Parte 1 – PCR en Tiempo Real
Adriana Freire Machado
Febrero/2010
Eppendorf do Brasil
Adriana Freire Machado
Aplicaciones
• Cuantificación absoluta y relativa
• Perfil de la expresión génica
• Determinación del número de copias de genes
• Discriminación alélica
• Tasa de SNP
• Identificación génica
• Validación de los datos de Microarrays
• Detección de patógenos
• Cuantificación de carga viral
• Identificación y cuantificación de transgenes
Realplex
Adriana Freire Machado
Eppendorf do Brasil
PCR Basic Technology
Reacíón da polimerase en cadena (PCR)
T T T TT A AAC C CC C
A A A AT TTC C C C CCT
A
A
G G G G GG
G G GG G
Pol
Reativos de PCR
• Template/ DNA target
• Primer (2)
• dNTPs
• DNA polimerasa (encima)
• Tampon de la reacción
(KCl, Mg2+, pH 8.3)
Realplex
Adriana Freire Machado
Eppendorf do Brasil
PCR Basic Technology
94°C
~55°C
PCR
T T T TT A AAC C CC C
A A A AT TTC C C C CCT
A
A
G G G G GG
G G GG G5‘ 3‘
5‘3‘
Separação
das fitas
“Anealling” do primer
72°C
Elongação pela
polimerase
Etapas do PCR
Realplex
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Eppendorf do Brasil
PCR Basic Technology
Amplificación de PCR
Amplificación
Exponencial
21 =
2 copies22 =
4 copies 8 copies 16 copies
Realplex
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Eppendorf do Brasil
PCR Convencional - Prós e Contras
Ventajas de la PCR
•Sensibilidad
•Especificidad
Desventajas de la PCR
•Quantificaçión no es tan fácil
•Complexa manipulación pós PCR
Realplex
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PCR quantitativa - Prós y Contras
PCR quantitativa:
Combina amplificación de PCR y detección fluorescente
Detección sensíble e específica
•Quantificación fácil y precisa
•Sem manipulación pós PCR „Detecção en tubo“
Possui todos los benefícios de PCR convencional y
compensa sus desventajas!
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PCR Basic Technology
Reacción de la polimerasa en cadena (PCR)
Reativos de PCR
• Template/ DNA target
• Primer (2)
• dNTPs
• DNA polimerasa (encima)
• Tampon de la reacción
(KCl, Mg2+, pH 8.3)
T T T TT A AAC C CC C
A A A AT TTC C C C CCT
A
A
G G G G GG
G G GG G
Pol
+marcador
fluorescente
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Marcadores del DNA
Ej. SYBR Green I
Excitación 494 nm
Formatos de detección I
Emisión 521 nm
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Sistemas basados en hibridización de sonda
•Hibridización de las sondas internas en el produto del PCR
•Interacción de los dos fluorocromos a una corta distancia:
FRET
Fluorescence Resonance Energy Transfer
(Resonancia de la fluorescencia por transferencia energética)
Formatos de Detección II
T A G C C T G CA G A G
R QReporter Quencher
Dyes
(JOE,VIC,FAM,TET
,ROX,TAMRA...
Realplex
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SYBR® Green
• Intercalarte de DNA doble cadena
• Fluoróforo em suspensión
• Inespecífico
• Curva de disociación o melting
• Noão permite multiplex
• La emisión de fluorescencia es proporcional al
número de moléculas y al tamaño del amplicon
• Mas barato
Realplex
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Curva de melting o de disociación
• Checa la especificidad de los productos generados
• Aumento de laa temperatura= reducción del sinal de
Sybr Green denaturación
• Diferentes amplicons=diferentes
picos en la curva de melting
* tamaños de amplicon e
cuantidad GC
• Posibilidad de identificación
de cepas diferentes
diseño de la reacción
Realplex
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Curva de melting o de disociación
Temperature [°C]
949290888684828078767472706866646260
- dI / dT (%)
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
-10
-20
-30
-40
-50
-60
Primer dimers
Product of Interest
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T T T TT A AAC C CC CA G G G G GG T T T TT A AAC C CC CA G G G G GGT T TAA C CC CG GG
T A G C C T G CA G A G
R Q
El principio TaqMan
Taq Polimerasa:
una encima, dos actividades
•5´-3´DNA Polimerasa
•5´-3´Exonucleasa (actividad TaqMan)
A
G
C C
A
C C
T
T
T T T T TGGG CCCC A A AAGCCGA
T
R
T T CAGCCGA
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Multiplexing
Dos o más sondas y Dyes (marcadores) en un tubo
T A G C C T G CA G A G
FAM Q Quencher
TAGCCTGC AGAG
Vic Q Quencher
Albo 1
Albo 2
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Tipos de Cuantificación
Cuantificación Absoluta:
- Determinación del número exacto de moléculas.
Valores numéricos con alguna unidad,
como número de copias o nanogramas de DNA.
Cuantificación Relativa:
- Análise comparativa del ácido nucléico alvo com o do controle interno
ou do calibrador.
Son comparados os Ct’s de cada muestra
los resultados representan ordenes de grandeza
(p.e: 5x más o menos expresión de un determinado gene).
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PCR Fase I
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
1 10 20 30 40
ciclos
Produto
Vista linear
1
10
100
1000
1 10 20 30 40
ciclos
Vista log
exponencial
linear
platô
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0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40
Detecció cinética
(PCR cuantitativa )
cycles
Product
Detección End point
(PCR convencional)
PCR - cinética vs. Detección End point
Ct (Threshold Cycle)- representado por el ciclo en el cual la producción de fluorescencia
cruza el umbral establecido. El cálculo del Ct siempre se realiza en la fase exponencial de
la curva.
Nº de ciclos
Fluorescencia
Cantidad Inicial
Ct
Curva Estándar
CtCtCt
Baseline o línea base -se refiere a los ciclos iniciales en los que no hay cambios
detectables en la cantidad de fluorescencia, y sólo se detecta la fluorescencia .
Threshold
Threshold (Umbral)- es el umbral en el que se produce un cambio significativo en la
fluorescencia
Background Fluorescence
Curva de amplificación
El Princípio Real Time
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Cuantificación absoluta
Desconhecido
Ef=10[-1/slope]-1
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Cuantificación Relativa
Usado principalmente para estudios de expresión génica
•Expresa los valores relativos a una muestra de referencia (calibrador, control, etc)
•Control (Calibrador): Muestra sin tratar o a tiempo 0, un tejido, etc.•Requiere usar un gen de referencia (control endógeno) para normalizar
- Generalmente genes housekeepings o RNA ribosomal
- No debe variar con el tratamiento
Sistema control (calibrador) Sistema Experimental
Gen referencia
Gen target
∆∆Ct= ∆Ct of sample – ∆Ct of calibrator
∆Ct= endogenous Ct – gene of interest Ct
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Cuantificación Relativa
∆CtSample
∆CtCalibrator
Housekeeping Gene
∆Ct
∆Ct
∆ ∆ Ct
2- ∆ ∆ Ct = Change in Expression Level
Gene of Interest
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Cuantificación Relativa
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Número de ciclo
fluorescence
GAPDH (control)
GAPDH (treatment)
TNFα (control)
TNFα (treatment)
analysis line
Como obtener el punto
correcto de
cuantificación?
threshold level – 10x SD
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Algoritimo CalQPlex en el software realplex
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CalQplex-Algorithm
x x x x x x x x x x x x xxx
x
x
xxxx x x x x x
Fluorescence
Cycle-Number
CalQplex-Ct-value
(reference point)
Change over from
the exponential to
the non-exponential
phase
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real-time PCR efficiency and
amplification performance
PCR inhibitors:
Hemoglobin, Urea, Heparin
Organic or phenolic compounds
Glycogen, Fats, Ca2+
Tissue matrix effects
Laboratory items, powder, etc.
RNA / DNA
degradation
PCR reaction
components
DNA
concentration
tissue
degradation
PCR enhancers:
DMSO, Glycerol, BSA
Formamide, PEG, TMANO, TMAC etc.
Special commercial enhancers:
Gene 32 protein, Perfect-Match, Taq-
Extender, AccuPrime, E. Coli ss DNA binding
unspecific
PCR productsDNA dyes
lab management
hardware:
PCR platform & cups
cycle conditions
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