PARTICIPACIN DE LAS CELULAS EPITELIALES MAMARIAS EN
LA SNTESIS DE CIDOS GRASOS OMEGA 3 Y 6 DE LA LECHE
HUMANA: EXPRESIN GNICA DE DESATURASAS Y
ELONGASAS
P R E S E N T A
Lic. Nutr. Elizabeth Sosa Castillo
Comit:
Co-tutor interno: Dr. Edmundo Bonilla Gonzlez
Co-tutor externo: Dra. Maricela Rodrguez Cruz
Asesor interno: Dr. Pablo G. Damin Matsumura
Asesor(a) externo: Dra. Mariela Bernabe Garca
Agradecimiento CONACYT
El programa de la Maestra en Biologa Experimental de la Universidad Autnoma
Metropolitana (UAM-I 309-1) pertenece al Padrn de Posgrados de Excelencia
CONACYT (PNPC) registro 001481 y cuenta con apoyo del mismo consejo Clave
DAFCyT 2003IMPTNNN0020.
Esta investigacin fue financiada por la Coordinacin de Investigacin Mdica en
Salud, IMSS, Mxico (FIS/IMSS/PROT/G09/769) y por el CONACYT
(FIS/IMSS/PROT/G09/7811).
El jurado designado por la Comisin Acadmica del Posgrado en Biologa
Experimental, de la Divisin de Ciencias Biolgicas y de la Salud de la Universidad
Autnoma Metropolitana Iztapalapa, aprob la tesis titulada Participacin de las
celulas epiteliales mamarias en la sintesis de cidos grasos omega 3 y 6 de la
leche humana: expresin genica de desaturasas y elongasas que present:
M. en B. E. Elizabeth Sosa Castillo
el da
3 de Mayo del 2012
Agradecimientos
Me gustara agradecer a Dios por la oportunidad que se me brindo al poder llevar a cabo con
xito este trabajo,
Tambin quiero agradecer a mis padres por confiar en mis sueos y darme el apoyo y
consejos necesarios para continuar en este camino, el cual, en ocasiones no es sencillo,
pero alguien alguna vez me dijo; Si las cosas fuesen fciles, todo el mundo las hara y eso
me quedo bastante claro.
Agradezco a mis hermanas y familia por todo el amor, paciencia y comprensin que me
brindaron durante este camino.
Agradezco a mis co-directores, asesores (as), profesores y coordinador por el tiempo, apoyo
y enseanzas que me brindaron desde el inicio hasta el final de esta Maestra.
Agradezco a mis amigos con quienes compart conocimientos y disfrute muchos momentos
de diversin y alegra.
Agradezco a todas aquellas personas que siempre estuvieron a mi lado brindndome su
apoyo, tiempo, conocimientos, amor y amistad. Compartiendo conmigo este sueo que
inicio hace un tiempo y que continuara hasta que Dios me lo permita.
Nunca consideres el estudio como una obligacin, sino como una oportunidad para penetrar
en el bello y maravilloso mundo del saber.
Hay una fuerza motriz ms poderosa que el vapor, la electricidad y la energa atmica: la
voluntad.
Albert Einstein
Resumen
Introduccin: Durante la lactancia el organismo materno desencadena diversas
adaptaciones metablicas para hacer frente a la demanda de cidos grasos poli-
insaturados de cadena larga (LC-PUFAs por sus siglas en ingls) requerida para el
recin nacido. Estos LC-PUFAs como el cido araquidonico (AA), cido
eicosapentaenoico (AEP) y acido docosahexaenoico (ADH), son componentes
estructurales de las membranas celulares, adems, intervienen en el crecimiento y
desarrollo del cerebro y de la retina en los perodos prenatal y posnatal. Estos son
sintetizados a partir de los PUFAs (cido linoleico y cido -linolnico) a travs de
diversas etapas de desaturacin por las desaturasas delta 5 y 6 (5D y 6D) y
elongacin por las elongasas 2 y 5 (Elovl-2 y Elovl-5). En la actualidad, poco se
sabe sobre los procesos de regulacin metablica de la leche en los humanos debido
a las limitaciones en la obtencin de tejido mamario. Debido a esto, es necesario
conocer si en la glndula mamaria se expresan los genes que participan en la
sntesis de estos cidos grasos y si dicha expresin se modifica en el transcurso de
la lactancia. Objetivo: Determinar los cambios en la expresin de las enzimas que
participan en la sntesis de cidos grasos omega 3 y 6 en las clulas epiteliales
mamarias de la leche materna y su correlacin con la concentracin de LC-PUFAs
en el calostro, la leche de transicin y en leche madura. Metodologa: El tipo de
estudio fue observacional, prospectivo y longitudinal. Se determino la expresin del
ARNm de los genes blanco 5D, 6D, Elovl-2, Elovl-5 y los genes de referencia ARP
yactina de clulas epiteliales mamarias durante la secrecin de calostro, leche de
transicin y leche madura de 6 mujeres, por PCR en tiempo real. Adems, se analizo
la composicin de cidos grasos en el calostro, leche de transicin y leche madura
por cromatografa de gases. Resultados: Durante la secrecin de leche madura
increment la expresin de la 5D, 6D y Elovl-5 con respecto al calostro. Las
proporciones de AL y ALN permanecieron estables durante el transcurso de la
lactancia, mientras que la proporcin de AA y ADH disminuyeron durante la
secrecin de leche madura en relacin al calostro. Conclusin: En los glbulos de
grasa de leche humana, se encuentran los transcritos provenientes de las clulas
epiteliales mamarias y que codifican para las enzimas que participan en la sntesis de
los LC-PUFAS. Durante la secrecin de la leche madura se incrementa la expresin
de estas enzimas para cubrir las necesidades de estos cidos grasos impuestas por
el recin nacido. Estos resultados sugieren que probablemente la glndula mamaria,
en conjunto con el hgado participa en la sntesis de los cidos grasos poli-
insaturados; AA, AEP Y ADH en respuesta a su alta demanda para el desarrollo del
neonato.
Abstract Background. Breastfeeding is a physiological stage with high metabolic demand.
During this period; breast milk provides the newborn the nutrients needed for growth
and development. The long chain-polyunsaturated fatty acids (LC-PUFAs) like
araquidonic (AA) eicosapentaenoic (EPA) and docosahexaenoic (DHA) are essential
fatty acids for the infant. LC-PUFAs are part of cell membranes, are involved in the
developing brain and retina in the prenatal and postnatal periods. They are
synthesized from PUFAs (linoleic acid and alfa-linolenic acid) through various stages
of desaturation and elongation by desaturases delta 5 (D5D) y 6 (D6D) and
elongases 2 (Elovl-2) and 5 (Elovl-5). To date little is known about the regulation of
metabolic pathways of milk in humans due to limitations in obtaining mammary tissue.
Therefore, it is necessary to study whether mammary gland can synthesize LC-
PUFAs through the expression of desaturasas and elongases and whether this
expression is modified during lactation. Objective. Determine changes in the
expression of enzymes involved in the synthesis of omega 3 and 6 in mammary
epithelial cells in breast milk and its correlation with the concentration of LC-PUFA in
colostrum, transitional milk and mature milk. Methods. Total RNA was extracted from
milk fat globules through lactation in six women by Trizol method. The transcripts
D5D, D6D, Elovl-2 and Elovl-5 were identified and quantified by real-time RT-PCR
using two reference genes ARP and -actin for normalization. Also, the fatty acid
composition of breast milk was determined by gas chromatography. Results. Human
mammary epithelial cells express transcripts of D5D, D6D and Elovl-5. This
expression increased during the secretion of mature milk with respect to colostrum.
The proportion of AL and ALN remained stable during the course of lactation, while
the proportion of AA and DHA decreased during secretion of mature milk compared to
colostrum. Conclusions. Human mammary gland expresses genes involved in the
synthesis of LC-PUFAs, suggesting that probably the breast tissue, together with the
liver (the main organ that synthesizes LC-PUFAs) participates in the synthesis of AA,
EPA and DHA in response to high demand for the development of the newborn.
NDICE
INTRODUCCIN. IMPORTANCIA DE LA GLNDULA MAMARIA ............................ 1
ANATOMA DE LA GLNDULA MAMARIA ................................................................ 2
FISIOLOGA DE LA GLNDULA MAMARIA ............................................................... 3
Periodo Mamotrfico ................................................................................................ 3
Periodo lactognico .................................................................................................. 4
Periodo lactopoytico ............................................................................................... 6
COMPOSICIN DE LA LECHE HUMANA .................................................................. 8
Calostro ..................................................................................................................... 9
Leche de transicin ................................................................................................... 9
Leche madura ........................................................................................................... 9
COMPOSICIN DE LOS LIPIDOS EN LA LECHE ................................................... 10
IMPORTANCIA DE LOS ACIDOS GRASOS POLI-INSATURADOS EN EL
LACTANTE ................................................................................................................ 12
FUENTES DE PUFAS Y LC-PUFAS ......................................................................... 14
Dieta ........................................................................................................................ 15
Movilizacin de reservas maternas ......................................................................... 16
Sntesis de novo de LC-PUFAS ............................................................................... 16
EXPRESION GENICA DE LAS ENZIMAS QUE SINTETIZAN LC-PUFAS ............... 19
FACTORES QUE REGULAN LA EXPRESION GENICA DE LAS DESATURASAS Y
ELONGASAS ............................................................................................................ 20
Factores dietarios ..................................................................................................... 21
Gnico (Polimorfismos) ............................................................................................ 24
Hormonal .................................................................................................................. 25
ANTECEDENTES ..................................................................................................... 26
Participacin de la glndula mamaria en la sntesis de LC-PUFAS ......................... 27
JUSTIFICACIN ....................................................................................................... 30
PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA ....................................................................... 31
OBJETIVO GENERAL Y ESPECIFICOS .................................................................. 32
HIPOTESIS ............................................................................................................... 33
METODOLOGA ........................................................................................................ 34
DIAGRAMA EXPERIMENTAL ................................................................................... 35
DESARROLLO EXPERIMENTAL ............................................................................. 36
Obtencin de muestras de leche .............................................................................. 36
Separacin de los glbulos de grasa y extraccin de ARN ...................................... 37
Cuantificacin del ARN total ..................................................................................... 38
Electroforesis en gel de agarosa ............................................................................. 38
Sntesis de cDNA y PCR punto final ........................................................................ 39
PCR en tiempo real .................................................................................................... 40
Anlisis de composicin de los cidos grasos de la leche materna ......................... 42
Extraccin de lpidos de leche humana ......................................................... 42
Metilacin de cidos grasos (cido-bsica) ................................................... 43
Anlisis estadstico ................................................................................................... 44
RESULTADOS ........................................................................................................... 45
Caractersticas demogrficas de los sujetos de estudio ........................................... 45
Cuantificacin y pureza del ARN total ...................................................................... 46
Integridad del ARN ................................................................................................... 47
Amplificacin por PCR punto final ............................................................................ 48
Anlisis cuantitativo de la expresin gnica por PCR en tiempo real ....................... 50
Expresin gnica de la desaturasa 5 ....................................................... 50
Expresin gnica de la desaturasa ........................................................ 52
Expresin gnica de la elongasa 5 (Elovl-5) .............................................. 53
Anlisis de composicin de cidos grasos ............................................................... 54
cidos grasos poli-insaturados .................................................................... 54
Asociacin entre la expresin gnica y la composicin de LC-PUFAS en la leche .. 56
cidos grasos mono-insaturados ................................................................ 58
cidos grasos saturados ............................................................................. 59
Expresin gnica de -lactoalbmina (-LA) y casena 3 (CAS-3) ............. 61
DISCUSIN ............................................................................................................... 63
CONCLUSIN ........................................................................................................... 69
PERSPECTIVAS ........................................................................................................ 70
BIBLIOGRAFIA .......................................................................................................... 71
1
INTRODUCCIN
IMPORTANCIA DE LA LACTANCIA MATERNA
La lactancia materna es un proceso fisiolgico en el cual la madre, a travs de la
leche, le provee al recin nacido los nutrientes, los factores de crecimiento y
componentes inmunolgicos necesarios para un adecuado crecimiento y desarrollo
durante el primer ao de vida. Otras ventajas de la lactancia materna incluyen la
reduccin de la incidencia y la severidad de infecciones, disminucin de la tasa de
retinopata grave y la prevencin de alergias (Leung A y cols., 2005).
Algunos reportes sugieren que los grupos de infantes alimentados al seno materno
tienen mejores resultados en pruebas psicomtricas que los infantes que son
alimentados con frmula lctea (Innis SM y cols., 1997). Por otro lado, estudios con
nios nacidos a trmino indican que los niveles de ADH en la corteza cerebral son
ms altos cuando son alimentados con leche materna, en comparacin con los
alimentados con frmula lctea, lo cual, puede estar relacionado a cantidades
elevadas de este cido graso en la leche humana (Farquharson J y cols., 1992).
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Leung%20AK%22%5BAuthor%5Dhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Farquharson%20J%22%5BAuthor%5D
2
ANATOMA DE LA GLNDULA MAMARIA
La glndula mamaria tiene como funcin principal la produccin y secrecin de
leche durante la lactancia y esta glndula mamaria est formada por tejido glandular,
conjuntivo, adiposo y estroma. El tejido conjuntivo permite mantener agrupados los
diferentes lbulos en una estructura glandular, mientras que el tejido adiposo se
dispone entre los distintos lbulos. El tejido glandular secretor est formado por 15-
20 lbulos que se disponen radialmente hacia el pezn. El estroma vascular provee
de los nutrientes necesarios presentes en la circulacin al tejido glandular para la
sntesis de la leche ((Fig. 1) (Gonzlez., 2006, Lawrence y Lawrence., 2007).
Fig. 1. Estructura anatmica de la glndula mamaria humana (Lawrence y Lawrence., 2007).
3
Cada lbulo est formado por una serie de lobulillos (entre 20 y 40); a su vez cada
lobulillo est constituido por numerosos alvolos (Gonzlez., 2006). Los alvolos son
unidades que corresponden a pequeas vesculas o sacos formados por una lmina
simple de clulas epiteliales secretoras, en disposicin cbica o columnar, que
rodean la luz alveolar, en la cual se va recolectando la leche formada (Fig. 2).
Fig 2. Corte transversal de un alvolo maduro o galactforo (Pocock y col; 2005).
Las clulas epiteliales tambin llamadas lactocitos son las que sintetizan y secretan
los componentes de la leche; y muestran todas las caractersticas clsicas de las
clulas secretoras, ya que poseen microvellosidades en las superficies luminales y
su citoplasma es rico en mitocondrias, en membranas de Golgi, retculo
endoplsmico rugoso, grnulos de secrecin y en gotas de lpidos (Pocock y col.,
2005). La divisin y diferenciacin de estas clulas tienen lugar durante el tercer
4
trimestre de la gestacin. Los alvolos estn rodeados por clulas mioepiteliales
formando una red laxa con numerosas ramificaciones cuya configuracin es
estrellada y que al contraerse, en respuesta a la oxitocina, expulsan la leche hacia
los conductos galactforos para que salga por el pezn durante la succin (Lawrence
y Lawrence., 2007).
FISIOLOGA DE LA GLNDULA MAMARIA
Desde el punto de vista funcional, el desarrollo de la glndula mamaria pasa por
cuatro perodos que son: el mamotrfico, durante el cual se llevan a cabo los
cambios estructurales de la glndula mamaria. El lactognico, que corresponde a la
reorganizacin estructural y fisiolgica que da lugar a la produccin de leche. El
lactopoytico, que corresponde al mantenimiento de la produccin de leche.
Finalmente, en el climaterio, se inicia el perodo de la involucin de la mayor parte de
las estructuras glandulares y de otros tejidos de la glndula mamaria (Arrieta y
Cravioto, 1985).
Perodo Mamotrfico
La glndula mamaria evoluciona a lo largo de tres periodos: embriognico, puberal-
adulto y gestacional. En el primero, la glndula no es ms que una excrescencia de
la piel y slo aparecen pequeas arborizaciones o conductos primitivos que se
propagan dentro del tejido subyacente.
5
Durante la infancia, estos conductos van desarrollndose, aunque el proceso queda
inhibido por la presencia de la testosterona. Ya en la pubertad o madurez sexual se
produce una rpida extensin de los conductos por accin de los estrgenos
ovricos (Cordova, 2003). Durante la pubertad y la vida adulta, la mamognesis se
presenta de forma cclica en las dos fases del ciclo menstrual: folicular y ltea.
Durante la primera, se incrementan las concentraciones de estrgenos produciendo
pigmentacin de la areola, aumento en el depsito de los tejidos adiposo y
conjuntivo, as como, incremento ductal. En la fase lutenica, se incrementa la
concentracin de progesterona, promoviendo el crecimiento lbulo-alveolar. La
accin de los estrgenos y la progesterona la accin sinrgica de otras hormonas
como la prolactina, hormona del crecimiento, insulina, cortisol y tiroxina. Las dos
fases de la mamognesis puberal preparan, durante cada ciclo a la glndula
mamaria para la gestacin (Cordova, 2003).
Perodo lactognico
Durante el embarazo tiene lugar el crecimiento de las glndulas mamarias y la
maduracin funcional de las clulas secretoras de los alvolos. En este proceso
intervienen la progesterona, los estrgenos, la prolactina y el lactgeno placentario,
entre otros. La placenta tiene un papel importante en el inicio del periodo lactognico
ya que produce progesterona que se incrementa a lo largo del embarazo, dando
como resultado el aumento en la proliferacin y la maduracin de los alvolos y de
las clulas secretoras del tejido mamario (Lawrence y Lawrence; 2007).
6
Adems, los estrgenos tambin producidos por la placenta y la estimulacin del
pezn incrementan los valores plasmticos de prolactina, la cual es fundamental en
el proceso de la lactognesis, ya que incrementa el crecimiento y la maduracin de
los alvolos. Tambin regula la sntesis de protenas, de lactosa y el metabolismo de
los lpidos de la leche. Al trmino del parto y despus de la expulsin de la placenta,
la produccin de estrgenos y progesterona disminuye rpidamente, mientras que se
mantiene la produccin de prolactina (Lawrence y Lawrence; 2007). Otra hormona
que tiene un papel importante en la lactognesis es el lactgeno placentario
humano (HPL) ya que tiene accin mamotrfica y lactognica. Adems, el HPL
estimula el desarrollo fetal y ejerce otros efectos metablicos importantes que se
relacionan principalmente con el ajuste de los niveles maternos de ciertos
metabolitos, moviliza las grasas y las hace disponibles como fuente de energa, lo
que disminuye el consumo de glucosa por parte de la madre y aumenta su
disponibilidad para el feto. (Guillot, 2003).
Perodo lactopoytico
En este periodo la secrecin lctea se mantiene mediante un mecanismo
neurohormonal en el que intervienen fundamentalmente la prolactina y la oxitocina.
(Fig 3). Durante los primeros 5-7 das despus del parto, la concentracin de
prolactina disminuye incluso en niveles inferiores a los existentes durante el
embarazo (Gonzlez, 2006). Su produccin se mantiene por el estmulo local que se
produce con la succin del pezn, que por va nerviosa origina la disminucin de
7
dopamina, y con ello se incrementa temporalmente la liberacin de prolactina y,
quiz tambin, por estmulo de la TRH. La oxitocina producida en el lbulo posterior
de la hipfisis, tiene un papel importante en la lactancia, esta acta sobre las clulas
mioepiteliales, cuya contraccin es responsable del vaciamiento de los alvolos y de
los pequeos conductos (Gonzlez, 2006). La liberacin de la oxitocina hipofisaria se
produce por un reflejo que se inicia en la mama, fundamentalmente por el estmulo
que produce la succin en el pezn, pero el reflejo puede ponerse en marcha por el
llanto del lactante y puede ser inhibido por alteraciones emocionales o estrs
(Gonzlez, 2006).
Estos procesos fisiolgicos, regulados por hormonas, que ocurren durante el
embarazo y lactancia son mecanismos de adaptacin para preparar al organismo
materno a procesos metablicos de alta demanda, en los cuales tiene que
proporcionarle al recin nacido los nutrimentos necesarios para su crecimiento y
desarrollo a travs de la leche materna.
8
Fig. 3. Etapas fisiolgicas para la secrecin de leche. 1) En el momento que el recin nacido succiona
el pezn, los receptores sensoriales envan la informacin al cerebro indicando que es necesario
producir leche. 2) En el hipotlamo, la glndula hipfisis segrega prolactina y oxitocina, ests
hormonas viajan por el torrente sanguneo hasta llegar a las glndulas mamarias. 3) Posteriormente,
la prolactina llega a los alvolos y estimula las clulas secretoras responsables de producir leche
(clulas epiteliales). 4) Finalmente, la oxitocina, al contraer a las clulas mioepiteliales que rodean a
las clulas epiteliales, provocan la liberacin de la leche, la cual viaja a travs de los conductos hasta
los senos galactforos. Los senos galactforos que almacenan la leche se vacan por la succin del
recin nacido. La produccin lctea est determinada por la frecuencia de la succin y el vaciado.
(Modificada de: www.pediatriaaldia.com).
9
COMPOSICIN DE LA LECHE HUMANA
En general, la leche humana es una solucin acuosa de hidratos de carbono, lpidos,
protenas, lactosa, minerales y vitaminas hidrosolubles. La proporcin de estos
componentes cambia durante la lactancia, tenindose como resultado tres diferentes
tipos de leche: calostro, leche de transicin y leche madura. (Lawrence y Lawrence;
2007)
Tabla 1. Composicin de la leche humana
Componente Calostro Transicin Madura
g/100mL
Hidratos de carbono (Lactosa) *Lpidos
Protenas (casena)
(Alfa-lactoalbmina)
5.3 2.9 4.1 1.6 1.1
6.6 3.6 1.6 0.5 0.4
7.0 3.8 0.9
0.25 0.26
mg/100mL
Calcio Fsforo Potasio Sodio Hierro
39 14 74 48 70
40 18 64 29 40
31 15 53 16 80
g/100mL 1 - mg/100mL2
Vitamina A1
Vitamina C2
Caloras (Kcal)
151 5.9
64.5
88 5.5
65.2
54 4.4
65.8
Modificada de Casanueva; 2009 y *Pombo; 1992.
10
Calostro
El calostro es la leche que se produce entre el da 5 al 7 postparto, su volumen vara
entre 2-20mL/da, tiene un contenido ms elevado de protenas incluyendo
inmunoglobulina A (IgA) y lactoferrina. Adems, contiene oligosacridos complejos
como la lacto-N-tetraosa, lacto-N-fucopentaosa monofucosilada I y II (Aranceta,
2005) diversos minerales como sodio, zinc, hierro, manganeso y potasio, menor
contenido en hidratos de carbono y lpidos (como colesterol).
Leche de Transicin
La leche de transicin est presente entre el 8 y el 14 da postparto. Este tipo de
leche contiene menor cantidad de protenas y vitaminas que el calostro, sin
embargo, el contenido de lactosa y lpidos (principalmente triacilgliceroles) es mayor
que la del calostro (Hernndez, 2010).
Leche Madura
La leche madura se produce desde el 15 da hasta el final de la lactancia, tiene
mayor porcentaje de lpidos (triacilgliceroles y colesterol) e hidratos de carbono en
comparacin con el calostro (Hernndez, 2010). La proporcin protenas
totales/casena del suero es de 60/40 e incluso 50/50 en la lactancia prolongada
(Majem y cols., 2006).
La composicin de la leche materna contiene los nutrimentos necesarios para el
crecimiento del recin nacido; entre stos los lpidos son componentes importantes
para que se lleve a cabo dicho proceso.
11
Composicin de los lpidos de la leche
Los lpidos presentes en la leche materna representan una importante fuente de
nerga para el recin nacido y aportan aproximadamente el 50% de las caloras.
Adems, son indispensables para el crecimiento y desarrollo del neonato,
especialmente durante el primer ao de vida. Los principales compuestos lipdicos de
la leche humana estn en forma de triacilgliceroles (98%), diacilgliceroles,
monoacilgliceroles, glicolipidos, esteroles, fosfolpidos y fracciones lipdicas de las
vitaminas A, D y K. (Fernndez y cols., 2008), (Aguilar, 2005). Los cidos grasos son
cidos carboxlicos con cadenas hidrocarbonadas (de 4 a 24 tomos de carbono) no
ramificadas (Koolman y cols; 2005). Dependiendo de su grado de saturacin, los
cidos grasos se clasifican: saturados, mono-insaturados y poli-insaturados, estos
ltimos conocidos como PUFAs por sus siglas en ingls (PolyUnsaturated Fatty
Acids). Con base en la posicin del primer doble enlace o instauracin (contando
desde el extremo metilo al grupo funcional carboxlico), los PUFAs pueden
clasificarse en las tres principales series: cidos grasos omega ()-9 (primer doble
enlace en el carbono 9), cidos grasos -6 (primer doble enlace en el carbono 6) y
cidos grasos -3 (primer doble enlace en el carbono 3; (Fig 4).
12
Fig. 4. Estructura qumica de los cidos grasos; omega 9 (cido oleico), -6 (cido linoleico; AL) y
-3 (cido alfa linolnico; -ALN).
Los cidos grasos omega-9 no son indispensables, ya que los mamferos pueden
introducir una insaturacin a un cido graso saturado en el carbono 9 y por lo tanto
se pueden sintetizar a partir de sus precursores. No ocurre lo mismo con los cidos
grasos -6 y -3, ya que los mamferos no pueden introducir insaturaciones en los
carbonos 6 y 3. De esta forma, los cidos grasos como el cido linoleico (C18:2,
omega-6, AL) y el cido alfa linolnico (C18:3, -3, -ALN) son indispensables.
13
stos son precursores de PUFAs de cadena larga (LC-PUFAs; del idioma ingls) -
PUFAs como el cido araquidnico (AA), el cido eicosapentaenoico (AEP) y el cido
docosahexaenoico (ADH). Debido a esto, se requiere obtenerlos con la dieta en
proporciones bien determinadas (Valenzuela y cols; 2003), ya que su carencia o
desequilibrio en la ingesta est asociada a procesos inflamatorios diversos y al
desarrollo precario de neuronas en pacientes con depresin (Herrera y cols., 2006).
Importancia de los cidos grasos poli-insaturados en el lactante
Los LC-PUFAs como el AA y el ADH ejercen sus funciones metablicas formando
parte de la estructura de los fosfolpidos de las membranas celulares, particularmente
de la fosfatidilcolina, la fosfatidiletanolamina y la fosfatidilserina. Por su alto grado de
poliinsaturacin, estos cidos grasos le aportan gran fluidez a las membranas. Esta
fluidez es esencial para que las protenas de la membrana (canales inicos,
receptores, uniones comunicantes, receptores catalticos, enzimas, estructuras
formadoras de vesculas, etc) puedan tener la movilidad que requieren sus funciones,
ya sea en la superficie de las membranas o en el interior de la bicapa lipdica
(Valenzuela y cols; 2003). Adems, la fluidez de las membranas es particularmente
importante en la funcin del sistema nervioso, especialmente del cerebro.
Las etapas ms crticas en la formacin de la estructura del encfalo ocurren durante
el ltimo trimestre gestacional en el humano y continan hasta los dos aos despus
del nacimiento. Estos procesos morfognicos, que se inician en la cresta neural, se
caracterizan por sucesivas etapas de neurognesis, migracin neuronal, apoptosis
selectiva, sinaptognesis y mielinizacin, etapas que en forma relativamente
14
secuencial dan forma y funcionalidad al tejido cerebral. Y los procesos celulares
requieren, a su vez, de la participacin activa de las clulas gliales, especficamente
de los astrocitos, quienes proveen a las neuronas de los metabolitos y del soporte
fsico que requiere su movilizacin dentro del encfalo. Esta morfognesis,
ntimamente asociada a la funcin del cerebro, requiere de un extraordinario aporte
de LC-PUFAs, particularmente de AA y de ADH (Valenzuela y cols., 2003). Por otra
parte, la retina est formada por miles de clulas fotorreceptoras, que contienen
cantidad elevada de ADH que desempean un papel importante para el envo de las
seales en las transmisiones nerviosas correspondientes a los estmulos luminosos.
Adems, la concentracin de ADH, tanto en el cerebro como en la retina, aumenta
durante el tercer trimestre de la vida y durante la infancia temprana, cuando estos
tejidos experimentan un perodo de mayor crecimiento (Aranceta y cols., 2005).
Durante la etapa gestacional e incluso despus del nacimiento, el aporte de LC-
PUFAs es realizado por la madre, ya que si bien el feto y el recin nacido tienen la
capacidad para formar LC-PUFAs a partir de los precursores AL y -ALN, sta es
muy limitada y no es suficiente para proveer la cantidad de LC-PUFAs requerida
(Valenzuela y cols., 2003), debido a que la actividad biosinttica del hgado fetal es
muy incipiente por la inmadurez fisiolgica de este rgano, por lo que a menor edad
gestacional su capacidad es menor. Se desconoce si la placenta humana tiene la
capacidad para sintetizar LC-PUFAs, sin embargo, es selectivamente permeable a
estos cidos grasos.
15
Fuentes de PUFAs y LC-PUFAs
Este tipo de cidos grasos en la leche materna pueden tener su origen de la dieta, de
los cidos grasos liberados por la movilizacin del tejido adiposo materno o de la
sntesis de novo en el hgado y en la glndula mamaria a partir de los precursores
provenientes de la dieta (Fig 5; Rodrguez y cols; 2006; Sheila, 2007).
Fig 5. Fuentes de los PUFAs y LC-PUFAs presentes en la leche.
Dieta: PUFAs Sntesis endgena: hgado
LC-PUFAS PUFAs
LC-PUFAs
PUFAs
LC-PUFAs
Glndula mamaria Movilizacin del
tejido adiposo
16
Dieta
La composicin de los cidos grasos de la leche materna se modifica con la dieta
materna, de tal modo que la composicin de la grasa ingerida se refleja en la grasa
lctea. Tanto la dieta previa al embarazo, que determina la composicin de los
cidos grasos del tejido adiposo acumulado durante este periodo, como la dieta
durante la lactancia, son los principales determinantes de la composicin de cidos
grasos que forman parte de los triacilgliceroles de la leche (Macias y cols., 2006).
Una dieta rica en PUFAs determina mayor contenido de stos en la leche, mientras
que una dieta con predominio de hidratos de carbono sobre lpidos determinar la
sntesis de novo de cidos grasos saturados y monoinsaturados en la glndula, con
mayor concentracin de cidos grasos saturados de cadena media (Macias y cols.,
2006). El AL y -ALN estn presentes principalmente en los aceites de semillas. Los
LC-PUFAs como el AA se encuentra en la yema de huevo y la carne magra, mientras
que el ADH se encuentra principalmente en pescados grasos.
El contenido de estos cidos grasos en la leche depende de la disponibilidad en los
tejidos maternos, por lo tanto, en mujeres gestantes y durante la lactancia se
recomienda la ingestin de al menos 200-300 mg/da de ADH que se consiguen con
dos raciones de pescado (45 gramos cada uno) a la semana (Campos y cols., 2010).
17
Movilizacin de reservas maternas
Si durante la lactancia el consumo de PUFAs es bajo, las reservas corporales
pueden ser usadas como un suplemento adicional para satisfacer los requerimientos
fisiolgicos de la madre y el feto. Cantidades considerables de AL se almacenan en
el tejido adiposo y son fciles de movilizar, sin embargo, el tejido adiposo contiene
bajas cantidades de AEP y ADH (Arterburn y cols., 2006), lo cual sugiere una
capacidad limitada para almacenar estos LC-PUFAs y la necesidad de ser
suplementados a travs de la dieta o sintetizarlos a partir de sus precursores.
Aunque, se ha observado que en adipocitos humanos aislados e incubados con
agentes lipolticos los cidos grasos AEP y ADH se movilizan preferentemente en
comparacin con otros cidos grasos. (Zhou y cols., 2001).
Sntesis de novo de LC-PUFAS
Las enzimas microsomales delta 5 y 6 desaturasas (5D y 6D) forman parte de un
complejo enzimtico, el cual incluye a la citocromo NADH b5 reductasa, citocromo b5
y la desaturasa respectiva (6D o 5D) (Hyekyung y cols., 1999a). Estas enzimas se
encuentran en la cara citoslica de la membrana del retculo endoplsmico de los
hepatocitos, su funcin es introducir dobles enlaces en las molculas de cidos
grasos de cadena larga esterificados con la coenzima A (acil-CoA) mediante una
reaccin de xido-reduccin. Mientras que el proceso de elongacin es catalizado
por las elongasas 5 y 2 (Elovl-5 y Elovl-2), empleando malonil-CoA como donador de
grupos acetilos y NADPH como agente reductor.
18
Los sustratos de Elovl-2 incluyen a los LC-PUFAs de 20 y 22 carbonos, mientras que
la Elovl-5 puede usar una serie ms amplia de sustratos, de 16 a 22 carbonos
(Wang y cols., 2005). Dentro del hgado, el AL y el -ALN son elongados y
desaturados para formar los LC-PUFAs (Anderson y cols., 2009). La biosntesis de
LC-PUFAs se lleva a cabo en los microsomas del retculo endoplsmico de los
hepatocitos. El primer paso en la biosntesis de los LC-PUFAs es la formacin de un
doble enlace cis entre los carbonos 6 y 7 del C18:3-3 (-ALN) y C18:2-6 (AL)
provenientes de la dieta, para producir el C18:4-3 y C18:3-3, respectivamente.
Esta reaccin es catalizada por la enzima 6 desaturasa. El siguiente paso,
catalizado por la elongasa 5 es la adicin de un par de carbonos empleando malonil-
CoA como donador del grupo acetilo y NADPH como agente reductor, para formar el
C20:3-6 y C20:4-3. Posteriormente, la 5 desaturasa forma un doble enlace en
los cidos grasos C20:3-6 y C20:4-3 para formar C20:4 -6 (AA) y C20:5-3
(AEP) respectivamente. A continuacin, el AEP es elongado a travs de las
elongasas 2 y 5 para formar C22:5-3, el cual es elongado (Elovl-2) y desaturado
(6D) para formar 24:6-3. Finalmente, este cido graso intermediario es ingresado
al peroxisoma y mediante -oxidacin limitada, se remueven dos tomos de carbono
para formar el ADH (C22:6-3), proceso conocido como retro-conversin (Bradbury,
2011; Fig 6).
19
Fig 6. Vas metablicas para la sntesis de novo de LC-PUFAs en hgado. cido alfa linolnico (-
ALN), cido eicosapentaenoico (AEP), cido docosahexaenoico (ADH), cido linoleico (AL), cido
araquidnico (AA). (Qin y cols., 2009).
20
EXPRESIN GNICA DE LAS ENZIMAS QUE SINTETIZAN LC-PUFAS
En el humano, los genes que codifican para las enzimas 5D y 6D se localizan en
el cromosoma 11 en la regin 11q12-q13.1, con orientacin cabeza-cabeza en el
promotor. Cada uno de los genes contienen 12 exones y 11 intrones (Xie y cols.,
2008). Por otro lado, los genes que codifican para las enzimas Elovl-2 y Elovl-5 se
localizan en el cromosoma 6 en las regiones 6p24.2 y 6p21.1-p12.1 respectivamente.
Cada gen contiene 8 exones y 7 intrones (www.ensembl.org). Es sabido que tanto el
ARNm de la 5D como de la 6D se expresan en varios tejidos de roedores y del
humano, incluyendo msculo esqueltico, pulmn, placenta, rin, corazn, glndula
adrenal, tejido adiposo blanco, cerebro, glndula mamaria y pncreas, entre otros,
sin embargo, se ha demostrado que se expresan de forma ms abundante en
hgado, cerebro, corazn (Hyekyung y cols., 1999b) y glndula mamaria lactante
(Rodrguez y cols., 2006).
Los genes de las elongasas se han identificado en el genoma humano, de rata y
ratn. A la fecha se han identificado siete subtipos de elongasas de cidos grasos
(Elovl 1-7;(Jakobsson y cols., 2006; Jump., 2009). De los cuales se ha demostrado
que los ARNm de Elovl-2 y Elovl-5 se expresan en testculo, glndula adrenal,
hgado, cerebro, tejido adiposo, cerebro, rin (Tvrdik y cols., 2000) y glndula
mamaria lactante. (Rodrguez y cols, 2011).
21
FACTORES QUE REGULAN LA EXPRESIN GNICA DE LAS DESATURASAS Y
ELONGASAS
La expresin gnica de las enzimas que sintetizan LC-PUFAs es regulada por
diversos factores, dentro de estos se encuentran los dietticos, genticos y
hormonales (Fig 7).
Fig 7. Factores asociados a la regulacin de la expresin gnica de las enzimas que sintetizan los LC-
PUFAs.
Polimorfismos
(Desaturasas y elongasas)
Insulina
Prolactina
PUFAS
LC-PUFAs
Factores de transcripcin
(SREBP y PPAR-a)
Polimorfismos
(Desaturasas y elongasas)
Insulina
Prolactina
PUFAS
LC-PUFAs
Factores de transcripcin
(SREBP y PPAR-a)
22
Factores dietarios
La actividad enzimtica, tanto de las desaturasas (5 y 6) como de las elongasas
(Elovl-2 y Elovl-5), es altamente dependiente de la composicin de los lpidos de la
dieta. Uno de los mecanismos de inhibicin de estas enzimas es por medio de
retroalimentacin negativa debido al exceso de los productos finales LC-PUFAs, ya
que estos pueden actuar, directa o indirectamente, como reguladores de la
homeostasis lipdica mediante su interaccin con factores de transcripcin (Matais y
cols., 2004). En estudios previos se ha observado que estos cidos grasos pueden
actuar como supresores de las protenas de unin a elementos de respuesta a
esteroles (SREBP), particularmente SREBP-1c y como inductor de los receptores
activados por proliferadores de los peroxisomas (PPAR) (Harnack y cols., 2009).
La familia de SREBPs presenta 3 isoformas (SREBP-1a, SREBP-1c y SREBP-2). La
protena SREBP-1a activa genes que regulan la sntesis de colesterol, cidos grasos y
triacilgliceroles, mientras que SREBP-1c induce genes asociados a la sntesis de
cidos grasos y finalmente SREBP-2 activa genes implicados en la sntesis del
colesterol (Horton y cols., 2002). SREBP-1a y SREBP-2 son regulados mediante
retroalimentacin negativa por el colesterol (Chatterje y cols., 2009), mientras que en el
hgado SREBP-1c es regulado, en el nivel transcripcional por la ingestin de hidratos
de carbono, insulina y glucosa (Matsumoto y cols., 2010). Adems, tanto SREBP-1a
como SREBP-1c son suprimidos por niveles elevados de LC-PUFAs (Takeuchi y cols.,
2010).
23
Se han propuesto diversos mecanismos por los cuales los LC-PUFAs regulan la
lipognesis a travs de SREBP-1; 1) los LC-PUFAs reducen la forma nuclear activa
de SREBP-1, 2) los LC-PUFAs disminuyen la estabilidad del ARN mensajero de
SREBP-1, y 3) los LC-PUFAs suprimen la expresin del ARNm de SREBP-1. Por lo
cual, dietas con alto contenido en LC-PUFAs favorecern la disminucin de SREBP-
1 y, como consecuencia, disminuirn la lipognesis (Rodrguez y cols., 2005).
Diversos estudios han demostrado que la expresin gnica de la 5D y 6D se
induce en ratones transgnicos que sobre
expresan el ARNm de SREBP-1c. Esto se debe a que la regin promotora del gen
6D contiene un elemento de respuesta para SREBP-1c (Nara y cols., 2002).
Adems, existen algunos estudios, incluyendo el realizado por nuestro grupo, que
muestran el efecto positivo del ARNm de SREBP-1c sobre la expresin gnica de las
desaturasas en el hgado y en la glndula mamaria lactante. Aunado a esto,
Matsuzaka y colaboradores, reportaron que en el hgado, tanto la expresin como la
actividad enzimtica de la 5D y 6D son inducidas por dietas bajas tanto en PUFAs
como LC-PUFAs y reprimida por dietas con alto contenido en estos cidos grasos
(Matsuzaka y cols., 2002). Un ejemplo de esto es la supresin del los ARNm de
Elovl-5, 5D y 6D en el hgado de ratas alimentadas con una dieta a base de aceite
de pescado. Sin embargo, no se encontr efecto cuando los animales fueron
alimentadas con aceite de oliva (Qin y cols., 2009). Los cambios en la expresin de
estos genes responden a cambios en la composicin de los PUFAs de la dieta y de
los requerimientos de stos por los tejidos (Wang y cols. 2005).
24
Por otra parte, los PPARs presentan 3 isoformas (, y ) y se activan por
concentraciones micromolares de LC-PUFAs, por eicosanoides derivados del cido
araquidnico y tambin por medicamentos hipolipemiantes, como los fibratos y por
proliferadores de peroxisomas (Kliewer y cols., 1997). PPAR- induce genes
involucrados en la oxidacin de cidos grasos de la mitocondria y de los
peroxisomas. PPAR- activa genes implicados en la regulacin del metabolismo y la
inflamacin (Pollock y cols., 2011), mientras que PPAR- induce la activacin de
genes asociados a la diferenciacin de adipocitos y metabolismo de la glucosa
(Jurkowski y cols., 2011, Schmidt y cols., 2010). Clark y colaboradores han reportado
que los LC-PUFAs -3 son ms potentes que los LC-PUFAs -6 como activadores
de PPARs in vivo (Clark y cols., 2000). Sin embargo, los metabolitos de los LC-
PUFAs como son los eicosanoides o cidos grasos oxidados tienen mayor afinidad
por PPAR- y por lo tanto, son activadores transcripcionales ms potentes de los
genes dependientes de PPAR-, entre los cuales se encuentran 5D y 6D.
Estudios previos, realizados en un modelo murino con una dieta deficiente en lpidos,
muestran que PPAR- es necesario para la induccin de la expresin de la 5D y
6D (Li y cols., 2005). Estos resultados son consistentes con datos que muestran
que el promotor de la 6D tiene elementos de respuesta para PPAR- (PPRE)
(Nakamura y cols., 2002).
25
Factores Genticos
Polimorfismos
Los polimorfismos genticos son variantes del genoma que aparecen por mutaciones
en algunos individuos, se transmiten a la descendencia y adquieren cierta frecuencia
en la poblacin tras mltiples generaciones. Se ha estimado que hay una variante en
cada 1000 pares de bases de los 3000 millones que configuran el genoma humano
(Iniesta y cols., 2005). Debido a esto es muy factible encontrar variantes en todos los
genes, incluyendo los genes que codifican para las enzimas involucradas en la
sntesis de LC-PUFAS. Algunos estudios han reportado polimorfismos en las
desaturasas 5 y 6, en donde la presencia de estos polimorfismos se asocia
indirectamente con la concentracin de LC-PUFAs en los fosfolpidos del suero o
plasma, en fosfolpidos de la membrana de eritrocitos y adipocitos (Puigmarti., 2010).
De manera que polimorfismos de un solo nucletido (SNP) en los genes 5D y 6D
contribuyen a la variabilidad del AA en los fosfolpidos del plasma y en los lpidos
totales en eritrocitos (Xie y cols., 2008). Aunado a esto, Morales y colaboradores
observaron que diversas variantes allicas en los genes 5D, 6D, Elovl-2 y Elovl-5
estn asociados con la concentracin de LC-PUFAs en el calostro de mujeres
espaolas; en donde la presencia de las variantes allicas rs174537-T, rs174570-T,
rs2072114-G, rs174602-G, rs526126-G, rs174626-C, rs174464-T y rs174468-G de
los genes de la 5D y 6D estn asociados con bajos niveles de AA. Mientras que
rs174602-G y 174464-T en estos mismos genes se asociaron con niveles bajos de
ADH. Con respecto a las elongasas, las variantes rs953413-A y rs3798719-T en el
26
gen Elovl-2 se asociaron con niveles elevados de AEP. Por lo contrario, ninguno de
los SNPs identificados en el gen Elovl-5 se asoci con los niveles altos de AA, AEP o
ADH, aunque se observ una tendencia entre la presencia del polimorfismo
rs12207094 y los niveles de AEP (Morales y cols., 2011).
Factores Hormonales
De los factores hormonales, se conoce que la insulina tiene un papel importante en el
control de la lipognesis. Diversos estudios han demostrado que esta hormona
promueve la expresin de la 5D y 6D a travs de la induccin de la abundancia de
SREBP-1c (Wang y cols., 2005). De acuerdo con esto, Rimoldi y colaboradores
reportaron que la abundancia del ARNm de 6D en hgado de ratas diabticas fue
menor en comparacin con el grupo control (Rimoldi y cols., 2001). Estos resultados
indican que la actividad de esta desaturasa, en respuesta a la insulina, podra estar
regulada al menos en parte, por eventos post-transcripcionales que requieren la
sntesis de una o varias protenas an desconocidas.
Por otra parte, estudios previos reportan que la actividad de la 5D y 6D puede
tener una funcin importante en la expresin y regulacin del receptor GLUT-4, a
travs de la modulacin en la sntesis de LC-PUFAS y, por tanto, en su
concentracin en diversos tejidos. Esto se debe a que los LC-PUFAs incrementan la
fluidez de la membrana celular y con ello elevan el nmero de receptores de GLUT-4
y su afinidad por la insulina en adipocitos. (Peyron y cols., 2002, Das y cols., 2005).
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Das%20UN%22%5BAuthor%5D
27
Otra hormona que al parecer tambin modula la expresin de las desaturasas es la
prolactina. Esta propuesta est basada en estudios previos realizados en un modelo
murino, en donde ratas que presentan hiperprolactinemia disminuye la concentracin
de AA, as como tambin el ndice de insaturacin, por lo tanto, sugiere que
disminuye la actividad de la -5D y -6D (Bellini y cols., 2007). Apoyando estos
hallazgos, tambin se ha observado que la prolactina estimula la transcripcin de
molculas clave para la sntesis de cidos grasos; tal como SREBP-1c durante el
embarazo (Naylor y cols., 2005).
ANTECEDENTES
Estudios realizados en nuestro pas han mostrado que los niveles de AA en la leche
de mujeres con nutricin deficiente (cuando el aporte de nutrientes no es suficiente
para cubrir las necesidades fisiolgicas del organismo) son similares al mostrado en
mujeres con un estado de nutricin adecuado (aquel que permite un funcionamiento
ptimo de todas las funciones celulares) (Martnez y cols., 2005). Esto sugiere que
durante la lactancia que es un estado fisiolgico de mayor demanda de LC-PUFAs, el
organismo materno promueve diversas adaptaciones metablicas para sintetizar
cantidades adecuadas de estos cidos grasos.
28
Participacin de la glndula mamaria en la sntesis de LC-PUFAs
Estudios previos realizados por nuestro grupo de investigacin en ratas lactantes
alimentadas con una dieta con diferente concentracin de lpidos (2, 5 y 10% de
lpidos totales), demostraron que en el da 12 de lactancia aproximadamente el 35%
del acido linolico (precursor de los LC-PUFAs -6) de la dieta es incorporado a la
glndula mamaria. Es importante sealar que, en este estudio tambin se observ
que la 5D y 6D se expresarn en este tejido y que su expresin est regulada por
los lpidos de la dieta, ya que a mayor concentracin de lpidos de la dieta disminuy
la expresin de SREBP-1 y con ello tambin la expresin de la 5D y 6D en
glndula mamaria. Por lo anterior, el incremento en la concentracin de lpidos en la
dieta es una seal para que el organismo no sintetice ms LC-PUFAs. Por lo
contrario, se observ que cuando la cantidad de PUFAs en la dieta fue baja, se
activan mecanismos adaptativos para sintetizar LC-PUFAs a travs del incremento
en la expresin de SREBP-1 en la glndula mamaria y en el hgado, el cual a su vez
incrementa la expresin de las enzimas 5D y 5D. Al mismo tiempo, hay reduccin
en la expresin de PPAR- heptico, disminuyendo la oxidacin de cidos grasos.
Estos resultados indicarn que la glndula mamaria tiene la capacidad de sintetizar
LC-PUFAs y que esta sntesis puede ser regulada por el contenido de lpidos en la
dieta (Rodrguez y cols., 2006). Adems, nuestro grupo de investigacin observ que
tanto en la glndula mamaria como en el hgado la sntesis endgena de AA, a partir
del AL que proveniente de la dieta es regulada por la concentracin de AL. En el
mismo estudio, la sntesis endgena de AA fue mayor en el grupo de ratas
29
alimentadas con una dieta baja en lpidos en comparacin con el grupo de animales
alimentados con una dieta alta en lpidos. No obstante, la sntesis endgena fue
insuficiente para alcanzar las concentraciones de AA semejantes a las encontradas
en la leche de ratas alimentadas con una dieta adecuada o alta en lpidos. La sntesis
limitada probablemente se explica por la baja cantidad del precursor AL en el grupo
con una dieta baja en lpidos. Sin embargo, se observ mayor incorporacin de AL
en la glndula mamaria de ratas alimentadas con la dieta baja en lpidos, indicando
que cuando la suplementacin de AL de la dieta es limitado, ste deber ser captado
de manera preferencial por el tejido mamario para ser secretado en la leche o
metabolizado para formar AA (Rodrguez y cols., 2009). Estos resultados sugieren
que algunas de las adaptaciones maternas que se generan para compensar
deficiencias en LC-PUFAs en la dieta es a travs de mayor transferencia de los
precursores de LC-PUFAs a la glndula mamaria y su posible incremento en la
sntesis de AA. Los requerimientos de los LC-PUFAS inician desde etapas
tempranas del embarazo y aumentan durante la lactancia, debido a que el consumo
de estos cidos grasos en el recin nacido a travs de la leche est relacionado con
el ptimo desarrollo cerebral fetal y cognoscitivo. Por esto, Rodrguez y
colaboradores (2011) determinaron en qu etapa del embarazo inicia la expresin de
las enzimas involucradas en la sntesis de LC-PUFAs, en los principales tejidos que
aportan estos cidos grasos. Los resultados de este estudio demostraron que la
expresin gnica de la 6D y 5D, as como tambin de la Elovl-5, en la glndula
mamaria es mayor al final del embarazo y al inicio de la lactancia hasta alcanzar
30
valores entre 32 y 67 veces ms, respectivamente, en comparacin a la glndula
mamaria de ratas vrgenes. En contraste, con lo observado, en el hgado, donde la
expresin aument en la segunda mitad del embarazo y la primera de la lactancia,
slo hasta valores mximos de ~2.7 veces ms con respecto al hgado de ratas
vrgenes, para ambas desaturasas. Por otro lado, en el tejido adiposo se observaron
incrementos de la expresin de 5D en los das 14 del embarazo y 5 de lactancia, la
expresin de 6D no vari durante el embarazo y la lactancia. La expresin de Elovl-
2 increment nicamente en el da 5 del embarazo y disminuy gradualmente
durante la lactancia, mientras que la expresin de Elovl-5 fue ms alta durante el
embarazo y la lactancia, en comparacin con el grupo de ratas vrgenes. Cabe
sealar que en el tejido adiposo se expresan estos genes que codifican para las
enzimas involucradas en la sntesis de los LC-PUFAs; sin embargo, su sntesis
pudiera no estar activa, ya que estos cidos grasos se presentan en concentraciones
muy bajas. Estos hallazgos sugieren que el tejido mamario es ms importante que el
hgado y el tejido adiposo con respecto a la expresin de dichas enzimas durante el
embarazo y la lactancia; lo anterior, dio como resultado mayor contenido de AA y
DHA en la glndula mamaria durante la primera mitad de la lactancia (Rodrguez y
cols., 2011). Con base en los resultados anteriores, se propone que la glndula
mamaria y el hgado actan de forma sinrgica en la sntesis de LC-PUFAs durante
el periodo de embarazo y lactancia. Durante estas etapas existe alta demanda
metablica en el organismo materno para proveerle las concentraciones adecuadas
de estos cidos grasos, tanto al feto como al recin nacido.
31
PROBLEMA DE INVESTIGACION
La nutricin materna es de crucial importancia durante el embarazo y la lactancia.
Los nutrimentos indispensables para el feto y el recin nacido incluyen los PUFAs y
LC-PUFAs, los cuales son muy importantes para el desarrollo cerebral fetal y
cognoscitivo del recin nacido; estos cidos grasos los adquiere el feto a travs de la
placenta y el recin nacido por medio de la leche humana. Estudios previos reportan
variabilidad en la concentracin de estos cidos grasos en la leche humana, la cual
puede estar dada por diversos factores que regulan su sntesis (genticos, dietticos
y hormonales). En la actualidad poco se sabe sobre los mecanismos de regulacin
metablica involucrados en la sntesis de estos cidos grasos en la leche humana,
principalmente debido a las limitaciones en la obtencin de tejido mamario. Debido
esto la mayora de las investigaciones se han realizado en modelos murinos. En
estudios recientes se ha demostrado la factibilidad de obtener ARN total de clulas
epiteliales presentes en los glbulos de grasa de la leche materna humana. Esto
genera la posibilidad de realizar estudios encaminados a identificar dichos
mecanismos.
Esta informacin nos plantea la siguiente pregunta de investigacin:
Las clulas epiteliales mamarias participan en la sntesis de cidos grasos poli-
insaturados de cadena larga omega 3 y 6?
32
HIPTESIS
La expresin de las enzimas que participan en la sntesis de LC-PUFAs omega 3 y 6,
en clulas epiteliales mamarias humanas, aumentar en la leche de transicin y
madura con respecto al calostro, lo que se correlacionar con el contenido de LC-
PUFAs presentes en ellas.
33
OBJETIVO GENERAL
Determinar los cambios en la expresin de las enzimas que participan en la sntesis
de cidos grasos omega 3 y 6 en las clulas epiteliales mamarias de la leche
materna y su correlacin con la concentracin de LC-PUFAs en el calostro, la leche
de transicin y en leche madura.
OBJETIVOS ESPECFICOS
Determinar si las clulas epiteliales expresan el transcrito de la 5D, 6D y Elovl-
5 en leche de mujeres.
Identificar el patrn de expresin de la 5D, 6D y Elovl-5 durante la secrecin
de calostro, leche de transicin y leche madura en mujeres.
Identificar la composicin de cidos grasos en el calostro, en la leche de
transicin y en la leche madura en mujeres.
Determinar si existe asociacin entre la expresin de los genes que participan en
la sntesis de cidos grasos omega 3 y 6 con la composicin de stos presentes
en la leche humana.
34
DISEO METODOLGICO
Tipo de estudio: observacional, prospectivo y longitudinal.
Criterios de inclusin
Mujeres primigestas que cursaron embarazo normo evolutivo, a trmino ( 37
semanas de gestacin) con producto nico cuyo peso al nacimiento fue mayor a 2.5
Kg, atendidas en la Unidad de Medicina Familiar No.1 del IMSS. Edades entre 18 y
35 aos, que no consumieron alimentos enriquecidos o suplementos con PUFAs y/o
LC-PUFAs durante el embarazo y que otorgaron su consentimiento informado por
escrito.
Criterios de eliminacin
Se eliminaron del estudio a las mujeres que consumieron alimentos enriquecidos o
suplementos con PUFAs y/o LC-PUFAs durante el estudio, que utilizaron algn
mtodo anticonceptivo hormonal, que desarrollaron alguna enfermedad y aquellas
que decidieron abandonar el estudio.
Tamao de muestra
El tamao de la muestra fue de 6 mujeres por factibilidad, la cual est determinada
por la complejidad de los procedimientos y por el elevado costo de los estudios.
Adems, existen reportes recientes que demuestran que con 6 a 10 mujeres
lactantes es suficiente para observar cambios importantes en el perfil de expresin
de diversos genes en clulas epiteliales presentes en glbulos de grasa de leche
humana (Maningat y cols., 2007).
35
DIAGRAMA EXPERIMENTAL
Toma de muestra de leche (15 mL leche)
Separacin de los glbulos de grasa Centrifugacin a 2680 g/10 min/4C
Extraccin de ARN (Chomczynski)
Extraccin de lpidos totales
(Tcnica de Folch)
1) Cuantificacin del ARN
Integridad del ARN
2) Amplificacin por PCR
punto final
Metilacin de cidos grasos
(cidobsica)
Identificacin y cuantificacin de cidos grasos
(Cromatografa de gases)
Anlisis estadstico
2 mL de leche 13 mL de leche
Cuantificacin del transcrito (PCR tiempo real)
Sntesis de cDNA (Transcriptasa reversa MMLV)
36
DESARROLLO EXPERIMENTAL
1.- Obtencin de muestras de leche.
Reportes previos realizados en mujeres mexicanas lactantes indican que las
muestras de leche colectadas a las 12:00, 20:00 y 24:00 h son las ms
representativas de la produccin de lpidos durante 24h (Stafford y cols., 1994). As
que por factibilidad las muestras de leche que se utilizaron para este estudio se
extrajeron a las 12:00 h. Las muestras fueron colectadas entre el da 5 y 7 post-parto
(calostro), en el da 14 (leche de transicin) y los das 21 y 28 (leche madura) del
mes 1, posteriormente se tom otra muestra en los das 28 del mes 2, 3 y 4. Para
facilitar la extraccin de leche y estimular el reflejo de bajada o de eyeccin lctea, se
debe preparar el pecho a travs de un masaje previo. El masaje se realiz con los
pechos descubiertos, oprimiendo firmemente el pecho hacia la caja torcica
(costillas), usando un movimiento circular con los dedos en un mismo punto, sin
deslizar los dedos sobre la piel. Este movimiento circular se cambi, despus de
unos segundos, hacia otra zona del pecho. Posteriormente, el pecho se frot
cuidadosamente desde la parte superior hacia el pezn, por todo alrededor (Aguayo
y cols, 2001). Una vez que se han reblandecido los lobulillos perifricos, la expresin
areolar que se acaba de describir es til para facilitar un vaciamiento completo de los
conductos colectores de la propia areola, este vaciamiento permite extraer tanto la
leche frontal o inicial como la leche escondida o final. La leche inicial no requiere
succin del recin nacido ya que es liberada por accin de la oxitocina y se
caracteriza por tener un bajo contenido en lpidos, mientras que la leche final
37
requiere una extraccin ms prolongada y se caracteriza por tener un alto contenido
lipdico y calrico (Aguilar y cols, 2005). Posterior al masaje, le leche se colect en
recipientes estriles (sumergidos en hielo) vaciando simultneamente ambos pechos
utilizando una bomba elctrica grado hospitalario. De la leche obtenida de ambos
pechos se tomaron aproximadamente 13 ml para la separacin de glbulos de grasa
para la posterior extraccin del ARN. Adems, se tom una alcuota de 2 ml de leche
para el anlisis de composicin de cidos grasos, el resto de la leche se le entreg a
la madre para la alimentacin del recin nacido.
2. Separacin de los glbulos de grasa y extraccin de ARN
Los 13 ml de leche se centrifugaron a 2680 g durante 10 minutos a 4 C.
Posteriormente la capa de grasa del sobrenadante se transfiri a otro tubo estril y
se realiz la extraccin de ARN (Maningat y cols, 2007). A esta grasa se le agreg 1
mL de Trizol, se mezcl con el vrtex y se dej reposar durante 5 minutos.
Posteriormente se centrifug a 10 000 rpm durante 10 minutos a 4C, una vez
centrifugado se obtuvieron tres fases, de las cuales se tom la fase media y se pas
a otro tubo estril. Seguido de este paso se le agregaron 200 l de cloroformo y se
centrifug a 1000 rpm durante 10 minutos a 4C. Se obtuvieron dos fases: una
acuosa y otra orgnica, la fase acuosa se pas a otro tubo estril y se le agregaron
600 l de isopropanol para precipitar el ARN, se mezcl con el vrtex y se dej a -
72C durante toda la noche. Finalmente la muestra se descongel a temperatura
ambiente y se centrifug a 10 000 rpm durante 10 minutos a 4C, se desech el
38
sobrenadante y al precipitado se agregaron 1 mL de etanol. Despus, se centrifugo a
7500 rpm durante 5 minutos a 4C, se elimin el sobrenadante y se dej secar el
botn durante aproximadamente 5 minutos a temperatura ambiente. El botn de ARN
se resuspendi con aproximadamente 30 L de agua grado biologa molecular
(Chomczynski y cols, 1987).
2. Cuantificacin del ARN total
Para conocer la concentracin del ARN total (ARNt) obtenido, se tom un 1 L de
ARN y se cuantific a una longitud de onda de 260nm y 280nm en el espectrmetro
Nanodrop ND-1000 u. v.vis marca Termo Scientific. Dado que el espectrofotmetro
da valores en nanogramos, se realiz una conversin a g para tener
concentraciones de ARN en esta unidad. La relacin de absorbancia 260/280 indica
la pureza del ARN y se considera que las relaciones en un rango de 1.8- 2.0 son
ptimas.
3. Electroforesis en gel de agarosa
Para determinar la integridad del ARN total extrado, se llev a cabo la tcnica de
electrofresis horizontal en gel de agarosa al 1% teido con bromuro de etidio (10
mg/dL). Esta tcnica se basa en el desplazamiento en este caso del ARN a travs de
una matriz porosa formada por la agarosa polimerizada, donde el tamao del poro
esta determinado por la concentracin de sta en una solucin de sales. Al aplicarse
una corriente elctrica a travs del gel, los cidos nucleicos que poseen una carga
negativa conferida por los grupos fosfato, migran hacia el nodo en condiciones de
pH neutro.
39
El procedimiento de esta tcnica se llev a cabo de la siguiente manera: se mezcl 1
g/L de ARN con 2l de buffer TBE 1X y 2L de solucin de arrastre (azul de
bromofenol-xilencianol y glicerol 40%). La electroforesis se llev a cabo a 90 voltios
durante 60 minutos. Finalmente el ARN se observ en un transiluminador con luz
ultravioleta a 260nm y se tom una fotografa de las muestras de ARN.
4. Sntesis de cDNA y PCR punto final
A partir de 2 g de ARN total se sintetiz el cDNA utilizando la transcriptasa reversa
MMLV. El ARN total se pre-incub con oligo dT y dNTPs (100 mM) a 65C por 5
minutos. Posteriormente el producto se incub con un amortiguador de reaccin (250
mM Tris-HCl, 375 mM KCl, y 15 mM MgCl2) y DTT (0.1 M) a 37C durante 2 minutos.
Finalmente, la sntesis de cDNA se realiz con la transcriptasa reversa MMLV,
ajustando a un volumen final de 20 l con agua grado biologa molecular libre de
ARNasas. La sntesis se realiz a 25C por 10 minutos seguida de una incubacin a
37C durante 50 minutos y finalmente a 70C por 15 minutos (Hernndez y cols;
1994). Para determinar que el cDNA se haya sintetizado de manera adecuada, se
realizo PCR punto final utilizando el gen constitutivo -actina y el producto
amplificado se verific mediante electroforesis en gel de agarosa al 2%.
40
5. PCR en tiempo real
La cuantificacin del ARNm de los genes de estudi se realiz mediante PCR en
tiempo real y se utiliz -actina y ARP como genes de referencia. El cDNA
sintetizado se amplific mediante la enzima ADN polimerasa del kit LightCycler Fast
Start DNA MasterPLUS SYBR Green I (Roche, Indianapolis, IN) utilizando primers
para los genes 6D, 5D, Elovl5, -lactoalbmina y casena-3 (Tabla 2). Los primers
de -lactoalbumina y casena-3 se utilizaron para confirmar que el ARN proviene de
clulas epiteliales, ya que estas protenas se expresan abundantemente slo en este
tipo celular. La reaccin se llev a cabo en el equipo LightCycler 2.0 (Roche
Molecular Biochemicals Mannheim Germany), que mide continuamente la
amplificacin de productos de PCR en cada ciclo, usando primers comunes para
PCR y el fluorocromo SYBR Green que se intercala en el surco menor de las hebras
de doble cadena de DNA, emitiendo fluorescencia. La amplificacin se realiz en un
volumen total de 20 l conteniendo 2 l de cDNA, 40 pmol de cada primer y 4 l de
MasterPLUS SYBR Green que contiene la enzima polimerasa Fast Start,
amortiguador para PCR, SYBR Green y MgCl2 3.5 mM en capilares de borosilicato
de 20 l. Durante la reaccin, la polimerasa se activa y el cDNA se desnaturaliza
pre-incubando a 95C durante 10 minutos. La amplificacin se desarroll durante 35
ciclos a 95C por 10 segundos y un alineamiento 60C por 7 segundos. La
adquisicin de la fluorescencia se realiz al terminar cada ciclo de PCR. Todas las
reacciones se realizaron por triplicado. Para el anlisis de la expresin se determin
el ciclo donde inicia el aumento de la fluorescencia, denominado punto de corte (Cp
41
de crossing point) o ciclo de umbral (Ct de threshold cycle). Se identific el Ct del gen
de normalizacin, y se calcul el valor de Ct en unidades relativas y el resultado
se report como 2 CT, para lo cual se us el software del instrumento LightCycler
(Roche) (Hernndez y cols; 1994).
Tabla 2. Secuencia de oligonucletidos utilizados para la amplificacin de las
regiones gnicas.
*Wang Y y cols, 2006, ** Maningat y col, 2007, ***Diseados con el programa
www.http://Primer3INPUT4.com.mx. Desaturasa 5 (5D), desaturasas 6 (6D), elongasa 5 (Elovl-
5), alfa lactoalbmina -LA), casena-3 (CAS-3) y protena acdica ribosomal (ARP).
Gen Sentido Antisentido Genes de estudio
5D
6D Elovl-5 Genes tejido especifico
-LA CAS-3 Genes de referencia
-actina ARP
5- TTGGCCTGGATGATTACCTT-3 5- ATCCCTTTCTACGGCATCCT-3 5-GTGCACATTCCCTCTTGGTT-3 5-CATAATGTGCCAAGAAGATCCT-3 5-CAACGGTGGACAGTGTAGTCA-3 5-TGGAATCCTGTGGCATCCATG-3 5- GGCACCATTGAAATCCTGAGTGAT-3
5-CTGTGTCACCCACACAAACC-3 5-TAGGCCTCCTGGTCAATCTC-3 5-TGGTCCTTCAGGTCCTCTTT-3
5-GCCACTGTTCCAGCTTCTCAGT-3 5-AGGCAGACAAATGGCTGAAG-3
5-TAAAACGCAGCTCAGTAACAG-3 5-TTGCGGACACCCTCCAGGAAGC-3
42
6. Anlisis de composicin de cidos grasos de la leche materna.
Extraccin de lpidos a partir de leche humana
Las muestras de leche se descongelaron a temperatura ambiente, posteriormente se
incubaron en bao mara a 37 C durante 15-20 minutos y se agitaron en vrtex
hasta homogenizar la muestra. Seguido de este paso se agreg 1 ml de leche a un
tubo cnico de vidrio de 50 ml (este paso se hizo por duplicado), posteriormente se
agregaron 18 mL de la mezcla cloroformo-metanol (2:1) y se mezcl en vrtex
durante 5 minutos. A continuacin se le adicionaron 6 ml de solucin NaCl al 0.7% y
se mezcl nuevamente en vrtex. La muestra se centrifug a 2600 rpm durante 20
minutos a 4C, despus se aspir con vacio la capa superior (fase acuosa y
remanente de protenas que forman un anillo en la interfase). A continuacin se
transfiri una alcuota de 8 mL de la fase de cloroformo (capa inferior) a un tubo
cnico de 15 ml previamente puesto a peso constante. Despus, se evapor el
solvente a sequedad con corriente de gas nitrgeno en una campana de extraccin
(Modificado de Folch y cols, 1956). Finalmente, la cantidad de grasa extrada se
calcul restando al valor del peso del tubo con los lpidos extrados menos el peso
del tubo vacio.
43
Metilacin de cidos grasos (cido-bsica)
El procedimiento que se desarroll en este trabajo consiste bsicamente en una
reaccin de transesterificacin en medio alcalino seguida de una esterificacin por
catlisis cida, al cual denominamos mtodo combinado de metilacin (Kramer y
cols, 1997).
A partir de 0.5 gr de grasa obtenida en el paso anterior, se aadi 0.5 ml de tolueno
seco (5M) y 1ml de una solucin 0.5 N de metxido de sodio disuelto en metanol.
Posteriormente se agregaron 250 l de solucin de cido margrico como estndar
interno en metanol (MetOH) 1mg/ml, se agit durante 30 segundos y se incub en un
mdulo de calentamiento (Pierce) a 55C durante 20 minutos. Terminado el
calentamiento, los viales se enfriaron a temperatura ambiente. Despus de este
paso, se agreg 1ml de una solucin de trifluoruro de boro disuelto en metanol a una
concentracin de 14%. Se agit durante 30 segundos y se coloc en el modulo de
calentamiento en las mismas condiciones del punto anterior. Se dej enfriar y se
aadi 1ml de iso-octano y 4ml de solucin saturada de NaCl (130 g en 500 mL de
H2O destilada). Posteriormente, se agit durante 2 minutos y se centrifug a 2500
rpm a 4C durante 10 minutos. Finalmente, la fase superior se transfiri a viales
color mbar previamente pesados con tapn de rosca y septo de PTFE/silicn. Se
dej evaporar el solvente a sequedad con corriente de nitrgeno y se volvieron a
pesar los viales para calcular el peso de los steres metlicos obtenidos. Con este
peso se ajust la concentracin de grasa metilada a una concentracin deseada de 2
mg/ml, para obtener picos de forma simtrica y bien definidos.
44
Las alcuotas de esta solucin se usaron para la cuantificacin de los cidos grasos
individuales por cromatografa de gases (Hewlett Packard 5890) equipado con un
detector de ionizacin de flama. La separacin de los steres metlicos de los cidos
grasos se realiz en una columna BPX 70 (SGE Germany) de 100 m de longitud. La
identificacin de los cidos grasos se llev a cabo comparando con los tiempos de
retencin de estndares de cidos grasos comerciales (Harris C; 2006).
Anlisis estadstico
Los resultados se describieron con medidas de tendencia central y de dispersin. La
expresin de las desaturasas y elongasas se compararon a lo largo del tiempo con
ANOVA para mediciones repetidas. La asociacin entre la expresin de las
desaturasas y elongasas con la composicin de LC-PUFAs se llevo a cabo con el
coeficiente de correlacin de Pearson.
La correlacin de Pearson permite medir la fuerza de la relacin lineal entre dos
variables. El valor de correlacin de 1 (sentido negativo) o +1 (sentido positivo)
indica una correlacin perfecta. Cuanto ms cercanos al 0 sean los valores, indican
una mayor debilidad de la relacin o incluso ausencia de correlacin entre las dos
variables.
45
Resultados
Caractersticas demogrficas de los sujetos de estudio
En este estudio participaron seis mujeres primigestas que cursaron embarazo normo
evolutivo a trmino, con producto nico. Las variables clnicas se muestran como
promedios desviacin estndar. (Tabla 3). La duracin del embarazo fue alrededor
de las 39.8 semanas, la edad y estatura promedio fue de 28.4 aos y 1.52 metros,
respectivamente. El peso previo al embarazo fue de 58.8 kilogramos y el peso al final
del mes 4 post-parto fue de 54.6 kilogramos. Los suplementos reportados por las
mujeres de estudio durante la lactancia fueron el cido flico y el hierro (Tabla 3).
Tabla 3. Caractersticas demogrficas de los sujetos de estudio
Variable Promedio
Edad (aos) 28.4
4.8
Talla ( m) 1.52
0.1
Peso previo al embarazo (Kg) 58.8
9.2
Peso mes 4 post - parto (Kg) 54.6
12.1
Gestacin (semanas) 39.8
0.3
Suplementos Acido flico y sulfato ferroso
46
Cuantificacin y pureza del ARN total
Uno de los pasos crticos para el xito de los anlisis realizados mediante PCR en
tiempo real es la cantidad y calidad de las muestras del ARN total. La calidad del
ARN total se mide en base a tres parmetros bsicos: pureza (se considera que el
cociente debe estar en un rango de 1.8-2.0 para ser consideradas ptimas),
integridad (en el gel se deben observar dos bandas bien definidas que son
caractersticas de los ARN ribosomales) y contaminacin por ADN genmico (no se
debe observar una banda arriba de las banda que corresponde al ARN ribosomal
28S).
Con la finalidad de determinar la concentracin y pureza del ARN total obtenido de
las muestras de glbulos de grasa de la leche de mujeres, se llev a cabo la
cuantificacin del ARN total en un espectrofotmetro NanoDrop ND-1000 a una
longitud de onda de 260nm.
La pureza del ARN total, con respecto a contaminacin por protenas, se determin
estableciendo la relacin de absorbancia 260/280, lo que indica que el ARN total
obtenido de las clulas epiteliales mamarias secretadas en los glbulos de grasa
cumpli con los requisitos necesarios para la posterior cuantificacin de los
transcritos de estudio. Los datos presentados en la tabla 4 son un ejemplo de la
concentracin y pureza de las muestras del ARN total.
47
Tabla 4. Concentracin y pureza del ARN total obtenido de clulas epiteliales
mamarias secretadas en glbulos de grasa
Integridad del ARN
Como se mencion anteriormente, es importante determinar la integridad del ARN
total obtenido de los glbulos de grasa ya que una integridad inadecuada puede
afectar la eficiencia de la tcnica de retrotranscripcin y del PCR. Por lo tanto, la
integridad de este ARN, fue analizada por electroforesis en gel de agarosa,
visualizndose dos bandas bien definidas que son caractersticas de los ARN
ribosomal (ARNr) 28S y 18S (Fig 8) (Schroeder y cols., 2006), lo cual nos indic una
adecuada integridad del ARN.
Etapa de lactancia ng/l 260/280
Semana 1 379.0 1.94
Semana 2 919.9 1.92
Semana 3 621.4 1.90
Semana 4 555.8 1.88
Mes 2 506.5 1.88
Mes 3 474.7 1.89
Mes 4 243.2 1.84
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Schroeder%20A%22%5BAuthor%5D
48
28S ARNr
18S ARNr
M1S1 M1S2 M1S3 M1S4 M2 M3 M4
Fig 8. ARN total obtenido de glbulos de grasa de clulas epiteliales mamarias. Gel de agarosa al 1%,
teido con bromuro de etidio (10 mg/dL). M = mes, S = semanas.
Amplificacin por PCR punto final
Para verificar la sntesis de cDNA de todas las muestras se realiz PCR punto final
del gen endgeno -actina. La figura 9 es un ejemplo de la amplificacin del cDNA
de una sola mujer durante los primeros cuatro meses de lactancia. Lo que se puede
observar es un solo producto de PCR indicado por una sola banda intensa y bien
definida que corresponde al tamao esperado del amplicon de -actina (320 pb). En
ninguna corrida de electroforesis se observ contaminacin del control negativo, lo
que demostr la eficiencia de la reaccin de PCR punto final.
49
Fig 9. Producto de PCR del gen actina sometido a electroforesis a 90V durante 30 minutos. Gel de
agarosa al 2%, teido con bromuro de etidio (10mg/dL), se utiliz un marcador de 100 pares de bases
(pb). S = semanas, M= mes, control negativo de PCR (PCR-).
400 pb
300 pb
200 pb
100 pb
M M1S1 M1S2 M1S3 M1S4 M2 M3 M4 (-PCR)
50
Anlisis cuantitativo de la expresin gnica por PCR en tiempo real
Con la finalidad de cuantificar los transcritos 5D, D, Elovl-5, -LA y Cas-3 se
llev a cabo su amplificacin por PCR en tiempo real. La cuantificacin relativa nos
indica el nmero de veces que el transcrito se expresa en relacin a la muestra de
referencia utilizada como control, que en este estudio es el calostro. Se utiliz el nivel
de expresin del gen -actina como gen referencial endgeno para normalizar el
nivel de expresin de los genes de inters.
Expresin gnica de la desaturasa 5
En la grfica 1 se observ que el perfil de expresin de la 5D increment de manera
gradual durante los primeros cuatro meses de lactancia materna. A partir de la
semana 4 de lactancia (leche madura) la expresin del transcrito fue de 1.9 veces
ms significativamente en comparacin con el calostro (semana 1). Mientras que
durante el mes 2 y 3 el incremento en la expresin fue 2.3 veces ms en la leche
madura en relacin al calostro, identificndose una mxima expresin del ARNm de
5D de 2.77 veces mayor en el mes 4 (leche madura) con respecto al calostro.
51
Grfica 1. Expresin del ARNm de la 5D en clulas epiteliales presentes en glbulos de grasa de
leche materna humana. Los niveles de expresin del ARNm de la 5D en la leche de transicin y
leche madura se compararon con el calostro. Los datos son mostrados como promedio ( error
estndar), S = semanas, M = mes. Prueba de ANOVA para mediciones repetidas, con post-prueba de
Dunnet. *P < 0.05.
Expresin del ARNm de 5D en clulas epiteliales mamarias
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
4,0
S1 S2 S3 S4 M2 M3 M4
*
Calostr Leche madura
*
*
*
Calostro Leche de
transicin
Unid
ades R
ela
tivas
52
Expresin gnica de la desaturasa 6
Aunque la expresin del ARNm deD en clulas epiteliales mamarias increment a
partir de la semana 2 de lactancia, etapa que tambin corresponde a la leche de
transicin este incremento fue significativo a partir del mes 2 (grafica 2). La mxima
expresin del ARNm de la D fue en promedio 2.7 veces mayor en el mes 3 de
lactancia en la leche madura con respecto al calostro.
Grfica 2. Expresin del ARNm de la 6D en clulas epiteliales presentes en glbulos de grasa de
leche materna humana. Los niveles de expresin del ARNm de la 6D en la leche de transicin y
leche madura se compararon con el calostro. Los datos son mostrados como promedio ( error
estndar). S = semanas, M = mes. Prueba de ANOVA para mediciones repetidas, con post-prueba de
Dunnet. *P < 0.05.
-
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
4,0
S1 S2 S3 S4 M2 M3 M4
Calostro Leche de
transicin
Leche madura
*
*
Unid
ades R
ela
tivas
Expresin del ARNm de 6D en clulas epiteliales mamarias
53
Expresin gnica de la elongasa 5 (Elovl-5)
Aunque en la grfica 3 se observa que la expresin del ARNm de la Elovl-5
increment a partir de la semana 3 (leche madura), ste fue significativo hasta el mes
3 de lactancia. Observndose que la mxima expresin fue en promedio 2.9 veces
ms con respecto al calostro.
Grfica 3. Expresin del ARNm de la Elovl-5 en clulas epiteliales presentes en glbulos de grasa de
leche materna humana. Los niveles de expresin del ARNm de la Elovl-5 en la leche de transicin y
leche madura se compararon con el calostro. Los datos son mostrados como promedio ( error
estndar). S = semanas, M = mes. Prueba de ANOVA para mediciones repetidas, con post-prueba de
Dunnet. *P < 0.05.
Expresin del ARNm de Elovl-5 en clulas epiteliales mamarias
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
4,0
S1 S2 S3 S4 M2 M3 M4
Unid
ades R
ela
tivas
*
Calostro Leche de
transicinLeche madura
54
Anlisis de composicin de cidos grasos
En este estudio, se determin la composicin de cidos grasos totales en los
distintos tipos de leche: calostro, la leche de transicin y la leche madura durante los
primeros cuatro meses de lactancia. Para esto, primero se extrajeron los lpidos
mediante la tcnica de Folch modificada, posteriormente los cidos grasos fueron
esterificados y finalmente el anlisis de los mismos se hizo mediante cromatografa
de gases.
cidos grasos poli-insaturados
En la grfica 4 se observ que la proporcin de los PUFAs como son el AL y -ALN,
precursores de los LC-PUFAs no cambiaron durante el transcurso de la lactancia. Sin
embargo, la proporcin de sus metabolitos como el ADH y AA disminuyeron de
manera significativa durante el transcurso de la lactancia. La proporcin de AA
disminuyo 3% en la leche de transicin y 8% en la leche madura con respecto al
calostro, mientras que la proporcin de ADH disminuy 6% en la leche de transicin
y 14% en la leche madura en relacin al calostro. Lo cual nos indic que en el
calostro hay una proporcin ms alta de LC-PUFAs y mientras transcurre el periodo
de lactancia esta proporcin disminuye en la leche madura. Por lo contrario,
podemos observar que la proporcin de AEP se mantiene constante durante los
primeros cuatro meses de lactancia.
55
Grfica 4. Composicin de PUFAs y LC-PUFAs en la leche materna humana durante la secrecin de
calostro, leche de transicin y leche madura. Con motivo de una mejor presentacin de los datos,
stos se presentan en logaritmo y son mostrados como promedio ( error estndar) del total de cidos
grasos durante los diferentes tiempos de lactancia materna. Los datos de leche de transicin y de
leche madura se compararon con los de calostro. S = semanas, M = mes. Prueba de ANOVA para
mediciones repetidas, con post-prueba de Dunnet. El smbolo * muestra diferencias significativas con
una p
56
Asociacin entre la expresin gnica y la composicin de LC-PUFAs en la leche
Para determinar si existe asociacin entre la expresin de los transcritos que
codifican para las enzimas que sintetizan los LC-PUFAs con la proporcin de stos
en la leche materna, se utiliz el coeficiente de correlacin de Pearson.
En la tabla 5 se observ que en la semana 2 de lactancia hay una asociacin positiva
entre la expresin de la 5D con la proporcin de AA, lo cual indica que cuando se
secreta la leche de transicin aument tanto la proporcin de AA como la expresin
del transcrito de la 5D. Tambin en la semana 4 de lactancia se observ una
asociacin positiva entre la expresin la 6D y AA, indicando que cuando se secreta
leche madura, aumenta la expresin de la 6D y como consecuencia tambin
incrementa la proporcin de AA. Estos resultados mostraron que en el mes 3 de
lactancia existe una asociacin positiva entre la expresin de la 6D con la
proporcin de AEP. Esto sugiere que cuando incrementa la expresin de la 6D
tambin aumenta la proporcin de AEP cuando se secreta la leche madura. Sin
embargo, durante el mes 2 de lactancia se observ una asociacin negativa entre la
expresin del ARNm de Elovl-5 con la proporcin de AEP, indicando que cuando se
secreta la leche madura existe un incremento en la expresin del transcrito de Elovl-5
pero disminuye la proporcin de AEP. Tambin en el mes 3 de lactancia se observ
una asociacin negativa entre la expresin de la 6D y Elovl-5 con la cantidad de
ADH en la leche madura.
57
Tabla 5. Asociacin entre la expresin de 5D, 6D y Elovl-5 con la proporcin de LC-PUFAs presentes en la leche
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