor SPR de cloranfenicol utilizará la variación en el ángulo de incidencia para obtener
la señal analítica (ver Figura 10), debido a su sensibilidad y relativa facilidad de medición, en
comparación con otros parámetros afectados por el cambio en el índice de refracción.
El análisis se lleva a cabo mediante inhibición competitiva (Figura 9). Por tanto, en primer lugar
se mezcla el anticuerpo con la muestra de leche. Seguidamente, se hace pasar la muestra por
la superficie de oro con el cloranfenicol inmovilizado. En función de la concentración de CAP en
la muestra, más o menos anticuerpo se unirá al CAP inmovilizado. En consecuencia, a mayor
variación de señal, menor concentración de CAP en la muestra.
Figura 9 Representación esquemática del inmunoensayo por inhibición competitiva.
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Esta técnica de detección tiene ventajas importantes. De entre ellas cabe destacar que no
precisa del marcaje de anticuerpos ni antígenos. Por otra parte, los eventos de
bioreconocimiento también pueden ser monitorizados en tiempo real,9 de manera que se
obtiene una gráfica como la de la Figura 10 (abajo). En principio, esta técnica permite la
cuantificación de cualquier analito para el cuál exista un elemento de bioreconocimiento.
Además, no precisa de que el analito tenga ninguna propiedad especial como fluorescencia o
bandas características de absorción o de scattering.10
Figura 10 Arriba, esquema de la superficie del sensor SPR y variación del mínimo de reflexión en función del ángulo (curva se
mueve hacia la derecha cuanto mayor bioreconocimiento se dé). Abajo, típico sensograma SPR de una interacción molecular en
función del tiempo.
Además de estas ventajas, ya existen prototipos de biosensores SPR portátiles de pequeñas
dimensiones,14, 15 que permiten la integración de todos los componentes. Este hecho haría
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posible el screening de las muestras in situ, por ejemplo, en las explotaciones ganaderas
productoras de leche y otros productos lácteos. Estos biosensores integran el detector SPR con
microfluídica, y por tanto, el consumo de muestra es reducido. Un ejemplo de dispositivo
portátil se representa en la Figura 11.
Figura 11 a) Fotografía del sensor y b) diagrama de sus componentes.
No obstante, y como todas las técnicas de análisis en superficie, SPR tiene sus limitaciones en
cuanto a sensibilidad y resolución (la menor diferencia de ángulo detectable). Aún y así,
existen diversas maneras de incrementar la señal, como por ejemplo usando por ejemplo un
anticuerpo secundario.
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4. REFERENCIAS
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