Facultad de
Ciencias Exactas y
Naturales
Modificación de moléculas con actividad biológica mediante
biocatálisis
Lucas E. Braun
- 2013 -
PREFACIO
Esta Tesina es presentada como parte de los requisitos para optar al grado Académico de
Licenciado en Química, de la Universidad Nacional de La Pampa y no ha sido presentada
previamente para la obtención de otro título en esta Universidad ni en otra Institución
Académica. Se llevó a cabo en el Laboratorio de Biocatálisis, dependiente de INCITAP-
CONICET- Departamento de Química-FCEyN-UNLPam durante el período comprendido
entre noviembre de 2010 y Febrero de 2013, bajo la codirección de la Dra. Laura
Mazzaferro y la dirección del Dr. Javier D. Breccia.
Santa Rosa, Febrero de 2013 Lucas E. Braun
Agradecimientos
En las siguientes líneas, deseo dar las gracias a quienes de alguna manera han colaborado
en la realización de este trabajo, tanto por sus aportes científicos como humanos.
En primer lugar a la Universidad Nacional de La Pampa (UNLPam), por otorgarme el lugar
físico y los conocimientos necesarios para llevar a cabo este trabajo.
Al personal docente y técnico del Departamento de Química de la FCEyN (UNLPam) por su
colaboración.
Al Director y Co-Directora del presente trabajo.
A mis compañeros de laboratorio, presentes y pasados, por su solidaridad.
A mis amigos por el aguante.
A Daniela por el día a día.
A mi familia por estar siempre.
Contenidos
RESUMEN 1
ABSTRACT
2
INTRODUCCIÓN
1. GLICÓSIDOS BIOACTIVOS 3
2. ENZIMAS CARBOHIDRATO-ACTIVAS COMO HERRAMIENTAS PARA LA GLICOSILACIÓN 4
3. COMPUESTOS POLIFENOLICOS COMO ACEPTORES GLICOSIDICOS 7
4. OBJETIVOS 9
MATERIALES Y MÉTODOS
1. REACTIVOS QUÍMICOS 10
2. SOLUCIONES STOCK 10
3. MEDICIÓN DE ACTIVIDAD ENZIMÁTICA 10
4. SELECCIÓN DE ACEPTORES 10
5. SÍNTESIS DE RUTINÓSIDOS 11
6. CROMATOGRAFÍA EN CAPA DELGADA 11
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
1. ESPECIFICIDAD DE LA CATALIZADOR α-RAMNOSIL-β-GLUCOSIDASA CON DIFERENTES
ACEPTORES BIOACTIVOS
12
2. RUTINOSILACIÓN DE HIDROQUINONA 14
3. ESTABILIDAD QUÍMICA DEL ACEPTOR HIDROQUINONA 15
4. CONCENTRACIÓN DEL CATALIZADOR Y LA CINÉTICA DE TRANSGLICOSILACIÓN A
DISTINTOS VALORES DE PH
16
5. AGREGADO DE CO-SOLVENTES MISCIBLES EN AGUA 17
6. EFECTO DE LA CONCENTRACIÓN DE HIDROQUINONA EN LA SÍNTESIS DE
HIDROQUINONA RUTINÓSIDO
18
CONCLUSIONES
19
REFERENCIAS
20
RESUMEN
En esta tesis se estudió la capacidad de transglicosilación del catalizador fúngico α-
ramnosil-β-glucosidasa sobre distintos fármacos –clindamicina, metronidazol, epinefrina,
hidroquinona y rifampicina–. Estos se eligieron por la presencia de oxidrilos aceptores en
posiciones primaria, secundaria y también fenólicos. Utilizando hesperidina como donor
del disacárido rutinosa, el catalizador fue capaz de glicosilar hidroquinona en solución
acuosa.
La síntesis de hidroquinona rutinosilada alcanzó la máxima conversión de sustrato (10%)
luego de 24 h, por lo que se aplicó un diseño factorial para optimizar las variables del
proceso de biocatálisis.
La hidroquinona se oxida fácilmente a p-benzoquinona en solución acuosa neutra, por lo
que se midió su estabilidad a diferentes valores de pH. Se encontró que la formación de p-
benzoquinona fue baja a pH ligeramente ácido (pH ≤ 6,0), por lo que se estudió la cinética
de transglicosilación en el rango de pH (4,0-6,0), donde se obtuvo la mayor conversión de
sustrato a pH 5,0. El incremento de 5 veces la concentración del catalizador (0,011 U/g de
hidroquinona) permitió establecer un máximo de producción de hidroquinona rutinósido
luego de 1-2 h de reacción a 30°C.
La presencia de co-solventes (dimetilformamida y dimetilsulfóxido) en el rango de
concentración de 0-5%v/v, incrementaron el rendimiento, mientras que concentraciones
mayores al 10%v/v fueron deletéreas para la reacción. Cuando se ensayaron diferentes
concentraciones de aceptor, el mayor rendimiento se alcanzó con una concentración inicial
de hidroquinona de 36 mM.
Gracias a la optimización realizada en este trabajo se obtuvo un incremento de 47,5 veces
en la productividad del proceso de biocatálisis.
ABSTRACT
In this thesis we studied the ability of the catalyst transglycosylation fungal α-rhamnosyl-
β-glucosidase on different drugs, clindamycin, metronidazole, epinephrine, hydroquinone
and rifampicin. These were chosen because of the presence of hydroxyl positions acceptors
primary, secondary and phenolic. Using hesperidin as rutinose disaccharide donor, the
catalyst was able to glycosylate hydroquinone in aqueous solution.
Rutinosilada hydroquinone synthesis reached maximum substrate conversion (10%) after
24 h, therefore factorial design was applied to optimize the biocatalytic process variables.
Hydroquinone is easily oxidized to p-benzoquinone in neutral aqueous solution, so that its
stability was measured at different pH values. It was found that the formation of p-
benzoquinone was low at slightly acid pH (pH ≤ 6.0), so that transglycosylation Kinetics in
the pH range (4.0-6.0), which yielded higher conversion of the substrate to pH 5.0. The
increase of 5 times the concentration of catalyst (0.011 U / g of hydroquinone) allowed
production set up rutinoside hydroquinone after 1-2 h of reaction at 30 ° C.
The presence of co-solvents (dimethylformamide and dimethylsulfoxide) in the
concentration range of 0-5% v/v, increased yield, while concentrations greater than 10%
v/v were deleterious to the reaction. When tested different concentrations of acceptor, the
highest yield was achieved with an initial concentration of 36 mM hydroquinone.
Thanks to the optimization performed in this study there was an increase of 47.5 times in
the biocatalysis process productivity.
Introducción
1. GLICÓSIDOS BIOACTIVOS
Muchos productos naturales biológicamente activos contienen carbohidratos en su
estructura. En algunos casos, el residuo glicosídico es crucial para su actividad; en otros, la
glicosilación altera los parámetros farmacocinéticos (Toshima, 2006). Como ejemplo,
podemos citar los bioflavonoides los cuales son metabolitos secundarios de las plantas,
pertenecientes al grupo de los polifenoles, se hallan en la mayoría de los alimentos como
glicósidos y como tales son parte de la dieta humana (Robards & Antolovich, 1997). Estos
son potentes antioxidantes, scavengers de radicales libres y quelantes de metales, y
exhiben numerosas actividades fisiológicas como, antiinflamatorios, antialérgicos,
anticarcinogénicos, entre otras (Robards & Antolovich, 1997).
Los desarrollos recientes en glicobiología molecular han permitido comprender mejor las
actividades de glicósidos y sus correspondientes agliconas; basados en estos
descubrimientos es posible desarrollar nuevas glicodrogas, más activas o más efectivas
(Bojarová & Kren, 2009; Kren & Martinková L. 2001)
La glicosilación se utiliza frecuentemente para la modificación estructural de compuestos
con actividad biológica, obteniéndose en ciertos casos productos con modificaciones en sus
propiedades. Sin embargo, es prácticamente imposible definir un patrón general de las
actividades biológicas de los glicósidos en comparación con sus respectivas agliconas. En
algunos casos, la introducción de un residuo glicosídico aumenta la solubilidad de
compuestos hidrofóbicos, lo que influye principalmente en su transporte a través de
membranas. En otros casos, las moléculas glicosiladas son menos lábiles que sus
agliconas. Tal es el caso del ácido ascórbico, una vitamina muy sensible, cuyo
almacenamiento a largo plazo se logró mediante la síntesis de un derivado glucosilado
(Yamamoto et al., 1990). Y por último pero, no menos importante, ha sido posible modular
el espectro de actividad de los antibióticos glicopéptidos mediante la variación de su
fracción glicosídica (Kren y Rezanka, 2008).
Con este escenario, la síntesis eficiente de glicoconjugados se está volviendo cada vez más
importante en el campo de la química orgánica y biológica (Toshima, 2006).
2. ENZIMAS CARBOHIDRATO-ACTIVAS COMO HERRAMIENTAS PARA LA
GLICOSILACIÓN
Los compuestos químicos con estructuras complejas y múltiples grupos hidroxilos
requieren del uso de reacciones altamente selectivas para su modificación química.
Frecuentemente requiere numerosas etapas de protección y desprotección de grupos
funcionales y el uso de metales pesados como catalizadores (Papanikolaou, 2001;
Perugino et al., 2004). La manipulación de los grupos protectores es necesaria para la
obtención de compuestos puros en vez de una mezcla anomérica (Perugino et al., 2004).
Dado que las enzimas son capaces de producir sustancias anoméricamente puras en una
sola etapa, dadas su estéreo y regioespecificidad, son consideradas cada vez más como una
clase útil de catalizadores para síntesis orgánica (van Rantwijik et al. 1999). Los
inconvenientes que se presentan en la síntesis química pueden ser evitados por la síntesis
enzimática (Ichikawa et al., 1992). Los procesos biocatalíticos pueden alcanzar altas
velocidades en condiciones suaves de temperatura, presión y pH, con la consiguiente
disminución del gasto de energía y producción de desechos. Esto implica que pueden
constituirse en tecnologías sustentables y compatibles con el ambiente (Cherry &
Fidantsef, 2003).
Los oligosacáridos y derivados pueden obtenerse por hidrólisis de polisacáridos o por
síntesis a partir de azúcares pequeños o glicósidos usando glicosiltransferasas o
glicosidasas (GH):
Glicosiltransferasas. Las glicosiltransferasas (EC 2.4.x.y) son las enzimas responsables de
la biosíntesis de los oligosacáridos y glicósidos en los organismos vivientes. Las mismas
catalizan la síntesis de uniones glicosídicas de una manera regio- y estereo-selectiva con
alto rendimiento. Sin embargo, éstas no han sido usadas ampliamente in vitro dado que se
requieren reactivos fosforilados –como UDP- demasiado costosos (van Rantwijk et al.,
1999; Liese et al., 2000).
Glicosidasas o glicosilhidrolasas. Las glicosidasas (EC 3.2.1.-) son enzimas hidrolíticas
que catalizan la ruptura de uniones glicosídicas. Si bien in vivo dichas enzimas operan en
una vía catalítica, in vitro también pueden ser usadas para la síntesis de glicósidos ya sea
mediante hidrólisis reversa –control termodinámico- o transglicosilación –control cinético-
(Watts & Withers, 2004). La unión puede realizarse por transferencia del residuo
glicosídico unido a la enzima a un aceptor glicosídico en vez de la molécula de agua, esto
se conoce como transglicosilación o por condensación directa de las unidades de azúcar en
condiciones de baja actividad acuosa y alta concentración de sustrato, llamada hidrólisis
reversa (Fig. 1). La diferencia entre las dos formas de síntesis depende de la naturaleza del
donor glicosídico. En la hidrólisis inversa, la reacción se realiza con un monosacárido (por
ejemplo glucosa), mientras que en la transglicosilación un glicósido (por ejemplo
disacárido, o un azúcar unido a una aglicona) se utiliza como el dador de glicósido. Ambas
reacciones pueden llevarse a cabo ya sea en sistemas monofásicos o bifásicos (Ismail Ali et
al., 1999).
Figura 1. Glicosilación enzimática mediada por glicosidasas (van Rantwijk et al., 1999)
Las glicosidasas son características por su alta estereoselectividad, son más accesibles,
termoestables, de bajo costo, usan dadores glicosídicos simples, en su mayoría no
necesitan cofactores y generalmente son más estables que las glicosiltransferasas
(Fernandez-Mayoralas, 1997). En los casos en que es posible, se opta por la
transglicosilación, dado que es relativamente eficiente en medios acuosos y bajas
concentraciones de sustratos.
Por ello, las glicosidasas son enzimas que a pesar de tener menos especificidad por el
grupo aceptor del glicósido que las glicosiltransferasas, han adquirido importancia en la
síntesis de glicósidos y oligosacáridos in vitro para la obtención de glicoconjugados en
medios acuosos con rendimientos moderados (Kouame et al., 2001).
Aunque estas enzimas tienen absoluto control sobre la configuración anomérica de la unión
creada recientemente, ellas frecuentemente no son regioselectivas como las transferasas.
La principal desventaja es la formación de mezclas de productos, debido a la selectividad
limitada de las glicosidasas con respecto al aceptor glicosídico (Faber, 2004).
2.1 Mecanismos de acción catalítica
La hidrólisis enzimática del enlace glicosídico tiene lugar mediante una hidrólisis ácido-
base. Dicha hidrólisis ocurre por medio de dos mecanismos principales, dando por
resultado una inversión (glicosidasas “inverting”) o bien una conservación (glicosidasas
“retaining") de la configuración anomérica. A continuación se describen los dos
mecanismos clásicos (Koshland, 1953) aunque existen variantes a dichos mecanismos. Una
variante en particular descubierta recientemente involucra el cofactor NADH (Yip et al.,
2004).
Glicosidasas “inverting”. Las glicosidasas que llevan a una inversión de la configuración
anomérica lo hacen mediante una sustitución nucleofílica que ocurre en un único paso e
involucra un estado de transición iónico (Fig. 2). La hidrólisis de un enlace glicosídico
da un producto de configuración , y viceversa. La reacción ocurre con asistencia
ácido/base de las cadenas laterales de dos residuos aminoacídicos, normalmente, ácido
aspártico o glutámico, que están localizados a 6-11 Å de distancia entre sí.
Figura 2. Mecanismo inverting para una α-glicosidasa.
Glicosidasas “retaining". Las glicosidasas que llevan a una conservación de la
configuración anomérica lo hacen mediante un mecanismo de desplazamiento doble. Estas
enzimas a menudo poseen la capacidad de transglicosilación. En el primer paso –
glicosilación-, un grupo carboxílico cataliza la remoción del grupo saliente, al mismo
tiempo que el otro carboxilato realiza un ataque nucleofílico sobre el sustrato para formar
un intermediario covalente de la enzima glicosilada. En el segundo paso –desglicosilación-
, el primer carboxilato funciona como una base para activar al nucleófilo atacante (una
molécula de agua en el caso de hidrólisis, o un alcohol en el caso de una
transglicosilación), el cual hidroliza el intermediario formado (Fig. 3).
ácido
base Estado de transición
3. COMPUESTOS POLIFENOLICOS COMO ACEPTORES GLICOSIDICOS
Los compuestos fenólicos se encuentran ampliamente distribuidos en la naturaleza y
pueden tener múltiples funciones fisiológicas, tales como la actividad antioxidante de las
catequinas y la actividad antileucémica del avarol. La glicosilación de compuestos
fenólicos aumenta su solubilidad en agua y podría mejorar las propiedades farmacológicas.
La actividad fisiológica y la biodisponibilidad de los glicósidos también suele depender del
tipo o posiciones de azúcares unidos. Por ejemplo, la actividad blanqueadora de la piel
(“skin whitening”) de la de -arbutina es ocho veces mayor que la de -arbutina. Por lo
tanto, nuevos compuestos fenólicos glicosilados podrían tener diferentes propiedades
farmacológicas (Prodanovic et al., 2005).
A lo largo de las últimas décadas, las glicosidasas han sido las enzimas más
frecuentemente descriptas para la glicosilación de alcoholes primarios y secundarios,
mientras que la glicosilación de compuestos fenólicos raramente se han abordado (Mena-
Arizmendi et al., 2011).
La mayor parte de las glicosidasas tienen mayor afinidad para glicosilar grupos oxidrilos
primarios respecto a los otros hidroxilos con mayor impedimento estérico (MacManus y
Vulfson, 2000). La actividad de transglicosilación de las glicosidasas normalmente sigue el
orden OH primarios>OH secundarios>OH aromáticos, y son en general inactivas frente a
Figura 3. Mecanismo retaining para una β-glicosidasa.
Estado de transición
Estado de transición
Enzima glicosilada
ácido/base
nucleófilo
oxidrilos terciarios. La transglicosilación de oxidrilos fenólicos, por lo tanto, no es sencilla
y existen pocos ejemplos exitosos. Nuestro grupo describió una nueva actividad enzimática
producida por Acremonium sp. DSM24697, la α-ramnosil-β-glucosidasa (EC 3.2.1.168),
que es capaz de transglicosilar el disacárido rutinosa a terpenos (Minig et al., 2011) y
alcoholes aromáticos (Mazzaferro et al., 2012). Sin embargo, no se han estudiado
sistemáticamente los parámetros de reacción respecto a moléculas de importancia
farmacológica. En el presente trabajo se estudió la capacidad de la enzima α-ramnosil-β-
glucosidasa para la síntesis de rutinósidos de moléculas bioactivas, con especial énfasis en
la rutinosilación de alcoholes fenólicos. Particularmente, el compuesto hidroquinona fue
elegido tanto por sus propiedades bioactivas, como por su estructura química la cual consta
de dos oxidrilos fenólicos.
La hidroquinona inhibe la melanogénesis in vitro e in vivo y es ampliamente utilizada
cosméticamente como un agente blanqueador de la piel, para el tratamiento de melasma,
hiperpigmentación post-inflamatoria y otros trastornos de hiperpigmentación. La
hidroquinona disminuye fuertemente la actividad tirosinasa e inhibe el metabolismo celular
al afectar tanto la síntesis de ADN como de ARN. Sin embargo, la hidroquinona tiene
efectos secundarios tales como irritación de la piel o dermatitis de contacto y se oxida
fácilmente en solución acuosa (Eun-Seong Seo et al., 2009). Para evitar tales efectos
secundarios, en los últimos años se ha dedicado un intenso esfuerzo para la búsqueda de
una alternativa a la hidroquinona para propósitos tanto farmacéuticos como cosméticos
(Zhi-Ming Hu et al., 2009). Un desarrollo reciente es el uso de arbutina (hidroxifenil- -D-
glucopiranósido) en lugar de hidroquinona, la cual es capaz de suprimir la síntesis de
melanina en la piel humana reduciendo los efectos secundarios (Eun-Seong Seo et al.,
2009). La arbutina es un glucósido natural de la hidroquinona que se encuentra presente
en las planta de guayaba, y es menos citotóxica en comparación con la misma
hidroquinona (Zhi-Ming Hu et al., 2009; Chao-Hsun Yang et al., 2010) (Fig. 4). Por otro
lado, arbutina- -glucosido (4-hidroxifenil- D-glucopiranósido) fue sintetizada
enzimáticamente utilizando arbutina como aceptor glicosídico, y almidón como donor
(Kazuhisa Sugimoto et al., 2003). También fueron sintetizados enzimáticamente derivados
glicosilados de hidroquinona como son hidroquinona- -isomaltosido e hidroquinona- -
glucosido utilizando hidroquinona como aceptor y maltosa como donor de glicósido
(Prodanovic et al., 2005).
La glicosilación de arbutina e hidroquinona se ha llevado a cabo para intentar fortalecer la
inhibición de la síntesis de melanina (Kazuhisa Sugimoto et al., 2003; Eun-Seong Seo et
al., 2009) disminuyendo aun más los efectos secundarios.
Figura 4. Estructura química de Hidroquinona (1), Arbutina (2) y -Arbutina (3).
La hidroquinona rutinosilada sería una nueva alternativa al uso de hidroquinona y arbutina.
El estudio de sus parámetros de síntesis es necesario para su potencial producción y uso en
farmacología, a la vez que proporcionan indicios para la síntesis de rutinosidos de
compuestos con estructura arílica similar.
4. OBJETIVOS
El objetivo general de este trabajo fue la glicosilación de moléculas de actividad
farmacologica para modificar su solubilidad, estabilidad y/o actividad biológica mediante
el uso de la enzima α-ramnosil-β-glucosidasa.
- Objetivos específicos
a. Determinación de la capacidad de la enzima α-ramnosil-β-glucosidasa para la
rutinosilación de diversos aceptores bioactivos
b. Optimización de las condiciones de síntesis enzimática en función de las
características bioquímicas de la enzima y las propiedades químicas de los sustratos y
productos.
(1) (2) (3)
Materiales y
Métodos
1. Reactivos químicos
Hesperidina, hesperetina, hesperidina metilchalcona, hidroxiquinona (HQ) se compraron
en Sigma Chemical (St. Louis). El metanol grado HPLC LiChrosolv® se obtuvo de Merck
(Darmstadt). El resto de los reactivos fueron de fuentes standard.
2. Soluciones stock
Las soluciones stock de hidroquinona y hesperidina (180 mM) para los ensayos de
transglicosilación y cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) se prepararon
solubilizando estos compuestos en dimetilformamida (DMF).
El pH se ajustó utilizando los siguientes buffers (50 mM): citrato de sodio (pH 3,0; 4,0 y
5,0), fosfato de sodio (pH 6,0 y 8,0) y Tris-HCl (pH 6,8 – 8,8).
3. Medición de actividad enzimática
Actividad α-ramnosil-β-glucosidasa. Se incubaron 450 µl de sustrato (1,8 mM
hesperidina en 50 mM buffer citrato de sodio pH 5,0) con 50 µl de solución enzimática
adecuadamente diluida. La reacción se realizó durante 1 h a 60°C y se finalizó agregando
500 µl de ácido 3,5-dinitrosalicílico (DNS) (Miller et al. 1959). Los tubos se colocaron en
un baño de agua hirviendo por 10 min y se enfriaron antes de medir la absorbancia a 540
nm. Una unidad de actividad α-ramnosil-β-glucosidasa se definió como la cantidad de
enzima requerida para liberar 1 µmol de azúcares reductores por minuto.
4. Selección de Aceptores
Para la reacción de transglicosilación se utilizó hesperidina como donor de disacárido, y
los aceptores hidroxilados metronidazol, clindamicina, hidroquinona, rifampicina y
epinefrina. La mezcla de reacción (500 µl) contenía: 1,8 mM hesperidina, 1,8 mM aceptor,
0,004 U/ml α-ramnosil-β-glucosidasa, 50 mM buffer fosfato pH 6,0; 2 % de co-solvente
(DMF); y se incubó a 30 ºC durante 25 h. La reacción se finalizó en baño maría hirviente
por 10 min.
5. Síntesis de rutinósido
Estabilidad química de hidroquinona y pH óptimo de reacción enzimática
La determinación de estabilidad de hidroquinona se realizó midiendo el espectro UV-
visible a 30 ºC a diferentes valores de pH.
La reacción de transglicoilación se llevó a cabo a distintos valores de pH, el cual se ajustó
utilizando los siguientes buffers (50 mM): citrato de sodio (pH 4,0 y 5,0), fosfato de sodio
(pH 6,0).
La mezcla de reacción (1000 µl) contenía: 1,8 mM hesperidina, 1,8 mM hidroquinona,
0,02 U/ml α-ramnosil-β-glucosidasa, 50 mM buffer, 2% de co-solvente (DMF); y se
incubó a 30 ºC durante 24 h.
Reacción en diferentes concentraciones de Co-solvente (DMF/DMSO).
Se utilizaron dos co-solventes (DMF y DMSO) para la reacción de transglicosilación en
distintos proporciones (0-50% v/v). La mezcla de reacción (1000 µl) contenía: 1,8 mM
hesperidina, 1,8 mM hidroquinona, 0,02 U/ml α-ramnosil-β-glucosidasa, 50 mM buffer
citrato de sodio pH 5,0; co-solvente (0-50% v/v); y se incubó a 30 ºC durante 2 h.
Reacción en diferentes concentraciones de aceptor.
Para determinar la concentración óptima de aceptor, se utilizaron distintas concentraciones
de hidroquinona. La mezcla de reacción (1000 µl) contenía: 1,8 mM hesperidina,
hidroquinona (1,8-90 mM ), 0,02 U/ml α-ramnosil-β-glucosidasa, 50 mM buffer citrato de
sodio pH 5,0; 5 % co-solvente; y se incubó a 30 ºC durante 2 h.
6. Cromatografía en capa delgada. Los productos de las reacciones enzimáticas se
analizaron por cromatografía en capa delgada (silica gel 60 W) usando acetato de etilo/2-
propanol/agua (3:2:2) como fase móvil y se revelaron con el reactivo de antrona. Las
imágenes a color 32-bit se descompusieron en los componentes rojo, verde y azul (RGB)
usando el software ImageJ 1.38x (National Institutes of Health, USA). Las imágenes
correspondientes al componente rojo se eligieron debido a la mayor relación señal/ruido.
Luego, la densidad óptica integrada se usó para la cuantificación de azúcares y glicósidos.
Resultados y
Discusión
1. Especificidad del catalizador α-ramnosil-β-glucosidasa con diferentes
aceptores bioactivos
Se estudió la capacidad de transglicosilación del catalizador α-ramnosil-β-glucosidasa
hacia distintos aceptores con aplicaciones farmacológicas. Se eligieron cinco compuestos –
clindamicina, metronidazol, epinefrina, hidroquinona y rifampicina– en base a sus
actividades biológicas y presencia de grupos oxidrilos fenólicos u oxidrilos en posiciones
primaria o secundaria (Tabla 1).
Tabla 1. Fármacos usados como aceptores del glicósido
Fármaco
Indicación Solubilidad en agua
logP
Clindamicina
Tratamiento de infecciones serias causadas por bacterias anaeróbicas susceptibles incluyendo Bacteroides spp., Peptostreptococcus, Clostridium spp., Streptococos anaeróbicos y microaerofílicos.
30.6 mg/l (a 25 ºC)
2,16
Metronidazol
Tratamiento de infecciones anaeróbicas e infecciones mixtas, incluyendo las causadas por Clostridium difficile, Helicobacter pylori, Giardia spp., amebiasis provocada por Entamoeba histolytica, e infecciones con Trichomonas.
950 mg/l (a 25 ºC)
-0,02
Epinefrina
Tratamiento de hipersensibilidad aguda, ataques asmáticos agudos, síndrome de Stokes-Adams.
180 mg/l (a 20 ºC)
-1,37
Rifampicina
Tratamiento de las infecciones por Mycobacterium, incluyendo la tuberculosis y la lepra; juega un papel en el tratamiento de Staphylococcus aureus meticilina-resitente (MRSA) en combinación con el ácido fucsídico. Se usa en la profilaxis de Neisseria meningitidis (meningitis).
1400 mg/l (a 25 ºC)
2.7
Hidroquinona Agente blanqueador de la piel. Se usa para aclarar áreas localizadas de piel oscurecida, ya que es un agente despigmentador débil.
59 mg/l (a 15 ºC)
0.59
Fuente: DrugBank, http://www.drugbank.ca; Wikipedia, http://es.wikipedia.org
La reacción de transglicosilación se realizó utilizando dichos fármacos como aceptores y
hesperidina como donor de rutinosa en cantidades equimolares, en distintas condiciones de
pH, tiempo de reacción y temperatura. Los productos de reacción se analizaron por
cromatografía en capa delgada. Se encontró que el biocatalizador es capaz de
transglicosilar hidroquinona, en solución acuosa (Fig. 5).
En cuanto a los demás aceptores, estos no pudieron ser glicosilados o presentaron
eficiencias menores en la reacción de síntesis, probablemente debido a que en las
condiciones empleadas no se veía favorecida su transglicosilación. La modificación de las
distintas variables del sistema, para cada aceptor en particular podría dar lugar a la síntesis
de su derivado glicosilado.
Se ha descripto la glicosilación de alcoholes primarios y secundarios (Minig et al., 2011;
Martearena, 2007; van Rantwijk et al, 1999), mientras que la glicosilación de compuestos
fenólicos es menos común (Mena-Arizmendi et al., 2011; Mazzaferro et al., 2012). En este
caso, hidroquinona resultó glicosilada, en concordancia con estudios previos que mostraron
la glicosilación de un oxidrilo fenólico en la cumarina 4-metilumbeliferona (Mazzaferro et
al., 2012). El fármaco hidroquinona se eligió como molécula modelo para ensayos
posteriores por poseer en su estructura dos oxidrilos fenólicos.
Hesperidina Rutinosa
Figura 5. Transglicosilación de rutinosa desde hesperidina a distintos fármacos. El signo (+) denota la presencia del catalizador en la mezcla de reacción, mientras que el signo (-) denota control. El aceptor etanol se añadió como control. Las flechas azules indican productos de transglicosilación. La mancha extra que se observa en el caso de clindamicina corresponde al fármaco, que presenta un residuo glicosídico per se.
+
Hid
rolis
is
+ − + − + − + − + − +
Etan
ol
Met
ron
idaz
ol
Clin
dam
icin
a
Epin
efri
na
Hid
roq
uin
on
a
Rif
amp
icin
a
Ru
tin
osa
2. Rutinosilación de hidroquinona
La hidroquinona (Tabla 1) posee en su estructura dos grupos oxidrilos arílicos, y por su
comportamiento como inhibidor de la enzima tirosinasa encuentra aplicación en productos
cosméticos para el blanqueamiento de la piel.
Sin embargo, esta no es químicamente estable y las cremas que la contienen sufren de
pardeamiento.
Fue descripta una mayor resistencia al pardeamiento del derivado glucosilado -arbutina
(4-hidroxifenil- D-glucopiranósido) respecto a la hidroquinona, cuando estos
compuestos fueron irradiados con luz ultravioleta (Eun-Seong Seo et al., 2009). También
existen descripciones de glucosilación de -arbutina para incrementar su estabilidad
química (Zhi-Ming Hua et al., 2009). Si bien la cromatografía nos indica la presencia de
hidroquinona rutinosilada, donde estaríamos logrando el derivado disacarídico en un solo
paso, es evidente que la reacción presenta una baja eficiencia y debería ser optimizada.
La síntesis de glicósidos depende de las distintas variables en el sistema como pH,
contenido de solvente, del aceptor glicosídico, concentración de catalizador, tipo de grupo
hidroxilo del aceptor, etc (Vic y Thomas, 1992; Chahid et al., 1992). Como ya se ha
mencionado anteriormente, la transglicosilacion de oxidrilos fenólicos no es sencilla, por
lo tanto, las condiciones de la reacción deben modificadas para aumentar la eficiencia del
proceso (Martearena, 2007).
Se analizó la producción de hidroquinona rutinosilada utilizando 0,004 U/ml α-ramnosil-β-
glucosidasa. La mayor concentración de producto se obtuvo al cabo de 25 h de reacción,
con rendimientos de aproximadamente 10% (Figura 6).
Figura 6. Curva de producción de hidroquinona-rutinósido catalizada por α-ramnosil-β-glucosidasa de Acremonium sp. DSM24697. La mezcla de reacción contenía 1,8 mM hidroquinona, 1,8 mM hesperidina, 50 mM buffer fosfato de sodio pH 6,0; 2%v/v DMF. Se incubó a 30°C con 0,004 U/ml α-ramnosil-β-glucosidasa. 0
0.02
0.04
0.06
0.08
0.1
0.12
0.14
0.16
0.18
0.2
0 5 10 15 20 25
Hid
roq
uin
on
a ru
tin
ósi
do
(m
M)
Tiempo (h)
3. Estabilidad química del aceptor hidroquinona
Con el fin de optimizar la reacción de transglicosilación, y teniendo en cuenta que la
hidroquinona se oxida fácilmente a p-benzoquinona en solución acuosa, su estabilidad se
midió a diferentes valores de pH (Fig. 7).
Figura 7. Efecto del pH en la oxidación de hidroquinona a p-benzoquinona (■ ) y actividad de α-ramnosil-β-glucosidasa a diferentes valores de pH (■ ). La intersección del sombreado azul y rojo indica el rango utilizado para continuar la optimización del proceso ( ).
La auto-oxidación de la hidroquinona a p-benzoquinona es dependiente del pH, ocurre
rápidamente a pH alcalino para producir compuestos coloreados (color marrón), pero
lentamente en solución ácida (Sirajuddin et al 2006). Se encontró que la formación de p-
benzoquinona fue baja a valores de pH ligeramente ácidos (pH ≤ 6,0), correspondiente al
sombreado azul en la figura 7. Estudios previos mostraron que los valores máximos de
actividad (>80%) del catalizador α-ramnosil-β-glucosidasa se encuentran en el rango de pH
4,0-7,0, lo cual esta indicado en la figura 7 con un sombreado rosa.
Teniendo en cuenta ambos rangos de pH, se seleccionó el intervalo de pH 4,0-6,0 para la
reacción de transglicosilación.
0
20
40
60
80
100
120
0.00
0.02
0.04
0.06
0.08
0.10
2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
Ac
tivid
ad
en
zim
átic
a (%
)Ab
s2
45/t
iem
po
(1
/min
)
pH
4. Concentración del catalizador y la cinética de transglicosilación a distintos
valores de pH
La eficacia de transglicosilación depende en gran medida de la relación cinética entre
síntesis/hidrólisis, que describe de manera eficiente cómo el intermediario de la enzima
glicosilada se transforma en producto. Es por ello que las condiciones de pH, tiempo y
temperatura requeridas para un máximo rendimiento de la hidrólisis no suelen ser las
mismas que las requeridas para la transglicosilación (van Rantwijk et al., 1999).
Otra variable importante es la selección de la concentración de enzima, dado que juega un
papel importante en el rendimiento y la productividad de la síntesis. De acuerdo con la
literatura, a mayor actividad de la enzima, mayor es la tasa de producto inicial, pero a su
vez este producto puede ser también hidrolizado por la enzima (Mena-Arizmendi et al.,
2011; Martearena, 2007; Jing Quan et al., 2007). Con el fin de incrementar la eficiencia
del proceso se decidió aumentar 5 veces la concentración del catalizador. La figura 8
muestra la influencia de ambas variables en la síntesis de hidroquinona rutinosilada dentro
del rango de pH donde la oxidación química de hidroquinona no es significativa.
Figura 8. Cinética de producción de hidroquinona rutinósilada a diferentes valores de pH, utilizando 0,02 U/ml de enzima.
En todos los casos se encontró que la producción era máxima luego de 1-2 h cuando se
utilizaban 0,02 U/ml de enzima, para luego disminuir, probablemente porque hidroquinona
rutinosilada funciona como sustrato de la enzima.
El mayor rendimiento 12,2 % se logró a pH 5,0 luego de 2 h de reacción. Dicho pH es el
pH óptimo para la reacción de transglicosilación, el cual coincide con el pH óptimo de la
enzima para la desglicosilación del flavonoide hesperidina (Fig. 7).
0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
0 4 8 12 16 20 24
Hid
roq
uin
on
a ru
tin
ósi
do
(m
M)
Tiempo (h)
pH 4
pH 5
pH 6
5. Agregado de co-solventes miscibles en agua
Una de las estrategias más utilizadas para mejorar los rendimientos en los procesos
enzimáticos que implican sustratos hidrófobos en medios acuosos es el uso de co-
disolventes orgánicos. Estos disolventes orgánicos pueden aumentar la solubilidad de los
sustratos y, por lo tanto, su disponibilidad para la reacción enzimática (Mena-Arizmendi et
al., 2011). Se estudió el efecto del agregado de los disolventes dimetilformamida (DMF) y
dimetilsulfóxido (DMSO) en el medio de reacción (Fig. 9).
La presencia del co-solvente aumentó la síntesis de producto en el rango 0-5%v/v, pero en
concentraciones mayores al 10%v/v estos fueron deletéreos para el proceso (Fig. 9).
El uso de solventes orgánicos en el medio de reacción aumenta la solubilidad de los
sustratos hidrófobos y/o cambia el equilibrio cinético (Kwon et al., 2006), lo cual, en
algunos casos puede mejorar la productividad del proceso (Mazzaferro et al., 2012). Sin
embargo, en las concentraciones de solvente utilizadas, el sistema continúa siendo
homogéneo, por lo que no se puede explicar la disminución dada por una menor
disponibilidad del aceptor o donor del glicósido. Es por esta razón que sugerimos que la
disminución en el rendimiento fué básicamente debida a una desestabilización del
catalizador.
Las glicosidasas a menudo muestran una falta de actividad en medios orgánicos, aunque
los efectos son generalmente reversibles, por lo que se requiere de la estabilización de las
enzimas, mediante la inmovilización u otras estrategias, para poder utilizar concentraciones
elevadas de solventes (Piñuel et al., 2011).
Figura 9. Efecto del co-solvente en la síntesis de hidroquinona rutinósido.
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55
0
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
Co-Solvente (% v/v)
Hid
roq
uin
on
a ru
tin
ósi
do
(m
M)
DMF
DMSO
6. Efecto de la concentración de hidroquinona en la síntesis de hidroquinona
rutinósido
Para estudiar el efecto de la concentración de aceptor en la reacción de síntesis, se varió la
concentración de hidroquinona en el rango 1,8-90 mM (Fig. 10)
Figura 10. Efecto de la concentración de aceptor en la síntesis de hidroquinona rutinósido.
Se encontró que 36 mM es la concentración más adecuada para la síntesis con un
rendimiento del 38% (Fig. 10). En concentraciones mayores no se observa un aumento en
la síntesis de producto y si bien no tenemos grandes diferencias la curva muestra una
tendencia a disminuir. Esto fenómeno podría deberse a la inestabilidad de la enzima en
elevadas concentraciones del aceptor glicosídico, el cual puede inducir la agregación de la
proteína por disminución de la constante dieléctrica o debido a las modificaciones
químicas producidas por la oxidación de la hidroquinona (Prodanovic et al., 2005).
En este tipo de reacciones, generalmente se propone emplear concentraciones del aceptor
más altas que las del donor para minimizar las autoglicosilaciones. Otra estrategia sería
mediante la síntesis en un reactor alimentado, para evitar la presencia de altas
concentraciones del dador glicosídico durante todo el proceso (Balogh et al. 2004).
Inicialmente el rendimiento de la reacción fue de un 10% al cabo de 25 h. Luego de
optimizar las variables del sistema como pH, contenido de co-solvente, concentración de
catalizador y aceptor glicosídico se obtuvo un rendimiento del 38% en tan solo 2 h de
proceso. Si consideramos la productividad de la biotransformación (productividad =
producción/tiempo) esta se incremento 47,5 veces. Esto señala el punto de partida para la
síntesis en mayor escala, la purificación y los estudios farmacológicos sobre hidroquinona
rutinósido.
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
Hid
roq
uin
on
a ru
tin
ósi
do
(m
M)
Hidroquinona (mM)
Conclusiones
En el presente trabajo se utilizó el catalizador α-ramnosil-β-glucosidasa de Acremonium sp.
DSM24697 para rutinosilar distintos aceptores hidroxilados de uso farmacológico. A partir
de los estudios realizados, se pueden alcanzar las siguientes conclusiones:
Hidroquinona resulto ser el aceptor del glicósido más eficiente respecto a los otros
fármacos estudiados en las condiciones de trabajo empleadas.
El catalizador α-ramnosil-β-glucosidasa fue capaz de transglicosilar un compuesto
fenólico.
Se determinó un rango de pH para el proceso que considera la estabilidad química
del aceptor glicosídico y la actividad del catalizador. Dicho rango se hallo entre
entre los valores de pH 4,0-6,0.
La presencia del co-solvente incrementó el rendimiento del proceso en el rango de
concentraciones 0-5%v/v.
El incremento de cinco veces la concentración del catalizador permitió reducir el
proceso de síntesis a sólo 2 h de reacción.
Se determinó 36 mM hidroquinona como la concentración más adecuada para la
síntesis en lote hidroquinona rutinosido, con un rendimiento del 38%.
La productividad del proceso se incremento 47,5 veces a través de las variables
optimizadas, por lo cual dichos parámetros permitirían la obtención de
hidroquinona rutinosilada a mayor escala.
Referencias
Balogh T, Boross L, and Kosary J. 2004. "Novel reaction systems for the synthesis of O-
glucosides by enzymatic reverse hydrolysis." Tetrahedron. 60:679-682.
Bojarová P and Křen V. 2009. “Glycosidases: a key to tailored carbohydrates.” Trends in
Biotechnology. 27 (4):199-209.
Chahid Z, Montet D, Pina M, and Graille J. 1992. "Effect of water activity on enzimatic
synthesis of alkylglicosides." Biotechnology Letters. 14:281-284.
Chao-Hsun Yang, Yi-Shyan Chen, Jeng-Shiow Lai, Willy W. L. Hong and Chih-
Chien Lin 2010. “Determination of the Thermodegradation of deoxyArbutin in
Aqueous Solution by High Performance Liquid Chromatography.” International
Journal of Molecular Sciences 11:3977-3987.
Cherry JR and Fidantsef AL. 2003. “Directed evolution of industrial enzymes: An
update.” Current Opinion in Biotechnology. 14: 438-443.
Eun-Seong Seoa, Jin Kanga, Jin-Ha Leec, Go-Eun Kimd, Ghahyun J. Kime, Doman
Kima. 2009. “Synthesis and characterization of hydroquinone glucoside using
Leuconostoc mesenteroides dextransucrase”. Enzyme and Microbial Technology.
45:355–360
Faber Kurt. 2004. "Glycosyl-Transfer Reactions." In Springer, editor, Biotransformations
in Organic Chemistry. Germany. 307-321.
Fernandez-Mayoralas, A. 1997. "Synthesis and modification of carbohydrates using
glycosidases and lipases." Topics in Current Chemistry. 186:1-20.
Ichikawa Y, Look GC, and Wong CH. 1992. "Enzyme-catalysed oligosaccharide
synthesis." Analytical Biochemistry. 202:215-238.
Ismail A, Soultani S and Ghoul M. 1999a. "Enzymatic-catalyzed synthesis of
alkylglycosides in monophasic and biphasic systems. I. The transglycosylation
reaction." Journal of Biotechnology. 69:135- 143.
Jing Quan, Jian-Ming Xu, Bo-Kai Liu, Cheng-Zhen Zheng, Xian-Fu Lin. 2007.
“Synthesis and characterization of drug–saccharide conjugates by enzymatic
strategy in organic media”. Enzyme and Microbial Technology. 41:756-763
Kazuhisa Sugimoto, Takahisa Nishimura, Koji Nomura, Kenji Sugimoto and Takashi
Kuriki. 2003. “Syntheses of Arbutin- α -glycosides and a Comparison of Their
Inhibitory Effects with Those of a-Arbutin and Arbutin on Human Tyrosinase”.
Chemical & Pharmaceutical Bulletin. 51:798—801
Koshland DE. 1953. “Stereochemistry and the mechanism of the enzymatic reactions.”
Biological Reviews. 28:416
Kouame LP, Niamke S, Diopoh S, and Colas B. 2001. "Transglycosylation reactions by
exoglycosidases from the termite Macrotermes subhyalinus." Biotechnology
Letters. 23:1575-1581.
Kren V and Martinkova L. 2001. “Glycosides in medicine: The role of glycosidic
residue in biological activity.” Current Medicinal Chemistry. 8:1303-1328.
Kren V and Rezanka T. 2008. “Sweet antibiotics – the role of glycosidic residues in
antibiotic and antitumor activity and their randomization.” FEMS Microbiology
Reviews. 32:858-889.
Kwon S J, Jung HC, Pan JG. 2007. “Transgalactosylation in a Water-Solvent Biphasic
Reaction System with β -Galactosidase Displayed on the Surface of Spores of
Bacillus subtilis.” Applied and Environmental Microbiology. 73:2251-2256
Liese A, Seelbach K, Wandrey C. 2000. Industrial biotransformations. Wiley-VCH,
MacManus DA and EN Vulfson. 2000. "Regioselectivity of enzymatic glycosylation of
6-O-acylglycosides in supersaturated solutions." Biotechnology and
Bioengineering. 69:585-590.
Martearena MR. 2009. Estudios de síntesis enzimática de ramnósidos y oligosacáridos
catalizadas por α -L-ramnosidasas.Universidad Nacional de Salta, Facultad de
Ciencias Exactas, Departamento de Química.
Mazzaferro LS, Piñuel L, Erra-Balsells R, Giudicessi SL, and Breccia JD. 2012.
“Transglycosylation specificity of Acremonium sp. α-rhamnosyl-β-glucosidase and
its application to the synthesis of the new fluorogenic substrate 4-
methylumbelliferyl-rutinoside.” Carbohydrate Research. 347:69-75.
Mena-Arizmendia A, Aldereteb J, Águila S, Martyc A, Miranda-Molinaa, López-
Munguíaa A, Castillo E. “Enzymatic fructosylation of aromatic and aliphatic
alcohols by Bacillus subtilis levansucrase: Reactivity of acceptors.” Journal of
Molecular Catalysis B: Enzymatic. 70:41–48.
Minig M, Mazzaferro LS, Erra-Balsells R, Petroselli G, and Breccia JD. 2011. α-
“Rhamnosyl-β-glucosidase-catalyzed reactions for analysis and biotransformations
of plant-based foods.” Journal of Agricultural and Food Chemistry. 59:11238-
11243
Papanikolaou S. 2001. "Enzyme-catalyzed synthesis of alkyl- β -glucosides in a water-
alcohol two-phase system." Bioresource Technology. 77:157-161.
Perugino G, Trincone A, Rossi M and Moracci M. 2004."Oligosaccharide synthesis by
glycosynthases." Trends in Biotechnology. 22:31-37.
Piñuel L, Mazzaferro LS and Breccia JD. 2011. “Operational stabilization of fungal α-
rhamnosyl-β-glucosidase by immobilization on chitosan composites.” Process
Biochemistry. 46:2330–2335.
Prodanovic R, Nenad M, Dusan S, Zlatovis M, Branislav B, Cirkovis T, and Vujcic Z.
2005. "Transglucosylation of hydroquinone catalysed by a-glucoside from baker´s
yeast." Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic. 35:142-146.
Robards K. and Antolovich M. 1997. “Analytical chemistry of fruit bioflavonoids.”
Analytical Chemistry., 122: 11R - 34R.
Sirajuddin, Iqbal Bhanger M, Abdul Niaz, Afzal Shah, Abdul Rauf. 2006. “Ultra-trace
level determination of hydroquinone in waste photographic solutions by UV–vis
Spectrophotometry.” Talanta 72:546–553
Toshima K. 2006. “Novel glycosylation methods and their application to natural products
synthesis.” Carbohydrate Research. 341:1282-1297.
Van Rantwijk M, Woudenberg-van Oosterom M, Sheldon RA. 1999. “Glycosidase-
catalysed synthesis of alkyl glycosides.” Journal of Molecular Catalysis B:
Enzymatic. 6:511-532.
Vic G and Thomas D. 1992. "Enzyme-catalysed synthesis of alkyl G-Dglucosides in
organic media." Tetrahedron Letters. 33:4567-4570.
Watts AG & Withers SG. 2004. “Glycosynthase-catalysed formation of modified
polysaccharide microstructures.” Journal of Biotechnology. 380:e9-e10.
Yamamoto I, Muto N, Nagata E, Nakamura T & Suzuki Y. 1990. “Formation of a
stable L-ascorbic acid alpha-glucoside by mammalian alpha-glucosidase-catalyzed
transglucosylation.” Biochimica et Biophysica Acta. 1035:44-50.
Yip VL, Varrot A, Davies GJ, Rajan SS, Yang X, Thompson J, Anderson WF,
Withers SG. 2004. “An unusual mechanism of glycoside hydrolysis involving
redox and elimination steps by a family 4 beta-glycosidase from Thermotoga
maritima.” Journal American Chemistry Society. 126:8354–8355
Zhi-Ming Hua, Qiong Zhou, Tie-Chi Lei, Shen-Feng Ding, Shi-Zheng Xu. 2009.
“Effects of hydroquinone and its glucoside derivatives on melanogenesis and
antioxidation: Biosafety as skin whitening agents”. Journal of Dermatological
Science 55:179–184.
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