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Posibilidades de la
Espectrometría de
Masas y del software
de análisis estadístico
“Mass Profiler
Professional” en
Investigación Clínica
Espectrometría de Masas y
Bioinformática: una herramienta
esencial en los laboratorios
actuales de investigación
Biomédica
Isidre Masana
Especialista Productes LC/MS
Agilent Technologies
Divisió Biociència i Anàlisi Químic
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Posibilidades de la
Espectrometría de
Masas y del software
de análisis estadístico
“Mass Profiler
Professional” en
Investigación Clínica
PROGRAMA:
1.- Introducción a la Espectrometría de Masas más Utilizada en Investigación.
2.- Flujos de Trabajo en Análisis Comparativos por Espectrometría de Masas.
3.- Concepto de Biología Integrada.
4.- Conclusiones.
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1.- Cuantificación y Perfilado de Compuestos Diana.
1A.- Análisis de un nº “limitado” de fármacos, metabolitos, péptidos, … con disponibilidad de patrones. Típica aplicación QqQ en MRM.
1B.- Perfilados masivos de un nº “ilimitado”/muy elevado de compuestos sin* disponibilidad de patrones (* La confirmación y cuantificación
de positivos si requerirá la disponibilidad de patrones).
2.- Análisis Comparativos: Correlaciones entre composición y propiedades de las poblaciones comparadas (enfermedades, pacientes clasificados, origen,…); descubrimiento biomarcadores,…
3.- Identificación de picos cromatográficos desconocidos.
Típicos Escenarios de Aplicación de las Técnicas de
LC/MS en Clínica y Toxicológia.
En LC/MS el equipo “ideal” dependerá del “escenario central” de trabajo
Típicas aplicaciones de TOF y Q-TOF (masa exacta)
BASE en investigación mediante MS (imprescindible en la no dirigida) Lab
ora
tori
os In
ve
sti
ga
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n
---
-
R
uti
na
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HPLC: todo tipo analitos GC: analitos volatilizables CE: analitos iónicos
Para poder ser detectadas
en MS las moléculas
necesitan ser ionizadas
Cromatografía
HPLC MS: QTOF
GC MS
Ejemplo Instrumentación MS: LC/MS-Q-TOF
JUAN
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Importancia de la Masa Exacta en Investigación: Selectividad
Cuantitativa de Cromatogramas de Iones con Masa Exacta. Ejemplo: 2ng/ml (2ppb) Clenbuterol en Orina
IC: 277.1 m/z - Ventana Extración 1 Da
Clenbuterol S/N = 14
Rango extracción típico Cuadrupolo
IC: 277.087 m/z - Ventana Extración 0.016 Da +/- 30ppm
S/N = 102
LC/MS-TOF Agilent 6210
Exactitud
Masa (ppm)
Nº posibles
fórmulas
empíricas
Tecnología
165 ppm 209 QUAD/TRAP
10ppm 13
5 ppm 7
2 ppm 2 TOF /Q-TOF Comp.: Reserpina (C33H40N2O9). [M+H]+: 609.281 m/z
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Extraer IC con masa exacta es la clave para Comparar/
Cuantificar RELATIVAMENTE perfiles de muestras complejas
El área específica de este pico se utilizará en la cuantificación relativa
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Posibilidades de la
Espectrometría de
Masas y del software
de análisis estadístico
“Mass Profiler
Professional” en
Investigación Clínica
PROGRAMA:
1.- Introducción a la Espectrometría de Masas más Utilizada en Investigación.
2.- Flujos de Trabajo en Análisis Comparativos por Espectrometría de Masas.
3.- Concepto de Biología Integrada.
4.- Conclusiones.
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2 Tipos de Estudios Comparativos en Clínica: Genéricos y Específicos
Comparación de
Perfiles Genéricos del Metabol/Prote-oma /…..
(metabolitos, péptidos,…
conocidos + desconocidos)
Se trabajará con MS (TOF/QTOF) en modo
espectral con masa exacta
Típico para Descubrimiento de
Nuevos Biomarcadores
LC/MS-QTOF
GC/MS-QTOF
LC/MS-QqQ
GC/MS-QqQ
Comparación de Perfiles Específicos (metab./pépt. concretos)
Se trabajará con MS (QTOF/QqQ) en modo
MS/MS o en MS en modo selectivo
Típico para Validación de Biomarcadores
Cambios en ciclos concretos del metabolismo
Flujo de Trabajo de Agilent en Estudios Comparativos de
Perfilado Genérico (típico p.e. en “Un-Targeted Metabolomics”)
Extraer automáticamente la información para cuantificar
relativamente MILES de compuestos desconocidos
Soft. Deconvolución: MFE
GC/MSD PCA
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Align, Normalize, Filtering, ANOVA,….
PCA
Modo MS
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Avanzado Algoritmo de Deconvolución “LC/MS Mass
Hunter Molecular Feature Extractor” para obtener por la
Masa Exacta de ”todos” los Compuestos Ionizados en la
Muestra Espectros Deconvolucionados
TIC IC’s 0
Forma parte del soft. de TOF y Q-TOF
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MFE proporcionará para cada analito deconvolucionado
• Masa Exacta y Tiempo ret. ID
• Intensidad señal Cuantificar
Flujo de Trabajo de Agilent en Estudios Metabolómicos de
Perfilado Genérico (“Un-Targeted Metabolomics”)
Buscar Correlaciones entre Grupos de Complejos Datos Espectrales
Intensidad, Tr, Masa exacta
GC/MSD
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Align, Normalize, Filtering, ANOVA,….
PCA
Modo MS
Modo MS/MS
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Mass Profiler Profesional: Herramientas de Comparación Estadística de Conjuntos de Muestras
Análisis
Estadístico
Admite Experimentos:
• Estudios simples (A vs. B)
• Estudios en función del tiempo, de condiciones múltiples, de dosificaciones varias, ….
• Clasificación (/ Autentificación) de muestras
Proporciona Muy Potentes Herramientas Estadísticas y de Visualización Comparación: • Filtrado simple (test de frecuencia)
• Test de relevancia (t-test, ANOVA 1 o 2 vías)
• Análisis de Componentes Principales (PCA)
• Agrupación (“Clustering” K-means, SOM, QT clustering),
• Predicción de Clases (K-nearest neighbors / SVM)
• Árboles jerárquicos Complete, average and single linkage (w. bootstrapping)
• Gráficos Volcano, Diagramas de Venn, ……
• Incluye Herramientas de visualización de datos (cromatogramas, espectros,…)
• Permite exportar la lista de iones precursores para realizar MS/MS y confirmar la identificación de los metabolitos de interés con Q-TOF’s de Agilent.
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Proyectos
Ensayos de Metabolómica/ Proteómica/ X-ómicas basados
en LC/MS, GC/MS, CE/MS
Platforma Multi-ómica: GeneSpring IB / MPP 12.5 Cambios de expresión reflejados directamente en las rutas
Ensayos Expresión Génica/ Transcriptomica basados en:
Microarrays, NGS, q-PCR
Enrichment Analysis on curated pathways and computationally – derived networks
Importación Genérica para equipos NO
Agilent: *.xls, *.xlsx, *.TXT or * .CSV files
Nexo unión experimentos multi–ómicos (p.e.transcriptomics/
metabolomics): Rutas Metabolicas
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A.-Electrospray Polaridad Positiva:
• Total metabolitos: 6747
• Filtrados (25% lineas celulares) : 3632
• Filtrados (p<0.005 FC>2.0) : 311
A B
• 22Rv1, LNCaP and VCaP: androgen responsive (prostate cancer),
• DU145 and PC3: androgen non-responsive (prostate cancer)
• RWPE (benign).
B.- Electrospray Polaridad Negativa:
• Total metabolitos: 2288
• Filtrados (25% lineas celulares) : 863
• Filtrados (p<0.005 FC>2.0) : 171
Permite predecir qué pacientes NO responderán al tratamiento
99.5% fiabilidad
Benignos
Responden tratamiento
NO Responden
Ejemplo Clasificación Pacientes Cancer de Prostata: Análisis de Componentes Principales (PCA) de metabolitos
significativamente alterados entre las 3 clases p<0.005 Fold Change >2.0
Benignos
Responden tratamiento
NO Responden tratamiento
1Cancer Center, Medical College of Georgia, Augusta, GA; 2Metabolomics Laboratory Agilent Technologies, Santa Clara, CA,….
Bases de Datos (PCD) y Bibliotecas de MS/MS (PCDL)
con Masa Exacta para Identificación y “Screenings”
Masivos por LC/MS-TOF/QTOF
Accurate Mass PCDBs and MS/MS
PCDLs METLIN Metabolite
PCDL 64.092 entries plus 8,712 MS/MS spectra for
2,286 metabolites
METLIN Metabolite
PCDB 64.092 entries
Forensics/Tox * PCDL
7,360 entries plus 8,263 MS/MS
spectra for 2,720 compounds
Forensics/Tox * PCD
7,360 entries
Pesticide PCD*
1,609 entries
Identificación y “Screenings” Masivos para aplicaciones
forenses/toxicológicas, seguridad alimentaria y
medioambiental, estudios metabolómicos,…..
*Kits de aplicaciones disponibles
Los TOF y QTOF facilitan mucho la ampliación del alcance del laboratorio (nº compuestos a monitorizar).
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Incluye:
680 metabolitos con T.Ret.
31.011 lípidos
Incluye
448 MS/MS de lípidos
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Abundancias Diferenciales de 3 Metabolitos de la Ruta de la Arginasa (Ciclo Urea) en Eritrocitos infectados por Malaria.
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15-10m
Rojo: Eritrocitos INFECTADOS
Azul: Eritrocitos NO INFECTADOS
Ver en que rutas metabólicas
están involucrados los
metabolitos relevantes del estudio
diferencial y cómo cambian.
Eritrocitos INFECTADOS // NO INFECTADOS
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2 Tipos de Estudios Metabolómicos: Genéricos y
Específicos
Comparación de Perfiles Genéricos del
Metaboloma (metabolitos conocidos
+ desconocidos)
Se trabajará con MS (TOF/QTOF) en modo
espectral con masa exacta
Típico para Descubrimiento de
Nuevos Biomarcadores
Comparación de Perfiles Específicos (metabolitos concretos)
Se trabajará con QqQ/QTOF en modo
MS/MS o en MS (QTOF/TOF) en modo
selectivo (masa exacta)
Típico para Validación* de Biomarcadores
Cambios en ciclos concretos del metabolismo
*Se corroborarán los resultados de PCA con perfiles específicos de un elevado
nº de individuos.
LC/MS-QTOF
LC/MS-QqQ
16-9m
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UntargetTarget Discovery by “Pathway to Database
Tool”: PMDC
Convierte la información de los metabolitos involucrados en las rutas seleccionadas en una Agilent “Personal Compound Database” (PCDB). Ésta se utiliza para cuantificar relativamente esos metabolitos en un conjunto de muestras adquiridas con masa exacta (modo MS con masa exacta y finas ventanas de masa de extracción ):
• Permite seleccionar las rutas metabólicas de interés de: Wikipaths, BioCyc, KEGG…
• Elimina metabolitos redundantes.
• Búsqueda en la web información adicional de los metabolitos:
• CAS ID, Nombre IUPAC, Estructura
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Flujo de Trabajo de Agilent en Estudios Metabolómicos de
Perfilado Especifico (“Targeted Metabolomics”)
GC-QqQ
LC-QqQ
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Predicción Automática de Clases: Lab. R&D QC
Etapas: 1.-Se genera un modelo predictivo
(lab. I&D) mediante algoritmos de predicción de clases (mediante Mass Profiler Profesional “MPP” a partir de datos de Mass Hunter MH ):
– Partial Least Squares Discrimination – Naïve Bayes – Decision Tree – Support Vector Machine – Neural Network
2.-El modelo predictivo generado se aplica en laboratorios Control Calidad (GC/MS Q/ QqQ/QTOF –LC/MS TOF/QTOF/QqQ) para clasificar nuevas muestras automáticamente sin intervención del usuario (mediante SCP: “Sample Class Predictor”).
Acquisition Feature
Extraction SCP
Mo
delo
Report _____________
_______
__________
__________
Acquisition Feature
Extraction SCP
Mo
delo
Report _____________
_______
__________
__________
Acquisition Feature
Extraction SCP
Mo
delo
Report _____________
_______
__________
__________
Acquisition Feature
Extraction SCP
Mo
delo
Report _____________
_______
__________
__________
Acquisition Feature Extraction Chemometric
Analysis
Aplicación Automática Modelo via Scripting (QC lab)
Mo
delo
P
red
icti
vo
MPP MassHunter (MH) MassHunter (MH)
MassHunter (MH)
MassHunter (MH)
MassHunter (MH)
Desarrollo del Modelo (lab. R&D)
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Posibilidades de la
Espectrometría de
Masas y del software
de análisis estadístico
“Mass Profiler
Professional” en
Investigación Clínica
PROGRAMA:
1.- Introducción a la Espectrometría de Masas más Utilizada en Investigación.
2.- Flujos de Trabajo en Análisis Comparativos por Espectrometría de Masas.
3.- Concepto de Biología Integrada.
4.- Conclusiones.
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Concepto y Aportaciones
de la Biología Integrada
• La Integración de datos experimentales de diferentes –ómicas permitirá:
• Reducir el ruido debido a la enorme variabilidad de las muestras biológicas.
• Validar los resultados experimentales a través de una coherente interpretación
biológica de los cambios de expresión observados entre distintas las distintas
poblaciones de individuos/ tratamientos/ enfermedades/…. comparadas en el estudio.
• Alternativa a validación biológica: la validación mono-ómica de biomarcadores
requiere efectuarla con unos miles de individuos de cada población.
• Dificultad : Extrema complejidad y variabilidad entre individuos de los procesos biológicos:
• La inhibición de una ruta metabólica es habitual que genere la
activación de otras vías alternativas.
• Mutaciones, defectos en la transcripción, modificaciones postraduccionales,…..
• Todas las –omicas acaban influenciándose unas a otras.
• ….
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DNA RNA Protein Metabolite
RNA Protein Metabolite
RNA Protein Metabolite
DNA
DNA RNA
Protein
Protein Metabolite
DNA RNA Protein Metabolite
El reto de la Biología
DNA RNA Protein Metabolite
RNA Protein Metabolite
RNA Protein Metabolite
DNA
DNA RNA
Protein
Protein Metabolite
DNA RNA Protein Metabolite
“-Omics” Biological Processes
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El Concepto de Biología Integrada
R
R
HO
Gene B
Gene A
Gene X
R
R
HO
Gene B
Gene A
Gene X R
R
HO
Gene B
Gene A
Gene X
• Identificar qué caminos están activos.
• Reducir el ruido biológico (por variabilidad).
• Sugerir experimentos de seguimiento.
Las rutas metabólicas constituyen el nexo de unión entre distintas -ómicas
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La visión integrada de datos de
multiples fuentes (/-ómicas) ayuda a
una mejor interpretación de los
resultados en su contexto (/biológico).
La visión de resultados de
disciplinas (/-ómicas) individuales
describe sólo una parte del cuadro.
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Enrichment Analysis on curated pathways and computationally – derived networks
Gene Product Data Overlay
Metabolite Data Overlay
Análisis Multi-ómico en Mass Profiler Professional 12-IB:
Cambios expresión representados en las propias rutas
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Posibilidades de la
Espectrometría de
Masas y del software
de análisis estadístico
“Mass Profiler
Professional” en
Investigación Clínica
PROGRAMA:
1.- Introducción a la Espectrometría de Masas más Utilizada en Investigación.
2.- Flujos de Trabajo en Análisis Comparativos por Espectrometría de Masas.
3.- Concepto de Biología Integrada.
4.- Conclusiones.
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Resumen.
• Los Estudios Metabolómicos basados en
Espectrometría de Masas y PCA son una
herramienta muy poderosa para el
Descubrimiento de Nuevos Biomarcadores.
• La Espectrometría de Masas es una herramienta
clave en laboratorios -ómicos y clínicos para
Investigación Biomédica y Monitorización
Terapéutica de Drogas (TDM).
• La Metabolómica guiada por Rutas metabólicas
es una herramienta muy poderosa para estudios
de Nuevos Biomarcadores y de Toxicidad de
nuevos fármacos.
• Los enfoques multi -ómicos reducen el "ruido de
muestras biológicas" (debida a su gran diversidad).
• La Metabolómica puede ayudar mucho en la
evolución hacia una medicina Predictiva,
Preventiva, Personalizada y Participativa.
Para colaboraciones científicas o servicios de análisis -ómicos, Agilent le puede poner en contacto con grupos de investigación / laboratorios que disponen de todas estas herramientas.
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[email protected] Especialista de Productos LC/MS Agilent Technologies
www.metabolomics-lab.com
http://www.chem.agilent.com
Tel. 901.11.6890
¿Preguntas?
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