ESCUELA SUPERIOR POLITÉCNICA DEL LITORALFACULTAD DE INGENIERÍA MARÍTIMA CIENCIAS

BIOLÓGICAS, OCEÁNICAS Y RECURSOS NATURALES

PATOLOGÍA

Infección experimental de Penaeus vannamei con Vibrio Parahaemolyticus

Guillermo Zamora

RiveraPonti Saquicela

Joshue Perez Paralelo: 1

Septiembre de 2015

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TABLA DE CONTENIDOS

TABLA DE CONTENIDOS.....................................................................................................................2

1 OBJETIVOS.......................................................................................................................................3

2. HIPÓTESIS.......................................................................................................................................3

3. INTRODUCCIÓN..............................................................................................................................3

4. MATERIALES...................................................................................................................................3

5. METODOLOGÍA..............................................................................................................................3

5.1 Animales experimentales.........................................................................................................3

5.2Cepas Bacterianas.....................................................................................................................4

5.3 Preparación de Inóculos...........................................................................................................4

5.4 Infección Experimental.............................................................................................................4

5.5 Centrifugación..........................................................................................................................4

6. MEMORIA DE CÁLCULO..................................................................................................................4

7. RESULTADOS..................................................................................................................................5

7.1. SIGNOS CLÍNICOS DE ENFERMEDAD.......................................................................................5

7.2 TABLAS DE DATOS..............................................................................................................5

7.3 CURVA DE MORTALIDAD....................................................................................................5

ANÁLISIS DE RESULTADOS..........................................................................................................6

CONCLUSIÓN..............................................................................................................................6

BIBLIOGRAFIA.............................................................................................................................6

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1 OBJETIVOS

Infectar camarones de 1g con Vibrio Parahaemolyticus a concentraciones de 107 y 106

Determinar qué concentración causa mayor mortalidad, si la causa en la población.

2. HIPÓTESISLos camarones Penaeus vannamei frente al sometimiento a un ensayo de desafío a con Vibrio parahaemolyticus presentaran una mortalidad mayor mortalidad a una concentración de 107 que de 106, en tanto que los individuos del grupo experimental no sufrirán muertes significativas.

3. INTRODUCCIÓN La acuicultura es el sector de producción de alimento de mas rápido crecimiento en el ámbito mundial y se establecido como una fuente de proteína para satisfacer la demanda de alimentos mundial debido a que los recurso naturales están sobrexplotados. Pero, en la actualidad, el mayor problema que enfrenta la industria de la acuicultura en el ámbito mundial, son las enfermedades causadas por varios agentes biológicos y no biológicos. Entre los grupos de microorganismos que causan perdidas serias en el cultivo de camarón, los mejores conocidos son las bacterias debido a los efectos devastadores que tienen sobre las granjas afectadas. Las enfermedades bacteriales, debido principalmente a Vibrio, que han sido reportadas en los sistemas de cultivo de penaideos implican a al menos 14 especies, las cuales son: Vibrio harveyi, V.

splendidus, V. parahaemolyticus, V. alginolyticus, V. anguillarum, V. vulnificus, V. campbelli, V. fischeri, V. damsella, V. pelagicus, V. orientalis, V. ordalii, V. mediterrani, V. logei etc.

4. MATERIALES -200 tarrinas plásticas

-3 jeringuillas de insulina

-Medio de cultivo LB

-Cajas Petri

-Equipo de seguridad de laboratorio

5. METODOLOGÍA5.1 Animales experimentales

200 camarones juveniles Penaeus vannamei, con un peso de 1g provenientes de la granja de producción Produmar de la provincia del Guayas-Ecuador se colocaron en el laboratorio de biología de la Facultad de Ingeniería Marítima, Ciencias Biológicas y Recursos Naturales de la ESPOL. Se colocaron a todos en tarrinas con una cantidad aproximada de 300 ml, en agua de salinidad de 2 ppt, sin aireación, y bajo condiciones controladas. Los animales fueron sometidos a un periodo de aclimatación de 3 días, después de los cuales el número de supervivientes fue de 115. Se alimentaron con un pellet diaria a cada uno, con recambios de agua diarios del 100 %. 30 camarones se dispusieron como grupo experimental 1, 30 como grupo experimental 2, y 30 como grupo control.

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5.2Cepas BacterianasLa cepa del Vibrio Parahaemolyticus se obtuvo del laboratorio del Centro de Servicios para la Acuicultura de la ESPOL, congeladas a -80 grados centígrados.

5.3 Preparación de Inóculos.La sepa bacteriana se preparó en LB medio, incubados a 28 grados centígrados por 24 horas y las bacterias, se realizó las respectivas disoluciones del cultivo para después ser contadas en placa de micro ELISA en el espectrofotómetro con una longitud de onda de 650 nm encontrándose que una densidad óptica representada por

8.8 x108 para 1000 ul.

5.4 Infección ExperimentalSe dispuso de 2 tratamientos experimentales para el proceso de infección. El grupo experimental 1, se inoculó 20 ul en el último segmento con una concentración de 5 x107 UFC/ml de Vibrio parahaemolyticus. El grupo experimental 2, se inocul’o a una concentración de 1.06 x106 UFC/ml y

finalmente el grupo control se inocul’o con el medio de cultivo esterilizado bajo el mismo protocolo.

5.5 Centrifugación Para obtener una mayor concentración de bacterias, para el grupo experimental 1, se colocó en 5 tubos ependorf 200 ul de la solución con 5 x107 UFC/ml de Vibrio parahaemolytis a 500 RPM por 8 minutos.

6. MEMORIA DE CÁLCULOObtencion de la densidad óptica a partir de la solución madre.

10−5→1.35x 107UFC /ml

Entonces, según los valores obtenidos a partir de la medición en el espectofotometro

1.35 x108UFCml

→0.152

X←1 O. D.

X=8.88 x108

Calculo de la concentración en el medio liquido

1O. D .→8.88 x108

0.121→X

X=1.06 x108

La medición obtenida del cultivo del medio liquido:

20ul→1 x106

1000ul→X

X=5 x107

4

Finalmente para la preparación de la inyección de 1000 ul. Como se obtiene un valor de 470 ul, se

debe agregar 530 ul de medio estéril.

1.06 x106→1000ul

5 x107→X

X=470ul

7. RESULTADOS7.1. SIGNOS CLÍNICOS DE ENFERMEDAD

Fig 1. Penaeus vannamei moribundo del grupo experimental 2, se observa

necrosis hepatopancreatica y urópodos rojizos.

Fig 2. Penaeus vannamei con nado errático e hipoxico.

Fig 3. Penaeus vannamei del grupo experimental 2 con la presencia de urópodos enrojecidos debido a la

expansión de cromatóforos.

7.2 TABLAS DE DATOS GrupoHoras Control 10ᶺ6 10ᶺ7

20 6 6 1124 8 12 1226 8 13 1246 13 21 1849 13 23 19

Tabla 1. Cantidad de camarones afectado en el transcurso de las horas

GrupoHoras Control 10ᶺ6 10ᶺ7

0 0 0 020 20,00 20,00 36,6724 26,67 40,00 40,0026 26,67 43,33 40,0046 43,33 70,00 60,0049 43,33 76,67 63,33

Tabla 2. Porcentaje de camarones afectado en el transcurso de las

horas

7.3 CURVA DE MORTALIDAD

5

1 2 3 4 5 60

10

20

30

40

50

60

70

80

90

Población afectada

Control 10ᶺ6 10ᶺ7

Porc

enta

je

Tabla 3. Curva de Mortalidad obtenida a partir de los resultados

obtenidos.

8. ANÁLISIS DE RESULTADOSLa presencia de síntomas clínicos, muestran que las bacterias están causando enfermedad. En la tabla 3 se observa que a las 20 H de prueba la concentración de

5 x107 causo mayor mortalidad, mientras

que en 106 se obtuvieron valores similares, pero a partir de las 24 horas la concentración de 106 empieza a causar mortalidades en la población a diferencia del grupo control.

La muerte del grupo control se puede deber a una mala manipulación en el momento de inyección, con lo cual se crea un sobre estrés al animal, mismo que muere.

9. CONCLUSIÓNEn este experimento se pudo concluir que la infección surtió efecto un tanto esperado en la población, ya que como se deduce que a mayor concentración 107 la población fue más afectada y las muertes mayores. En

tanto que en la concentración menor 106 la cantidad de camarones afectados fue menor. A las primeras 20 horas el experimento presentó una buena dirección porque la cantidad de organismos afectados en la concentración 107 era mayor, luego esta no siguió esta tendencia debido a que la cantidad de afectados disminuyo y aumento en la concentración menor, es decir 106. Esto presenta un problema, ya que no se cumple la hipótesis al 100 %.

Muchos factores pudieron influir en la muerte de individuos del grupo experimental de menor concentración como por ejemplo mala manipulación, las bacterias al tratar de llegar a una mayor concentración se estresan y pueden morir o no actúan, efecto de la tarrina en los camarones, etc.

10. BIBLIOGRAFIA Adams, A. 1991. Response of penaeid

shrimp to exposure to Vibrio species. Fish Shellfish Immunol 1:59–70.

Alday-Sanz. V., Roque, A., Turnbull, JF. 2002. Clearing mechanisms of Vibrio vulnificus biotype I in the black tiger shrimp Penaeus monodon. Dis Aquat Org 48:91–99.

Anderson, I.G., Shamsudin, M.N. and Shariff, M. 1988. Bacterial septicemia in juvenile tiger shrimp, Penaeus monodon, cultured in Malaysian brackishwater ponds. Asian Fis.Sci. 2: 93-108.

Baticados, M.C.L., Lavilla-Pitogo, C.R., Cruz-Lacierda, E.R., de la Pena, L.D. and Sunaz, N.A. 1990. Studies on the chemical control of luminous bacteria Vibrio harveyi and V splendidus isolated from diseased Penaeus monodon larvae and rearing water. Dis. Aquat. Org. 9: 133-13.

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